UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
(CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL)

AUGUSTO RYONOSUKE TAIRA

DIFERENTES PROGESTÁGENOS E UTILIZAÇÃO DO EFEITO MACHO

COMO ESTRATÉGIAS PARA INCREMENTAR A PRODUÇÃO IN VIVO DE
EMBRIÕES OVINOS

Niterói, RJ
2022
 AUGUSTO RYONOSUKE TAIRA

DIFERENTES PROGESTÁGENOS E UTILIZAÇÃO DO EFEITO MACHO

COMO ESTRATÉGIAS PARA INCREMENTAR A PRODUÇÃO IN VIVO DE
EMBRIÕES OVINOS

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Medicina Veterinária da Universidade Federal
Fluminense, como requisito para obtenção do Grau de
Doutor em Medicina Veterinária. Área de
Concentração: Clínica e Reprodução Animal.

Orientador: Prof. Dr. Felipe Zandonadi Brandão

Coorientador: Dr. Jeferson Ferreira da Fonseca
Coorientador: Prof. Dr. Rodolfo Ungerfeld

Niterói, RJ
2022
 AUGUSTO RYONOSUKE TAIRA

DIFERENTES PROGESTÁGENOS E UTILIZAÇÃO DO EFEITO MACHO

COMO ESTRATÉGIAS PARA INCREMENTAR A PRODUÇÃO IN VIVO DE
EMBRIÕES OVINOS

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Medicina Veterinária da Universidade Federal
Fluminense, como requisito para obtenção do Grau de
Doutor em Medicina Veterinária. Área de
Concentração: Clínica e Reprodução Animal.

Defesa em 29 de março de 2022.

BANCA EXAMINADORA
Assinado de forma digital por Felipe Zandonadi
Brandao fzbrandao@id.uff.br:06937261721
Dados: 2022.11.19 19:33:28 -03'00'

Prof. Dr. Felipe Zandonadi Brandão - Orientador

Universidade Federal Fluminense - UFF

Drª. Juliana Dantas Rodrigues Santos

Universidade Federal Fluminense - UFF

Prof. Dr. Felipe Farias Pereira da Camara Barros

Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro - UFRRJ

Profa. Drª. Lorena Lacuesta Gómez

Universidad de la República – UDELAR

Profa. Drª. Julia Giriboni Pinto

Universidad de la República – UDELAR

Niterói, RJ
2022
À minha avó, Valery Hubner Cabrera, pelo amor
incondicional para comigo e por me ensinar o
verdadeiro valor da vida: amar. Aos meus
afilhados e sobrinha, pois eles são a nova geração
para um mundo melhor em que acredito. A todos
que de alguma forma contribuíram para a
realização desta tese,
Dedico.
 AGRADECIMENTOS
A Deus por me permitir vivenciar com saúde esse ciclo e sempre me guiar ao
longo dessa jornada.
Aos meus pais Maria Cristina H. C. Taira e Alberto Y. Taira por serem meu porto
seguro e por me apoiarem independente das minhas escolhas. Agradeço também aos meus
irmãos Kendra Y. Taira e Alvaro Y. Taira que, independentemente de tudo, sempre
acreditaram em mim! Sou grato a todos os meus familiares, vocês tornaram essa
caminhada muito mais leve e feliz!
Ao meu melhor amigo, companheiro para todos os momentos, muito obrigado por
caminhar comigo, juntos somos mais fortes e acreditamos no que somos capazes. Junior
C. Bergamaschi você foi e é essencial em minha vida, muito obrigado.
Ao meu orientador professor Felipe Zandonadi Brandão, agradeço pela
oportunidade e pela confiança em mim depositada. Quem diria que um experimento com
“chivos” abriria portas para este doutorado. Tivemos pouco tempo durante nossa
passagem pelo Uruguai, mas nunca irei esquecer aquele 4x1 do Brasil sobre o Uruguai
em pleno estádio Centenário. Meses depois, sem que eu pudesse imaginar, recebi um e-
mail com o convite para participar da seleção do doutorado, e sem dúvida mudou minha
vida! Muito obrigado por esta oportunidade professor.
Aos meus coorientadores, Dr. Jeferson Ferreira da Fonseca sou grato por toda
ajuda e aprendizado nos experimentos. Sempre com boa vontade, com ideias geniais e
sugestões brilhantes, muito obrigado por todo o aprendizado. Ao Dr. Rodolfo Ungerfeld,
que me recebeu prontamente em seu laboratório durante o meu mestrado e novamente
durante o doutorado, eu aprendo muito com o senhor. Muito obrigado por ser tão humano
e compartilhar o seu conhecimento, hoje eu só tenho a agradecer. Muito obrigado aos
coorientadores, sou uma pessoa muito melhor desde que os conheci.
Às instituições de fomento, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de estudo, Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq – 400785/2016-1), a Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA - 02.13.06.026.00.02) e a Faperj (E-
26/202.781/2018) pelo financiamento do estudo.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação da UFF, por toda a
dedicação e aprendizado. Em especial à professora Drª. Joanna Maria Gonçalves de Souza
Fabjan por ser uma pessoa bondosa e extremamente inteligente. Obrigado pela
participação na minha tese, tanto experimental quanto nas excelentes correções dos
artigos, admiro-te muito.
Aos membros da banca examinadora pela contribuição para melhoria desse
trabalho, em especial à Drª. Juliana Dantas Rodrigues dos Santos, que se tornou uma das
minhas melhores amigas durante o doutorado. Contigo essa caminhada foi mais leve. Ao
professor Dr. Felipe Farias Pereira da Camara Barros, o qual tive a oportunidade de que
me coorientasse durante o mestrado, irmão de república, muito obrigado por estar
presente. Não poderia deixar de mencionar a Drª. Lorena Lacuesta Gómez e a Drª. Julia
Giriboni Pinto, minha troca com vocês foi incrível, me recordo do primeiro baile de salsa
que fui e da despedida no paintball. Minha estadia no país de vocês foi indescritível, tenho
um carinho enorme por todos.
Aos meus amigos de pós-graduação, obrigado por todos os momentos que
compartilhamos, por terem tornado meus dias mais leves. Obrigado por terem auxiliado
durante todas as etapas experimentais, esta tese não seria possível sem ajuda de cada um
de vocês.
A equipe da Fazenda Escola, por serem tão dedicados e solícitos para me ajudar
durante os experimentos.
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a realização desse
trabalho,

Muito obrigado!
 “Ninguém sabe tudo, assim como ninguém ignora tudo. O saber
começa com a consciência do saber pouco. É sabendo que sabe pouco que
uma pessoa se prepara para saber mais”.
Paulo Freire
 RESUMO
A indústria da produção in vivo de embriões tem movimentado a pecuária em âmbito
internacional. No entanto, podemos classificar o processo de superovulação (SOV) como
etapa-chave, isto porque, existe alta variabilidade de respostas. A obtenção de protocolos
de superovulação com respostas eficientes é algo que desafia os cientistas. Neste
contexto, objetivou-se estudar diferentes fontes de progestágenos e o efeito macho
durante a SOV sobre a produção e qualidade de embriões ovinos. No primeiro
experimento dois progestágenos (MAP: acetato de medroxiprogesterona e P4:
prpgesterona) foram comparados durante a SOV após o protocolo “Dia 0”. A população
folicular e a quantidade de corpos lúteos (CL) não diferiram entre os tratamentos
(P>0,05). Em relação à recuperação de embriões, as estruturas recuperadas por animal
foram semelhantes entre os grupos (P>0,05). Contudo, no grupo P4 houve tendência (P
= 0,08) a um maior número de estruturas viáveis por ovelha, seguida pelo tratamento com
MAP e controle. A taxa de viabilidade de embriões oriundos do grupo P4 foi maior
quando comparado a embriões obtidos do grupo controle (71,9% vs. 24,5%; P = 0,01),
mas foi similar quando comparado ao grupo MAP (49,9%; P = 0,2). Em relação à
expressão gênica dos embriões, o tratamento com P4 e MAP resultou em um maior
número de transcritos de TGFB1 (envolvido na proliferação e diferenciação celular) em
relação ao grupo controle (P<0,05). No experimento 2, o efeito do estímulo com macho
durante a SOV foi avaliado sobre o desenvolvimento folicular, taxa ovulatória e produção
de embriões. O número de corpos lúteos, folículos anovulatórios, estruturas recuperadas,
embriões viáveis bem como estruturas degeneradas e não fertilizadas foram semelhantes
(P>0,05) entre os grupos. No entanto, o grupo macho (ME) tendeu a ter maior taxa de
viabilidade comparada ao controle (CON) (73,8 ± 12,4 vs. 36,7 ± 13,0%; P = 0,051). Os
diâmetros dos dois maiores folículos do grupo ME tiveram valores mais altos em relação
ao CON (P<0,0001 e P = 0,002, respectivamente). Em conclusão, a utilização da P4
durante a SOV tende a ter uma maior taxa de viabilidade. Quando o efeito macho é
acrescentado, notam-se os aumentos dos diâmetros dos dois folículos maiores,
melhorando a taxa de viabilidade dos embriões produzidos.
Palavras-chave: Expressão gênica, multiplas ovulações, produção de embrião, protocolo
Dia 0.
 Abstract
The in vivo embryo production industry has moved livestock on an international
scale. However, we can classify the superovulation (SOV) process as a key step,
because there is a high variability of responses. Obtaining SOV protocols with
efficient responses is something that intrigues scientists. In this context, the
objective was to study different sources of progestogens and the male effect during
SOV on the production and quality of ewes embryos. The first experiment
compared two sources of progestogen (MPA or P4) during SOV after the “Day 0”
protocol. The follicular population and the amount of corpora lutea (CL) did not
differ between treatments (P>0.05). Regarding embryo recovery, the structures
recovered per animal were similar between groups (P>0.05). However, in the P4
group there was a trend (P = 0.08) to a greater number of viable structures per
ewe, followed by treatment with MPA and control. The rate of viability of
embryos from the P4 group was higher when compared to embryos obtained from
the control group (71.9%; 24.5%; respectively; P = 0.01), but it was similar when
compared to the MPA group (49.9% %; P = 0.2). Regarding the gene expression
of embryos, treatment with P4 and MPA resulted in a greater number of TGFB1
transcripts (involved in cell proliferation and differentiation) compared to the
control group (P<0.05). Experiment 2 evaluated the effect of male stimulation
during SOV on follicular development, ovulatory rate and embryos yield. The
number of corpora lutea, anovulatory follicles, recovered structures, viable
embryos, as well as degenerated and unfertilized structures were similar (P>0.05)
between groups. However, the male group (ME) tended to have a higher viability
rate compared to the control (CON; 73.8 ± 12.4 and 36.7 ± 13.0% respectively; P
= 0.051). The diameters of the largest and second largest follicles in the ME group
had higher values in relation to the CON (P<0.0001 and P = 0.002 respectively).
In conclusion, using P4 during SOV tends to have a higher viability rate. When
male effect is added, it increases in the diameters of the first and second largest
follicles improving the viability rate of the produced embryos.
Keywords: Gene expression, multiple ovulations, embryo production, Day 0
protocol.
 SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 ........................................................................................................ 1

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 2

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .................................................................... 4

2.1. Fisiologia da reprodução ovina e dinâmica folicular ..................................... 4

2.2. Protocolos de sincronização do estro para MOTE......................................... 5

2.3. Protocolos de superovulação ......................................................................... 6

2.4. Progestágenos exógenos ................................................................................ 9

2.4.1. CIDR® .......................................................................................................10

2.4.2. Acetato de medroxiprogesterona (MAP) .................................................. 11

2.5. Efeito macho ................................................................................................ 12

2.6. Qualidade do embrião .................................................................................. 13

2.6.1. Expressão gênica....................................................................................... 13

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 15

CAPÍTULO 2 ...................................................................................................... 27

ABSTRACT........................................................................................................ 28

1. Introduction..................................................................................................... 29

2. Materials and methods .................................................................................... 30

2.1. Experimental location, animals, and study design ....................................... 31

2.2. Follicular population .................................................................................... 32

2.3. Corpora lutea count and embryo recovery ................................................... 32

2.4. RNA extraction, reverse transcription, and quantitative RT-qPCR

amplification ...................................................................................................................32

2.5. Calculations and statistical analysis ............................................................. 34

3. Results............................................................................................................. 34

3.1. Effect of progestogens on the follicular population during SOV ................ 34

3.2. Effect of progestogen treatments in the superovulatory response ............... 34

3.3. Effect of progestogens on the gene expression profile ................................ 35

 4. Discussion ....................................................................................................... 35

5. Conclusions..................................................................................................... 36

Reference ............................................................................................................ 37

CAPÍTULO 3 ...................................................................................................... 49

Biostimulation with the ram effect increases the follicle recruitment, ovulatory
diameter, and embryo viability rate in superovulated ewes ........................................... 50

ABSTRACT........................................................................................................ 50

1. Introduction..................................................................................................... 51

2. Material and methods...................................................................................... 53

2.1. Experimental location, animals, and study design ....................................... 53

2.2. Ultrasonic evaluation ................................................................................... 55

2.3. Hormonal treatments for cervical dilation and embryo collection .............. 56

2.5. Blood collection and progesterone quantification ....................................... 56

2.6. Statistical analysis ........................................................................................ 57

3. Results............................................................................................................. 58

3.1. Follicular population .................................................................................... 58

3.3. Serum progesterone concentrations ............................................................. 59

4. Discussion ....................................................................................................... 59

References........................................................................................................... 62

3. CONSIDERAÇÕES FINAIS..........................................................................72
 Lista de Figuras

Capítulo II
Figure 1. Schematic representation of the experimental design. Experimental
groups: CON – superovulated ewes without any exogenous progestogens; TP4 – use of
an intravaginal device containing P4 during superovulation with FSH; TMPA – use of an
intravaginal sponge containing progestin (medroxyprogesterone acetate; MPA) during
superovulation with FSH. . ............................................................................................ 46
Figure 2. Follicular population of the different experimental groups throughout a
superovulatory treatment. Number of A) small (< 3 mm), B) medium (3-5 mm), and C)
large (> 5 mm) follicles throughout a superovulatory treatment, from the Day 0 protocol
in sheep. The moments of FSH, GnRH, and PGF2α administration are indicated with
arrows. Ewes were treated with an intravaginal sponge containing medroxyprogesterone
acetate (grey bars) or an intravaginal implant containing P4 (white bars), or were given
no exogenous progestogens (black bars). The follicular population was assessed by
transrectal B-mode ultrasonography (US) every 12 h, from the first FSH dose until 36 h
after the GnRH administration (M1 to M10). Different letters: P < 0.05 regardless of the
treatment ....................................................................................................................... ..47
Figure 3. Expression of embryonic competence markers in in vivo-produced
blastocysts. Genes associated with pluripotency (octamer-binding transcription factor 4
– OCT4 and Homeobox protein – NANOG), cell growth, proliferation, and differentiation
(transforming growth factor beta 1 – TGFB1), apoptosis (B-cell lymphoma protein 2 –
BCL2 and BCL2 associated X protein – BAX), mitochondrial activity (Nuclear
respiratory factor 1 – NRF1), and trophectoderm differentiation (Caudal Type Homeobox
2 – CDX2) were evaluated in grade I and II blastocysts. CON – ewes superovulated
without exogenous progestogen (black bars); TMPA – ewes with a medroxyprogesterone
acetate sponge during superovulation (white bars); TP4 – ewes with a progestogen (P4)
implant during superovulation (grey bars). Different letters differ statistically (P <
0.05).................................................................................................................................48

Capítulo III
Figure 1. Experimental procedures and treatments, including hormonal
administration, period of ram stimulation, ultrasonic evaluation, and embryo recovery;
MPA: medroxyprogesterone acetate; CIDR: progesterone device; eCG: equine Chorionic
Gonadotropin; FSH: follicle stimulating hormone; AI: artificial insemination;
Experimental groups: GCON – superovulated ewes which remained isolated from rams;
GRE – superovulated ewes where there was placement of rams with ewes during the latter
part of the period when the hormonal treatment regimen was imposed. ........................ 69
Figure 2. Number of A) small (<3 mm), B) medium (3–5 mm), and C) large (>5
mm) follicles throughout the period when the hormonal treatment regimen was imposed,
based on the “Day 0” protocol in superovulated ewes where there was placement of rams
with ewes (GRE; black bars) and superovulated ewes which remained isolated from rams
(GCON; white bars). The timing of FSH, GnRH, and cloprostenol administration is
indicated with arrows. Different capital letters indicate differences over time (P<0.05).
Different lower-case letters indicate differences between groups at the same time point
(P<0.05). ........................................................... ..............................................................70
 LISTA DE TABELAS

Capítulo II
Table 1. The sequence of the specific primers used in the RT-qPCR for the gene
expression evaluation of in vivo-derived embryos in sheep ........................................... 44
Table 2. Superovulatory response and embryo production from Santa Inês
ewes................................................................................................................................45

Capítulo III
Table 1. Ultrasonographic outcomes from Santa Inês ewes in which there was
superovulation with FSH (133 mg in six decreasing doses) after “Day 0” protocol, when
there was or was not placement of rams with ewes during the superovulatory treatment
regimen. The data are expressed as LSmeans ± SEM. ................................................... 67
Table 2. Ovarian response and embryo production in Santa Inês ewes treated to
super-stimulate ovarian follicular development with FSH (133 mg in six decreasing
doses), where there was or was not placement of rams with ewes (GRE and GCON,
respectively) during the period when the treatment regimen was imposed to super-
stimulate follicular development in ewes that were subjected to non-surgical embryo
recovery .......................................................................................................................... 68
 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

% por cento
< menor
= igual
> maior
± mais ou menos
≥ maior ou igual à
® marca registrada
ºC graus Celsius
µg micrograma
µl microlitro
ATP Adenosina trifosfato
BAX Apoptosis regulator BAX (Regulador de apoptose BAX)
BCL2 B-cell lymphoma protein 2 (Proteína 2 do linfoma de células B)
Be blastocisto eclodido
Bi blastocisto inicial
Bl blastocisto
Bn blastocisto em eclosão
BPM-15 Bone morphogenetic protein 15 (Proteína morfogenética óssea 15)
Bx blastocisto expandido
CDX2 Type Homeobox 2 (Proteína homeobox caudal tipo 2)
CL corpo lúteo
COC complexo cumulus-oócitos
DNA ácido desoxirribonucleico
E2 estradiol
eCG gonadotrofina coriônica equina
EPV espaço perivitelino
FGA acetato de fluorogestona
FSH hormônio folículo estimulante
FSHr receptor do hormônio folículo estimulante
GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase” (Gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase)
GDF9 Growth differentiation factor 9” (Fator 9 de diferenciação de crescimento)
GnRH hormônio liberador de gonadotrofina
h horas
hCG gonadotrofina coriônica humana
IATF inseminação artificial em tempo fixo
IETS Sociedade Internacional de Transferência de Embriões
IFNT interferon tau
LH hormônio luteinizante
LHr receptor do hormônio luteinizante
MAP acetato de medroxiprogesterona
Mc mórula compacta
MCL-1 Proteína de diferenciação celular de leucemia mielóide
mg miligrama
Mi mórula inicial
Min minutos
MOTE múltipla ovulação e transferência de embrião
mRNA ácido ribonucleico mensageiro
mtDNA ácido desoxirribonucleico mitocondrial
NANOG Homeobox protein NANOG (Proteína Homeobox NANOG)
NRF1 Nuclear respiratory factor 1” (Fator respiratório nuclear 1)
OCT4 Octamer-binding transcription factor 4 (Fator de transcrição de ligação a
octâmero 4)
oFSH hormônio folículo estimulante de origem ovina
P4 progesterona
PCR reação em cadeia da polimerase
pFSH hormônio folículo estimulante de origem suína
PGF2α prostaglandina F2 alfa
qRT-PCR Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (Reação em
cadeia da polimerase via transcriptase reversa quantitativa)
RELN reelin (reelina)
RNA ácido ribonucléico
ROS espécie reativa de oxigênio
RPCL regressão prematura de corpo lúteo
SOV superovulação
TFAM Fator Mitocondrial de Transcrição A
TGF-β1 O fator de crescimento transformador beta 1
YWHAZ proteína 14-3-3 zeta
ZAR 1 Proteina do zigoto 1
α alfa
β beta
CAPÍTULO 1

Fundamentação teórica

1
 1. INTRODUÇÃO

A múltipla ovulação e transferência de embrião (MOTE) tem como objetivo

acelerar o ganho genético a aumentar a propagação de animais geneticamente superiores.
Está biotécnica consiste em uma sucessão de etapas, as quais podem ser afetadas por
diversos fatores, como, dose de gonadotrofina, concentração sérica de progesterona
durante o tratamento, status ovariano no início da estimulação, repetibilidade, o que
resulta em uma alta variabilidade de respostas (BARTLEWSKI et al., 2009;
MENCHACA et al., 2009; BARTLEWSKI et al., 2016; MACIEL et al., 2019)
A variabilidade na produção e qualidade dos embriões produzidos in vivo, tem
sido atribuída principalmente ao meio endócrino, em especial às baixas concentrações de
progesterona durante o tratamento de SOV. Cuadro et al. (2018) observaram que o uso
de um dispositivo intravaginal contendo progesterona (P4) durante as administrações de
FSH aumenta a taxa de fertilização e o número de embriões viáveis. Embora a
administração de progestágenos durante o protocolo pareça melhorar a resposta, as
informações ainda são escassas. Menchaca et al. (2018) demonstraram que maiores
concentrações circulantes de progesterona durante o período de crescimento folicular pré-
ovulatório aumentam a competência ao desenvolvimento de complexos cumulus oócitos
(COC) para a produção in vitro de embriões. Além disso, o tratamento com progestágeno
também aumentou os níveis de transcrição de genes associados à esteroidogênese e
competência oocitária em COC (BRAGANÇA et al., 2020). Aparentemente, o aumento
da competência ao desenvolvimento in vitro observado por Menchaca et al. (2018) está
associado a um aumento na atividade esteroidogênica durante o crescimento folicular e o
acúmulo de transcritos relacionados à competência ao desenvolvimento. Portanto,
testamos a hipótese de que a molécula de progestágeno (Acetato de medroxiprogesterona
- MPA ou progesterona - P4) promove diferentes efeitos na população folicular, na
produção e qualidade embrionárias e no perfil de expressão gênica dos embriões.
Nessa linha de raciocínio para otimizar a MOTE, notamos que, o efeito macho
durante a superovulação não havia sido estudado. Isso porque, sabe-se que, a
bioestimulação com macho, associado a protocolos de sincronização de estro, aumentam
o número de animais responsivos ao tratamento hormonal. A introdução de um reprodutor
sexualmente maduro junto às fêmeas é capaz de estimular o eixo hipotálamico–
hipofisário–gônodal, o que resulta no aumento de pulsos de GnRH seguido do aumento
dos níveis basais e da frequência de pulsos de LH, acarretando na ovulação

2
(DELGADILLO et al., 2009). Dessa forma, hipotetizamos que o efeito macho durante a
SOV incrementa as taxas ovulatórias e diminui o número de folículos anovulatórios,
estimulado pelo aumento das concentrações de LH.

3
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1.Fisiologia da reprodução ovina e dinâmica folicular

Os ovinos são animais poliéstricos estacionais de dias curtos, com manifestação

e/ou intensificação dos fenômenos reprodutivos pelo aumento do estímulo a liberação de
melatonina. O ciclo estral é dividido em três fases: fase de anestro, fase reprodutiva e a
fase de transição. A fase de anestro no hemisfério sul, ocorre entre os meses de julho a
novembro, quando é observada a ausência de manifestação de estros em ovelhas. A fase
reprodutiva ocorre entre os meses de fevereiro a junho, por se tratar de uma espécie
sazonal. Já a fase de transição ocorre nos meses de dezembro a janeiro. No entanto, fatores
como raça, clima, genética, manejo nutricional, manejo dos animais e estágio de lactação
podem influenciar no período e na duração de cada fase (BALARO et al., 2014).
O ciclo estral dos ovinos dura em torno de 17 dias, podendo ocorrer de três a
quatro ondas de crescimento folicular. Em cada onda ocorre um aumento transitório das
concentrações circulantes de FSH coordenado pela progesterona (SOUZA, 2013). A fase
estral propriamente dita dura de 24-36 h, podendo ser mais curto no início e final da fase
reprodutiva, bem como, na presença do macho e em fêmeas jovens. De forma geral, de
um a quatro folículos podem atingir o diâmetro ovulatório (FONSECA, 2006), sendo que
as ovulações ocorrem de forma espontânea normalmente entre 24 – 27 h do início do
estro podendo ser única ou múltipla. A fase luteal e folicular duram em torno de 13 e 4
dias, respectivamente, dentro do ciclo estral (FONSECA et al, 2014).
A dinâmica folicular baseia-se em acompanhar o desenvolvimento dos folículos
desde a emergência de pequenos folículos antrais até a possível ovulação a partir da
formação do folículo pré-ovulatorio (onda ovulatória) ou, a ocorrência da atresia folicular
(regressão dos folículos) (ZIEBA et al., 2002). Todo processo é controlado por
mecanismos neuroendócrinos e dependem do intercâmbio ordenado do sistema nervoso
central por ação do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH), que irá estimular a
hipófise a secretar hormônio luteinizante (LH) e hormônio folículo estimulante (FSH).
Esses hormônios serão responsáveis pelo recrutamento e maturação folicular, produção
de esteróides, ovulação e luteogênese (CHEMINEAU et al., 2008; GOMES et al., 2012).
Cada onda de crescimento folicular é caracterizada pelas fases de recrutamento, seleção
e dominância (BINELLI et al., 2006). Para cada nova onda, ocorre um aumento das

4
concentrações de FSH e assim, de um a três folículos manterão o crescimento enquanto
os outros entram em atresia após a divergência folicular (MENCHACA et al., 2010).
O FSH apresenta uma função primordial na formação do antro folicular, estimula
a mitose das células da granulosa e a formação do fluido folicular. Com o
desenvolvimento das células da granulosa ocorre o aumento dos receptores para LH e da
atividade da aromatase. Tal fenômeno prepara as células da granulosa para a luteinização
após um pico de LH. Vale mencionar que a atividade estereidogênica é dependente da
ação de FSH e LH nas células da granulosa e da teca, respectivamente (HAFEZ; HAFEZ,
2004).
A secreção pulsátil de FSH nas ovelhas ocorre aproximadamente a cada seis dias,
o que resulta em três pulsos originando três ondas de crescimento. O hormônio ativina
junto com o FSH estimula a maturação dos oócitos e os capacita para o desenvolvimento.
Já a folistatina atua na inibição de FSH e na inativação da ativina, tornando-se um
importante modulador da secreção de FSH (GOMES et al., 2012).
A dominância folicular é o processo pelo qual o folículo selecionado exerce
dominância sobre os demais folículos recrutados, suprimindo o crescimento dos mesmos
e inibindo o recrutamento de uma nova onda em ambos ovários. Este folículo dominante
desempenha um papel ativo na supressão do crescimento dos subordinados, pois a
secreção de estradiol e inibina funcionam como retroalimentação negativa sobre a
hipófise, inibindo a secreção de FSH. O folículo então passa a ser dependente do LH e
não mais de FSH, devido a maior expressão de receptores de LH nas células da granulosa
(MENCHACA et al., 2010).

2.2.Protocolos de sincronização do estro para MOTE

A utilização prolongada de progestágenos durante as SOV não garante a sincronia

satisfatória da atividade ovariana além de interferir no padrão de recrutamento folicular
dependendo do momento da inserção do dispositivo (OLIVEIRA et al., 2016). À vista
disto, a sincronização do ciclo estral aperfeiçoa os protocolos de SOV e colheita de
embriões quando iniciado junto com a nova onda folicular (FONSECA, 2006).
Com intuito de diminuir a falta de sincronia e a presença de folículos grandes no
início da SOV, Menchaca et al. (2009) propuseram um protocolo curto de sincronização
de estro antes do início da SOV. O protocolo baseava-se na manutenção por cinco a sete
dias de um progestágeno associado ao eCG (fonte de gonadotrofina). No momento da

5
retirada da fonte de progestágeno foi associada uma aplicação de prostaglandina F2α
(PGF2α) e 36 h após uma aplicação de GnRH. Deste modo, a ovulação foi sincrônica em
90% dos animais até 72 h após a retirada do progestágeno. Assim, o melhor momento
para o início da SOV foi definido, com o aumento da média de embriões por animal
superovulado. Além disso, a aplicação de GnRH aprimorou as condições ovarianas para
o protocolo de SOV e induziu a ovulação da maioria dos animais (TEIXEIRA et al.,
2016).
Um estudo realizado utilizando a lecirelina como fonte de gonadotrofina também
demonstrou eficiência na taxa de ovulação, sugerindo o período de 80 h após a remoção
da fonte de progestágeno para o início dos protocolos de SOV em doadoras da raça Santa
Inês (BALARO et al., 2016). Em outro estudo foi demonstrado que o uso de implantes
de progesterona associados à agonistas de PGF2α foi suficiente para a sincronização da
emergência folicular em ovelhas da raça Santa Inês sem a necessidade de adição de
análogos de GnRH, todavia, houve efeito negativo sobre a taxa de recuperação
embrionária (SOUZA-FABJAN et al., 2017).
Notou-se que protocolos de sincronização de estro com nove dias apresentaram
maior taxa de ovulação e produção de embrião quando comparados aos protocolos de seis
dias (FIGUEIRA et al., 2020). Contudo, a proposta de tratamentos curtos tem como
intuito controlar a resposta folicular e a ovulação em um menor período, apresentar taxas
de fertilização aceitáveis e, em alguns casos, possibilitar a reutilização dos dispositivos
intravaginais de progesterona.

2.3.Protocolos de superovulação

O programa de múltipla ovulação e transferência de embrião, também conhecida

como produção in vivo de embriões, baseia-se na sincronização do estro seguido da
superovulação das doadoras, fertilização, colheita dos embriões e inovulação nas
receptoras. Porém são observados alguns entraves como: a fase do ciclo estral no início
do protocolo, concentração de progesterona durante a SOV, falha do pico de LH após
tratamento com gonadotrofinas, falha na repetibilidade da técnica, entre outros
(OLIVEIRA, 2011; CUADRO et al., 2018; PINTO et al., 2020). Com isso, para obter-se
sucesso na MOTE, é necessária a execução bem-sucedida de todas as etapas envolvidas.
A MOTE é indicada aos produtores com intuito de aumentar o plantel; realizar
melhoramento genético, zootécnico e sanitário; e garantir a conservação do germoplasma

6
dos animais (COGNIÉ et al., 2003). Assim com a utilização desta técnica ocorre um
aumento na pressão de seleção da fêmea doadora e redução do intervalo entre gerações,
podendo-se utilizar fêmeas jovens (FONSECA et al, 2014).
Podemos destacar o processo de superovulação e o método de coleta de embriões
como etapas-chave (GOMES et al., 2014). Além disso, alguns fatores intrínsecos como
raça, idade e quantidade de coletas realizadas bem como alguns fatores extrínsecos a
exemplo da estação do ano e alimentação dos animais podem influenciar a estimulação
ovariana e o procedimento de coleta, resultando em uma alta variabilidade de respostas
(GONŹALEZ-BULNES et al., 2004; CORREIA et al., 2017; PINTO et al., 2017;
BERGSTEIN‐GALAN et al., 2019).
Os protocolos de SOV, são baseados no bloqueio da dinâmica folicular com
progesterona e na aplicação de altas doses de gonadotrofinas exógenas, dentre as quais se
destaca o hormônio folículo estimulante (FSH) de origem ovina (oFSH) ou suína (pFSH),
podendo-se utilizar a gonadotrofina coriônica equina (eCG) e a gonadotrofina coriônica
humana (hCG), embora seu uso esteja sendo reduzido. (OLIVEIRA, 2011).
A eCG foi amplamente utilizada para SOV, entretanto, esta gonadotrofina
apresenta uma meia-vida longa, o que acarreta alta incidência de folículos anovulatórios
e consequentemente altas concentrações de estradiol, que está correlacionado com a
menor taxa de recuperação embrionária e maior incidência de regressão prematura de
corpo lúteo (RPCL; AZAWI et al., 2010). Segundo Evans e Armstrong (1984), altas
concentrações de estrógeno alteram o transporte de gametas no trato reprodutivo levando
a diminuição da recuperação embrionária.
Outro fator, está relacionado à produção de anticorpos anti-eCG, observado em
fêmeas que receberam sucessivas aplicações. Com esses anticorpos circulantes, ocorre
inibição da ação da gonadotrofina, atraso ou ausência da ovulação, o que pode afetar a
fertilidade dos animais (FONSECA et al, 2014).
Atualmente, uma alternativa ao uso da eCG, são múltiplas aplicações de FSH seja
de origem suína, ovina ou caprina sendo a gonadotrofina de escolha para SOV em ovinos.
A utilização desta gonadotrofina (FSH), apresenta melhores taxas de ovulação, menor
incidência de folículos anovulatórios e uma resposta individual mais uniforme ao
protocolo (BARTLEWSKI et al., 2016). Porém o uso deste hormônio gera a necessidade
de intensificação do manejo, pois apresenta uma meia-vida de 10 h, o que leva a
necessidade do uso fracionado em múltiplas doses (6 a 8) e consecutivas aplicações
durante o protocolo de SOV (DEMOUSTIER et al., 1988).

7
 Não existe um consenso na dose total de FSH a ser utilizado durante o protocolo
de SOV. Gibbons et al. (2010) compararam o uso de duas doses de FSH (80 mg ou 200
mg) para superovular ovelhas Merino e, não encontraram diferença no número de
embriões recuperados grau I e II, mesmo com a menor taxa de ovulação em animais que
receberam a dose de 80 mg. Em ovelhas Santa Inês, o número de ovulações e de folículos
anovulatórios não variou entre as ovelhas que receberam 100, 133 ou 200 mg de FSH,
diferentemente do que foi observado no estudo citado anteriormente, a menor dose
resultou na melhor taxa de ovulação (MACIEL et al., 2016)
Segundo Maciel et al. (2016) a aplicação de doses de 100 mg de FSH resulta em
melhores taxas de ovulação e menor percentual de falhas anovulatórias. Recomenda-se
que o início da aplicação de FSH ocorra 48 h após a retirada da fonte de progestágeno e
que seja mantida a aplicação em doses decrescentes por dois a quatro dias (FONSECA et
al, 2014).
Em um estudo que avaliou a utilização de FSH em protocolos sucessivos foi
possível observar um aumento da população de folículos médios e grandes. Porém o uso
sucessivo de protocolos de SOV em ovelhas promoveu uma tendência à menores taxas
de ovulação, o que pode estar associado à uma diminuição das concentrações de LH por
esgotamento. Esses achados justificam o aumento dos cistos ovarianos com a aplicação
dos protocolos. Para minimizar a queda nas taxas de ovulação, foi abordada a estratégia
de alternar um ciclo estral fisiológico e a aplicação de eCG em protocolos de SOV, esse
procedimento resultou em benefícios na viabilidade de tais protocolos (PINTO et al.,
2020).
A eficácia de determinadas doses de FSH foi avaliada em outro estudo, no qual
foi demonstrado que o uso de 100 mg ou 200 mg são eficientes em protocolos de SOV.
Porém, a resposta ovulatória e a qualidade embrionária foram afetadas com o uso da
menor dose (100 mg). Isto foi constatado através do aumento de células embrionárias
apoptóticas (MACIEL et al., 2019).
Outro grande entrave dentro da SOV é a regressão prematura de corpo lúteo
(RPCL) em pequenos ruminantes. Esses corpos lúteos regredem no período que antecede
a colheita dos embriões (entre o 4º e 5º dia pós-ovulação). Normalmente, a luteólise
ocorre entre o 5º e 6º dia pós-ovulação (CORREIA et al., 2017). Nesse sentido, a
regressão luteal está associada a elevadas concentrações plasmáticas de estrógeno durante
a fase luteal inicial, que promove um decréscimo na resposta aos protocolos de SOV
(FONSECA, 2006).

8
 Algumas estratégias têm sido estudadas para redução do processo de RPCL, como
o uso de drogas tais como o flunixin meglumine, um antiinflamatório não esteroidal. Este
medicamento induziu o decréscimo na pulsatilidade de PGF2α evitando ou reduzindo a
ocorrência da RPCL (AKÉ-LOPEZ et al., 2005). Além disso, a administração de agentes
luteotrópicos como o hCG ou o GnRH é uma alternativa para evitar a RPCL. Essas
estratégias podem impulsionar o aumento da recuperação de embriões viáveis
(FONSECA et al., 2014; RODRIGUEZ et al., 2015).

2.4.Progestágenos exógenos

Os protocolos de sincronização de estro tornaram-se base para os processos de

SOV, porém tem-se atribuído aos progestágenos os efeitos negativos relacionados ao
número de ovulações e qualidade do embrião transferido. Protocolos longos, com duração
de 12 a 14 dias, levam a concentrações subluteais nos últimos dias do processo, alterando
o padrão de crescimento e persistência folicular, interferindo no processo de fecundação
e desenvolvimento de embriões viáveis (FONSECA et al, 2014).
Assim, foi demonstrado que protocolos curtos, com duração de cinco a sete dias,
são suficientes para sincronizar a emergência da onda folicular (MENCHACA;
RUBIANES, 2004). Nesses casos, recomenda-se a aplicação de PGF2α para garantir a
luteólise, pois, a duração do tratamento é menor que a fase luteal do ciclo estral natural.
Em um estudo foi constatado que as aplicações de PGF2α no momento da inserção da
fonte de progestágeno, resultaram na antecipação do estro após a retirada do dispositivo
intravaginal em comparação a aplicação de PGF2α simultânea a retirada do dispositivo
intravaginal (MARTEMUCCI; D’ALESSANDRO, 2011). Em cordeiras observou-se
maior intervalo para o início do estro em comparação a fêmeas multíparas quando foi
utilizado protocolo de curta duração e o efeito macho durante o período de anestro sazonal
(UNGERFELD, 2016).
A utilização dos progestágenos tem como princípio gerar um aumento repentino
na concentração sérica de P4 e, assim, ativar o eixo hipotálamico-hipofisário-gonadal a
regredir os folículos presentes e recrutar novos (SOUZA, 2013). Verificou-se que o uso
de progestágenos em curto prazo não afeta a população folicular e melhora
significativamente a qualidade do oócito e o desenvolvimento embrionário. Esses
achados foram associados a uma melhor morfologia dos COCs (MENCHACA et al.,
2018). Em outro estudo foi constatado um aumento no número de ovulações, na taxa de

9
fertilização e de recuperação embrionária, além do aumento na recuperação de embriões
viáveis, quando as ovelhas foram suplementadas com progesterona durante a fase de
superestimulação com FSH. Esses achados demonstram a importância da progesterona
durante a fase pré-ovulatória tendo uma função expressiva na competência oocitária
(CUADRO et al., 2018).
Como fontes de progestágeno podem ser utilizados os dispositivos intravaginais
de liberação lenta de P4 - CIDR® (Controlled Internal Drug Release – Dispositivo interno
de liberação controlada de droga), implantes auriculares, esponjas intravaginais com
acetato de fluorogestona (FGA) ou acetato de medroxiprogesterona (MAP) (SOUZA,
2013). Bartlewski et al. (2015) demonstraram uma queda na taxa de recuperação
embrionária nas ovelhas que receberam CIDR quando comparada ao MAP.
Com isso, informações sobre o tipo de dispositivo, a via de administração, a
farmacocinética, o metabolismo do composto ativo e a quantidade de hormônio contido
e liberado pelo dispositivo são necessárias para avaliar o período de exposição ao
progestágeno de escolha e o efeito na fertilidade da fêmea (MENCHACA et al., 2017)

2.4.1. CIDR®
O CIDR® é um dispositivo intravaginal de silicone com liberação lenta de
progesterona análoga a P4 endógena, porém apresenta um custo mais alto quando
comparado aos outros dispositivos utilizados (FONSECA et al., 2014). A vantagem na
utilização deste dispositivo é o fornecimento de concentrações de P4 imediata pela
dispersão homogênea das partículas sólidas desse hormônio. Além disso, fornece bem-
estar animal permitindo drenagem de secreções vaginais, diminuindo assim, possíveis
infecções. As concentrações de P4 obtidas com o uso do CIDR visam diminuir o suporte
de LH e, promover a renovação folicular por meio do recrutamento de novos folículos,
até atingirem o estágio pré-ovulatório, de cinco a sete dias após a inserção do dispositivo
(GONZALEZ-BULNES et al., 2020).
Dispositivos intravaginais provenientes de protocolos anteriores, têm uma
tendência de induzirem folículos pré-ovulatórios persistentes (SOUZA, 2013). Não sendo
indicada a reutilização de dispositivos oriundos de protocolos anteriores de doze dias ou
mais, pois não são considerados economicamente viáveis (SWELUM et al., 2018).
Santos-Neto et al. (2015) comparando três diferentes dispositivos intravaginais
quanto à taxa de prenhez após IATF cervical ou intrauterina com sêmen fresco, realizadas
48 ou 54 h após a remoção dos dispositivos intravaginais, respectivamente, observaram

10
melhores taxas nas fêmeas tratadas com dispositivos intravaginais de silicone (CIDR) em
comparação aos animais que receberam esponjas intravaginais com acetato de
medroxiprogesterona (MAP).
Em outro estudo observou-se que o uso de CIDR, acetato de fluorogestona (FGA)
ou MAP, em protocolos de seis dias, é igualmente eficaz para a indução de estro em
ovelhas no período de anestro (YU, 2019). Bartlewski et al. (2015) compararam o uso do
MAP e CIDR em protocolos de seis dias em ovelhas e constataram que apesar de não
haver diferença entre a resposta ovulatória e a produção de embrião entre os grupos,
houve uma redução do tamanho máximo dos folículos, após injeção de E2 no grupo
CIDR. Além disso, os folículos antrais foram significativamente menores.

2.4.2. Acetato de medroxiprogesterona (MAP)

O MAP é uma molécula com ação biológica semelhante a progesterona,
frequentemente encontrada nas esponjas intravaginais, é amplamente utilizado na rotina
reprodutiva de pequenos ruminantes em razão do baixo custo e praticidade. É
recomendado o uso do MAP em protocolos que variam de cinco a 14 dias para uma
sincronização de estro mais eficiente e, a associação de luteolíticos, em especial, no
período de transição do anestro para fase reprodutiva (CASTILHO et al., 2013). Outros
autores demonstraram que o uso de MAP por seis dias foi tão eficaz quanto o protocolo
com 14 dias para indução de estro em ovelhas em anestro, a eficácia de ambos os
protocolos foi comprovada com taxas de gestação semelhantes entre os grupos
(UNGERFELD; RUBIANES, 2002).
Já, em ovelhas em lactação, notou-se que o protocolo hormonal curto de seis dias
é mais eficiente, por contribuir para a quebra do bloqueio do anestro pós-parto e do efeito
de fotoperíodo, tornando-se uma alternativa para a produção intensiva de cordeiros sem
a necessidade do desmame precoce (FARIAS, 2016). Embora esses achados sejam
promissores, a utilização de esponjas impregnadas ou não com hormônios ou seus
análogos prejudica a fertilidade dos animais. Isso pôde ser demonstrado através de um
estudo que testou a utilização de esponjas intravaginais placebo mantidas por 13 dias.
Como resultado, houve uma redução da taxa de concepção, ou seja, um efeito negativo
na fertilidade (MANES et al., 2014).
A utilização do MAP mostrou-se mais eficiente quando comparada a aplicação
intramuscular de P4, a qual não foi capaz de induzir nem sincronizar o cio, resultando em
um baixo percentual de partos no grupo tratado com P4 intramuscular (BRETANHA et

11
al., 2019). Outro fator a ser considerado são as doses de MAP contidas nas esponjas. O
uso de baixas doses de MAP, como 40 mg, ou metade de um dispositivo intravaginal de
60 mg, quando comparada a tradicionalmente utilizada (60 mg), foi eficaz na
sincronização do cio em ovelhas Merino fora da estação de monta, induzindo estro dentro
de 36 – 48 h após a retirada da esponja (GREYLING et al., 1994; YU et al., 2019). Isso
porque, a diferença na quantidade de progestágeno presente nos dispositivos intravaginais
(40, 50 ou 60 mg) não altera os níveis absorvidos de MAP (SIMONETTI et al., 2000).
Já em protocolos de estimulação ovariana para a produção in vitro de embriões,
Bragança et al. (2020) compararam o uso de MAP, CIDR ou a progesterona endógena
(controle) durante a estimulação ovariana e constataram que, para a estimulação ovariana
a partir do protocolo “Dia 0”, não é necessário o incremento de progesterona, isso porque,
os folículos aspirados, oócitos recuperados, taxa de recuperação e grau dos oócito não
diferiram entre os grupos.

2.5.Efeito macho

O efeito macho é utilizado com uma alternativa ao uso de protocolos hormonais

para sincronização do estro, principalmente na fase de transição. Este efeito consiste no
afastamento dos machos do rebanho por 60 dias e o retorno após esse período. Tal
fenômeno também ocorre entre fêmeas cíclicas e fêmeas em anestro, induzindo a
ovulação com retorno da atividade sexual (ORIHUELA et al., 2015). Essa bioestimulação
é um procedimento comumente empregado em estações de acasalamento restritas a
pequenos intervalos, quando se desejam antecipar ou prolongar a estação de monta e em
sistemas de produção situados em baixas latitudes. A interação social do macho com as
femêas, induz um aumento na frequência de pulsos acompanhado por uma diminuição da
amplitude de pulso de LH, o que provoca a ovulação cerca de 50h após o contato incial
(Martin et al.,1986).
Um ponto crucial para o sucesso desta técnica é a intensidade da libido do macho,
a qual se manifesta pelo comportamento de cortejo, refletindo diretamente na taxa de
animais que ovulam após o inicio da exposição (PERKINS et al., 1994). Essa primeira
ovulação induzida após a introdução do carneiro, não é acompanhada do comportamento
de estro e, em alguns animais, o corpo luteo subsequente a esta ovulação, apresenta um
curto tempo de vida (Martin et al.,1986).

12
 Há fortes tendências dos países em diminuir a utilização de hormônios,
reafirmando o benefício da utilização desta biotécnica por ser considerado “verde, ético
e limpo” (SOUZA, 2013). Assim, a bioestimulação quando associada a protocolos de
sincronização de estro, aumentam o número de animais responsivos ao tratamento,
otimizando os protocolos hormonais, isso porque, após a introdução do macho junto às
fêmeas, ocorre à redução da retroalimentação negativa do estradiol no eixo hipotalâmico
hipofisário e o incremento nas concentrações deste hormônio culmina com a luteólise
mais precoce, antecipando o momento do estro (MEILÁN; UNGERFELD, 2014).
Contudo, ainda não foi identificado na literatura relatos de pesquisas que
avaliaram o efeito macho durante os protocolos de superovulação, com o objetivo de
estimular o aumento das concentrações de LH para melhorar as taxas ovulatórias e
consequentemente otimizar a produção de embrião.

2.6.Qualidade do embrião

No momento final de crescimento do folículo, quando ocorre um aumento pré-

ovulatório de LH e a ovulação, o líquido folicular muda suas características de domínio
do E2 para P4 para que as células da granulosa possam luteinizar e formar o CL. Nesse
momento de alterações foliculares ocorre a retomada da meiose e maturação do oócito
através da sinalização intracelular de P4 (LONERGAN; SÁNCHEZ, 2020). A
estimulação excessiva pelo FSH afeta a expressão de genes associados ao crescimento e
proliferação celular, atrasando a diferenciação das células da granulosa, o feedback
positivo ao LH e o processo de formação de folículos dominantes (BRAGANÇA et al.,
2018).

2.6.1. Expressão gênica

A PCR quantitativo em tempo real (q-PCR) é bastante utilizada para análises de
expressão gênica em embriões com o intuito de predizer características relacionadas a
qualidade e competência ao desenvolvimento. Assim, padrões de expressão de alguns
genes e sua correlação com a qualidade embrionária têm sido extensivamente estudados,
permitindo uma melhor diferenciação entre embriões viáveis e não-viáveis (VALLEH et
al., 2014; LONERGAN et al., 2006).
A expressão de determinados genes pode ser utilizada como preditor de alterações
do desenvolvimento embrionário. Os fatores de transcrição importantes para a

13
manutenção da pluripotência (OCT4 e NANOG) são expressos nas células de massa
celular interna que são mediados pela ação do CDX2 expresso nas células
trofectodérmicas. A transcrição do DNA mitocondrial e a replicação no estágio de
blastocisto em ruminantes, são coordenadas pelo NRF1 que quando alteradas
comprometem a proliferação mitocondrial e a homeostase celular. Este
comprometimento afeta a liberação do citocromo C pelas membranas das mitocôndrias
que gerará um desequilíbrio entre os genes anti-apoptótico (BCL-2) e pró-apoptótico
(BAX) desencadeando a morte celular programada (BRAIR et al., 2020).
Alguns genes envolvidos em estresse celular (HSP70, PMSB5) e funções
apoptóticas (BAX, BCL2, CASPASE 3) fornecem uma ideia a respeito do metabolismo
celular e consequentemente a competência ao desenvolvimento embrionário, tornando-
os importantes marcadores moleculares (CÁNEPA et al., 2014; MISHRA et al., 2016).
Em pequenos ruminantes existe uma correlação positiva entre o tamanho do
folículo com um melhor desenvolvimento e qualidade oocitária para a produção in vitro
de embriões (SOUZA-FABJAN et al., 2014). Além disso, a expressão gênica desses
oócitos é modulada pelo tratamento hormonal utilizado. Especificamente a expressão de
marcadores da via esteroidogênica, que é reduzida com o aumento das doses de FSH,
bem como alguns marcadores que refletem na qualidade oócitária (BRAGANÇA et al.,
2018).

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doi.org/10.1016/j.anireprosci.2022.106938
27
Progestogen supplementation during superovulation leads to higher embryo viability and

TGFB1 gene expression in sheep

Augusto Ryonosuke Tairaa*, Ribrio Ivan Tavares Pereira Batistaa, Juliana Dantas
Rodrigues Santosa, Pedro Henrique Nicolau Pintoa, Mario Felipe Alvarez Balaroa,
Caroline Gomes do Espírito Santoa, Viviane Lopes Braira, Joanna Maria Gonçalves
Souza-Fabjana, Rodolfo Ungerfeldb, Jeferson Ferreira da Fonsecac, Felipe Zandonadi
Brandãoa

a
Faculdade de Veterinária, Universidade Federal Fluminense, Av. Vital Brasil Filho, 64,
CEP 24230-340, Niterói, RJ, Brazil
b
Facultad de Veterinaria, Universidad de la República, Lasplaces 1620, Montevideo,
11600, Uruguay
c Embrapa Caprinos e Ovinos, Núcleo Regional Sudeste, Rodovia MG 133, Km 42, CEP
36155-000, Coronel Pacheco, MG, Brazil
*Corresponding author: augusto.vete@gmail.com

ABSTRACT
This study aimed to compare the effect of the administration of either
medroxyprogesterone acetate (MPA) or progesterone (P4) in superovulation (SOV)
treatments applied during the first follicular wave on follicular development, embryo
yield, and the expression of genes related to pluripotency maintenance, differentiation of
the trophectoderm, cell growth and differentiation, apoptosis and energy metabolism in
sheep embryos. The estrous cycle of 36 multiparous ewes was synchronized with a short
protocol, and the animals were randomly allocated to three groups. At the beginning of
SOV, 12 ewes per treatment received an intravaginal sponge impregnated with 60 mg of
MPA (TMPA), or an intravaginal device containing 0.33 g of P4 (TP4), or received no
progestogen treatment (CON). The device was kept until the fifth dose of FSH. Ewes
were mated with five fertile rams. Gene expression was performed by RT-qPCR using
grade I and II blastocysts. The numbers of corpora lutea, total structures and viable
embryos recovered per ewe were similar (P > 0.05) among groups. However, the viability
rate was higher in TP4 (71.9 ± 16.3%) compared to CON (24.4 ± 16.8%; P = 0.01) and
similar to TMPA (49.9 ± 16.3%; P = 0.2). Similarly, when compared with CON,

28
treatment with P4 or MPA positively regulated the TGFB1 transcript involved in cell
proliferation and differentiation (P = 0.01 and P = 0.03, respectively). In conclusion,
supplementation with P4 during the first follicular wave of the estrous cycle improves
embryo viability and alters the expression of the TGFB1 gene.
Keywords: Gene expression; Multiple ovulations; Embryo production; Day 0 protocol;
Progestins; Ewes

1. Introduction
The presence of large follicles at the beginning of an FSH treatment decreases the
ovarian response and, thus, embryo production in small ruminants (Rubianes et al., 1995;
Menchaca et al., 2002). To avoid the presence of a large follicle, Menchaca et al. (2002)
proposed beginning the superovulatory treatment at the onset of the first follicular wave
of the estrous cycle, the so-called “Day 0 protocol”. With this protocol, the administration
of FSH begins immediately after ovulation (Day 0 of the ovulatory cycle), when there are
no large follicles present. Although this treatment has been effectively used for the
production of embryos (in vivo/in vitro) in sheep (Menchaca et al., 2009; Balaro et al.,
2016; Bragança et al., 2020) and goats (Menchaca et al., 2007; Taşdemir et al., 2011;
Mogase et al., 2016), the obtained embryo quality is not as good as expected. This is
mainly explained by the low progesterone (P4) concentrations present during the
treatment and the effects on the characteristics of the growing follicles and oocytes.
According to Cuadro et al. (2018), the administration of P4 by an intravaginal device
during FSH administration increases the fertilization rate, the number of viable embryos,
and the proportion of high-quality embryos.
Little is known, however, about whether the administration of P4 or other
progestogens during the superovulatory “Day 0 protocol” improves the response.
Menchaca et al. (2018) demonstrated that greater circulating progesterone concentrations
during the preovulatory follicular growth period increase the developmental competence
of cumulus-oocyte complexes (COC) for in vitro embryo production. Moreover,
treatment with P4 also increases the transcript levels associated with steroidogenesis
(FSH receptor, LH receptor, and α-estradiol receptor) and oocyte competence (zygote
arrest 1, growth differentiation factor 9, and B-cell lymphoma 2) in sheep COC (Bragança
et al., 2018). Based on this information, it could be hypothesized that the increase in the
in vitro developmental competence observed by Menchaca et al. (2018) is associated with
an increase in the steroidogenic activity during follicular growth and the accumulation of

29
transcripts related to developmental competence. The administration of different
progestogens also modifies the response since the use of P4 provides greater expression
of the transcripts of the reelin protein (RELN; associated with oocyte competence), FSHr,
and LHr than medroxyprogesterone acetate (MPA) (Bragança et al., 2018). This
difference might be explained by the different actions at the cellular level, time of
metabolism, and excretion (Lieberman and Curtis, 2017), although progestins are more
widely used than P4 worldwide due to their availability and cost. While MPA induces
similar effects as P4 by stimulating progesterone receptors, it also binds to other steroid
receptors, including the glucocorticoid, mineralocorticoid, and androgen receptors
(Africander et al., 2013), thus activating several pathways simultaneously. Human studies
suggest that MPA, unlike P4, represses pro-inflammatory cytokine gene expression in
cervical epithelial cells via a mechanism involving the recruitment of the glucocorticoid
receptor to cytokine gene promoters (Govender et al., 2014).
Considering the aforementioned information, it might be predicted that the
progestogen used during superovulatory treatment affects the competence of the in vivo
produced embryo to establish a pregnancy and generate healthy offspring. Therefore, the
hypothesis of this study was that the progestogens administered (both MPA and P4)
during the superovulatory treatment of ewes alter the follicular population, quantitative
and qualitative in vivo embryo production, and gene expression profile in blastocyst
embryos. The study aimed to determine whether the administration of P4 or MPA during
superovulatory treatment affects the response to the “Day 0 protocol” in ewes. The study
also included the comparison of the effects of these hormones on the expression profile
of genes associated with pluripotency (OCT4 and NANOG), cell growth, proliferation,
and differentiation (TGFB1), apoptosis (BCL2 and BAX), mitochondrial activity (NRF1),
and trophectoderm differentiation (CDX2).

2. Materials and methods

This study was approved by the Ethical Committee for Animal Use of the
Universidade Federal Fluminense (#95002404/18), and it was conducted under the ethical
principles of the Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório.

30
2.1. Experimental location, animals, and study design

The research comprised two repetitions, performed in September-October and in

October-November 2019, respectively (spring in the southern hemisphere), at the
Unidade de Pesquisa Experimental em Caprinos e Ovinos (UniPECO) in Cachoeiras de
Macacu (22º27´45´ S), Rio de Janeiro, Brazil. In each repetition, 18 multiparous Santa
Inês ewes, ranging from two to three years old, weighing 37.4 ± 4.6 kg (mean ± SD) and
with a body condition score of 2.8 ± 0.3 (1 to 5 scale), were used. All animals were
healthy, with no reproductive or clinical disorders, remained in a confined system, and
were fed with access to chopped Napier grass (Pennisetum purpureum cv. Cameron) and
200 g/day per animal of concentrate (16% crude protein, soybean, and corn bran). Water
and mineral salt (Ovinofós, Tortuga, São Paulo, Brazil) were provided ad libitum. Estrus
synchronization was performed with intravaginal sponges containing 60 mg
medroxyprogesterone acetate (Progespon, Syntex, Buenos Aires, Argentina) used for 6
days. One day before sponge removal, 300 IU eCG (Novormon 5000 MSD Animal
Health, São Paulo, Brasil) and 0.12 mg cloprostenol sodium (Estron, Agner Unio, São
Paulo, Brazil) were administered intramuscularly, whereas 0.025 mg lecirelin (Gestran
Plus, Tecnopec, São Paulo, Brazil) was administered 36 h after progestogen withdrawal
(Menchaca et al., 2009; Balaro et al., 2016).
The animals were randomly allocated into three experimental groups for the
beginning of the superovulation treatment. The superovulatory protocol started 80 h after
the removal of the sponge (Day 0), with 133 mg FSH (Folltropin-V, Bioniche Animal
Health, Ontario, Canada) divided into six decreasing doses (33.25/33.25, 19.95/19.95,
13.3/13.3 mg) every 12 h (Santos et al., 2020). Along with the first dose of FSH, the
animals received i) an intravaginal sponge containing 60 mg MPA (Progespon, Syntex,
Buenos Aires, Argentina; TMPA = 12) or ii) an intravaginal device containing 0.33 g
progesterone (Eazi-Breed CIDR, Zoetis, São Paulo, Brazil; TP4 = 12); both remained
until the fifth dose of FSH. Twelve ewes whose only source of progesterone was the
physiological P4 produced by the initial corpus luteum (CL) were used as controls (CON
= 12). Regardless of the experimental group, all animals received 0.24 mg of cloprostenol
(Estron, Agner Unio, São Paulo, Brazil) concomitantly with the application of the sixth
dose of FSH, and 12 h later 0.025 mg of lecirelin (Gestran Plus, Tecnopec, São Paulo,
Brazil) was administered intramuscularly (Fig. 1). The ewes were naturally mated with

31
fertile Santa Inês rams, four times with a 12 h interval, starting immediately after the last
dose of FSH.

2.2. Follicular population

All ultrasonography (US) evaluations were performed by the same operator using
a portable device (Sonoscape S6, Sonoscape, Shenzhen, China) equipped with a 7.5 MHz
transrectal linear transducer. The follicular population was assessed in each animal using
B-mode US every 12 h, from the first FSH dose until 36 h after the GnRH administration,
totaling 10 moments of evaluation (M1 to M10). The follicles were classified based on
their diameter as small (< 3 mm), medium (3 to 5 mm), or large (> 5 mm), and the number
of follicles in each category was recorded, as proposed by Pinto et al. (2020).

2.3. Corpora lutea count and embryo recovery

Six days after the last mating, the ewes were deprived of food (24 h) and water
(12 h), submitted to general anesthesia, and settled in the Trendelenburg position (Lima
et al., 2015). The counting and evaluation of the CLs were performed by laparoscopy, as
described by Bruno-Galarraga et al. (2015), and only red-colored CLs were considered
functional. Ewes with ≥ 3 CLs were submitted to surgical embryo recovery through a
longitudinal ventral laparotomy (Santos et al., 2020). The recovered fluid was evaluated
using a stereomicroscope with 20 X to 40 X magnification. Embryos were classified
according to their developmental stage and quality (Mapletoft et al., 2020) and only grade
I and II blastocysts were selected and dry frozen in cryotubes (DNase and RNase free) in
liquid nitrogen until molecular analysis. For gene expression analysis, a total of 10 grade
I and II blastocysts were used to conform two pools comprising five blastocysts from
different animals in each group.

2.4. RNA extraction, reverse transcription, and quantitative RT-qPCR amplification

Total RNA extraction was performed using an RNeasyMicro Kit (Qiagen Inc.,
Valencia, EUA) according to the manufacturer’s instructions and treated with DNase for
15 min to avoid DNA contamination. RNAase free water (14 µL) was added, and the
RNA quantification of each pool was performed using 1 µL of sample on a
spectrophotometer (Nanodrop 2000, Wilmington, DE, USA); this resulted in a mean (ng)
total RNA/blastocyst of 7.72 ± 2.1, 8.42 ± 1.47, and 8.16 ± 0.86 for the CON, TMPA,

32
and TP4 groups, respectively. The SuperScript III first-strand synthesis Supermix
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was used for reverse transcription, and the same RNA
concentration (17.5 ng/total RNA) was used in all samples. A mixture of oligo (dT) 20
primers, dNTP mixture, Superscript III-RT, RNase OUT, MgCl2, RT buffer, and RNA
sample with a final volume of 20 µL was prepared to perform the reverse transcription
reaction. The mixtures were first incubated at 65 ºC for 5 min and then at 50 ºC for
50 min. The reaction was stopped at 85 °C for 5 min, and then the samples were chilled
on ice. After that, RNase H was added to the samples and they were incubated at 37 ºC
for 20 min.
The relative quantification was done using a real-time polymerase chain reaction (ABI
Prism 7300 Sequence Detection Systems, Foster City, CA, USA) in triplicate. The
reactions (20 µL total volume) were achieved with a mixture of an SYBR green kit
(10 µL; Power SYBR Green, Applied Biosystems), 0.1 µM primers (described in Table
1), nuclease-free water, and reverse-transcribed cDNA (1 µL). Negative controls were
similarly run with each group of samples containing the RT-qPCR reaction mixture
without nucleic acids. Template cDNAs were denatured at 95 ºC for 10 min, and the gene
amplification was amplified by 40 cycles of thermal cycling programmed at 95 ºC for
15 s, 60 ºC for 15 s, and 60 ºC for 30 s. Fluorescence data were acquired during the
extension steps. After each RT-qPCR run, a melting curve analysis was performed to
confirm that a single specific product had been generated. The primer efficiency was
calculated using LinRegPCR software (Ramakers et al., 2003) for each reaction. The
primer efficiency standard was 1.96, 1.92, 1.94, 1.93, 1.91, 1.91, 1.95, 1.93, and 1.98 for
OCT4, NANOG, TGFB1, BCL2, BAX, NRF1, CDX2, GAPDH and H2AFZ, respectively.
Relative quantification was performed via the comparative Ct method (2−ΔΔCt) using the
REST 2008 software (Livak and Schmittgen, 2001) and the efficiencies were obtained
with the LinRegPCR software. The expression of each target gene was normalized using
the standards GAPDH and H2AFZ. The stability of the reference genes was calculated
according to the methodology described by Pfaffl et al. (2004) using the BestKeeper -
Excel tool. The values of the Pearson correlation coefficient observed for the GAPDH (r2
= 0.778) and H2AFZ (r2 = 0.765) genes demonstrate the stability (P < 0.01) of these
reference genes.

33
2.5. Calculations and statistical analysis

The numbers of small, medium, and large follicles were compared with a mixed
model, including treatment, time and their interaction as the main effects, considering
time as a repeated measure. The recovered structures were classified as embryos (all
stages and quality; Mapletoft et al., 2020), non-fertilized oocytes or free zona pellucida.
Only embryos grade I and II were considered as viable. The recovery rate was calculated
as recovered structures*100/number of CLs and the viability rate as viable
embryos*100/recovered structures. Data were compared with a mixed model (SAS
University Edition). The model included the treatments (CON, TMPA, and TP4) as the
main effects and the repetition as a random factor. The results are expressed as LSmeans
± SEM. For all tests, P < 0.05 was considered significant, and P < 0.1 was considered to
indicate a tendency.

3. Results
3.1. Effect of progestogens on the follicular population during SOV

There was no effect of treatment or an interaction of the treatments with time in

the number of follicles from each size. However, the number varied with time (P < 0.0001
in the three categories of follicles) (Fig. 2). Regardless of the experimental group, there
was a progressive increase in the population of medium and large follicles, accompanied
by a decrease in the population of small follicles throughout the studied period.

3.2. Effect of progestogen treatments in the superovulatory response

The treatments did not affect the number of CLs or the recovery rate (Table 2).
However, there were tendencies for differences in the number of structures recovered and
the number of viable embryos (P = 0.08 for both) (Table 2). Only grade I and II embryos
were considered as viable. From those, 41.25% were morula, 56.25% were blastocysts,
and 2.5% were hatched blastocysts in the three groups. The treatments affected the
viability rate (P = 0.046), which was greater in TP4 than in CON (P = 0.014) and
intermediate in TMPA, without any differences with the other groups (Table 2).

34
3.3. Effect of progestogens on the gene expression profile

The administered progestogens did not affect the number of transcripts associated
with pluripotency (OCT4), maintenance of pluripotency (NANOG), apoptosis (BCL2),
mitochondrial activity (NRF1), or trophectoderm differentiation (CDX2). However, the
TGFB1 transcript was less expressed in the CON group embryos than in the TP4 and
TMAP embryos (P = 0.01 and P = 0.03, respectively) without differences between both
progestogens (Fig. 3).
The high concentrations of progestogen during follicular growth affect oocyte
competence, probably increasing the capacity of the oocyte to undergo cleavage and
embryonic development in vitro (Menchaca et al., 2018), most likely through the positive
regulation of TGFB1 – a gene involved in cell growth, proliferation, and differentiation,
contributing to the increase in oocyte competence.

4. Discussion
The results of the study demonstrate that the administration of progesterone at the
beginning of SOV increases the rate of embryonic viability. Previously, in vitro studies
have demonstrated that plasma P4 concentrations in animals from which oocytes are
collected also affect in vitro embryo production (McEvoy et al., 1995; Menchaca et al.,
2018; Saad et al., 2019), which is consistent with the findings of the present study.
Additionally, previous in vivo studies have reported a markedly higher pregnancy rate in
dairy cows with a higher concentration of P4 compared to a lower concentration before
artificial insemination (Inskeep, 2004; Wiltbank et al., 2011). This benefical effect of P4
may be explained by in follicular fluid composition (Cerri et al., 2011), cumulus
expansion, and oocyte competence (Fair and Lonergan, 2012). Relatively lower
concentrations of P4 lead to the disruption of oocyte nuclear maturation (Rajamahendran
and Manikkam, 1994) and the impairment of fertilization (Rivera et al., 2011) and early
embryonic development (Mihm et al., 1994; Ahmad et al., 1995).
The gene expression data, specifically the TGFB1 gene, whose expression was
higher in embryos from the TMPA and TP4 groups, also suggest a greater capacity for
cell growth, proliferation, and differentiation of these embryos compared to embryos
from the CON group. Furthermore, these data suggest a greater capacity for the
implantation and post-implantation development of these embryos, since TGFB1 also
mediates the invasion of the endometrium by the trophectoderm during implantation

35
(Jones et al., 2006; Li, 2014; Monsivais et al., 2017). TGFB1 acts as an
autocrine/paracrine factor during embryonic development, modulating the
microenvironment in which the embryo develops and implants (Chow et al., 2001). It is
likely that higher progestogen concentrations during follicular growth can modify the
composition of both the follicular and uterine fluids (Lonergan and Sánchez, 2020),
impacting the oocyte and, consequently, embryo quality (Cuadro et al., 2018). Moreover,
Kim et al. (2006) reported that the addition of progesterone to a co-culture of human
endometrial epithelial and stromal cells also increases the concentration of TGFB1 in
media culture. Therefore, the addition of progestogens might have also increased the
concentration of TGFB1 in the uterus and due to the previously mentioned embryonic
maternal interaction characteristics (Chow et al., 2001), potentially leading to the
progressive increase of this gene in TP4 and TMPA embryos. Although this study does
not allow us to confirm whether these pathways are involved, it should be considered that
the treatments ended before ovulation, and so should have acted in the characteristics of
the ovulated oocytes and/or the milieu in which that oocyte/embryo developed.
In line with previous reports (Bragança et al., 2019), the tested treatments did not
affect the follicular population. Although Bartlewski et al. (2015) have reported that the
administration of P4, in comparison with MPA, increased the number of follicles ≥ 3 mm,
this difference was only transient and did not alter the ovulatory response. However,
while P4 increased the viable embryo rate compared with the controls, MPA did not.
Therefore, these results suggest that the difference in progestogen metabolism and
clearance (Husein and Kridli, 2002) does not modify the superovulatory response of ewes,
although it might modify the final embryo quality.

5. Conclusions
In conclusion, the administration of P4 during the Day 0 superovulatory treatment
protocol enhances the embryo viability rate. The effect of progestogens ended before
ovulation, however, the use of MPA/P4 modified the milieu of development of the
oocytes, increasing the final quality of the embryos by increasing the expression of the
TGFB1 gene.

Declaration of competing interest

None of the authors has any conflict of interest to declare.

36
Credit authorship contribution statement
A.R. Taira: Conceptualization, Methodology, Investigation, Data curation,
Formal analysis, Writing – original draft, Writing – review & editing. R.I.T.P. Batista:
Conceptualization, Methodology, Formal analysis, Supervision, Visualization, Writing –
review & editing. J.D.R. Santos: Investigation, Data curation. P.H.N. Pinto:
Investigation, Data curation, Writing – review & editing. M.F.A. Balaro: Investigation,
Data curation, Writing – review & editing. C.G. Espírito Santo: Investigation, Data
curation. V.L. Brair: Investigation, Data curation, Writing – review & editing. J.M.G.S.
Fabjan: Investigation, Data curation. R. Ungerfeld: Methodology, Writing – review &
editing. J.F. Fonseca: Methodology, Writing – review & editing. F.Z. Brandão: Project
administration, Supervision, Resources, Visualization, Conceptualization, Methodology,
Writing – review & editing.

Acknowledgements
This work was funded by FAPERJ ((E-26/202.781/2018), CNPq (400785/2016-
1) and Embrapa (Project 02.13.06.026.00.02). PHNP had a postdoctoral scholarship from
FAPERJ. FZB, JFF and JMGS-F are fellows of the CNPq. JDRS had a scholarship
provided by FAPERJ.

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43
 Table 1
The sequence of the specific primers used in the RT-qPCR for the gene expression
evaluation of in vivo-derived embryos in sheep.

Gene Sequence of primers (5' - 3') Annealing Size

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temp. (°C) (bp)
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TGFB1 63 390 Juengel et al. (2004)
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GAGGAGTCCCAGGACATCAA
OCT4 56 204 Bebbere et al. (2010)
CCGCAGCTTACACATGTTCT
TTCCCTCCTCCATGGATCTG
NANOG 53 501 Sanna et al. (2010)
AGGAGTGGTTGCTCCAAGAC
GCAGGTCCTGTGGGAATG
NRF1 61 412 Nau et al. (2002)
CTGGGATAAATGCCCGAAG
GCCACCATGTACGTGAGCTAC
CDX2 60 140 Sakurai et al. (2010)
ACATGGTATCCGCCGTAGTC
CCTGGGATCTTGAAACTCTCCTT
BAX 60 566 Chakravarthi et al. (2015)
CTGAGCCAGGCTGAAATCAAAA
GCCGAGTGAGCAGGAAGAC
BCL2 60 214 Chakravarthi et al. (2015)
GTTAGCCAGTGCTTGCTGAGA
ATGTTTGTGATGGGCGTGAA
GAPDH 60 176 O'Connor et al. (2013)
ACAGTCTTCTGGGTGGCAGT
GTCGTGGCAAGCAAGGAG
H2AFZ 57 182 O'Connor et al. (2013)
GATCTCGGCCGTTAGGTACTC
TGFB1: transforming growth factor beta 1; OCT4: octamer‐binding transcription factor‐
4; NANOG: nanog homeobox; NRF1: nuclear respiratory factor 1; CDX2: caudal type
homeobox 2; BAX: BCL2 associated X, apoptosis regulator; BCL2: B-cell lymphoma
protein 2; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; H2AFZ: H2A histone
family, member Z.

44
 Table 2
Superovulatory response and embryo production from Santa Inês ewes.
CON TMPA TP4 P
CLs (n) 6.0 ± 1.2 (0 - 11) 7.7 ± 1.1 (0 – 14) 8.2 ± 1.1 (0 – 18) ns
Recovered structures (n) 2.4 ± 0.9 (0 - 5) 4.8 ± 0.8 (1 – 10) 4.9 ± 0.8 (1 – 13) 0.08
Viable embryos (n) 1.0 ± 0.7 (0 - 4) 1.9 ± 0.7 (0 – 7) 3.3 ± 0.7 (0 – 9) 0.08
Recovery rate (%) 44.5 ± 9.5 (0 - 100) 62.4 ± 9.1 (25 – 100) 62.5 ± 9.1 (12 – 100) ns
Viability rate (%) 24.4 ± 16.8b (0 - 100) 49.9 ± 16.3ab (0 – 100) 71.9 ± 16.3a (0 – 100) 0.04
Different letters within the same row differ statistically (P < 0.05); within the brackets are
the absolute numbers; CON – ewes superovulated without exogenous progestogen;
TMPA – ewes with a medroxyprogesterone acetate sponge during superovulation; TP4 –
ewes with a progestogen (P4) implant during superovulation. Recovery rate: structures
recovered*100/number of CLs; viability rate: viable embryos recovered*100/recovered
structures. Data are presented as mean ± SEM.

45
Figure captions

Fig. 1. Schematic representation of the experimental design. Experimental groups: CON

– superovulated ewes without any exogenous progestogens; TP4 – use of an intravaginal
device containing P4 during superovulation with FSH; TMPA – use of an intravaginal
sponge containing progestin (medroxyprogesterone acetate; MPA) during superovulation
with FSH.

46
Fig. 2. Follicular population of the different experimental groups throughout a
superovulatory treatment. Number of A) small (< 3 mm), B) medium (3-5 mm), and C)
large (> 5 mm) follicles throughout a superovulatory treatment, from the Day 0 protocol
in sheep. The moments of FSH, GnRH, and PGF2α administration are indicated with
arrows. Ewes were treated with an intravaginal sponge containing medroxyprogesterone
acetate (grey bars) or an intravaginal implant containing P4 (white bars), or were given
no exogenous progestogens (black bars). The follicular population was assessed by
transrectal B-mode ultrasonography (US) every 12 h, from the first FSH dose until 36 h
after the GnRH administration (M1 to M10). Different letters: P < 0.05 regardless of the
treatment.

47
Fig. 3. Expression of embryonic competence markers in in vivo-produced blastocysts.
Genes associated with pluripotency (octamer-binding transcription factor 4 – OCT4 and
Homeobox protein – NANOG), cell growth, proliferation, and differentiation
(transforming growth factor beta 1 – TGFB1), apoptosis (B-cell lymphoma protein 2 –
BCL2 and BCL2 associated X protein – BAX), mitochondrial activity (Nuclear
respiratory factor 1 – NRF1), and trophectoderm differentiation (Caudal Type Homeobox
2 – CDX2) were evaluated in grade I and II blastocysts. CON – ewes superovulated
without exogenous progestogen (black bars); TMPA – ewes with a medroxyprogesterone
acetate sponge during superovulation (white bars); TP4 – ewes with a progestogen (P4)
implant during superovulation (grey bars). Different letters differ statistically (P < 0.05).

48
CAPÍTULO 3

Biostimulation with the ram effect increases the follicle recruitment,

ovulatory diameter, and embryo viability rate in superovulated
ewes

Publicado na
Theriogenology, v. 181 (2022), p. 140-146
doi.org/10.1016/j.theriogenology.2022.01.021
49
Biostimulation with the ram effect increases the follicle recruitment, ovulatory
diameter, and embryo viability rate in superovulated ewes

Augusto Ryonosuke Tairaa*, Felipe Zandonadi Brandãoa, Viviane Lopes Braira, Isabel
Oliveira Cosentinoa, Felipe Seabra Cardoso Leala, Ana Clara Sarzedas Ribeiroa, Mário
Felipe Alvarez Balaroa, Ribrio Ivan Tavares Pereira Batistaa, Joanna Maria Gonçalves
Souza-Fabjana, Jeferson Ferreira da Fonsecab, Rodolfo Ungerfeldc

a
Faculdade de Veterinária, Universidade Federal Fluminense, Av. Vital Brasil Filho, 64,
CEP 24230-340, Niterói, RJ, Brazil.
b
Embrapa Caprinos e Ovinos, Núcleo Regional Sudeste, Rodovia MG 133, Km 42, CEP
36155-000, Coronel Pacheco, MG, Brazil.
c
Departamento de Biociencias Veterinarias, Facultad de Veterinaria, Universidad de la
República, Lasplaces 1620, Montevideo, 11600, Uruguay.
*Corresponding author.
E-mail address: augusto.vete@gmail.com (AR Taira).

ABSTRACT
The aim of this study was to compare the preovulatory follicular development and

superovulatory outcomes in superovulated ewes which were either stimulated or not

stimulated by placement with rams. The treatment regimen to super-stimulate ovarian

follicular development was imposed to 28 ewes on “Day 0”, from which 14 were

stimulated with active rams for 48 h, starting at the time of the fifth FSH dose, with the

ram being removed from the pen with the ewes and replaced which other ram every 12 h,

using four different rams (group GRE). The other 14 ewes remained isolated from rams

throughout the protocol (group GCON). All ewes were administered 133 mg of FSH, into

six doses in decreasing quantities, every 12 h. The follicular development and number of

ovulations were determined using ultrasonography. Biostimulation resulted in an

increased number of large follicles, follicle diameter, and embryo viability rate (viable
50
embryos/recovered structures x 100) was greater in ewes of the GRE than GCON group.

The number of corpora lutea, follicular cysts, recovered structures, viable embryos, and

degenerated and unfertilized structures was similar in ewes of the GRE and GCON group.

Structures were recovered from more GRE than GCON ewes. In conclusion,

biostimulation with rams during the last phase of the treatment regimen to induce

superovulation enhanced the follicular growth and increased the embryo viability rate in

ewes.

Keywords: follicular growth; male effect; multiple ovulations; socio-sexual stimulation.

1. Introduction
An important limitation of superovulatory treatments is that some follicles

respond to gonadotrophin stimulation, are recruited, grow, and develop to the size from

which there can be an ovulation but ultimately regress without there being an ovulation

[1]. This inconsistency between follicle recruitment and ovulation occurrence may be

consequence of insufficient pulsatile luteinizing hormone (LH) release from the anterior

pituitary. This hormone is a primary factor in modulating the endocrine and

morphological changes in the developing follicles and oocytes, including the induction

of final maturation, fertilizing capacity, and developmental competence [2]. One strategy

to increase the percentage of follicles that grow and from which there is ultimately

ovulation and therefore, viable embryo production could be to supplement the LH during

this important period of follicular development before there is atresia of these follicles.

No practical treatment regimens have been developed to increase LH exogenous

stimulation of follicles by administering LH in ways to mimic the small amplitude LH

pulses that induce follicular development and prevent atresia during the proestrus period

preceding ovulation. However, there might be natural strategies to increase the secretion

51
of LH. Social stimuli, such as the ram effect, may be an alternative strategy to stimulate

LH secretion. The placement of rams with ewes that have not been previously in the

presence of rams results in a reduction in the negative feedback effects of estradiol,

resulting in an increased frequency of LH pulse release from the anterior pituitary in ewes,

does, and cows [3,4]. In anestrous ewes, when there is placement of a ram with anestrous

ewes, there is a decrease in estradiol negative feedback inhibition of pulsatile LH release

[5]. This management approach has previously been utilized to induce ovulations with

their pregnancies resulting in ewes that were previously seasonally [6] or postpartum [7.8]

anestrus. Furthermore, the introduction of rams induces an increase of LH pulsatility in

cyclic ewes, even during periods when there is ongoing progestogen treatment [9]. This

finding is consistent with the observation of an advancement of estrous behavior induced

in medroxiprogesterone-pretreated ewes by the introduction of rams, which is probably

related to an increase of LH secretion and an increase of the follicular growth rate [10].

Consequently, the placement of rams with ewes results in an increase of LH pulsatile

secretion in ovariectomized ewes, whether treated with progestogens or not [11], and in

ewes at different stages of the estrous cycle [12]. Therefore, the ram effect has been used

to improve the results when there are treatments to synchronize the timing of estrus

among ewes in a flock [13,14].

With this in mind, the hypothesis of the present study was that placement of rams

with ewes that had not previously been penned with rams would enhance development of

follicles and increase the number of ovulations from large ovarian follicles during the

period a treatment regimen was being imposed to super-stimulate ovarian follicular

development. Therefore, the aim of this study was to compare the follicular development

and superovulatory outcomes when there was placement of rams with ewes during the

52
period when a treatment regimen was being imposed to super-stimulate ovarian follicular

development.

2. Material and methods

This study was approved by the Ethics Committee for the Use of Animals of the

Universidade Federal Fluminense (#95002404/18) and was conducted using procedures

consistent with the ethical principles of the Brazilian Society of Science in Laboratory

Animals.

2.1. Experimental location, animals, and study design

The research was conducted from November to December (spring), at the

Experimental Research Unit in Goats and Sheep (UniPECO) in Cachoeiras de Macacu

(22º 27’ S), Rio de Janeiro, Brazil. The study involved 28 multiparous Santa Inês ewes

(3.6 ± 1.1 years old; 42.9 ± 4.9 kg; 2.9 ± 0.3 of BCS on a scale of 1 to 5; mean ± SD). All

ewes were subjected to clinical and ultrasonic evaluations and were free from

reproductive or clinical disorders. Ewes were managed in an intensive system, fed with

chopped Napier grass (Pennisetum purpureum cv. Cameron) and 300 g/per animal/daily

of concentrate (16% of crude protein), and free access to water and mineral salt

(Ovinofós, Tortuga, São Paulo, Brazil).

Experimental ewes were allocated to two groups of 14 ewes each and handled in

two repetitions, with seven animals/treatment, separated by one day to ensure that

effective and efficient embryo collection processes occurred. The two treatments were 1)

ram effect group (group GRE) and 2) control group (group GCON). The stage of the

estrous cycles among all the ewes were synchronized using a short-term progestin-based

treatment regimen through an intravaginal sponge impregnated with 60 mg of

53
medroxyprogesterone acetate (Progespon; Syntex, Buenos Aires, Argentina) for a

duration of six days, plus 0.24 mg of cloprostenol (Estron, Agner Unio, São Paulo, Brazil)

i.m., and 300 IU of eCG (Novormon 5000; MSD Animal Health, São Paulo, Brazil) i.m.,

one day before sponge withdrawal [15]. Thirty-six hours after sponge removal, 0.025 mg

of lecirelin i.m. was also administered (Gestran Plus; Tecnopec, São Paulo, Brazil) to

synchronize the timing of ovulations among ewes [16].

The treatment regimen to induce superovulations started 80 h after the removal of

the sponge (Day 0), with 133 mg of FSH (Folltropin-V, Bioniche Animal Health, Ontario,

Canada) i.m. divided into six doses of decreasing quantity as treatments proceeded

(33.25/33.25, 19.95/19.95, 13.3/13.3 mg) every 12 h [17]. At the first FSH dose, an

intravaginal device containing 0.33 g of progesterone (Eazi-Breed CIDR, Zoetis, São

Paulo, Brazil) was inserted into all animals and remained in situ until the fifth FSH dose

(Day 2). Along with the sixth FSH dose, there was administration of 0.24 mg of

cloprostenol i.m. and, 12 h afterwards, 0.025 mg of lecirelin i.m. (Fig. 1).

All ewes were isolated from rams, without visual, olfactory, or auditory stimulus

for 60 days before the study began. During all the experimental steps, the ewes assigned

to the GCON and GRE group remained in separated barns of the rams (minimum distance

= 200 m). While the GCON ewes remained isolated from rams throughout the whole

study there was a "teaser" ram placed with the ewes of the GRE group after the

progesterone device was removed, at the time of administration of the fifth FSH. For this,

four different adult Santa Inês rams (2.9 ± 0.4 years old; 56.8 ± 3.1 kg; 3.0 ± 0.2 of BCS)

were used to induce the ram effect. The rams used were reproductively mature, and

sexually experienced, as they had been previously utilized for breeding, and subjected to

an andrological examination, and were fitted with a protective apron affixed to their

abdominal region to prevent copulation. Each ram remained peened with seven ewes,

54
with there being removal and replacement with a novel ram every 12 h thus, there was a

total 48 h of biostimulation.

Fresh semen collected from rams with previously proven fertility was deposited

into the cervical ostium of all ewes three times. Inseminations were performed 24, 36,

and 48 h after the fifth FSH dose, depositing 300 x 106 spermatozoa per dose. Cervical

insemination was performed with a speculum equipped with a light source and a

multidose insemination instrument (Walmur Veterinary Instruments, Montevideo,

Uruguay).

2.2. Ultrasonic evaluation

The follicular population was determined using an ultrasonic portable device

(Sonoscape S6, Sonoscape, Shenzhen, China) equipped with a 7.5 MHz linear transducer

for transrectal use. All scans were performed by the same operator. The ovaries were first

evaluated at the beginning of the treatment regimen for inducing superovulation, to assess

the ovarian status (Day 0); thereafter, serial assessments were conducted every 12 h from

the fifth FSH dose until the last insemination (Day 2 to Day 4). The ovarian ultrasonic

evaluations continued every 24 h until the day before embryo collection (Day 5 to Day

9). Follicles were classified based on diameter as small (< 3 mm), medium (3 to 5 mm),

or large (> 5 mm). The number of follicles in each category was recorded based on the

criteria described by Pinto et al. [18]. The Doppler mode was used to assess the corpora

lutea, with the following settings: 20% color gain, 10 kHz pulse repetition frequency, 7

cm depth, and 75 kHz wall filter. One day before embryo recovery, the number of corpora

lutea and luteal perfusion were determined using Doppler-mode ultrasonography, and

only the vascularized corpora lutea were considered functional [19].

55
2.3. Hormonal treatments for cervical dilation and embryo collection

For embryo collection, all animals were administered the hormonal cervical

dilation treatment regimen described by Leite et al. [20]: 100 µg of estradiol benzoate i.v.

(RIC-BE, Agener Union, São Paulo, Brazil) diluted in 2.5 mL of absolute ethyl alcohol

and 2.5 mL of saline, and 0.12 mg of cloprostenol i.m., 12 h before embryo collection. In

addition, 100 IU of oxytocin i.v. (Oxytocin Forte UCB; Centrovet, Goiânia, Brazil) was

administered 15 min before the embryo collection procedure was initiated.

Ewes were sedated with 0.1 mg/kg of acepromazine maleate i.v. (Acepran; Vetnil,

São Paulo, Brazil) and 0.3 mg/kg of diazepam i.v. (Diazepam; Santisa, São Paulo, Brazil),

in addition to epidural anesthesia with 2.0 mg/kg of ketamine hydrochloride (Cetamin;

Syntec, São Paulo, Brazil) [20]. Embryo collection was performed immediately, after

cervical traction and fixation. The structures were recovered using a closed-circuit system

(Embrapa Circuit for the recovery of goat/sheep embryos; Embrapa, Brazilia, Brazil),

using the procedure described by Fonseca et al. [21].

After this procedure, the total structures (embryos, unfertilized oocytes, empty

pellucid zones, and degenerated structures) were screened and counted in a

stereomicroscope. The embryos were classified according to stage of development and

morphological characteristics, as described by IETS [22]. Only class 1 embryos (grade I,

II, and II) were considered viable embryos.

2.5. Blood collection and progesterone quantification

Six blood samples were collected every 24 h from Day 4 to Day 9 (Fig. 1) using

jugular venipuncture procedures. Blood samples were centrifuged at 1500 g for 15 min,

and the serum was separated and immediately stored at -20 ˚C until the progesterone

assay was performed. Progesterone values were determined using a solid-phase

56
radioimmunoassay utilizing a commercial kit (MP Diagnostics Division, Orangeburg,

New York, USA) [23]. Samples were analyzed in a single assay, with a sensitivity of 0.05

ng/mL and an intra-assay coefficient of variation of 8.9%, with all values within the curve.

2.6. Statistical analysis

The numbers of small, medium, and large follicles were compared with a mixed

model, including treatment, time, and their interaction as the main effects, considering

time as a repeated measure. The embryo recovery rate was calculated as recovered

structures*100/(number of corpora lutea); the viability rate as viable

embryos*100/(recovered structures); and the unfertilized rate (and rate of degenerates) as

unfertilized structures*100/(recovered structures). The percentage of large follicles from

which there were ovulations was calculated as the number of corpora

lutea*100/(maximum number of large follicles observed using ultrasonic procedures).

The luteal functionality was evaluated and compared with results when using B-mode

and Doppler-mode ultrasonic procedures. The data were compared with a mixed model

(SAS University Edition). The model included the treatments (GCON and GRE) as main

factors and the repetition as a random factor. These results are expressed as LSmeans ±

SEM. The proportion of ewes from which at least one structure was recovered was

compared with the Fisher exact probability test. The dispersion of the proportion of large

follicles from which there were ovulations was compared using the Bartlett test. There

were considered to be mean differences when there was a P≤0.05, and there were

considered to be trends for mean differences when there was 0.05< P<0.1.

57
3. Results
3.1. Follicular population

The number of follicles from all categories of follicles (small, medium, and large)

varied according to the treatment, time, and an interaction between treatment and time

(P<0.0001 for the three factors in all the follicular categories). At the beginning of the

treatment regimen to induce superovulation (Day 0), the population of small, medium,

and large follicles was similar between groups; however, after the placement of the rams

with the ewes (fifth FSH dose; Day 2) until Day 3.5, ewes of the GRE group had more

large follicles than GCON ewes (Fig. 2). The number of small and medium follicles was

greater in ewes of the GCON than GRE group until Day 4 and Day 5, respectively.

The diameter of the largest and second-largest follicles before ovulation was

greater in ewes of the GRE than GCON group (P<0.0001 and P=0.002, respectively).

There were the largest number of large follicles at the same time points in ewes of both

groups. Although the number of large follicles was greater in the ewes of the GRE than

GCON group (P=0.001; Table 1), the proportion of large follicles from which there were

ovulations was greater in ewes of the GCON group (P=0.02; Table 1). However, the

proportion of large follicles from which there were ovulations was more homogeneous in

the ewes of the GRE than GCON group (P=0.009).

3.2. Ovarian response and embryo production

The luteal perfusion assessed using Doppler procedures, as well as the number of

corpora lutea, viable embryos/number of corpora lutea, and anovulatory follicles did not

differ between groups. Similarly, the percentage embryo recovery, number of viable

embryos, and total number of recovered, degenerated, and unfertilized structures per ewe

did not differ between groups. Nonetheless, more ewes of the GRE group had at least one

58
structure recovered than ewes of the GCON group, furthermore, ewes of the GRE group

had a higher viability rate (viable embryos/recovered structures) (P=0.02 and P=0.05

respectively; Table 2).

3.3. Serum progesterone concentrations

There were no differences in P4 concentrations as a result of treatment with

concentrations only varying with time (P<0.0001). The values increased from Day 4 to 7

(0.02 ± 0.45 compared with 2.52 ± 0.45 ng/mL, respectively; P<0.0001), on Day 8 (4.24

± 0.45; P=0.0009), and from Day 8 to 9 (6.33 ± 0.45; P<0.0001).

4. Discussion
The main outcomes in the present study confirm the hypothesis, because the

placement of reproductively mature rams during the last phase of the superovulatory

protocol resulted in a greater the number of large follicles, larger diameter at the time of

ovulation, and increased embryonic viability rate. Although the number of corpora lutea

and concentrations of P4 were similar between ewes of the two groups, the results indicate

that biostimulation could be an effective procedure to stimulate the development of a

larger number of follicles as a result of treatments to stimulate follicular development

than occurred in the ewes where there was no biostimulation. Furthermore, the number

of ewes from which oocytes/embryonic structures were recovered was larger than in the

ewes for which there was no biostimulation imposed, and some outcomes were more

homogeneous among ewes of the group in which there was biostimulation imposed. This

is a positive outcome, considering the large amount of variability that often occurs in the

response to hormonal treatment regimens for inducing superovulation responses [24]. It

remains to be determined how this stimulation could also cause an increase in the number

59
of follicles from which there is ovulation; however, increasing the follicular recruitment

and embryo quality are key results in any strategy to improve the results of treatments to

super-stimulate follicular development.

The placement of rams with ewes induced an increase in the number of large

follicles. This was probably a consequence of the stimulation of the growth of small and

medium follicles because these results occurred simultaneously. The results from the

present study indicate the decrease of small and medium follicles was due to the greater

growth rate in ewes where there was biostimulation with rams of ovarian follicles [25,26],

which probably is the reason for the greater follicle growth, as previously reported in the

same breed [27]. The greater follicular growth rate in ewes in which there was

biostimulation is probably a consequence of the rapid response to gonadotropic

stimulation. The strategy of exchanging the “teaser” ram every 12 h was probably critical

as it repeatedly renewed the stimulus during the 48-h period when rams were with the

ewes because ram sexual behavior is related extent of biostimulation that results when

rams are placed with ewes, including the luteal function [28]. It is important to ensure

that the biostimulation effects are sufficient for inducing the endocrine/physiological

responses, which can be enhanced after a period when there is no ram penned with the

ewes. Similarly, it is interesting to hypothesize the possible effects of changing the length

of the stimulation period, because prolonging the period rams are penned with ewes might

be a strategy to increase the proportion of large follicles from which there are ovulations.

In the present study, biostimulation also had positive effects on embryo quality, a

result of the greater percentage of viable embryos. There may be several explanations for

this finding, which are not mutually contradictory. First, the proportion of viable oocytes

with fertilization capacity is related to the size of the follicles from which there is

ovulation [29]. In this sense, the estradiol:progesterone ratio of the largest follicles results

60
in the oocytes contained in these follicles having greater developmental competence than

those from smaller follicles, resulting in a greater percentage blastocyst rate after in vitro

fertilization [30]. Developmental competence is also related to the capacity for nuclear

and cytoplasmic maturation, because the pre-ovulatory surge release of LH induces the

resumption of meiosis by modulating oocyte development so that there is competence for

fertilization [2,31]. Crozet et al. [32] reported similar results in goats, where the

percentage of morula or blastocyst produced in vitro was related to the follicular size at

the time of ovulation. However, it is possible that the difference in the preovulatory

dynamics led to modification of the oviductal–uterine milieu; interestingly, however, this

was unrelated to the corpora lutea function and/or progesterone concentrations, ensuring

there was an adequate uterine milieu present for embryo development. In conclusion, the

biostimulation by placing rams with ewes during the latter portion of the treatment

regimen for super-stimulation of ovarian follicular development resulted in the

stimulation of follicular growth and increased the percentage embryonic viability in ewes.

Declaration of Conflicts of Interest

None of the authors has a conflict of interest to declare.

Acknowledgements

The authors thank Jasmine BS Pinheiro and Pedro HN Pinto for their assistance during

data collection. The study was supported by FAPERJ (E-26/202.781/2018), CNPq

(400785/2016-1) and Embrapa (Project 02.13.06.026.00.02). ART was supported by

CAPES (code 001). FZB and JMGS-F are FAPERJ and CNPq fellows.

61
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65
 Tables and figures

Table 1. Ultrasonographic outcomes from Santa Inês ewes in which there was
superovulation with FSH (133 mg in six decreasing doses) after “Day 0” protocol, when
there was or was not placement of rams with ewes during the superovulatory treatment
regimen. The data are expressed as LSmeans ± SEM.

GCON GRE P
Maximum number of large follicles 4.1 ± 0.7 7.6 ± 0.7 0.001
Moment at which the maximum number of
4.4 ± 0.9 4.5 ± 0.9 ns
large follicles was observed (day of treatment)
Largest follicle (mm) 5.9 ± 1.3 7.6 ±1.5 <0.0001
Second largest follicle (mm) 5.2 ±1.6 6.4 ± 0.8 0.002
Large follicles that ovulated (%)* 118.2 ±
208.8 ± 133.3 0.02
27.6
GCON: superovulated ewes which remained isolated from rams the period the treatment
regimen was imposed.
GRE: superovulated ewes where there was placement of rams with ewes during the
treatment the period the treatment regimen was imposed.
Large follicles that ovulated: number of corpora lutea*100/maximum number of large
follicles.
ns: not significant.
* The dispersion of the data differed (P=0.009).

66
Table 2. Ovarian response and embryo production in Santa Inês ewes treated to super-
stimulate ovarian follicular development with FSH (133 mg in six decreasing doses),
where there was or was not placement of rams with ewes (GRE and GCON, respectively)
during the period when the treatment regimen was imposed to super-stimulate follicular
development in ewes that were subjected to non-surgical embryo recovery.
GCON GRE P
Ewes washed with at last one structure recovered 12/14
6/14 (42.9) 0.02
(%) (85.7)
Number of corpora lutea 8.0 ± 1.0 9.1 ± 1.0 ns
Number of anovulatory follicles 1.2 ± 0.4 0.6 ± 0.4 ns
Recovered structures 3.0 ± 0.9 3.9 ± 0.9 ns
Number of viable embryos 2.2 ± 0.9 3.0 ± 0.8 ns
Number of unfertilized structures 0.8 ± 0.5 0.8 ± 0.5 ns
Number of degenerate structures 0.01 ± 0.1 0.08 ± 0.1 ns
Recovery rate (%) 31.3 ± 13.6 49.3 ± 13.3 ns
Viability rate (%) 36.7 ± 13.0 73.8 ± 12.4 0.05
Unfertilized rate (%) 13.3 ± 9.9 16.9 ± 9.5 ns
Degenerate rate (%) 0.01 ± 1.2 1.5 ± 1.2 ns
The data are expressed as LSmean ± SEM.
GCON: superovulated ewes which remained isolated from rams the period the treatment
regimen was imposed.
GRE: superovulated ewes where there was placement of rams with ewes during the
treatment the period the treatment regimen was imposed.
Recovery rate: recovered structures*100/number of corpora lutea.
Viability rate: viable embryos*100/recovered structures (oocytes or embryos).
Unfertilized rate: unfertilized structures*100/recovered structures (oocytes or embryos).
Degenerate rate: degenerated structures*100/recovered structures (oocytes or embryos).
ns: not significant.

67
Figure 1. Experimental procedures and treatments, including hormonal administration,
period of ram stimulation, ultrasonic evaluation, and embryo recovery; MPA:
medroxyprogesterone acetate; CIDR: progesterone device; eCG: equine Chorionic
Gonadotropin; FSH: follicle stimulating hormone; AI: artificial insemination;
Experimental groups: GCON – superovulated ewes which remained isolated from rams;
GRE – superovulated ewes where there was placement of rams with ewes during the latter
part of the period when the hormonal treatment regimen was imposed.

68
Figure 2. Number of A) small (<3 mm), B) medium (3–5 mm), and C) large (>5 mm)
follicles throughout the period when the hormonal treatment regimen was imposed, based
on the “Day 0” protocol in superovulated ewes where there was placement of rams with
ewes (GRE; black bars) and superovulated ewes which remained isolated from rams
(GCON; white bars). The timing of FSH, GnRH, and cloprostenol administration is
indicated with arrows. Different capital letters indicate differences over time (P<0.05).
69
Different lower-case letters indicate differences between groups at the same time point
(P<0.05).

70
 3. CONSIDERAÇÕES FINAIS
No presente estudo, podemos concluir que a administração de P4 durante o
protocolo de tratamento puperovulatório do Dia 0 aumentou a taxa de viabilidade
embrionária, devido ao incremento da expressão do gene TGFB1. Quando associado com
a bioestimulação do efeito macho durante a última parte do regime de tratamento
superovulatório, foi possível observar o incremento do crescimento folicular resultando
em um maior percentual de embriões viáveis, otimizando assim, a múltipla ovulação e
transferência de embrião ovinos.

71