Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

PPGCbiol

Tese

AVALIAÇÃO DO ESTRESSE
OXIDATIVO E DEFESAS
ANTIOXIDANTES NA
INFECÇÃO PELO VÍRUS
OROPOUCHE EM MODELO
ANIMAL.

Marília Bueno da Silva Menegatto

2023
 MARÍLIA BUENO DA SILVA MENEGATTO

AVALIAÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO E DEFESAS ANTIOXIDANTES NA

INFECÇÃO PELO VÍRUS OROPOUCHE EM MODELO ANIMAL

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas, da Universidade
Federal de Ouro Preto, como requisito para obtenção do
título de Doutora em Ciências Biológicas

Orientadora: Prof. Dra. Cintia Lopes de Brito Magalhães

Ouro Preto
2023
 SISBIN - SISTEMA DE BIBLIOTECAS E INFORMAÇÃO

M541a Menegatto, Marilia Bueno Da Silva.

MenAvaliação do estresse oxidativo e defesas antioxidantes na infecção
pelo vírus Oropouche em modelo animal. [manuscrito] / Marilia Bueno Da
Silva Menegatto. - 2023.
Men76 f.: il.: color., gráf..

MenOrientadora: Profa. Dra. Cintia Lopes de Brito Magalhães Magalhães.

MenTese (Doutorado). Universidade Federal de Ouro Preto. Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas.
MenÁrea de Concentração: Bioquímica Estrutural e Biologia Molecular.

Men1. Infecções por Bunyaviridae. 2. Estresse oxidativo. 3. Patogênese.

4. Espécies Reativas de Oxigênio. I. Magalhães, Cintia Lopes de Brito
Magalhães. II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Título.

CDU 577.2

Bibliotecário(a) Responsável: Luciana De Oliveira - SIAPE: 1.937.800

 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
REITORIA
INSTITUTO DE CIENCIAS EXATAS E BIOLOGICAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICAS

FOLHA DE APROVAÇÃO

Marília Bueno da SIlva Menegatto

Avaliação do estresse oxidativo e defesas antioxidantes na infecção pelo vírus Oropouche em modelo animal

Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal

de Ouro Preto como requisito parcial para obtenção do título de doutor

Aprovada em 22 de maio de 2023

Membros da banca

Dra Cintia Lopes de Brito Magalhães - Orientador(a) (Universidade Federal de Ouro Preto)
Dra Jaqueline Maria Siqueira Ferreira (Universidade Federal de São João Del Rey)
Dra Etel Rocha Vieira (Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri)
Dr André Talvani Pedrosa da Silva (Universidade Federal de Ouro Preto)
Dr Frank Silva Bezerra (Universidade Federal de Ouro Preto)

Cintia Lopes de Brito Magalhães, orientador do trabalho, aprovou a versão final e autorizou seu depósito no Repositório Institucional da UFOP
em 25/05/2023

Documento assinado eletronicamente por Cintia Lopes de Brito Magalhaes, PROFESSOR DE MAGISTERIO SUPERIOR, em
25/05/2023, às 15:11, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de
outubro de 2015.

A autenticidade deste documento pode ser conferida no site http://sei.ufop.br/sei/controlador_externo.php?

acao=documento_conferir&id_orgao_acesso_externo=0 , informando o código verificador 0531758 e o código CRC F9DEB1B7.

Referência: Caso responda este documento, indicar expressamente o Processo nº 23109.006953/2023-73 SEI nº 0531758

R. Diogo de Vasconcelos, 122, - Bairro Pilar Ouro Preto/MG, CEP 35402-163

Telefone: 3135591672 - www.ufop.br
 AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer primeiramente meus pais, Guerino e Ana Rita, que tornaram a
minha pós graduação possível, sempre me incentivaram, apoiaram e não mediram esforços para
me darem colo, saúde mental, conforto e presença, mesmo a mais de 500 quilômetros de
distância. Aos meus irmãos e avós que acreditaram e confiaram em mim, cada um à sua maneira.
Aos meus filhos de 4 patas... Brahminha que me acompanha desde o processo seletivo
do mestrado, fiel companheira de escrita na cozinha de casa. Puffinha! Ah, Puffinha... Hoje é a
estrela mais brilhante no céu, minha estrela guia. A vida em Ouro Preto mudou depois que
montamos a nossa casinha! E agora enviou para mim meu mais novo pinguinho, Dirceu. Afinal,
não existe Marília sem Dirceu, não é mesmo? Chegou nesse último ano mais pesado para trazer
leveza, alegria, bagunça e para me fazer companhia. Com toda certeza, sem vocês não teria
chegado até aqui tão realizada.
Ao Rhaian, meu namorado, presente de pandemia. Nunca foi só por causa da pandemia,
sabemos disso. E eu, que sempre tive muito forte na cabeça que só a minha própria companhia
me bastava, aprendi que dividir a vida com alguém é muito gostoso também! Agradeço por
esses quase 3 anos compartilhando momentos e memórias juntos. E claro, a república Casaca,
palco de tantos momentos bons e companhias boas nessa minha caminhada.
À minha dupla de vida, Isabelinha Morato, comigo desde a graduação, nunca soltou da
minha mão e sempre me fez sentir “casa”, minha família em Ouro Preto desde então. Com você
veio nosso triozinho inseparável e maravilhoso, com o Gabriel! Ah, que saudade da gente juntos!
Não me lembro de um momento ruim sequer com a gente, porque tudo virava risada e motivo
pra gente reunir e tomar uma juntos. Nossa mesa cativa no nosso bar preferido, nossos garçons
preferidos, nossa banda preferida e o fechamento do bar de sempre! Obrigada por tanto, vocês
foram FUNDAMENTAIS!
Agradeço também à Cintia, minha orientadora, pela oportunidade de trabalhar com ela
e realizar este trabalho. Tão querida, elegante e acessível, que cumpre seu papel de orientar tão
bem e de forma tão leve, natural e humana. Um exemplo (cada vez mais raro) a ser seguido de
profissional e de mulher. Entende meu jeito e me aconselha a ser mais forte e durona desde o
dia que fui perguntar se gostaria de me orientar.
Agradeço às “alunas da Cintia”, Leticia Trindade pela ajuda e pontapé inicial com o
OROV, e inclusive Rafa e Ariane por todos os ensinamentos, ajuda, parceria e companheirismo
diário, seja em todas as temporadas no biotério, ou com os experimentos que deram certo de
primeira e também aqueles que não deram certo até hoje. Mas gostaria de deixar aqui meu
agradecimento especial à Ariane, minha dupla de pesquisa, que desde o primeiro dia no
doutorado me ensinou praticamente tudo que sei hoje do zero, com muita boa vontade,
paciência e dedicação. Trabalhar ao seu lado sempre foi um privilégio. Agradeço por cada troca
e discussão científica que tivemos, pela companhia de bancada mas também pela companhia
de passeio com os dogs e ombro amigo que já ouviu muita coisa. Eu acho que hoje em dia eu
sou boa no que faço, já você é excelente... mas juntas, acho que somos imbatíveis!
Fazer ciência não é nem um pouco fácil, no governo anterior foi pior ainda, época do
retrocesso científico, da desvalorização da ciência. Mas estar com a Cíntia e as meninas me
fizeram acreditar que seria possível e que dias melhores sempre virão. Obrigada por essa
experiência que só me enriqueceu e me deu vontade de continuar em frente!
Agradeço à todos os amigos que fiz nessa jornada e que de uma forma ou outra
tornaram a caminhada prazerosa. Também ao crossfit que me deu força, autoconhecimento,
me fez enxergar pequenas e grandes superações e conquistas pessoais, lugar onde aliviei muito
o estresse e a ansiedade de resultados que não deram tão certo quanto eu esperava. Mas tudo
é aprendizado, é bagagem!
Agradeço ao Laboratório de Biologia e Tecnologia de Microrganismos pelo espaço e
fornecimentos de insumos que tornaram este trabalho possível. Ao Limp, LBM e Laboratório de
Morfopatologia pela ajuda e parceria.
À Universidade Federal de Ouro Preto, ao NUPEB e ao Programa de Pós Graduação em
Ciências Biológicas pela oportunidade e infraestrutura.
À Capes, CNPq e Fapemig pelo apoio financeiro.
Deixo aqui o meu abraço apertado e o muito obrigada!
Menegatto, M.B.S

RESUMO

O Oropouche orthobunyavirus (OROV) é o arbovírus causador da Febre Oropouche, cujos

sintomas são febre alta, cefaléia, mialgia, artralgia, fotofobia, tontura, náuseas e vômito. Mais
de meio milhão de pessoas já foram infectadas com o OROV desde seu isolamento em 1955,
sendo a Febre Oropouche uma doença negligenciada de caráter emergente. Até o momento
não há medicamentos antivirais ou vacinas disponíveis contra a infecção e ainda, pouco se sabe
sobre os mecanismos envolvidos em sua patogenicidade. Assim, estudos que busquem entender
os mecanismos envolvidos na patogênese do OROV são de extrema importância. Nesse sentido,
dados da literatura vêm demonstrando que o estresse oxidativo pode estar envolvido na
patogênese de vários agentes virais, dentre alguns arbovírus como Dengue, Zika, Chikungunya
e Mayaro. O estresse oxidativo é a condição que se estabelece quando há um desequilíbrio entre
os oxidantes, como as “Espécies Reativas de Oxigênio” (ERO), e os antioxidantes, como as
enzimas Superóxido Dismutase (SOD) e Catalase (CAT), a favor dos oxidantes. Sendo assim, este
estudo teve como objetivo investigar em modelo animal, a homeostase redox em órgãos alvos
da infecção. Primeiramente camundongos BALB/c de 21 dias de vida foram infectados via
subcutânea com 6x106 Unidades Formadoras de Placas (UFP) do OROV e monitorados por 21
dias quanto ao desenvolvimento da doença e sobrevida. Os animais desenvolveram doença
aguda autolimitada, com menor ganho de peso entre os dias 2 e 5, sem mortalidade. Para os
próximos experimentos, os animais foram infectados da mesma forma e eutanasiados no 4º dia
pós infecção (dpi). Ao final desse período, os animais infectados apresentaram aumento
significativo do baço, leucopenia, anemia e trombocitopenia. Ainda, desenvolveram anticorpos
neutralizantes anti-OROV, aumento dos níveis séricos das transaminases hepáticas (AST/ALT) e
das citocinas pró-inflamatórias Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e Interferon-γ (IFN-γ). O
genoma do OROV e partículas virais infecciosas foram detectados no fígado e baço dos animais.
A histopatologia revelou inflamação hepática e aumento do número e área total de nódulos
linfóides no baço. No que diz respeito à homeostase redox, a infecção pelo OROV levou a um
aumento dos níveis de ERO e dos biomarcadores de estresse oxidativo malondialdeído (MDA) e
proteína carbonilada no fígado e baço. Ainda, nesses mesmos órgãos, a infecção pelo OROV
levou a uma diminuição nas atividades das enzimas SOD e CAT. Juntos, estes resultados mostram
que a infecção pelo OROV culmina com desequilíbrio na homeostase redox e consequente
estresse oxidativo em órgãos alvos da infecção, ajudando a elucidar alguns aspectos importantes
que podem contribuir na patogênese da Febre Oropouche.
Palavras-chave: vírus Oropouche, estresse oxidativo, patogênese

iv
Menegatto, M.B.S

ABSTRACT

Oropouche orthobunyavirus (OROV) is the arbovirus that causes Oropouche fever, the
symptoms of which are common to most arboviruses such as high fever, headache, myalgia,
arthralgia, photophobia, dizziness, nausea and vomiting. More than half a million people have
been infected with OROV since its isolation in 1955. Although Oropouche fever is classified as a
neglected and emerging disease, to date, there are no antiviral drugs or vaccines available
against the infection and little is known about its pathogenicity. Thus, studies that seek to
understand the mechanisms involved in the pathogenesis of OROV are extremely important. In
this sense, literature data have shown that oxidative stress may be involved in the pathogenesis
of several viral agents, such as Dengue, Zika, Chikungunya and Mayaro. Oxidative stress is the
condition established when there is an imbalance between oxidants, such as “Reactive Oxygen
Species” (ROS), and antioxidants, such as Superoxide Dismutase (SOD) and Catalase (CAT)
enzymes, in favor of oxidants. Therefore, this study aims to investigate, using an animal model,
the redox homeostasis in target organs of the infection. First, 21-day-old BALB/c mice were
subcutaneously infected with 6x106 Plaque Forming Units (PFU) of OROV and monitored for 21
days for disease development and survival. The animals were susceptible to infection however
they developed acute self-limiting disease. Infected animals stopped gaining weight from days
2 to 5 post infection (dpi). From then on, 4 dpi was defined as the day of euthanasia for the
following experiments. At the end of 4dpi, the infected animals showed a significant
enlargement of the spleen, leukopenia, anemia and thrombocytopenia. They developed anti-
OROV neutralizing antibodies, increased liver transaminases and increased serum levels of the
pro-inflammatory cytokines Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α) and Interferon-γ (IFN-γ). Viral
genome and infectious viral particles were detected in liver and spleen of the animals.
Histopathology revealed liver inflammation and increased number of total area and number of
lymphoid nodules in the spleen. With regard to redox homeostasis, OROV infection led to
increased levels of ROS and the oxidative stress biomarkers malondialdehyde (MDA) and protein
carbonyl in the liver and spleen. Also, in these same organs, OROV infection led to a decrease in
the activities of SOD and CAT enzymes. Together, these results show that OROV infection
culminates in an imbalance in redox homeostasis and consequent oxidative stress in target
organs of the infection, helping to elucidate some important aspects that may contribute to the
pathogenesis of Oropouche Fever.

Keywords: Oropouche virus, oxidative stress, pathogenesis

v
Menegatto, M.B.S

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Esquema ilustrativo da partícula viral do vírus Oropouche e organização do

genoma....................................................................................................................................... 15
Figura 2: Esquema representativo do tamanho dos fragmentos genômicos e regiões de leitura
OROV cepa BeAn19991 .............................................................................................................. 16
Figura 3: Ciclo de multiplicação dos Orthobunyavirus ................................................................ 18
Figura 4: Ciclos de transmissão urbana e silvestre do vírus Oropouche .................................... 20
Figura 5: Histórico do vírus Oropouche no Brasil ........................................................................ 22
Figura 6: Distribuição geográfica de surtos relatados da Febre Oropouche desde o isolamento
do OROV em 1955 ..................................................................................................................... 24
Figura 7: Decomposição e detoxificação de espécies reativas de oxigênio pela ação das enzimas
antioxidantes ............................................................................................................................. 31
Figura 8: Susceptibilidade de camundongos BALB/c à infecção pelo OROV ............................. 50
Figura 9: Alterações nos parâmetros hematológicos no sangue de animais infectados com
OROV.......................................................................................................................................... 51
Figura 10: Aumento dos níveis séricos de AST/ALT em camundongos infectados com
OROV.......................................................................................................................................... 52
Figura 11: Análise histopatológica do fígado de camundongos controle e infectados com
OROV.......................................................................................................................................... 53
Figura 12: Análise histopatológica do baço de camundongos controle e infectados com
OROV.......................................................................................................................................... 54
Figura 13: Carga viral do OROV no fígado e baço dos animais infectados ................................. 55
Figura 14: A infecção pelo OROV induz aumento da produção de ERO, estresse oxidativo e
diminuição da atividade do sistema antioxidante endógeno em camundongos
BALB/c........................................................................................................................................ 57
Figura 15: A infecção pelo OROV aumento os níveis séricos de citocinas pró-
inflamatórias............................................................................................................................... 58

vi
Menegatto, M.B.S

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 9
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................................... 11
1.1 – Arboviroses emergentes ................................................................................................ 11
1.2 – Família Peribunyaviridae, gênero Orthobunyavirus ....................................................... 12
1.3 – O vírus Oropouche ......................................................................................................... 14
1.3.1 – Estrutura e genoma do OROV ................................................................................. 14
1.3.2 – Ciclo de multiplicação.............................................................................................. 16
1.3.3 – Ciclos de transmissão .............................................................................................. 18
1.3.4 – Distribuição geográfica ............................................................................................ 20
1.3.5 – A Febre Oropouche ................................................................................................. 24
1.3.6 – Patogênese da Febre Oropouche ............................................................................ 26
1.4 – Espécies reativas, antioxidantes e o estresse oxidativo................................................. 28
1.5 – Estresse oxidativo na patogênese de infecções virais.................................................... 32
2. JUSTIFICATIVA ......................................................................................................................... 34
3. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 35
3.1 – Objetivo geral ................................................................................................................. 35
3.2 – Objetivos específicos ...................................................................................................... 35
3.2.1 - Em camundongos BALB/c adultos (3 semanas) infectados ou não com OROV,
avaliar durante 21 dias: ....................................................................................................... 35
3.2.1 - Em camundongos BALB/c adultos (3 semanas) infectados ou não com OROV,
avaliar no 4º dpi: ................................................................................................................. 35
4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................... 36
4.1 – Cultivo celular e estoque viral ........................................................................................ 36
4.1.1 – Cultivo celular .......................................................................................................... 36
4.1.2 – Origem do vírus e estoque viral .............................................................................. 36
4.1.3 – Titulação viral .......................................................................................................... 37
4.2 – Animais e Delineamento experimental .......................................................................... 37
4.2.1 – Origem dos animais ................................................................................................. 37
4.2.2 – Delineamento experimental.................................................................................... 38
4.3 – Avaliação massa corpórea .............................................................................................. 39
4.4 – Avaliação de hepatomegalia e esplenomegalia ............................................................. 39
4.5 – Parâmetros Hematológicos ............................................................................................ 39
4.6 – Anticorpos neutralizantes anti-OROV ............................................................................ 39
4.7 – Dosagens das transaminases hepáticas ......................................................................... 40

vii
Menegatto, M.B.S

4.8 – Quantificação de citocinas pró-inflamatórias por citometria de fluxo .......................... 40

4.9 – Análises histológicas ....................................................................................................... 41
4.10 – Determinação da carga viral ........................................................................................ 41
4.11 – Quantificação do genoma viral por qPCR..................................................................... 42
4.11.1 – Extração de RNA .................................................................................................... 42
4.11.2 – Síntese de cDNA por RT-PCR ................................................................................. 42
4.11.3 – qPCR ...................................................................................................................... 42
4.12 – Quantificação das Espécies Reativas de Oxigênio (ERO).............................................. 43
4.13 – Dosagens dos biomarcadores de estresse oxidativo ................................................... 43
4.13.1 – Ensaio de oxidação de lipídeos pelo método de TBARS........................................ 43
4.13.2 – Ensaio de proteína carbonilada ............................................................................. 45
4.14 – Sistema de defesa antioxidante ................................................................................... 46
4.14.1 – Ensaio enzima Superóxido Dismutase (SOD) ........................................................ 46
4.14.2 – Ensaio enzima catalase (CAT) ................................................................................ 46
4.15 – Quantificação proteínas totais ..................................................................................... 47
4.16 – Análise Estatística ......................................................................................................... 48
5. RESULTADOS ........................................................................................................................... 49
5.1 – Avaliação da susceptibilidade dos camundongos à infecção pelo OROV ..................... 49
5.2 – A infecção pelo OROV resulta em danos ao fígado e baço em camundongos BALB/c . 52
5.3 – Avaliação da carga viral ................................................................................................. 54
5.4 – A infecção pelo OROV induz aumento de ERO e altera a homeostase redox no fígado e
baço dos animais ..................................................................................................................... 55
5.5 – A infecção pelo OROV aumenta os níveis de citocinas pró-inflamatórias .................... 58
6. DISCUSSÃO .............................................................................................................................. 58
7. CONCLUSÕES ........................................................................................................................... 62
REFERÊNCIAS ............................................................................................................................... 63
ANEXOS ....................................................................................................................................... 71

viii
Menegatto, M.B.S

INTRODUÇÃO

A ocorrência de epidemias causadas por vírus no Brasil e no mundo é alta e de grande

preocupação aos órgãos sanitários e de saúde. Dentre elas, destacam-se as arboviroses, aquelas
transmitidas ao homem por vetores artrópodes. Na última década foi registrada a disseminação
global de importantes arbovírus como Dengue virus (DENV), Zika virus (ZIKV), Chikungunya virus
(CHIKV) e Yellow Fever virus (YFV) (WEAVER et al., 2018) , além do Mayaro virus (MAYV) (HOTEZ
et al., 2017) e Oropouche virus (OROV) (ROMERO-ALVAREZ et al., 2018) nas Américas.
No entanto, apesar desses patógenos infectarem milhões de pessoas e terem grande
impacto econômico na saúde pública mundial, a maioria permanece negligenciada (PEREIRA et
al., 2021), inclusive o OROV. No Brasil, a doença decorrente da infecção pelo OROV, chamada
Febre Oropouche, é a segunda arbovirose mais comum na Amazônia Legal, depois da Dengue
(SCIANCALEPORE et al., 2022). Ainda, a Febre Oropouche é pouco estudada, subnotificada, uma
vez que os sintomas febris iniciais são praticamente indistinguíveis da Dengue, Zika e
Chikungunya, e atualmente não existe diagnóstico específico (PEREIRA et al., 2021; SAKKAS et
al., 2018).
O OROV pertencente à família Peribunyaviridae e ao gênero Orthobunyavirus (ICTV,
2023). Ele foi isolado pela primeira vez em 1955 em Trinidad e Tobago e, desde seu primeiro
isolamento, já causou infecções em mais de meio milhão de pessoas em países da América do
Sul e Central (SAKKAS et al., 2018). No Brasil, o OROV foi isolado em 1960 no sangue de uma
preguiça (Bradypus trydactilus) no estado do Pará e, um ano depois causou uma epidemia na
capital Belém, onde foram infectadas aproximadamente 11.000 pessoas (DA ROSA et al.,
2017). Desde então, inúmeros surtos de OROV foram relatados em cidades de outros estados
brasileiros do norte, nordeste, sudeste e centro-oeste (ROMERO-ALVAREZ et al., 2018), sendo
considerado um arbovírus de capacidade emergente iminente.
A Febre Oropouche tem como sintomas febre alta, cefaleia, mialgia, artralgia, fotofobia,
tontura, náuseas e vômito, podendo evoluir para meningite. Embora não exista registro de
óbito decorrente da infecção, a doença causa uma elevada perda de produtividade e
sobrecarrega os serviços médicos públicos (DA ROSA et al., 2017). Já foram descritos casos de
infecção humana em que o OROV atingiu o sistema nervoso central com comprometimento
neurológico e alterações nas transaminases hepáticas (SAKKAS et al., 2018). Além disso, estudos
in vivo em hamsters e camundongos BALB/c mostram que o fígado é um importante sítio
para a multiplicação do OROV, podendo resultar em hepatite necrosante aguda. Após a

9
Menegatto, M.B.S

multiplicação nesse órgão, o vírus atinge a corrente sanguínea e pode alcançar o SNC e causar
danos neurológicos (RODRIGUES et al., 2011; SANTOS et al., 2012, 2014).
Apesar de toda sua importância, até o momento, não há medicamentos antivirais ou
vacinas disponíveis contra a infecção pelo OROV e ainda, pouco se sabe sobre os mecanismos
envolvidos em sua patogênese, incluindo aqueles relacionados a resposta do hospedeiro que
contribuem para os danos teciduais. Nesse sentido, este trabalho busca elucidar possíveis
fatores que participam da patogênese do OROV.
Nesse contexto, é crescente o número de trabalhos da literatura demonstrando que o
estresse oxidativo contribui para a patogênese de vários agentes virais, como os vírus das
Hepatites C e B, Influenza, Encefalite Japonesa, Dengue, Imunodeficiência humana (HIV), vírus
Respiratório Sincicial, Chikungunya, Mayaro, ZIKV e Coronavirus 2 da síndrome respiratória
aguda grave (SARS-CoV2) (ALMEIDA et al., 2020; BOLUKBAS et al., 2005; CAMINI et al., 2017;
CECCHINI et al., 2020; HOSAKOTE et al., 2009; JOUBERT et al., 2012; LIU et al., 2017; PACE et al.,
1995; RAUNG et al., 2001; SOUNDRAVALLY et al., 2008; TARDIF et al., 2005). O estresse oxidativo
é a condição que se estabelece quando há um desbalanço do controle e sinalização redox
(JONES, 2006) . Esse desequilíbrio é decorrente de um aumento da produção dos oxidantes,
como as “Espécies Reativas de Oxigênio” (ERO), ou uma depleção dos antioxidantes, como as
enzimas Superoxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e Glutationa Peroxidase (GPx). Quando
em excesso, essas espécies reativas podem causar danos ao DNA, lipídeos e proteínas,
com consequente perda da integridade e funcionalidade celular e danos aos órgãose e
tecidos (HALLIWELL et al., 1994; SIES et al., 2017). No contexto das infecções virais, baixas
concentrações de ERO induzem a proliferação celular e a maioria dos vírus multiplica melhor em
células que estão proliferando. No entanto, com o progresso da infecção, mais ERO são
formadas a fim de conter o vírus e um aumento na produção dessas espécies culmina no
estresse oxidativo e seus efeitos tóxicos para o hospedeiro. Além disso, alterações no
status redox nas células hospedeiras podem selecionar populações virais mutantes, bem
como ativar fatores de transcrição, como o fator nuclear kappa B (NF-kB), os quais favorecem a
multiplicação viral. Uma vez que o NF-kB é liberado, ele transloca para o núcleo e se liga ao DNA
celular, induzindo consequentemente a transcrição de genes celulares e/ou virais (CAMINI et
al., 2017; SCHWARZ, 1996).
Assim, desde que o estresse oxidativo está relacionado à patogênese de um grande
número de doenças virais e ainda muitos aspectos da infecção pelo OROV precisam ser
elucidados, este estudo teve como objetivo investigar se a infecção pelo OROV em modelo
murino culmina na desregulação da homeostase redox e o estresse oxidativo. Entender melhor

10
Menegatto, M.B.S

estes mecanismos são de primordial importância, visto ser essa doença um problema de saúde
pública e caráter emergente.

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1 – Arboviroses emergentes

Os arbovírus são vírus zoonóticos de genoma RNA e agentes causadores de doenças em animais
e humanos, que provocam grande prejuízo econômico e social e estão distribuídos em todo o
mundo (PAPA, 2019). São assim chamados pois se multiplicam em vetores artrópodes
(“arthopod-born viruses”), como mosquitos e carrapatos, e em vertebrados. Uma vez infectados,
os vetores transmitem o vírus ao se alimentarem de sangue animal, por exemplo de pássaros e
mamíferos. O ciclo de manutenção desses arbovírus na natureza é mantido no momento em
que novos vetores se alimentam desses animais infectados e/ou no processo de transmissão
vertical (transovariana), quando o vetor artrópode passa o vírus para sua progênie (FIGUEIREDO,
2007; SHOPE et al., 1997).
A emergência de arbovírus acontece por diversos fatores. Geralmente é iniciada por um
evento de infecção por transbordamento, ou seja, o patógeno que anteriormente era
transmitido por mosquitos que picavam animais selvagens (ciclo silvestre) passa a ser
transmitido por vetores que infectam humanos (ciclo urbano), rompendo a barreira entre
espécies (LAMBRECHTS, 2023; SCIANCALEPORE et al., 2022), como aconteceu com os vírus da
Febre Amarela, Dengue, Chikungunya e Zika (LAMBRECHTS, 2023; SCIANCALEPORE et al., 2022).
Além disso, a (re)emergência é um fenômeno natural relacionado à evolução e
adaptação viral. Quando o vírus infecta vários organismos, o hospedeiro pode vir a produzir
cepas mais virulentas ou adaptadas. Uma importante causa de mutação de vírus com genoma
RNA é a recombinação do genoma em uma infecção simultânea de um hospedeiro por mais de
um vírus da mesma família ou gênero (PAPA, 2019; FIGUEIREDO, 2007; WEAVER et al., 2010).
Neste caso, como consequência da alta taxa da mutação do genoma, uma mudança de
aminoácidos no material genético pode resultar em uma nova competência vetorial, como
aconteceu com o CHIKV. Uma única mudança de aminoácido no genoma viral tornou o Ae.
Albopictus susceptível à infecção e disseminação do CHIKV, causando uma epidemia em 2005 e
2006 na Ilha da Reunião, na França (TSETSARKIN et al., 2007).
Outros fatores que contribuem para o surgimento das infecções virais são as mudanças
climáticas, o crescimento populacional urbano desordenado e o aquecimento global. As
mudanças no ecossistema geradas pelo homem perturbam o sistema natural dos arbovírus,

11
Menegatto, M.B.S

levando ao aumento da prevalência de um determinado vetor, criando novos hospedeiros

reservatórios, ou induzindo uma adaptação dos vírus transmitidos por vetores artrópodes a
novos ciclos de manutenção (LIMA-CAMARA, 2016; PAPA, 2019; PEREIRA et al., 2021;
FIGUEIREDO, 2007; WEAVER et al., 2010). Ainda, viagens e comércios entre estados e países
facilitam e contribuem para a expansão da população de vetores, invasão e disseminação dos
vírus em ambientes favoráveis à multiplicação, como áreas urbanizadas e com ilhas de calor
(LIMA-CAMARA, 2016; WEAVER et al, 2010).
Existem mais de 500 espécies de arbovírus diferentes pertencentes a mais de 14 famílias
virais registradas no Catálogo Internacional de Arbovírus (MADEWELL, 2020; RODRIGUES-ALVES
et al., 2020). A grande maioria dos arbovírus faz parte das famílias Flaviviridae, Peribunyaviridae,
Togaviridae, Reoviridae e Orthomyxoviridae. De todos esses arbovírus catalogados, mais de 150
são agentes etiológicos de patologias humanas (CLETON et al., 2012; MADEWELL, 2020;
RODRIGUES-ALVES et al., 2020).
No mundo, principalmente em países da América Latina, tem sido observada a
(re)emergência de arboviroses causadas pelo CHIKV, MAYV e Venezuelan equine encephalitis
virus (VEE) , pertencentes à família Togaviridae; West Nile virus (WNV), YFV, DENV, ZIKV e Saint
Louis encephalitis virus (SLEV), da família Flaviviridae; e o OROV, da família Peribunyaviridae
(FIGUEIREDO, 2007; LIMA-CAMARA, 2016; PEREIRA et al., 2021; WEAVER et al., 2010). As
manifestações clínicas dessas infecções virais são parecidas e podem ser classificadas em 4
principais síndromes: doença febril leve ou grave, erupção cutânea e artralgia, síndrome
neurológica e síndrome hemorrágica. Porém outros sintomas podem também ser observados,
como hepatite, broncopneumonia e conjuntivite (CLETON et al., 2012). Devido à similaridade
dos sintomas, muitas das arboviroses são subnotificadas e o diagnóstico não é correto na
maioria dos casos (LORENZ et al., 2017).

1.2 – Família Peribunyaviridae, gênero Orthobunyavirus

A família Peribunyaviridae está inserida no reino Riboviria, filo Negarnaviricota, subfilo

Polyploviricotina, classe Ellioviricetes, e ordem Bunyavirales. Compreende 7 gêneros, sendo eles
Herbevirus, Khurdivirus, Lakivirus, Lambavirus, Orthobunyavirus, Pacuvirus e Shangavirus, sendo
141 espécies de importância humana e veterinária (ICTV, 2023). A maioria dos vírus
pertencentes a essa família são arbovírus, sendo assim mantidos em ciclos de transmissão
vertebrados-artrópodes. Alguns são considerados específicos de artrópodes e não infectam
vertebrados (HUGHES et al., 2020).

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Menegatto, M.B.S

Os vírions da família Peribunyaviridae são esféricos ou pleomórficos, com tamanho

variando de 80 a 120nm de diâmetro. A superfície viral é envolta em um envelope lipídico com
projeções de heterodímeros de glicoproteínas (Gc e Gn) incorporadas. As glicoproteínas de
superfície possuem de 5-18nm de comprimento e formam uma rede compacta organizadas de
forma semelhante a um tripé. O genoma consiste em 3 fragmentos de RNA senso negativo que
codificam 4 proteínas estruturais e 2 não estruturais, como será melhor descrito no item
seguinte desta revisão (ELLIOTT, 2014; HUGHES et al., 2020).
Grande parte dos vírus, inclusive os mais estudados da família Peribunyaviridae,
pertencem ao gênero Orthobunyavirus e estão distribuídos no mundo todo em áreas tropicais,
de clima temperado e também na região Ártica. Os Orthobunyavirus já foram isolados de
esquilos, morcegos, pássaros e preguiça, e englobam uma ampla gama de hospedeiros
vertebrados, incluindo primatas não humanos e humanos (ZHAO et al., 2021).
Fazem parte desse gênero 129 espécies, divididas em 18 sorogrupos (ICTV, 2023). Entre
os principais sorogrupos estão Bunyamwera, Califórnia e Simbu. Pertencentes ao sorogrupo
Bunyamwera, os vírus Bunyamwera (BUNV), Cache Valley (CVV), Germinston (GERV), Ilesha
(ILEV), Fort Sherman (FSV) e o Guaroa (GROV) são responsáveis por patologias humanas cujos
sintomas variam de doença febril leve a aguda. Em animais ruminantes, BUNV e CVV causam
sintomas graves ocasionando aborto espontâneo e efeitos teratogênicos (AYERS et al., 2019;
GARCIA-SASTRE et al., 2010; ZHAO et al., 2021). O sorogrupo Califórnia compreende vírus
isolados de mosquitos que causam em humanos doença febril com envolvimento do sistema
nervoso central, podendo levar a encefalite e/ou meningoencefalite. Fazem parte desse
sorogrupo o vírus Encefalite da California (CEV), Jamestown Canyon (JCV), La Crosse (LCV),
Snowshoe hare (SSHV), Tahyna virus (TAHV), entre outros (EVANS et al. 2019; WEBSTER et al.,
2017).
Em relação ao sorogrupo Simbu, este é dividido em 2 subclados filogenéticos, subclado
A (denominado Manzanilla e Oropouche) e subclado B (Simbu, Akabane, Sathupero, Shamonda
e Shuni). As espécies virais do sorogrupo Simbu possuem alta diversidade genética devido à
ampla distribuição geográfica e adaptação a diversos ambientes. Os vírus pertencentes ao
subclado B não infectam humanos ou primatas, entretanto vários deles causam doenças
importantes no gado. Já os do complexo Oropouche, únicos que causam patologias humanas,
compreende os vírus Oropouche (OROV), Jatobal (JATV), Iquitos (IQTV), Leanyer (LEAV), Oya
(OYV) e Thimiri (THIV) (GARCIA-SASTRE et al., 2010; SAKKAS et al., 2018; WANG et al., 2019).

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Menegatto, M.B.S

1.3 – O vírus Oropouche

O OROV foi isolado pela primeira vez em 1955 (cepa TRVL 9760), no sangue de um trabalhador
florestal residente na Vila Vega de Oropouche, em Trinidad e Tobago, que apresentou febre, dor
nas costas e tosse (HENRY et al., 2018). Na época nenhum outro caso febril foi relatado,
entretanto foram encontrados anticorpos neutralizantes anti-OROV no sangue de 3 das 46
pessoas que passaram por testes sorológicos (TILSTONLUNEL, 2017). Cinco anos depois, em
1960, uma outra cepa de OROV (TRVL 35111) foi isolada também de um pool de 177 mosquitos
Coquillettidia venezuelensis coletados na floresta Bosh Bosh, no mesmo país. Ambas as cepas
foram relacionadas antigenicamente por testes de fixação de complemento e de neutralização
(DA ROSA et al., 2017).
Aqui no Brasil, o OROV teve seu primeiro isolamento em 1960, do sangue de uma
preguiça (Bradypus trydactilus) capturada em uma área de floresta, durante a construção da
rodovia que interligava Belém a Brasília. Ainda, foi detectado o vírus em um pool de mosquitos
Ochlerotatus serratus coletados na mesma região (DA ROSA et al., 2017). No ano seguinte já
acontecia a primeira epidemia da Febre Oropouche, na cidade de Belém, com mais de 11.000
infectados. Desde então, o OROV demonstrou seu potencial epidêmico e mais de meio milhão
de pessoas já foram infectadas em mais de 30 epidemias (SAKKAS et al., 2018). Atualmente o
OROV se distribui geograficamente na América, em países como Brasil, Peru, Panamá, Argentina
(TILSTONLUNEL, 2017), Guiana Francesa (GAILLET et al., 2021) e Haiti (ELBADRY et al., 2021).

1.3.1 – Estrutura e genoma do OROV

Assim como a maioria dos vírus pertencentes ao gênero Orthobunyavirus, a partícula viral do
OROV é esférica, de 80 e 120nm de diâmetro, envolvida em um envelope lipídico com
glicoproteínas de superfície aderidas (Gc e Gn). Internamente, apresenta três segmentos de
genoma RNA fita simples, senso negativo, denominados S (small), M (medium) e L (large)
conforme o número relativo de nucleotídeos de cada segmento: pequeno (1 kilobase de
tamanho), médio (4.5 kb) e grande (6.9 kb), respectivamente. Os fragmentos de genoma são
circundados pelo nucleocapsídeo helicoidal com a proteína N e conectados individualmente com
a proteína L (RNA polimerase dependente de RNA viral, RdRp), formando assim os 3 complexos
chamados de ribonucleoproteínas (RNP), como mostrado na Figura 1 (PEREIRA et al., 2021;
ROMERO-ALVAREZ et al., 2018; SAKKAS et al., 2018; DA ROSA et al., 2017).

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Menegatto, M.B.S

Figura 1: Esquema ilustrativo da partícula viral do vírus Oropouche e organização do genoma

Fonte: Adaptado de Romero-Alvarez et al. (2018)

O genoma do protótipo brasileiro (cepa OROV BeAN 19991) foi sequenciado e mostrou
que o segmento S possui 958 nucleotídeos, o M 4.385 nucleotídeos, enquanto o L apresenta
6.852 nucleotídeos. As sequências de codificação dos 3 segmentos são flanqueadas por duas
regiões não codificantes terminais, 5’ e 3’, que embora possuam números diferentes de
nucleotídeos, onze são altamente conservados entre si. O fragmento S possui duas regiões
codificantes (ORF – “open reading frame”) sobrepostas que serão traduzidas na proteína
estrutural N, do nucleocapsídeo (26,26 kDa de tamanho), cuja função é de proteção do genoma
quando encapsidado, e também na proteína NSs não estrutural (10,65 kDa). Já o RNA M possui
uma única ORF que codifica uma poliproteína posteriormente clivada em 3 proteínas, duas
glicoproteínas de superfície Gn (28,3 kDa) e Gc (107,14 kDa), que vão permitir a aderência e
penetração do OROV na célula hospedeira, e uma não estrutural, NSm (26,65 kDa). Por fim, o
maior fragmento de genoma contém uma ORF que codifica a proteína L, a RdRp (261,25 kDa),
responsável pela transcrição e replicação do genoma (FILES et al., 2022; TILSTONLUNEL, 2017;
DA ROSA et al., 2017). A Figura 2 ilustra os 3 fragmentos de genoma e suas respectivas proteínas
virais traduzidas.
Em relação às proteínas não estruturais, TilstonLunel e colaboradores (2016) realizaram
estudos utilizando genética reversa com a ausência dessas proteínas e demonstraram que a
NSm é dispensável para a replicação do OROV em células de mamíferos e mosquitos, enquanto
a NSs é um importante gene de virulência atuando contra o sistema imunológico inato das
células hospedeiras, uma vez que a proteína atua como antagonista do interferon tipo I,
permitindo assim que o vírus se replique eficientemente na célula (TILSTONLUNEL et al., 2016;
DA ROSA et al., 2017)

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Menegatto, M.B.S

Figura 2: Esquema representativo do tamanho dos fragmentos genômicos e regiões de leitura

OROV cepa BeAn19991

Fonte: Adaptado de Da Rosa et.al. (2017)

Devido ao genoma fragmentado, acontece com frequência na natureza o evento

denominado rearranjo genético entre os vírus do mesmo gênero e mesmo sorogrupo. Esses
rearranjos surgem em uma co-infecção de dois vírus diferentes na mesma célula, sendo que a
partícula viral da progênie pode conter segmentos de genoma derivados de ambos os “pais”. O
rearranjo é comum entre vírus segmentados de outras famílias também, entretanto o
surgimento de um novo vírus traz consigo a preocupação de uma patogenicidade aumentada.
Alguns novos vírus recombinantes envolvendo o OROV e demais vírus do sorogrupo Simbu já
foram descritos, como o vírus Iquitos (IQTV), o vírus Madre de Dios (MDDV) e o vírus Perdões
(PDEV). Estes vírus recombinantes contêm os segmentos S e L provenientes do OROV, e os
segmentos M de outros vírus ainda não reconhecidos do sorogrupo Simbu (ELLIOTT, 2014;
NAVARRO et al., 2016; PEREIRA et al., 2021; SAKKAS et al., 2018; DA ROSA et al., 2017).

1.3.2 – Ciclo de multiplicação

O ciclo de multiplicação do OROV pode ser representado pelo ciclo geral dos Orthobunyavirus,
mostrado na Figura 3. A adsorção do vírus envolve a interação entre as glicoproteínas Gn e/ou
Gc (adesinas) e os receptores na superfície da célula do hospedeiro (passo 1). Em seguida, a
penetração da partícula viral é dada por endocitose mediada por clatrina (passo 2), e o
endossomo acidificado libera o genoma no citoplasma (desnudamento) (passo 3). Após o
desnudamento, ocorre a transcrição primária catalisada pela RdRp (passo 4), momento em que
é sintetizado o mRNA viral (antigenoma) que posteriormente é traduzido nas proteínas virais
(passo 5), onde Gn e Gc dimerizam no retículo endoplasmático (RE) e complexo de Golgi. Em

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Menegatto, M.B.S

seguida, os 3 fragmentos de genoma viral senso negativo (RNA genômico – gRNA) são transcritos
em antigenomas (agRNA), fita molde (template) para a replicação na fábrica viral (passo 6). A
mudança da transcrição para a replicação não é muito clara, porém é necessário um número de
proteínas N suficientes para encapsular os antigenomas e genomas na replicação. Apenas as
proteínas RdRp e do nucleocapsídeo (N) são necessárias nos processos de transcrição e
replicação. A fita do antigenoma produzido na replicação é sempre encapsulada pela proteína
N na célula hospedeira, de modo a evitar interações com a fita molde na transcrição e também
minimizar a formação de fitas duplas de RNA (dsRNA) evitando sua detecção pela resposta
imune do hospedeiro. No próximo passo, as ribonucleoproteínas (genoma encapsidado) são
transportadas para as membranas do complexo de Golgi modificadas por Gn e Gc, e assim as
novas partículas virais são montadas e brotam nas vesículas derivadas da membrana do
complexo de Golgi (passo 7). Em seguida, essas vesículas contendo as partículas virais são
transportadas até a superfície celular via exocitose (passo 8), ocorrendo a fusão das membranas
da vesícula com a plasmática, facilitada pelos filamentos de actina (passo 9), e finalmente as
novas partículas virais infecciosas são liberadas da célula hospedeira (passo 10) (ELLIOTT, 2014).

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Menegatto, M.B.S

Figura 3: Ciclo de multiplicação dos Orthobunyavirus

Fonte: Adaptado de Elliot (2014)

1.3.3 – Ciclos de transmissão

O OROV é mantido na natureza por meio de dois ciclos, silvestre e urbano. Embora dados
existentes na literatura a respeito da detecção de OROV em hospedeiros reservatórios sejam
limitados, já foram detectados anticorpos anti-OROV no sangue de hospedeiros vertebrados
como preguiças (Bradypus tridactylus), primatas não humanos como macacos-prego (Sarajus
spp.), macacos bugios pretos e dourados (Alouatta caraya), saguis de tufos pretos (Callithrix
penicillata), roedores (Proechimys spp.) e pássaros selvagens (Fringillidae, Thaurapidae,
Columbidae). Em relação aos vetores artrópodes, que são infectados e transmitem o vírus para
novos hospedeiros, o OROV já foi isolado de mosquitos silvestres como Aedes (Ochlerotatus)
serratus, Coquilletidia venezuelensis, Culex quinquefasciatus e Culicoides paraensis
(MENDONÇA et al., 2021; PEREIRA et al., 2021; SAKKAS et al., 2018; DA ROSA et al., 2017).
Em relação ao ciclo urbano, o OROV ainda não tem um ciclo permanente bem
estabelecido. O homem é o único hospedeiro vertebrado envolvido (PEREIRA et al., 2021), uma
vez que estudos demonstraram que animais domésticos, como cães, gatos e galinhas não estão

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Menegatto, M.B.S

implicados nesse ciclo de transmissão. Ainda, o homem é o elo que liga o ciclo silvestre ao ciclo
urbano, pois pode se infectar ao invadir áreas de florestas e em seguida retorna às áreas urbanas
durante o período de viremia (PEREIRA et al., 2021; ROMERO-ALVAREZ et al., 2018; DA ROSA et
al., 2017). Até o presente momento a transmissão urbana do OROV por mosquitos antropofílicos
não é conhecida, como ocorre em outras arboviroses como dengue, zika e chikungunya. No
entanto, várias evidências sugerem que esse arbovírus tem o potencial de estabelecer ciclos
urbanos permanentes (MENDONÇA et al., 2021).
Em relação aos vetores do ciclo urbano, o OROV já foi isolado de Culicoides paraensis,
cujo nome popular é “maruim” ou “borrachudo”, e de Culex quinquefasciatus durante períodos
epidêmicos (MENDONÇA et al., 2021; DA ROSA et al., 2017). O Culicoides paraensis é tratado
como vetor principal (PEREIRA et al., 2021), implicado em epidemias envolvendo até 100.000
infectados e, fortes evidências demonstram eficiência do artrópode em transmitir a doença,
mesmo se alimentando experimentalmente de sangue com baixos títulos virais (PEREIRA et al.,
2021; WIRTH et al., 1989). Além disso, estudos demonstraram que os C. paraensis tem potencial
de transmissão do OROV a hamsters após 5 ou mais dias se alimentando do sangue de pacientes
infectados. Esse importante vetor possui hábitos diurnos e é amplamente distribuído em áreas
tropicais e subtropicais dos países da América, incluindo o Brasil, e ainda é encontrado em alta
densidade em períodos epidêmicos (FILES et al., 2022; SAKKAS et al., 2018; DA ROSA et al.,
2017).
Estudos realizados por Hoch e colaboradores (1987), mais recentemente Mendonça e
colaboradores (2021) e também McGregor e colaboradores (2021) mostraram baixa ou
nenhuma eficiência de transmissão do OROV por mosquitos Cx. quinquefasciatus (HOCH et al.,
1987; MCGREGOR et al., 2021; MENDONÇA et al., 2021). No entanto, Cardoso e colaboradores
(2015) detectaram o fragmento S do genoma do OROV nessa espécie de vetor sugerindo a
provável participação do Cx. quinquefasciatus no ciclo urbano do OROV (CARDOSO et al., 2015).
Nesse sentido, Mendonça e colaboradores (2021) testaram a infecção do OROV em Cx.
quinquefasciatus, Ae. aegypti e Ae. albopictus contornando a barreira do intestino médio dos
mosquitos e infectando o OROV sistematicamente no corpo dos artrópodes. Dessa forma, foi
observado altas taxas de infecção nas três espécies testadas, mostrando que o vírus é capaz de
infectar e multiplicar em tecidos da cabeça, tórax e abdômen. Ou seja, Cx. quinquefasciatus, Ae.
aegypti e Ae. albopictus possuem receptores necessários para que o OROV tenha aderência às
suas células e sejam internalizados de forma eficiente (MENDONÇA et al., 2021).
Em posse dessas informações, O OROV tem potencial não só de estabelecer ciclos
urbanos permanentes no Brasil e em países das Américas, mas também de expandir para novas
regiões e continentes. Embora seja difícil prever uma mutação adaptativa do OROV que resulte

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Menegatto, M.B.S

em uma competência vetorial eficiente de novos vetores, uma vez que isso aconteça, torna-se
possível a re-emergência da febre Oropouche transmitida por importantes vetores de centros
urbanos/periurbanos, como o Aedes aegypti (MENDONÇA et al., 2021). A Figura 4 abaixo
esquematiza os ciclos de transmissão do OROV bem como os vetores e hospedeiros
reservatórios envolvidos.

Figura 4: Ciclos de transmissão urbana e silvestre do vírus Oropouche. Os vetores estão

representados por a (C. paraenses), b (Cx. quinquefasciatus) e c (C. paraensis, Cq. venezuelensis,
Ae. serratus, Cx. quinquefasciatus) e os hospedeiros por d (pássaros), e(preguiças) e f (macacos).

Fonte: Adaptado de Sakkas et.al. (2018)

1.3.4 – Distribuição geográfica

Desde seu primeiro isolamento em 1955, o OROV causou grandes epidemias e espalhou-se
principalmente pela região Amazônica do Brasil e por países como Panamá, Peru, Venezuela e
Argentina. A Figura 5 esquematiza uma linha do tempo ilustrando os principais fatos e surtos da
Febre Oropouche no Brasil. De 1960 a 1978, as epidemias causadas pelo OROV aparentemente
estavam restritas ao estado do Pará, na região norte do país. Foi em 1961 o primeiro surto
registrado, com mais de 11.000 casos de infecção humana. Desde então, ocorreram mais 7
surtos em pequenos e grandes centros urbanos do estado, com registros de cerca de 30.000
infectados. A literatura aponta que durante esses surtos, nos grandes centros urbanos o OROV
se limitava a alguns bairros, já em regiões de aldeias, se espalhava por toda parte sendo o C.

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Menegatto, M.B.S

paraensis e Cx. quinquefasciatus os vetores mais comuns nas áreas endêmicas. Entre os anos de
1980 e 1981 tem-se registro do OROV causando as duas maiores epidemias, em Belém (PA) e
em Manaus (AM), abrangendo a área de circulação do vírus, totalizando mais de 100.000
infecções humanas (SAKKAS et al., 2018; SCIANCALEPORE et al., 2022; DA ROSA et al., 2017). A
partir de então, na região Amazônica, foram relatados apenas casos esporádicos ou surtos
autolimitados, o que indica uma provável circulação silenciosa do OROV. Nesse período a
doença também se espalhou para outros estados da região norte, nordeste e centro-oeste do
Brasil, incluindo Amapá, Acre, Rondônia, Tocantins, Maranhão (SAKKAS et al., 2018) e Goiás
(ROMERO-ALVAREZ et al., 2018).
No ano de 2000, foi a primeira vez que o OROV foi isolado de uma espécie de macaco
(Callithrix sp) em Arinos, cidade do estado de Minas Gerais, na região sudeste do país (NUNES
et al., 2005). Este foi o primeiro isolamento do vírus fora da área epidemiológica conhecida,
demonstrando o potencial desse arbovírus de se espalhar para novas áreas e novos hospedeiros.
Além disso, o isolamento do OROV na região sudeste indica risco de maiores epidemias, uma
vez que é a região mais populosa do Brasil, incluindo capitais como Rio de Janeiro, São Paulo e
Belo Horizonte. Tais centros urbanos são caracterizados pela intensa migração de pessoas,
transporte que permite a disseminação de zoonoses, bem como turismo que atrai visitantes de
todos os lugares do mundo, que pode contribuir para a disseminação do OROV para fora do país
e até da América (SAKKAS et al., 2018). Em 2010 houve um segundo isolamento do OROV em
Callithrix sp na mesma região (DA ROSA et al., 2017).
De 2003-2004, no estado do Pará, foram relatados 2 pequenos surtos da Febre
Oropouche, em Parauapebas e Porto de Moz. Dois anos depois, em 2006, aconteceu mais uma
grande epidemia no estado, com mais de 18.000 infectados, demonstrando a re-emergência da
Febre Oropouche após 26 anos sem nenhum outro caso esporádico relatado. Essa lacuna
epidemiológica pode ser explicada pelo acúmulo de pessoas que ainda não haviam sido expostas
ao vírus, como os jovens e imigrantes. Nos anos seguintes, 2007 e 2008 foram notificados surtos
em Manaus (AM) e em 2011 a 2012 vários municípios do estado de Mato Grosso também
registraram surtos de infecção pelo OROV (SAKKAS et al., 2018). No ano de 2016 aconteceu o
primeiro caso de infecção humana pela Febre Oropouche fora da região Amazônica, dois
pacientes febris na cidade de Ribeirão Preto (SP) após viagem a áreas de floresta, Rondônia e
Porto Seguro (BA) (LUNA et al., 2017).

21
Menegatto, M.B.S

Figura 5: Histórico do vírus Oropouche no Brasil. Linha do tempo traçada com os principais fatos
e surtos da Febre Oropouche desde que OROV foi isolado, baseado nas revisões de Romero-
Alvarez et al (2018), Sakkas et al (2018) e Da Rosa et al (2017).

Fonte: Próprio autor

22
Menegatto, M.B.S

Fora do Brasil, foram registradas epidemias da Febre Oropouche no Panamá e no Peru.

No Panamá, o primeiro registro de circulação do OROV foi em 1989, na Vila de Bejuco, próximo
à capital do país. O vírus foi isolado de pacientes febris com suspeita de dengue, em um
programa de vigilância. Alguns anos depois, em 1992, a presença do OROV foi detectada em
pacientes febris que viviam no porto da cidade de Iquitos, maior cidade da Amazônia Peruana.
A partir de então, surtos foram registrados em várias cidades do Peru, incluindo as cidades de
Puerto Maldonado e Madre de Dios em 1994. Acredita-se que o vírus tenha entrado no país e
se espalhado pelas margens do rio Amazonas devido às atividades do homem e dos animais da
região. O surto mais recente no Peru foi em 2016 em Cusco. Além disso, estudos de vigilância
epidemiológica em humanos e mamíferos selvagens indicaram a circulação do OROV em países
como Trinidad, Argentina, Bolívia, Colômbia, Equador e Venezuela (ROMERO-ALVAREZ et al.,
2018; SAKKAS et al., 2018; DA ROSA et al., 2017).
Recentemente Ciuoderis e colaboradores (2022) detectaram a presença do OROV no
soro de pacientes com doença febril aguda, em quatro cidades da Colômbia, no período de 2019
a 2022 (CIUODERIS et al., 2022). Ainda, Elbadry e colaboradores (2021) demonstraram que
crianças do Haiti também foram infectadas em 2014. Este foi o primeiro registro da infecção
viral no país, entretanto só foram identificados porque os pacientes fizeram parte de um estudo
que buscou identificar a causa de doenças febris virais no Haiti (ELBADRY et al., 2021). Além
disso, houve detecção do genoma do OROV em 23 pacientes em Saül, na Guiana Francesa,
durante surto de COVID-19 e dengue em 2020 (GAILLET et al., 2021). Estes casos recentes
mostram a capacidade do OROV de se expandir geograficamente e também exemplificam a
subnotificação dos casos existentes devido aos sintomas inespecíficos e a falta de um
diagnóstico diferencial. A Figura 6 aponta a localização dos casos de infecção ao longo dos anos
e a capacidade do OROV de invadir novos limites geográficos.

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Menegatto, M.B.S

Figura 6: Distribuição geográfica de surtos relatados da Febre Oropouche desde o isolamento

do OROV em 1955. Os pontos vermelhos indicam os surtos com evidência sorológica e/ou
detecção do genoma viral.

Fonte: Files et.al., 2022

1.3.5 – A Febre Oropouche

A patologia causada pela infecção do OROV é denominada Febre Oropouche, uma doença febril
aguda autolimitada cujos sintomas se assemelham aos de outras arboviroses, incluindo febre
(~39°C), calafrios, dor de cabeça, mialgia, artralgia, tontura, mal-estar, náuseas, dor epigástrica,
vômitos, fotofobia e dor nos olhos. Também foram relatados, em raras ocasiões, erupção
cutânea no tronco e nos braços, sangramento espontâneo, manchas vermelhas pelo corpo,
sangramento nasal e gengival e também sinais clínicos relacionados ao sistema nervoso central

24
Menegatto, M.B.S

(SNC) como meningite asséptica ou meningoencefalite. Essas manifestações geralmente

acontecem em pessoas imunocomprometidas e também com ruptura prévia da barreira
hematoencefálica (BHE). Alguns pacientes apresentaram fraqueza física e perda de força por um
período de 2 a 4 semanas (ROMERO-ALVAREZ et al., 2018; SAKKAS et al., 2018; SCIANCALEPORE
et al., 2022; DA ROSA et al., 2017). Ocorre também aumento das enzimas hepáticas e leucopenia
(2.000 leucócitos/mL) (FILES et al., 2022).
O período de incubação da Febre Oropouche é de 3 a 8 dias (FILES et al., 2022). Passado
esse período, os infectados desenvolvem os sintomas listados acima e apresentam alta viremia,
podendo transmitir o vírus uma vez picados por mosquitos competentes. O período de fase
aguda é entre 2 a 7 dias. Após 3, 4 e 5 dias a viremia diminui, com redução do título viral de 72%,
44% e 23%, respectivamente (SAKKAS et al., 2018). Em mais ou menos 7 dias a maioria dos
pacientes sintomáticos se recupera espontaneamente. Entretanto, em 60% dos casos há
recorrência dos sintomas mais leves em um intervalo de duas a três semanas após
convalescença, entretanto ainda não é conhecida a causa dessa recorrência (FILES et al., 2022;
ROMERO-ALVAREZ et al., 2018; SAKKAS et al., 2018). A infecção pelo OROV afeta homens e
mulheres de todas as faixas etárias. Em locais endêmicos, deve ser incluído o diagnóstico da
Febre Oropouche naqueles pacientes com suspeita de infecção aguda do SNC. Na Amazônia
Ocidental Brasileira, 6,1% das amostras de fluido cérebro-espinhal de pacientes hospitalizados
que apresentaram infecção viral do SNC foram consideradas OROV positivas por meio de
técnicas de diagnóstico molecular (SAKKAS et al., 2018).

1.3.5.1 –Diagnóstico e tratamento

O diagnóstico clínico da Febre Oropouche ainda é um desafio. Como os sintomas são

semelhantes à dengue e chikungunya, por exemplo, que frequentemente circulam nas mesmas
áreas, o diagnóstico por sintomatologia e testes clínicos é um problema. Por este motivo, a Febre
Oropouche não é bem diagnosticada e consequentemente subnotificada (FILES et al., 2022).
Atualmente o diagnóstico baseia-se em ensaios sorológicos, como testes de inibição da
hemaglutinação, neutralização e fixação de complemento; imunoenzimáticos (ELISA) para
detecção de imunoglobulina total, IgM e IgG; e moleculares, envolvendo a reação da
transcriptase reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) e RT-PCR em tempo
real, a fim de detectar o genoma do OROV nas amostras biológicas. Além disso, o diagnóstico
também pode ser estabelecido por meio do isolamento do OROV em culturas de células. Em
relação ao diagnóstico molecular, a maioria detecta o segmento S (pequeno) do genoma do

25
Menegatto, M.B.S

OROV, entretanto devido à existência dos rearranjos (MDDV, IQTV e PERDV) entre as espécies
do sorogrupo Simbu, esforços devem ser feitos no desenvolvimento de técnicas baseadas na
detecção do segmento M que é único e específico do OROV. Atualmente não existe diagnóstico
comercial ou testes rápidos para detecção do Oropouche disponíveis no mercado (ROMERO-
ALVAREZ et al., 2018; DA ROSA et al., 2017).
O tratamento disponível para a doença é voltado apenas ao alívio dos sintomas, não
interferindo na multiplicação do OROV. Além disso, poucos estudos foram conduzidos em busca
de tratamento potencial ou opções de prevenção da Febre Oropouche. Atualmente não existem
vacinas contra a infecção do OROV em humanos (SAKKAS et al., 2018).

1.3.6 – Patogênese da Febre Oropouche

A forma como o OROV persiste e estabelece a doença no corpo humano ainda não está muito
bem elucidada. Até o presente momento não foi relatada morte decorrente da infecção pelo
OROV, e sabe-se que os infectados apresentam sintomas sistêmicos com viremia nos 2 a 4 dias
após o início dos primeiros sintomas. Já foram descritos casos de infecção humana com
alterações nas transaminases hepáticas, sugerindo danos ao fígado (SAKKAS et al., 2018;
VERNAL et al., 2019). Ainda, o vírus pode atingir progressivamente as vias neurais e já foi isolado
do líquido cefalorraquidiano de pacientes, porém a forma como o OROV invade o SNC ainda é
desconhecida (SAKKAS et al., 2018; DA ROSA et al., 2017). Nesse sentido, pesquisas vêm sendo
desenvolvidas utilizando modelo animal a fim de compreender e elucidar importantes aspectos
da patogênese desse arbovírus. A maioria dos estudos in vivo buscaram compreender este
mecanismo de invasão do OROV no sistema nervoso central.
Araújo e colaboradores (1978) foram os pioneiros na busca pelo estabelecimento de um
modelo animal de infecção pelo OROV. Dessa forma, hamsters de 3 a 4 semanas de idade foram
inoculados com o vírus via intracerebral (cepa BeAn 19991), sendo o modelo testado susceptível
à infecção. Foi possível observar hepatite grave fatal nos animais infectados e detecção do vírus
nas lesões hepáticas, com necrose dos hepatócitos e hipertrofia das células de Kupffer, o que
sugere uma transmissão hematogênica do OROV do cérebro para o fígado (ARAUJO et al., 1978).
Rodrigues e colaboradores (2011) utilizaram o mesmo modelo animal (hamsters golden),
entretanto avaliaram a via subcutânea de infecção (4x105.6 TCID50), uma vez que essa via
mimetiza a via de infecção natural do OROV. Os animais desenvolveram infecção sistêmica, com
manifestações neurológicas graves, incluindo paralisia, e ainda foram detectados altos títulos
virais no fígado (106.2 TCID50/g) e cérebro (105.9 TCID50/g), sugerindo que estes órgãos são sítios
de replicação viral e também corroborando com a provável disseminação hematogênica do vírus

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Menegatto, M.B.S

(RODRIGUES et al., 2011). Sendo assim, o OROV parece penetrar a barreira hematoencefálica
(BBB) por um mecanismo ainda desconhecido, observado pelas manifestações clínicas da
doença. Aparentemente o vírus é transportado pela corrente sanguínea, e escapa da BBB por
estar dentro de um fagócito, evitando uma resposta imune. Embora utilizada diferentes vias de
inoculação, ambos estudos demonstraram o tropismo do OROV pelos hepatócitos (RODRIGUES
et al., 2011; SAKKAS et al., 2018).
Entretanto, este modelo animal esbarra na dificuldade de ser heterogênico, ou seja,
apresenta um genoma altamente heterozigótico e, consequentemente, há uma grande
diversidade genética na população de uma mesma colônia (ANDRADE et al., 2002). Por esse
motivo, o uso dos hamsters como modelo animal torna-se inadequado na condução de estudos
imunológicos detalhados sobre as interações vírus-hospedeiro. Na busca por um modelo murino
isogênico, Santos e colaboradores (2012) utilizaram camundongos BALB/c neonatos (1 dia de
idade) infectados via subcutânea com 106.25 TCID50 do OROV. Os animais sucumbiram à doença
5 dias pós infecção (dpi) apresentando sinais clínicos graves como letargia e paralisia, e 85%
morreram em até 10 dpi. O vírus foi recuperado no cérebro dos animais doentes e a hibridização
in situ e a imunohistoquímica comprovaram o neurotropismo do OROV, embora a histopatologia
tenha sido leve no cérebro com pouca inflamação. Ainda, os animais desenvolveram hiperplasia
no baço, porém não houve recuperação viral ou detecção do antígeno neste órgão (SANTOS et
al., 2012, 2014). Mais tarde, outro estudo dos mesmos autores buscou uma investigação mais
detalhada da progressão e propagação do OROV no SNC, dessa vez foram infectados (via
subcutânea) camundongos BALB/c de 21 dias de idade. Os achados sugerem que o OROV utiliza
a rota neural durante a fase inicial de infecção, atingindo a medula espinhal e o cérebro em até
3dpi. Com o decorrer da doença, na fase mais tardia, o vírus invade de alguma forma a BBB,
disseminando-se para o parênquima cerebral, apresentando manifestações mais graves de
encefalite (SANTOS et al., 2014; DA ROSA et al., 2017).
Outro estudo utilizando camundongos C57BL/6 imunocomprometidos demonstrou que
a ativação da proteína de sinalização antiviral mitocondrial (MAVS), a produção do Interferon
do tipo I (IFN-I), bem como os fatores reguladores do interferon (IRF 3 e 7) são essenciais para
o controle da infecção pelo OROV. Estes fatores desempenham papel importante na resposta
imune inata, controlando a replicação viral, o dano hepático e também a morte dos animais
(PROENCA-MODENA et al., 2015). Ainda, o fator regulador de interferon 5 (IRF-5) é importante
na modulação da resposta antiviral do hospedeiro nos órgãos periféricos, que controlam a
disseminação do OROV no SNC. O IRF-5 possui efeito inibitório na manifestação da doença neuro
invasiva e também na replicação do vírus no fígado, baço e no sangue dos animais durante o
estágio inicial da doença (PROENCA-MODENA et al., 2016; SAKKAS et al., 2018).

27
Menegatto, M.B.S

Em relação a estudos in vitro sobre a patogênese da Febre Oropouche, Acrani e

colaboradores (2010) indicaram que a infecção pelo OROV em células HeLa causa apoptose por
uma via intracelular que envolve mitocôndrias e é desencadeada por um mecanismo que
depende da replicação e da expressão de proteínas virais (ACRANI et al., 2010). Mais
recentemente, Geddes e colaboradores (2021), por meio da análise do transcriptoma de
astrócitos primários infectados, mostraram que o OROV modulada positivamente as vias
relacionadas ao ciclo celular, divisão celular, manutenção e replicação de DNA e remodelação
da matriz celular dos astrócitos. E ainda, as vias reguladas negativamente corroboram com a
desregulação da resposta do Interferon, o que pode vir a aumentar as manifestações
neuropatológicas da infecção (GEDDES et al., 2021). Estes achados vão em concordância com
os estudos in vivo anteriores, comprovando o potencial neurotrópico do OROV e o envolvimento
da via do IFN-I no controle da infecção. Diante do exposto, apesar dos avanços científicos, muitas
perguntas permanecem sem resposta com relação à patogênese do OROV, sendo de suma
importância e relevância estudos que buscam maior compreensão dos mecanismos envolvidos.

1.4 – Espécies reativas, antioxidantes e o estresse oxidativo

Espécies reativas (ER) incluem os radicais livres, definidos como uma espécie capaz de existir de
forma independente (“livre”) e contendo um ou mais elétrons desemparelhados na sua última
camada eletrônica. Devido ao número ímpar de elétrons do radical livre, ele é muito instável, de
vida curta e bastante reativo, podendo receber ou doar elétrons facilmente de/para outras
moléculas a fim de atingir sua estabilidade (PHANIENDRA et al., 2015). As ER incluem também
moléculas que, apesar de não serem radicais, apresentam alta reatividade nos sistemas
biológicos (HALLIWELL, 1992; LI et al., 2016), como o peróxido de hidrogênio (H2O2). As ER são
formadas naturalmente durante as reações metabólicas de um sistema vivo, como na respiração
celular, ou por mecanismos enzimáticos e não enzimáticos associados a processos patológicos.
Elas contribuem com o sistema de defesa contra patógenos e participam da sinalização celular,
regulação de citocinas, fatores de crescimento, fatores de transcrição, imunomodulação e
apoptose (CAMINI et al., 2016; OKTYABRSKY et al., 2007; PISOSCHI et al., 2015).
As ER podem ser classificadas em diferentes classes dependendo do seu átomo central,
como por exemplo espécies reativas de oxigênio (ERO), nitrogênio (ERN) ou cloro (ERC)(LI et
al.,2016). As Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) são derivadas da redução do oxigênio
molecular (O2) e incluem moléculas radicalares, como ânion superóxido (O2•-) e o radical hidroxil
(OH•), e também não radicalares, como peróxido de hidrogênio (H2O2) (HALLIWELL et al., 1994;

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Menegatto, M.B.S

NONELL et al., 2016; LI et al., 2016; PISOSCHI et al., 2015). O O2•- pode ser formado de várias
formas, como resultado da redução por um elétron do O2 por várias oxidases (por exemplo
NADPH oxidase, xantina oxidase e ciclo-oxigenase) ou decorrente da atividade das cadeias
transportadoras de elétrons na mitocôndria e no retículo endoplasmático. Podem ser
produzidos também por células fagocíticas como monócitos, neutrófilos, eosinófilos e
macrófagos durante a fase de ativação de um processo inflamatório para eliminar patógenos
(HALLIWELL, 1992; PISOSCHI et al., 2015; VASCONCELOS et al., 2007). O radical hidroxil (OH•) é
produzido a partir das reações do tipo Fenton (1) e Haber Weiss (2), como mostrado abaixo, e é
considerado a espécie mais prejudicial e tóxica dentre as ERO. Possui tempo de meia-vida curta
e interage com as biomoléculas imediatamente após sua geração. Além disso, uma vez formado,
o organismo humano não dispõe de mecanismo de defesa (GOETZ et al., 2008; PISOSCHI et al.,
2015; VASCONCELOS et al., 2007).

Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH• + OH- (1)

O2•- + H2O2 O2 + OH• + OH- (2)

Por fim, o peróxido de hidrogênio (H2O2), que é gerado pela dismutação do O2•- por oxidases ou
pela β-oxidação de ácidos graxos, é capaz de produzir radicais livres quando interage com íons
metálicos, aumentando seu caráter oxidativo (BARREIROS et al., 2006; PISOSCHI et al., 2015).
Mesmo importantes em várias funções celulares, uma produção exacerbada de ERO
culmina em inúmeros danos celulares. As ERO podem atacar componentes vitais como os ácidos
graxos poli-insaturados, proteínas e ácidos nucléicos. Essas reações podem alterar propriedades
intrínsecas da membrana plasmática, como a fluidez, o transporte de íons, perda de atividade
enzimática, inibição da síntese de proteínas e também causar danos ao DNA, resultando em
perda da integridade e funcionalidade celular. Alguns dos efeitos deletérios provenientes da
geração de radicais livres incluem a oxidação de proteínas, peroxidação lipídica e mutação do
DNA. A peroxidação lipídica é o processo biológico contínuo e prejudicial no qual os ácidos
graxos poli-insaturados da membrana são atacados pelas ERO (BANDYOPADHYAY et al., 1999;
HALLIWELL et al., 1994; SURESH et al., 2016). Sendo assim, as ERO precisam estar em níveis
metabólicos ajustados suficientes para responder à demanda celular e aos mecanismos de
defesa do sistema imune, por exemplo eliminando células mitóticas indesejadas ou
mitocôndrias, uma vez que o excesso tem influência negativa também sobre o envelhecimento,
envolvendo comprometimento das funções fisiológicas, promovendo incidência de doenças e

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Menegatto, M.B.S

consequentemente reduzindo o tempo de vida do sistema vivo (PHANIENDRA et al., 2015;

PISOSCHI et al., 2015; ZOROV et al., 2014).
Para combater o excesso de ER e manter um nível que proporciona funcionamento
celular adequado, os organismos vivos contam com um sistema de defesa antioxidante que vai
operar na eliminação de ER e/ou minimizar os seus efeitos negativos. O antioxidante é definido
como qualquer substância que pode prevenir, reduzir ou reparar o dano induzido por ER a uma
biomolécula alvo, e quando presente em menor concentração em relação ao substrato oxidável,
retarda ou previne a oxidação. Estudos já comprovaram a capacidade dos antioxidantes de
conter os efeitos negativos das ERO e ainda diminuir a incidência de câncer e outras doenças
degenerativas (LI et al., 2016; LUSHCHAK, 2014; PISOSCHI et al., 2015). Os antioxidantes podem
ser classificados em duas formas: enzimático e não enzimático. As enzimas são produzidas de
forma endógena, e incluem principalmente as da família Superóxido Dismutase (SOD), Catalase
(CAT) e Glutationa Peroxidase (GPx). Já os antioxidantes não enzimáticos podem ter origem no
próprio organismo, como a glutationa, ou serem adquiridos através da dieta, como vitaminas C
(ácido ascórbico), vitamina E (tocoferol), carotenóides, antocianinas, polifenóis e ácido úrico
(HALLIWELL et al., 1994; LUSHCHAK, 2014).
A SOD é a primeira enzima envolvida na ação antioxidante, responsável por catalisar a
desmutação do O2•-, convertendo-o em O2 e H2O2, como mostra a Figura 7. A ação da SOD
permite a eliminação do ânion superóxido mesmo em baixas concentrações. São encontradas
três isoformas de SOD no organismo: SOD1 que predomina nas células eucarióticas e contém
Cu2+ e Zn2+ como centros redox (encontrada no citosol); SOD2 com Mn2+ (encontrada na matriz
mitocôndria); SOD3 extracelular (BANDYOPADHYAY et al., 1999; BARREIROS et al., 2006;
PISOSCHI et al., 2015). A CAT, por sua vez, decompõe o H2O2 em H2O e O2, protegendo as células
dos danos oxidativos causados pelo peróxido. A CAT é expressa na maioria das células, órgãos e
tecidos e também com concentrações elevadas no fígado e nos eritrócitos. Localiza-se no
peroxissoma, organela essa responsável pela desintoxicação celular e oxidação de ácidos graxos
de cadeia longa. Os peroxissomos são fonte inesgotável de ERO como peróxidos orgânicos,
produtos carbonílicos e oxigênio singlete. A GPx também é responsável pela detoxificação do
H2O2, entretanto utiliza a glutationa (GSH) como agente redutor, obtendo como produto final a
glutationa oxidada (GSSH), H2O e O2, assim como mostra a Figura 7. GPx é encontrada no citosol
e na mitocôndria (BIRBEN et al., 2012; HALLIWELL et al., 1994; VASCONCELOS et al., 2007).

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Menegatto, M.B.S

Figura 7: Decomposição e detoxificação de espécies reativas de oxigênio pela ação das

enzimas antioxidantes. A superóxido dismutase (SOD) metaboliza o ânion superóxido (O2•),
enquanto Catalase (CAT) e Glutationa peroxidase (GPx) são responsáveis pela conversão do
peróxido (H2O2) em água (H2O) e oxigênio molecular (O2).

Fonte: próprio autor

Inicialmente acreditava-se que em um sistema vivo, a geração de ERO e a atividade das

defesas antioxidantes encontravam-se em equilíbrio, entretanto essa balança poderia estar
inclinada no sentido da produção de ERO, uma vez que há um dano oxidativo constante no corpo
humano. Assim, em uma condição onde ocorre um maior desequilíbrio a favor da geração de
ERO, ocorre o estresse oxidativo, definido como “um distúrbio no equilíbrio entre a produção
de espécies reativas de oxigênio e as defesas antioxidantes”, que podem levar à lesão tecidual
(BETTERIDGE, 2000; HALLIWELL et al., 1994). O desequilíbrio pode ser consequência tanto da
falta na capacidade antioxidante, quanto na superprodução de ERO (WANG et al., 2023).
Entretanto, sabe-se que o estresse oxidativo está envolvido em vários sistemas, inclusive com
papel importante nas vias de sinalização redox. Dessa forma, houve uma necessidade de
atualizar a definição e em 2006 Jones redefiniu o termo estresse oxidativo como “uma
interrupção da sinalização e controle redox” (CAMINI et al., 2016; JONES, 2006; SIES et al., 2017).
O dano induzido pelo aumento da produção de ERO contribui para a patogênese e
fisiopatologia de inúmeras doenças, como as degenerativas: Parkinson, Alzheimer, doença de
Huntington e esclerose lateral amiotrófica, além de doenças cardiovasculares e inflamatórias,
catarata e até mesmo o câncer. O estresse oxidativo está implicado em mais de 100 doenças,
seja como fonte de origem ou como resultado decorrente da patologia, além de acelerar
progressão da doença de forma grave (PHANIENDRA et al., 2015; PISOSCHI et al., 2015; SURESH
et al., 2016; WANG et al., 2023). Ainda, nos últimos anos, está cada vez mais evidente a
contribuição do estresse oxidativo na patogênese de várias infecções virais (CAMINI et al., 2016).

31
Menegatto, M.B.S

1.5 – Estresse oxidativo na patogênese de infecções virais

A primeira evidência de que o estresse oxidativo está envolvido em infecção viral devido ao
aumento de ERO foi demonstrada em 1979, por Peterhans, ao avaliar a infecção do vírus Sendai
em esplenócitos de camundongos BALB/c (PETERHANS, 1979). Mais tarde, estudos mostraram
que muitos retrovírus podem causar morte celular ao gerar o estresse oxidativo em células
infectadas. As ERO podem facilitar ou até promover a multiplicação viral, dependendo do tipo
celular e do patógeno envolvido, e seu efeito nas funções celulares depende da quantidade de
ERO produzidas e do tempo em que a célula foi exposta. Dependendo do vírus, a produção de
ERO varia, entretanto muitos vírus compartilham uma via patogênica em comum caracterizada
pelo aumento da produção de ERO e a depleção de antioxidantes endógenos (CAMINI et al.,
2016; RESHI et al., 2014; SCHWARZ, 1996).
Em uma possível infecção, o corpo detecta a presença do vírus que em seguida é
englobado e fagocitado por células do sistema imune, incluindo macrófagos, neutrófilos e
células dendríticas. A partir de então o patógeno ativa nessas células a expressão dos complexos
NADPH oxidase e óxido nítrico sintase, que serão responsáveis por uma maior produção de ER.
Além disso, os fagócitos ativados pela presença do vírus podem liberar citocinas pró-oxidantes,
como o fator de necrose tumoral (TNF) e interleucina-1 (IL-1). Essas citocinas promovem a
captação de ferro pelo retículo endotelial, e o acúmulo de ferro pode gerar radical hidroxil por
meio das reações de Fenton e Haber Weiss. Uma outra consequência da liberação de citocinas
é que o TNF pode inibir a respiração mitocondrial além de liberar o fator de transcrição nuclear
NF-ƙB, que por sua vez pode favorecer o aumento da multiplicação viral. Quando há liberação
de NF-kB ele é translocado para o núcleo da célula e se liga ao DNA, podendo induzir a
transcrição de genes celulares e/ou virais (CAMINI et al., 2016; LIU et al., 2017; SCHWARZ, 1996).
A infecção viral induz oxidantes como óxido nítrico (NO), O2•-, OH• e H2O2 que podem
contribuir na modulação de respostas celulares, regulação da multiplicação viral, nas defesas do
hospedeiro e consequentemente na patogênese do vírus (ZHANG et al., 2014). Uma vez que ER
estão relacionadas diretamente as funções celulares, uma mudança em diferentes vias de
sinalização pode interferir na modulação da expressão gênica, adesão, metabolismo, ciclo
celular, seleção de populações virais mutantes e apoptose. No primeiro momento as ER
combatem a infecção e funcionam como um mecanismo de proteção da célula hospedeira,
contribuindo por exemplo na indução da apoptose (JACOBSON, 1996). Entretanto, à medida que
a multiplicação viral avança mais ER são formadas, levando a um desequilíbrio na homeostase
redox. Sabendo disso, o estresse oxidativo induzido por vírus pode contribuir em vários aspectos

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Menegatto, M.B.S

da sua patogênese, incluindo as respostas inflamatórias e morte celular (CAMINI et al., 2016;
LIU et al., 2017; RESHI et al., 2014).
No que diz respeito aos produtos das ER e da peroxidação lipídica, eles podem afetar a
multiplicação do vírus modulando o estado de ativação das células, regulando a resposta
inflamatória e imune do hospedeiro e causando dano oxidativo aos tecidos e componentes virais
(PETERHANS, 1997; SCHWARZ, 1996). Porém, a extensão em que o dano oxidativo desempenha
um papel benéfico para o hospedeiro, controlando a multiplicação viral, ainda não é muito
elucidada. Outro fator importante é que, além de favorecer a produção de oxidantes, os vírus
podem inibir também a síntese das enzimas antioxidantes (VALYI-NAGY et al., 2005). Diante do
exposto pode-se dizer que o estresse oxidativo está relacionado a vários aspectos da patogênese
de vários agentes virais.
Estudos já comprovaram o envolvimento do estresse oxidativo na infecção de
importantes vírus como papiloma vírus humano (HPV), hepatite C (HCV), hepatite B (HCB), vírus
da encefalite japonesa (JEV), Influenza (H1N1), vírus respiratório sincicial (RSV), da
imunodeficiência humana (HIV), Chikungunya (CHIKV), Dengue (DENV) (CAMINI et al., 2016),
Rift Valley (RFV) (NARAYANAN et al., 2014) e mais recentemente também na infecção pelo SARS-
CoV2 (CECCHINI et al., 2020). Além disso, o nosso grupo de pesquisa demonstrou também
envolvimento do estresse oxidativo na patogênese do ZIKV (ALMEIDA et al., 2020) e MAYV (DA
SILVA CAETANO et al., 2019; FERRAZ et al., 2021).
Assim, diante das evidências que o estresse oxidativo desempenha papel importante na
patogênese de diversos agentes etiológicos virais, dentre eles alguns arbovírus, o presente
trabalho teve como objetivo avaliar alterações na homeostase oxidativa relacionadas com a
infecção pelo OROV em modelo murino.

33
Menegatto, M.B.S

2. JUSTIFICATIVA

A Febre Oropouche é uma arbovirose de grande importância epidemiológica, principalmente na

região da Amazônia brasileira, sendo classificada como uma doença negligenciada de caráter
emergente. Segundo estudos, acredita-se que mais de meio milhão de pessoas já foram
infectadas com o OROV desde que foi isolado em 1955. Ainda, no Brasil, até pouco tempo
atrás, acreditava-se que o OROV era restrito a região Norte, no entanto, estudos evidenciam a
circulação do vírus em outras regiões do país, incluindo o Sudeste onde localiza-se grandes
centros urbanos. Assim, diante da possibilidade de que a Febre Oropouche tenha potencial de
(re)emergir no Brasil, assim como aconteceu com outros arbovírus como Dengue, Zika,
Chikungunya e Febre Amarela, acredita-se que quaisquer medidas sejam menos onerosas e mais
eficientes sob todos os aspectos, quanto mais cedo forem tomadas. Uma das preocupações dos
virologistas é justamente a emergência de viroses ainda não devidamente caracterizadas,
para as quais não se sabe exatamente a relevância, a patogenia, o tratamento e as formas de
controle. Portanto, visto que a Febre Oropouche é um problema de saúde pública e caráter
emergente, justifica-se o presente trabalho que busca elucidar ou melhor entender os
mecanismos que contribuem para a patogênese do OROV. Assim, nossa pergunta é se, como na
infecção por outros importantes arbovírus, o estresse oxidativo ocorre na infecção pelo OROV e
ainda, se a infecção causa uma desregulação das defesas antioxidantes endógenas. Ampliar os
conhecimentos sobre os aspectos relacionados à patogênese do OROV permitirá uma melhor
caracterização desse vírus. Compreendidas essas relações, o conhecimento poderá também ser
estendido a outros importantes patógenos da família Peribunyaviridae.

34
Menegatto, M.B.S

3. OBJETIVOS

3.1 – Objetivo geral

Avaliar o estresse oxidativo e as defesas antioxidantes na infecção pelo vírus Oropouche em

camundongos BALB/c.

3.2 – Objetivos específicos

3.2.1 - Em camundongos BALB/c adultos (3 semanas) infectados ou não com OROV, avaliar
durante 21 dias:

i. Progressão da doença, sinais clínicos e sobrevida;

3.2.1 - Em camundongos BALB/c adultos (3 semanas) infectados ou não com OROV, avaliar
no 4º dpi:

ii. Massa corporal, massa do fígado e do baço;

iii. Perfil hematológico;
iv. Produção de anticorpos neutralizantes no soro;
v. Níveis séricos das transaminases hepáticas (AST/ALT);
vi. Níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias;
vii. Carga viral no sangue, fígado e baço;
viii. Alterações histopatológicas no fígado e baço;
ix. Produção de ROS no fígado e baço;
x. Biomarcadores de estresse oxidativo malondialdeído e proteína carbonilada no fígado,
e baço;
xi. Atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAT no fígado e baço.

35
Menegatto, M.B.S

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 – Cultivo celular e estoque viral

4.1.1 – Cultivo celular

Para o desenvolvimento dos ensaios in vitro deste trabalho, incluindo a produção do estoque
viral e titulação, foram utilizadas as células de linhagem contínua Vero, que são fibroblastos
oriundos de rim de macaco verde africano (Cercopithecus aethiops). A linhagem de células Vero,
obtida da American Type Culture Collection (ATCC; EUA), foi cultivada e mantida em garrafas
médias de cultivo celular (75 cm2) utilizando meio Mínimo Essencial de Eagle Modificado por
Dulbecco, com alta concentração de glicose (DMEM HG; Sigma-Aldrich, EUA), suplementado
com 5% de soro fetal bovino (SFB; Gibco, EUA), e os antimicrobianos: estreptomicina
(100µg/mL; Sigma-Aldrich, EUA), penicilina potássica (100U/mL; Sigma-Aldrich, EUA) e
anfotericina B (2,5µg/mL; SigmaAldrich, EUA). As culturas celulares foram mantidas em estufa
a 5% de CO2 a 37°C, com atmosfera umidificada, e os repiques realizados a cada 2 – 3 dias,
quando a monocamada de células atingia 90-100% de confluência.

4.1.2 – Origem do vírus e estoque viral

O OROV, protótipo brasileiro cepa BeAn 19991 [GenBank número KP052850 (segmento L),
KP052851 (segmento M) e KP052852 (segmento S)], foi isolado originalmente de um hospedeiro
vertebrado (Bradypus tridactylus) no Estado do Pará (Brasil) em 1960 (SAEED et al., 2000). A
amostra utilizada nos ensaios foi gentilmente cedida pelo professor Eurico de Arruda Neto, do
Instituto de Pesquisa em Virologia da Universidade Federal de São Paulo (USP) em Ribeirão
Preto.
O estoque viral foi produzido em garrafa média de cultura de células Vero confluentes,
infectadas com uma multiplicidade de infecção (moi) de 0,1 e adicionado volume mínimo de
meio DMEM HG sem adição de SFB para a etapa de adsorção. Após 1h de incubação na estufa
de CO2 a 37°C (agitadas a cada 10 minutos para favorecer a adsorção viral), o meio de cultura
foi completado e suplementado com 2% de SFB. Em seguida, a cultura infectada foi novamente
incubada em estufa de CO2 a 37°C por 48h até que fosse possível a visualização do efeito
citopático (morte celular – células completamente soltas da monocamada) comparado com a
cultura controle. Para a clarificação do sobrenadante, o cultivo foi então disposto em tubo de
15mL e centrifugado a 5000 rpm e 4°C a fim de remover os debris celulares. A partir do

36
Menegatto, M.B.S

sobrenadante clarificado, foram feitas alíquotas em microtubos e armazenadas em freezer a -

80°C para posterior uso nos demais ensaios. Por meio da titulação viral (descrito abaixo),
quantificou-se o OROV e o título obtido foi de 6,1x107 Unidades Formadoras de Placa (UFP)/mL.

4.1.3 – Titulação viral

Para determinar o número de partículas infecciosas presentes na suspensão viral após

propagação do OROV, foi realizada a titulação viral utilizando a técnica de contagem de
formação de placas de lise conforme descrito por Dulbecco (DULBECCO, 1952). A técnica
consiste na infecção da cultura celular com alíquotas de diluições sucessivas da suspensão viral
com o objetivo de quantificar o vírus por meio da contagem das Unidades Formadoras de Placas
(UFP).
Sendo assim, placas de 6 poços foram previamente implantadas com células Vero (1x106
células/poço) e ao atingir confluência de 90%, as células foram lavadas com tampão salina (PBS;
10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, 140mM NaCl, 3mM KCl, pH 7,2) e em seguida infectadas com
300µL de cada uma das 5 diluições seriadas da suspensão viral do OROV. Após 1h de adsorção
na estufa com 5% de CO2 e 37°C (agitação a cada 10 minutos), o inóculo foi retirado e adicionado
em cada poço 2,0 mL de meio 199 semi- sólido acrescido de carboximetilcelulose (CMC) 1,25%
e 1,5% SFB. O meio de cultura gelatinoso garante que a partícula viral fique imobilizada e só
consiga infectar células vizinhas, podendo então ser observada a placa de lise (zona com células
destruídas pela infecção). As placas foram novamente incubadas por 72h e por fim a
monocamada celular fixada em solução 10% de formol (30 minutos) seguida de coloração com
cristal violeta a 1% (15 minutos) para visualização das UFP.
O cálculo do título viral é baseado no número de UFP obtido no poço da diluição que
apresentou entre 30 e 300 placas de lise viral, e então multiplicado pelo inverso da diluição,
convertido para UFP/mL.

4.2 – Animais e Delineamento experimental

4.2.1 – Origem dos animais

Os animais utilizados neste trabalho para os experimentos in vivo foram fornecidos pelo Centro
de Ciência Animal (CCA) da Universidade Federal de Ouro Preto. Os procedimentos
experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA/UFOP), sob
protocolo de número 3850250619 (Anexo I). Foram utilizados camundongos machos e fêmeas

37
Menegatto, M.B.S

da linhagem BALB/c selvagens com 21 dias de idade, mantidos em caixas de polipropileno com
sistema de microisolador contendo maravalha, em ambiente arejado, com controle de
temperatura, luminosidade (ciclo claro/escuro) e ventilação. Durante todo o experimento, a
dieta e a água foram oferecidas ad libitum.

4.2.2 – Delineamento experimental

Primeiramente, para verificar a susceptibilidade de camundongos BALB/c (21 dias de vida) à

infecção pelo OROV (cepa BeAn 19991), foi feito um experimento piloto com 22 animais,
divididos em 2 grupos, sendo o n amostral de 11/grupo calculado pelo programa BioEstat 5.3.
Sendo assim, 11 camundongos foram infectados no dorso via subcutânea com o OROV numa
quantidade de 106 UFP (grupo infectado), e outros 11 animais receberam 100μL de PBS 1x no
mesmo local e pela mesma via (grupo controle). Esses animais foram observados diariamente
quanto a sobrevida e progressão da doença por meio dos sinais clínicos (ganho de peso,
prostração, piloereção, dificuldade de locomoção, dentre outros) durante 21 dias. Após esse
período, os animais receberam uma sobredose anestésica de cetamina (300mg/kg) e xilazina
(30mg/kg), via intraperitoneal, e em seguida eutanasiados por exsanguinação e o sangue total
foi coletado.
Depois de verificada a progressão da doença nesse modelo, foi definido o 4dpi como o
dia da eutanásia para os experimentos seguintes. Então, foram utilizados mais 22 animais,
novamente divididos em 2 grupos, sendo um grupo com 11 camundongos que foram infectados
com o OROV (106 UFP) via subcutânea (grupo infectado), e outro grupo contendo 11 animais
que receberam 100μL de PBS 1x pela mesma via (grupo controle). Os animais foram observados
diariamente.
Assim, após 4 dias, os camundongos foram anestesiados e eutanasiados conforme
descrito acima. Após coletar o sangue, foi feita a perfusão cardíaca com PBS 1x e então coletados
o fígado e baço. Todos os materiais biológicos foram mantidos em banho de gelo durante o
procedimento e em seguida, armazenados em freezer -80°C até o momento de uso. Para a
análise histológica, parte do fígado e do baço foi conservada em solução tamponada de
formaldeído 3,7% (v/v). Quanto ao sangue coletado, uma alíquota foi separada para análise
hematológica em microtubos contendo anticoagulante EDTA (uma gota); outra alíquota foi
centrifugada a 10000rpm por 10 min a 4°C a fim de se obter o soro, sendo este também
armazenado em freezer -80°C até o momento de uso. Vale ressaltar que toda experimentação
in vivo seguiu as boas práticas de manejo animal.

38
Menegatto, M.B.S

4.3 – Avaliação massa corpórea

Os animais controles e infectados com o OROV foram avaliados quanto ao percentual de ganho
de massa corporal. Para isso, no dia 0 (antes da infecção) e durante os 21 dias os camundongos
foram pesados em balança semi-analítica (Marte, AD3300). A massa inicial foi considerada
igual a 100% e a massa corpórea dos demais dias calculada a partir desde dado.

4.4 – Avaliação de hepatomegalia e esplenomegalia

Para avaliar se a infecção pelo OROV poderia causar hepatomegalia e esplenomegalia, os

respectivos órgãos dos camundongos foram pesados após eutanásia utilizando uma balança
semi-analítica (Marte, AD3300), e então calculou-se a razão da massa dos órgãos em relação à
massa total do camundongo.

4.5 – Parâmetros Hematológicos

A análise do perfil hematológico dos animais dos grupos controle e infectado foi feita em
parceria com o Laboratório de Imunopatologia da UFOP (LIMP), com auxílio do Dr. Rory
Cristiane Fortes de Brito. Utilizando o equipamento automatizado Auto Hematology Analyzer
(Mindray BC-2800 Vet, Hamburgo, Alemanha), foram feitas análises globais de leucócitos,
eritrócitos, hemoglobina e plaquetas .

4.6 – Anticorpos neutralizantes anti-OROV

Para avaliar a produção de anticorpos anti-OROV no soro dos animais infectados foi realizado o
teste de neutralização de redução de placa (PRNT). Primeiramente, para inativação do
complemento, as amostras foram mantidas a 56°C por 30 minutos. Em seguida, preparadas as
diluições seriadas do soro (1:20 a 1:80), essas foram então incubadas com 200 UFP do OROV por
1h a 37°C, incluindo os controles de célula e viral. Em placas de 12 poços, as células Vero
(previamente implantadas, 5x105 células/poço) foram infectadas com 150 µL dos controles e de
cada uma das soluções contendo o soro mais OROV. Após adsorção viral em estufa de CO2 a
37°C, o inóculo foi retirado e adicionado em cada poço 1mL de meio 199 semi-sólido acrescido
de carboximetilcelulose (CMC) 1,25% e 1,5% SFB. Por fim, as placas foram novamente incubadas
por 72h e reveladas após fixação da monocamada com formol (10%) seguida de coloração com

39
Menegatto, M.B.S

cristal violeta (1%) a fim de visualizar as UFP. As amostras de soro foram consideradas positivas
quando o número médio de placas correspondia a uma redução de 50% na contagem de placas
comparado com o controle viral. O título de anticorpo neutralizante foi calculado dividindo 1mL
pelo volume da solução (soro mais OROV) inoculado no poço (150 µL), e multiplicando pelo
inverso do valor da última diluição positiva do soro (GEESSIEN KROON et al., 2016). O título foi
expresso em unidades neutralizantes (UN) por mL de soro.

4.7 – Dosagens das transaminases hepáticas

A aspartato aminotransferase (AST) e a alanina aminotransferase (ALT) são enzimas hepáticas e

uma quantificação elevada dessas enzimas no soro é a anormalidade mais comumente
encontrada em doenças do fígado. Sabendo disso, para avaliar se a infecção pelo OROV poderia
causar alguma injúria hepática, os níveis séricos de AST e ALT foram dosados nos animais dos
grupos controle e infectado. O ensaio é baseado nas reações catalisadas por AST e ALT,
mostradas abaixo:

L-aspartato + α-cetoglutarato AST

Glutamato + Oxalacetato

L-alanina+ α-cetoglutarato ALT

Glutamato + Piruvato

As dosagens foram realizadas por meio de um kit da Labtest (Minas Gerais, Brasil, Ref. 52 e 53),
conforme recomendações do fabricante. O piruvato e o oxalacetato gerado a partir das reações
acima foi mensurado por meio da formação de hidrazona, um composto com cor amarela
intensa em meio alcalino. Em seguida, mediu-se a absorbância em espectrofotômetro Victor X3
Multilabel (Perkin Elmer) com comprimento de onda de 490 nm. A concentração das
transaminases foi calculada a partir da curva padrão para ambas enzimas.

4.8 – Quantificação de citocinas pró-inflamatórias por citometria de fluxo

Os níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias foram medidos nas amostras de soro dos animais
dos grupos controle e infectado utilizando o kit Mouse Inflammation Cytometric Bead Array
(CBA) (BD, EUA) conforme as instruções do fabricante.

40
Menegatto, M.B.S

4.9 – Análises histológicas

A fim de avaliar possíveis alterações histopatológicas decorrentes da infecção no fígado e baço,

fragmentos desses órgãos dos animais controle e infectado foram fixados em solução de formol
3,7% (v/v) tamponado. Em seguida, parafinados e cortados (secções de 4µm) em um micrótomo
rotativo, fixados em lâminas histológicas, seguido do processo de coloração com hematoxilina
e eosina (H&E). Para isso, as lâminas contendo os cortes foram colocadas em banho de xilol
(para desparafinar), na sequência etapas de desidratação em banhos de álcool absoluto e
hidratação em álcool 90%, 80%, 70% e água, finalizadas com banho de hematoxilina e eosina.
Após fixação das lâminas com a lamínula, as imagens histológicas foram capturas com o auxílio
do Microscópio Leica DM5000B (400x) do Laboratório Multiusuários de Microscopia do
NUPEB/UFOP e do Laboratório de Morfologia e Ensino de Ciências.
Para as medidas morfométricas dos hepatócitos, foram capturados 22 campos/animal
e o número de células inflamatórias determinado usando o software Leica QwinV3 Image
Processing and Analysis (Alemanha). As lâminas e a avaliação histológica do fígado foram feitas
em parceria com o laboratório de Imunopatologia da UFOP, com o auxílio da Rosália da
Conceição Alves Lopes e professora patologista Dra. Cláudia Martins Carneiro. Já para os cortes
histológicos do baço, foram capturados 25 campos/animal e então determinado o número de
nódulos linfóides e a área total da polpa branca utilizando o software ImageJ (RUEDEN et al.,
2017). As lâminas e as análises do baço foi feita em parceria com o professor patologista Dr.
Wanderson Geraldo de Lima, do Laboratório de Morfopatologia da UFOP.

4.10 – Determinação da carga viral

Para acompanhar a disseminação do OROV foi realizada a titulação das amostras de soro, fígado
e baço dos animais do grupo infectado, pelo ensaio de formação de placas utilizando placa de
12 poços com células Vero confluentes. Sendo assim, 40 mg dos tecidos (fígado e baço) foram
homogeneizados em 400µL de PBS com posterior centrifugação a 10000 rpm e 4°C por 5
minutos. Para a infecção das células foi utilizado 150µL do sobrenadante das amostras de tecido.
Já para as amostras de soro, tomou-se 50µL de cada amostra, que foi diluída 3x em meio de
cultura, sendo o volume do inóculo de 150 µL. Os procedimentos seguintes foram realizados
conforme descrito no item 4.1.3. Os animais foram considerados positivos para a presença do
OROV quando identificada a formação de placa de lise. O número de partículas virais infecciosas
foi expresso como UFP/g de órgão (fígado ou baço). Além disso, foi realizada também a detecção

41
Menegatto, M.B.S

e quantificação do genoma viral OROV no sangue, fígado e baço dos animais infectados por meio
da qPCR.

4.11 – Quantificação do genoma viral por qPCR

4.11.1 – Extração de RNA

Para quantificar o genoma do OROV nas amostras de sangue, fígado e baço, o RNA total foi
extraído utilizando o reagente Brazol, conforme instruções do fabricante (LCG – Biotecnologia)
Ao final do processo, o RNA extraído foi eluído em água nuclease-free, quantificado em
espectrofotômetro Nanodrop (Thermo Scientific, EUA) e armazenado em freezer -80°C até o
momento de uso.

4.11.2 – Síntese de cDNA por RT-PCR

Na reação em cadeia da polimerase (PCR) de um vírus cujo genoma é RNA, faz-se necessária a
realização de uma etapa de reação de Transcrição Reversa (RT) para síntese de um DNA
complementar (cDNA), construído a partir da ação da enzima transcriptase reversa, que servirá
de molde na qPCR. A síntese do cDNA foi iniciada a partir de 2µg do RNA total molde, a enzima
transcriptase reversa MultiScribeTM (50U/µL) e oligonucleotídeos iniciadores randômicos
(GeneAmpR RNA PCR, Applied Biosystems, EUA), em concentrações indicadas pelo fabricante.
Em seguida, foram adicionados também ao microtubo contendo a reação, o mix de nucleotídeos
100mM (dNTPs), tampão 10x da enzima e água (q.s.p.), com volume final da reação de 20µL. A
RT foi realizada utilizando o termociclador Veriti Thermal Cycle (Applied Biosystems, EUA),
com ciclo de 25°C por 10 minutos, 37°C por 120 minutos e 85°C por 5 minutos. As amostras
foram estocadas a -20°C até o momento do uso.

4.11.3 – qPCR

O nível de expressão do RNAv do OROV e do normalizador GAPDH (gliceraldeído 3-fosfato

desidrogenase) foram avaliados pela técnica de PCR em tempo real (qRT-PCR). Sendo assim, os
cDNAs obtidos anteriormente foram utilizados como moldes nas reações de qPCR, juntamente
com os oligonucleotídeos iniciadores para o segmento S do OROV (NAVECA et al., 2017) e
GAPDH (XIONG et al., 2010) . As reações foram realizadas por meio do kit SYBR Green PCR Master
Mix (Applied Biosystems, EUA), segundo recomendações do fabricante, no equipamento ABI
7500 Real Time PCR Instrument (Applied Biosystems, EUA). Foram 40 ciclos de 95°C por 15
segundos e 60°C por 1 minuto.

42
Menegatto, M.B.S

Para a quantificação relativa, corrigiu-se os valores de ΔCt (Ciclo de detecção – “Cycle

threshold”) do gene alvo pelo valor do gene normalizador (GAPDH), e em seguida foi calculado
o 2-ΔΔCt de cada amostra.

4.12 – Quantificação das Espécies Reativas de Oxigênio (ERO)

A fim de quantificar ERO no tecido dos animais infectados, no momento da necrópsia,

fragmentos de fígado e baço foram coletados e rapidamente homogeneizados em DMEM-HG
gelado (Invitrogen; 1:10 m/v) usando homogeneizador do tipo Potter (Novatecnica, Brasil). Após
homogeneizadas as amostras foram centrifugadas por 30 segundos a 12000 rpm e 4°C. Em uma
placa de 96 poços preta, foi adicionando 100µL do sobrenadante e 100 µL da sonda 5-(-6)-
clorometil-2',7'-diclorodihidrofluoresceína acetil éster (CM-H2DCFDA; Invitrogen, EUA), na
concentração de 2µM. O CM-H2DCFDA é um indicador de ERO nas células, pois quando
quebrado por esterases intracelulares não específicas, gera a molécula DCFH, que reage com
ERO gerando fluorescência. Sendo assim, a fluorescência do DCFH foi quantificada no momento
(tempo 0) e após 20min de adição da sonda na amostra. A reação foi incubada no escuro a 37°C,
utilizando um leitor de microplacas de fluorescência (VICTOR™ X3 – PerkinElmer) a 485/535 nm,
conforme recomendação do fabricante. Também foi determinado a fluorescência do meio
DMEM com adição da sonda (branco). Este valor basal foi descontado do valor de fluorescência
de cada amostra. As unidades de fluorescência de ERO foram calculadas a partir da equação 1:

∆𝐹 = 𝐹𝑡20 − 𝐹𝑡0 (1)

Onde Ft20 é a fluorescência após 20 minutos e Ft0 é a fluorescência no momento da adição da

sonda, e o resultado expresso como unidades de fluorescência.

4.13 – Dosagens dos biomarcadores de estresse oxidativo

4.13.1 – Ensaio de oxidação de lipídeos pelo método de TBARS

O malondialdeído (MDA) é uma substância oriunda da peroxidação lipídica das células, que por
sua vez reage com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) formando um complexo colorido cuja
concentração pode ser medida espectrofotometricamente a 535nm. Dessa forma, quantificar o

43
Menegatto, M.B.S

nível de MDA é um parâmetro muito importante no que se pode inferir sobre o status redox em
uma célula ou um tecido.
As dosagens de MDA, proteína carbonilada, SOD e CAT foram iniciadas a partir do
mesmo homogenato dos tecidos. Para isso, 50mg de tecido foram homogeneizados em 500µL
(mantendo essa proporção) de tampão fosfato (para 1000mL: NaH2PO4 1,42g; KH2PO4 1,36g; KCl
0,1g; NaCl 4g; EDTA anidro 0,0372g, pH 7,8) com auxílio de um homogeneizador. Em seguida, as
amostras foram incubadas em banho de gelo por 10 minutos, centrifugadas a 4°C e 13000 rpm
por mais 10 minutos, e sobrenadante coletado foi armazenado a -20°C até o momento do uso.
Para quantificar o MDA, 200µL de ácido tricloroacético (TCA) 10% (m/v) gelado foi
adicionado a 100µL do sobrenadante, seguido de incubação por 5 minutos em banho de gelo.
As amostras foram centrifugadas a 14000 rpm e 4°C por 5 minutos, 200µL do sobrenadante foi
passado para um novo tubo e adicionado 200µL do TBA 1% (m/v). A curva padrão de MDA foi
construída conforme Tabela 1, e em 200µL de cada ponto foi adicionado 200µL de TBA. Em
seguida, as amostras, incluindo os pontos da curva e o branco, foram passadas em vórtex e
incubadas em banho maria a 100°C por 60 minutos. Finalmente, após os tubos esfriarem à
temperatura ambiente, 100µL (em duplicata) de todas as amostras foi transferido para os poços
de microplacas para posterior leitura no espectrofotômetro a 535nm (Adaptado de Buege; Aust,
1978).

Tabela 1: Curva padrão de MDA para dosagem de TBARS

Tubo 30μM MDA + H20 Volume (μL) MDA (µM)

1 300μL + 0 H20 300 30

2 180μL + 120 H20 300 18

3 90μL + 210 H20 300 9

4 0μL + 300 H20 300 0

Em paralelo, a partir do homogenato inicial de cada amostra em tampão fosfato, foi

dosada a quantidade de proteína total pelo método de Bradford. Por fim, a concentração final
de TBARS foi calculada a partir da equação 2 e os resultados expressos como [nmol MDA/mg
proteína total].
(DOamostra − DObranco ) x fator de diluição
[𝐓𝐁𝐀𝐑𝐒] = (2)
inclinação da equação da reta x [proteína total]

Na qual DO é densidade óptica a 535nm.

44
Menegatto, M.B.S

4.13.2 – Ensaio de proteína carbonilada

A proteína carbonilada é um outro importante biomarcador do estresse oxidativo, pois é

formada a partir da oxidação de proteínas por ERO. Sendo assim, pode ser mensurada pelo
método sensível utilizando o composto 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNPH). O DNPH, por sua vez,
reage com os grupos carbonila formando 2,4-dinitrofenil-hidrazona (DNP), que diluído em
dodecil sulfato de sódio (SDS) pode ser detectado a 370nm em espectrofotômetro UV-visível.
A determinação da concentração de proteína carbonilada dos tecidos foi realizada a partir de
uma adaptação do método descrito por Levine et al (1994).
Para isso, foram adicionados em microtubos 200μL do homogenato dos tecidos e 200μL
de TCA 20% (m/v) com posterior homogeneização e centrifugação a 4°C e 5000 rpm por 5
minutos. Descartou-se o sobrenadante e o pellet foi ressuspendido em 500μL de DNPH, com
incubação a temperatura ambiente e no escuro por 15 minutos (com agitação a cada 5 minutos).
Após incubação, foi adicionado em cada amostra 500μL de TCA 20% (m/v), seguido de
homogeneização em vórtex e centrifugação a 5000 rpm e 4°C por 5 minutos. Novamente
descartou-se o sobrenadante e o pellet foi lavado com 1000μL da solução etanol/acetato de etila
(1:1), seguido de agitação, centrifugação a 5000 rpm e 4°C por 10 minutos, e mais uma vez o
sobrenadante foi descartado. Esse procedimento de lavagem com a solução de etanol/acetato
de etila foi realizado duas vezes. Por fim, o pellet foi seco e ressuspendido em 1000μL de SDS
6% (m/v), com posterior centrifugação a 10000 rpm e 4°C por 5 minutos. As amostras foram
então lidas em espectrofotômetro UV-visível a 375nm utilizando cubeta de quartzo. O branco
utilizado foi a solução SDS 6%.
Assim como no ensaio de MDA, quantificou-se também a proteína total (mg/mL)para
ser obtida a concentração da proteína carbonilada em relação à concentração de proteínas
totais. O cálculo foi realizado segundo a lei de Lambert-Beer, empregando o coeficiente de
extinção molar do DNPH (22000M-1cm-1) como representado na equação 3. Os resultados foram
expressos como [nmol DNPH incorporado/mg proteína total].

(DOamostra − DObranco )x 1000000

𝐂= (3)
ɛ x V x [proteína total]

Onde DO é densidade óptica a 375nm, V é o volume da amostra (mL), e ɛ o coeficiente de

extinção molar.

45
Menegatto, M.B.S

4.14 – Sistema de defesa antioxidante

4.14.1 – Ensaio enzima Superóxido Dismutase (SOD)

A enzima SOD catalisa a dismutação do ânion superóxido (O2•-) em oxigênio (O2) e peróxido de
hidrogênio (H2O2). Para quantificar a atividade enzimática de SOD, foi utilizado o método de
inibição da auto-oxidação do pirogalol (Marklund, 1974 – adaptado). Por meio do método é
possível mensurar a capacidade da SOD pois ela inibe a auto-oxidação do pirogalol quando
catalisa a dismutação desse ânion. O pirogalol realiza auto-oxidação com a variação de pH, uma
vez em meio básico, essa reação de auto-oxidação gera o O2•-. Os ânions superóxidos, por sua
vez, são responsáveis por reduzirem o MTT (metil tiazoltetrazólio) à cristais de formazan. Dessa
forma, como a SOD compete com o O2•- formado na auto-oxidação do pirogalol, foi definido que
uma unidade da enzima SOD (U SOD) é a quantidade de enzima que reduz a taxa de auto-
oxidação do pirogalol em 50%.
Sendo assim, 30μL das amostras de fígado e baço homogeneizadas anteriormente em
tampão fosfato, foram pipetadas em duplicata em microplaca de 96 poços, seguido de 99μL do
tampão fosfato, 6μL de MTT e 15μL de pirogalol em cada um dos poços contendo as amostras.
Nos poços destinados ao branco, foi pipetado 144μL do tampão e 6μL de MTT (solubilizado em
tampão fosfato). Já para o padrão de SOD, 129μL de tampão, 6μL de MTT e 15μL do pirogalol
(solubilizado em tampão fosfato). Em seguida, a placa foi incubada por 5 minutos em estufa a
37°C e a reação foi encerrada adicionando 100μL de DMSO em todos os poços. A leitura da
absorbância foi realizada a 595nm no leitor de microplaca Victor X3 Multilabel (Perkin Elmer).
Novamente, a proteína total de cada amostra também foi dosada pelo método de Bradford e a
concentração de SOD foi calculado como mostrado na equação 4, e o resultado expresso em U
SOD/mg proteína total.

DOamostra
DObranco
[𝐒𝐎𝐃] = (4)
[proteína total]x V

Onde DO é a densidade óptica e V é o volume da amostra.

4.14.2 – Ensaio enzima catalase (CAT)

A catalase é a enzima responsável pela decomposição do H2O2 em H2O e O2. Para dosar a
atividade de CAT foi utilizado o método cinético adaptado de Aebi (1984). O ensaio iniciou-se

46
Menegatto, M.B.S

com 30μL de cada amostra (homogenato dos tecidos em tampão fosfato) ressuspendida em
970μL do mix contendo tampão PBS modificado e 30% de H2O2, com leitura imediata em
espectrofotômetro UV-vis a 240nm em uma cubeta de quartzo. Foi anotado a absorbância inicial
(t0) e após 60 segundos (tf). O branco continha apenas o tampão PBS. É sabido que a medida da
atividade da CAT ocorre por meio da velocidade com que o H2O2 é reduzido pela ação enzimática
da CAT, resultando em consequente diminuição no valor da absorbância em 240nm. Então, a
diferença na leitura das absorbâncias, no intervalo de 60 segundos, permite estabelecer a
velocidade de redução do H2O2, sendo proporcional à velocidade da reação enzimática
catalisada pela CAT (AEBI, 1984). Uma unidade da enzima catalase (U CAT) decompõe 1 µmol
de H2O2 por mg de proteína em 60 segundos (MAEHLY et al., 1954). Sendo assim, após
quantificação de proteína total das amostras, o cálculo da atividade enzimática de CAT foi feito
utilizando a equação 5. Os resultados foram expressos como U CAT/mg proteína total

(DOt0 − DOtf ) x 1000

[𝐂𝐀𝐓] = (5)
ɛ x [proteína total]

Onde DO é a densidade óptica a 240nm e ɛ o coeficiente de extinção molar (39,4 M-1cm-1).

4.15 – Quantificação proteínas totais

Como citado nos ensaios dos biomarcadores de estresse oxidativo e defesas antioxidantes, foi
necessário dosar proteína total e o método utilizado para essa quantificação foi o descrito
por Bradford (1976). Este ensaio baseia-se na interação do corante Coomassie Blue com as
proteínas por meio dos aminoácidos de cadeias laterais básicos ou aromáticos. Para isso, 10µL
de cada amostra foi adicionada (em triplicata) nos poços de microplacas de 96 poços,
juntamente com 190µL do corante Bio-Rad Protein Assay (1:4). A placa foi incubada a
temperatura ambiente por 30 minutos e em seguida realizada a leitura da absorbância a 595nm
no leitor Victor X3 Multilabel (Perkin Elmer). Em paralelo, foi construída também uma curva
padrão com albumina de soro bovino (BSA), sendo sete pontos de 2 a 0,03mg/mL, pipetados na
placa da mesma forma que as amostras. A partir da curva padrão foi calculada a concentração
de proteínas totais pela equação da reta gerada. O resultado final foi expresso em mg/mL.

47
Menegatto, M.B.S

4.16 – Análise Estatística

Todos os dados obtidos no trabalho foram expressos em Média ± Desvio Padrão e analisados
pelo programa GraphPad Prism, versão 5.01. Após confirmada a normalidade dos dados pelo
teste de Kolmogorov- Smirnov, as diferenças entre os grupos controle e infectado foram
consideradas significantes utilizando o teste t-Student não pareado, com valor de p menor ou
igual a 0,05. Nos gráficos, os símbolos *, **,*** representam diferenças significativas entre os
grupos com p≤0.05, p≤0.01 e p≤0,001, respectivamente.

48
Menegatto, M.B.S

5. RESULTADOS

5.1 – Avaliação da susceptibilidade dos camundongos à infecção pelo OROV

Primeiramente os animais foram avaliados quanto ao desenvolvimento de doença e sobrevida

após infecção pelo OROV por um período de 21 dias. Nos animais infectados, nenhum sinal
clínico como prostração, piloereção, tremores, arqueamento de dorso e dificuldade de
locomoção foi observado, somente uma diminuição do ganho de massa corpórea, quando
comparados aos animais do grupo controle. Como mostra a Figura 8A, a infecção pelo OROV
diminuiu significativamente o ganho de massa corporal dos animais nos dias 2 a 5 pós infecção.
Em seguida, esse percentual foi restabelecido e igualou-se ao do grupo controle. Além disso,
houve sobrevida de 100% dos animais durante o período avaliado. A partir deste ensaio foi
determinado o 4º dpi como o dia da eutanásia nos experimentos seguintes para que a doença
pudesse ser avaliada durante a fase aguda, antes da total resolução pelo sistema imune.
Sendo assim, novos grupos contendo animais controles e infectados foram observados
até 4 dpi e eutanasiados. O fígado e o baço foram coletados e pesados. Foi observado
visualmente um aumento do tamanho do baço dos animais infectados, no momento em que a
cavidade abdominal foi exposta (Figura 8B). Confirmando esse aspecto observado, ao mensurar
a massa do órgão, houve um aumento significativo (Figura 8C) da massa do baço dos animais
infectados em relação a massa do baço dos animais controles, demonstrando que o OROV
induziu um quadro de esplenomegalia nesses animais. Quanto à massa do fígado, não foi
possível observar diferença significativa entre os animais (Figura 8D).
Quando avaliado o perfil hematológico, foi observada uma diminuição em todos os
parâmetros analisados. A infecção pelo OROV induziu nos animais leucopenia ou redução dos
leucócitos (Figura 9A); plaquetopenia ou redução das plaquetas (Figura 9B); e anemia
caracterizada pelos baixos níveis de hemácias (Figura 9C) e hemoglobina (Figura 9D). Ainda, para
avaliar a resposta imune humoral desenvolvida contra OROV, os animais infectados foram
testados quanto à indução de anticorpos neutralizantes. As porcentagens médias de redução de
placa foram 64,9% (±12,2), 50% (±11) e 40,9% (±9,8) em diluições de soro de 1:20, 1:40 e 1:80,
respectivamente (Figura 9E). Dessa forma, o título médio de anticorpos neutralizantes anti-
OROV foi de 266,6 NU/mL. Juntos, esses resultados mostram que camundongos BALB/c de 21
dias de idade são suscetíveis à infecção subcutânea pelo OROV, porém desenvolvem uma
doença aguda autolimitada e resolutiva.

49
Menegatto, M.B.S

Figura 8: Susceptibilidade de camundongos BALB/c à infecção pelo OROV. (A) O peso corporal
dos camundongos foi registrado diariamente. As porcentagens do peso médio em relação ao
seu peso inicial foram plotadas de 1 a 21dpi. (B) Cavidade abdominal exposta de animais
indicando aumento do tamanho do baço (seta). (C e D) O baço e o fígado foram pesados e os
dados obtidos plotados como a razão entre o peso do órgão e o peso corporal. Os dados são
expressos como média ± DP (n=10), plotados e analisados usando o teste t-Student, onde * p≤
0,05 e *** p≤0,001 em comparação com o grupo controle.

A B
Controle OROV
180 Control
peso
de gain

OROV
160
weight
de ganho

140 *
% body

120
% of

100

80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021
Dayspós
Dias post-infection
infecção

C D
0.010 0.08
corporal

***
baço/peso corporal
weight

liver/body weight

0.008 0.07
Ratio spleen/body

Ratiofígado/peso

0.006 0.06

0.004 0.05
Razão

0.002 0.04
Razão

0.000 0.03
Control
Controle OROV Controle
Control OROV

50
Menegatto, M.B.S

Figura 9: Alterações nos parâmetros hematológicos no sangue de animais infectados com

OROV. Os níveis de (A) leucócitos, (B) plaquetas, (C) hemácias e (D) hemoglobina foram
avaliados em amostras de sangue (contendo anticoagulante EDTA) utilizando o equipamento
automatizado Auto Hematology Analyzer (Mindray BC-2800 Vet, Alemanha). Os dados são
expressos como média ± DP (n=10), (E) Porcentagem de redução de formação de placa (PFU) em
amostras de soro. Dados expressos como média ± DP (n=8). Todos os dados foram analisados
usando o teste t-Student, onde ** p ≤ 0,01 e *** p≤0,001 em comparação ao grupo controle.

A Leucócitos B Plaquetas
400
3
*** **
300

(x10 9/L)
2
(x10 9/L)

200

1
100

0
0 Controle OROV
Controle OROV

C Hemácias D Hemoglobina
10 15
***
***
8
10
(x10 12/L)

6
(g/dL)

4
5
2

0 0
Controle OROV Controle OROV

E Anticorpos neutralizantes
100
(vs Controle de vírus)
% Redução de UFP

80

60

40

20

0
1:20 1:40 1:80
Diluições do soro

51
Menegatto, M.B.S

5.2 – A infecção pelo OROV resulta em danos ao fígado e baço em camundongos BALB/c

Para caracterizar eficientemente os efeitos hepáticos da infecção por OROV nos animais, foram
determinados os níveis séricos de ALT e AST. Estas transaminases estão presentes nos
hepatócitos e na presença de uma lesão hepática, são extravasadas no sangue, podendo ser
mensuradas por ensaios colorimétricos. Os níveis médios de AST e ALT aumentaram
significativamente nos animais infectados (Figura 10A e B), evidenciando um grau significativo
de injúria hepática após infecção por OROV. Além disso, na análise histopatológica das amostras
de fígado, os resultados revelaram aumento de infiltrado inflamatório no parênquima hepático
dos animais infectados (Figura 11C e D), em relação aos animais controles (Figura 11A e B). Uma
maior contagem de células inflamatórias no fígado dos animais infectados foi também
observada pela morfometria (Figura 11E).
O baço é um órgão linfóide e possui dois componentes principais, a polpa vermelha e
polpa branca. A polpa branca é composta pelos nódulos linfóides, constituídos de linfócitos B e
uma artéria central, localizada no centro do nódulo. A polpa vermelha é a região entre os
nódulos, constituída pelo tecido sanguíneo. Corroborando com o quadro de esplenomegalia
anteriormente observado, o corte histológico da Figura 12 representa o maior número de
nódulos (circulados pela linha tracejada) no grupo infectado (Figura 12B) comparado com o
grupo controle (Figura 12A). Esse aumento do número e da área total dos nódulos linfóides pode
ser confirmado também na Figura 12 (C e D). Assim, junto com o aumento da massa do órgão,
estes achados histopatológicos sugerem maior atividade do baço no combate à infecção pelo
OROV.

Figura 10: Aumento dos níveis séricos de AST/ALT em camundongos infectados com OROV.
Os níveis de (A) alanina aminotransferase (ALT) e (B) aspartato aminotransferase (AST) foram
medidos no soro por ensaio colorimétrico. Os dados são expressos como média ± DP (n=10),
analisados usando o teste t-Student, onde ** p ≤ 0,01 em comparação ao grupo controle.

A B
** **
500 500
Atividade ALT (U/mL)

Atividade AST (U/mL)

400 400

300 300

200 200

100 100

0 0
Controle OROV Controle OROV

52
Menegatto, M.B.S

Figura 11: Análise histopatológica do fígado de camundongos controle e infectados com

OROV. Fotomicrografias dos cortes histológicos do fígado corados com Hematoxilina-Eosina. Em
(A e B), grupo controle com aspecto histológico normal. Em (B e C) grupo infectado (OROV) com
presença de foco de infiltrado inflamatório, constituído por células mononucleares e
polimorfonucleares. Barras pretas indicam 50 μm (A/C) e 100 μm (B/D) de magnitude. (E)
Representação quantitativa de células inflamatórias no fígado dos camundongos após
morfometria. Para a contagem de células inflamatórias, os dados são expressos como média ±
DP (n=10), analisados pelo teste t-Student, onde *** p ≤ 0,01 em relação ao grupo controle.

53
Menegatto, M.B.S

Figura 12: Análise histopatológica do baço de camundongos controle e infectados com OROV.
Fotomicrografias dos cortes histológicos do baço corados com Hematoxilina-Eosina. Em (A) está
representado o grupo controle e (B) o grupo infectado por OROV. Os nódulos linfóides são
circulados pela linha tracejada. Há maior número de nódulos linfóides (polpa branca) nos
animais infectados. Barras pretas indicam 200 μm (A/B) de magnitude. (C) Número de nódulos
e (D) área total dos nódulos linfóides. Os dados são expressos como média ± DP (n=7), analisados
com o teste t- Student, onde * p ≤ 0,05 e *** p ≤ 0,01 em comparação com o grupo controle.

A B

5.3 – Avaliação da carga viral

Amostras de sangue total, fígado e baço foram utilizadas para detectar a carga viral por qRT-PCR
nos camundongos infectados. O genoma OROV foi detectado nos órgãos, fígado e baço, mas
não no sangue total (Figura 13A). Como pode ser visto, foi detectada uma maior amplificação
do segmento S do genoma do OROV no baço quando comparado com as amostras de fígado.
Em seguida, os títulos de partículas virais infecciosas foram determinados a partir do soro e dos
homogenatos de fígado e baço. Aproximadamente 63% e 100% das amostras de fígado e baço
testadas (n=8), respectivamente, foram positivas para vírus através do ensaio de formação de
placa, sem vírus viável detectado no soro (Figura 13 B). Os títulos no fígado e no baço variaram
de 6,6x101 a 1,3x102 PFU/g e 6,6x101 a 3,3x102 PFU/g, respectivamente, sem diferença

54
Menegatto, M.B.S

estatística entre as médias. Sendo assim, a presença do genoma OROV e de partículas

infecciosas no fígado e no baço corroboram as alterações observadas nesses órgãos.

Figura 13: Carga viral do OROV no fígado e baço dos animais infectados. (A) O RNA total foi
extraído de amostras de fígado e baço. A carga viral foi determinada por RT-qPCR usando
primers específicos que amplificam uma porção do segmento S do RNA do OROV. A carga viral
relativa foi determinada como a proporção do genoma viral para o gene constitutivo GAPDH.
(B) Carga viral nos tecidos medida pelo ensaio de formação de placas. Os dados são expressos
como média ± DP (n = 8), analisados usando o teste t-Student, onde *** p ≤ 0,001 comparando
os valores do fígado e do baço.

B
2.8

(Log10 PFU/g de tecido)

2.6

Título OROV
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
Fígado Baço

5.4 – A infecção pelo OROV induz aumento de ERO e altera a homeostase redox no fígado e
baço dos animais

Uma vez detectada carga viral no fígado e no baço dos camundongos, confirmando que esses
órgãos são susceptíveis à multiplicação do OROV, o próximo passo foi investigar se haveria uma
maior produção de ERO induzida pela infecção. Sendo assim, os níveis de ERO foram
mensurados utilizando o marcador fluorogênico, CM-H2DCFDA, que no momento em que é
clivado por esterases intracelulares gera DCFH como subproduto. O DCFH reage então com as
ERO e o produto final emite fluorescência verde. Conforme mostrado na Figura 14A, houve
aumento significativo da fluorescência no fígado e no baço dos animais infectados, indicando
aumento da produção de ERO em ambos os órgãos quando comparado ao grupo controle.
Com o aumento da formação de ERO induzida pela infecção, o próximo passo foi
investigar se esse aumento de ERO culminaria com danos oxidativos aos lipídeos e proteína
celulares. Dessa forma, os níveis de dois biomarcadores de estresse oxidativo (MDA e proteína
carbonilada) foram medidos nos animais do grupo controle e infectado. A infecção pelo OROV
resultou no aumento significativo dos níveis de MDA no fígado, porém não houve alteração nos
níveis de MDA no baço dos animais infectados (Figura 14B). Por outro lado, os níveis de proteína

55
Menegatto, M.B.S

carbonila aumentaram significativamente em ambos os órgãos (Figura 14C) quando comparado

com o controle. Sendo assim, esses resultados confirmam que o estresse oxidativo ocorre
durante a infecção por OROV in vivo.
Em decorrência das alterações redox, o sistema antioxidante endógeno foi então
investigado. Para isso, foi mensurada a atividade total de SOD, crítica para a proteção dos
componentes celulares contra ataques das ERO. Os resultados mostraram que a infecção por
OROV diminuiu significativamente a atividade de SOD total no fígado e baço dos animais (Figura
14D). As enzimas SOD são responsáveis por metabolizar o O2• em H2O2, que é posteriormente
convertido em H20 e O2 pela CAT (WANG et al.,2018; PILLAI et al., 2019). Portanto, a atividade
da CAT no fígado e no baço também foi avaliada. Em ambos os órgãos, a atividade de CAT
diminuiu significativamente nos camundongos infectados (Figura 14E). Dessa forma, os
resultados sugerem que durante a infecção pelo OROV ocorre uma depleção do sistema
enzimático antioxidante.

56
Menegatto, M.B.S

Figura 14: A infecção pelo OROV induz aumento da produção de ERO, estresse oxidativo e
diminuição da atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAT em camundongos BALB/c.
Homogenatos de fígado e baço foram utilizados para avaliar: (i) a produção de espécies reativas
de oxigênio (ERO) (A), cujo gráfico representa as unidades médias de fluorescência calculadas
pela diferença entre a última e a primeira leitura do ensaio DCFH-DA; (ii) biomarcadores de
estresse oxidativo MDA (B) e proteína carbonilada (C); (iii) as atividades de SOD total (D) e CAT
(E). Os dados são expressos como média ± DP (n=9), analisados usando o teste t-Student, onde
* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 *** p ≤ 0,001 em comparação com o grupo controle.

57
Menegatto, M.B.S

5.5 – A infecção pelo OROV aumenta os níveis de citocinas pró-inflamatórias

A literatura mostra que o estresse oxidativo presente na patogênese viral está associado ao
aumento da produção de ERO, que por sua vez desencadeia a produção de citocinas pró-
inflamatórias (CAMINI et al., 2017; PILLAI et al., 2019). Sendo assim, foi avaliado o perfil de
citocinas pró-inflamatórias em amostras de soro. A infecção pelo OROV mostrou um aumento
significativo nos níveis séricos de fator de necrose tumoral (TNF-α) (Figura 15A) e interferon-γ
(IFN-γ) (Figura 15B).

Figura 15: A infecção pelo OROV aumento os níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias.
Foram utilizadas amostras de soro para dosagem das citocinas TNF-α (A) e IFN-γ (B) por
citometria de fluxo. Os dados são expressos como média ± DP (n=9), analisados usando o teste
t-Student, onde * p ≤ 0,05 e ** p ≤ 0,01 em comparação ao grupo controle.

A B
8 ** 8
**
TNF-alpha (pg/mL)

IFN-gama (pg/mL)

6 6

4 4

2 2
ND
0 0
Controle OROV Controle OROV

6. DISCUSSÃO

Apesar do OROV ser um vírus descoberto há mais de 65 anos, com risco significativo de
emergência nas Américas, os estudos relacionados à sua patogênese e fisiopatologia ainda são
limitados. Portanto, o uso de modelos animais para elucidar os mecanismos que contribuem
para esta doença pode fornecer uma melhor compreensão da Febre Oropouche. Neste trabalho
foi demonstrado que camundongos BALB/c com três semanas de idade são suscetíveis à
infecção subcutânea, que é a rota que melhor mimetiza a via de infecção natural, com formação
de anticorpos neutralizantes anti-OROV. Os animais desenvolveram doença aguda autolimitada,
sem mortalidade, até 21 dpi, e apresentaram redução no percentual de ganho de peso em
relação ao grupo controle. Além disso, foi observado que a infecção por OROV gerou aumento
do baço caracterizado pelo aumento do volume e peso do órgão. Esses achados também foram
descritos anteriormente por Santos e colaboradores (2012), em que camundongos BALB/c de
um dia de idade infectados com o OROV apresentaram uma parada no crescimento corporal e
hiperplasia do baço. Também demonstramos que a infecção por OROV causou alterações nos

58
Menegatto, M.B.S

parâmetros hematológicos, como leucopenia, trombocitopenia e anemia. Em pacientes

humanos na fase aguda da doença, uma diminuição nos leucócitos já foi documentada (valores
tão baixos quanto 2000 leucócitos/mL) (FILES et al., 2022).
Além disso, neste trabalho foi observado um aumento nos níveis de ALT/AST no soro
dos camundongos infectados com OROV. Corroborando com esse aumento das transaminases,
as análises histopatológicas e morfométricas revelaram focos de inflamação no parênquima
hepático desses animais. Casos de infecções humanas com alterações de AST/ALT também
foram descritos, sugerindo dano hepático (SAKKAS et al., 2018; VERNAL et al., 2019). Em Golden
hamsters infectados com OROV, a histopatologia revelou hepatite com infiltrado inflamatório
linfomononuclear abundante, histiócitos e eosinófilos dispersos, necrose focal, congestão
sinusoidal e hiperplasia de células de Kupffer (RODRIGUES et al., 2011). No entanto, em um
modelo experimental de infecção de camundongos BALB/c lactentes (um dia de idade)
infectados com OROV, a presença de algumas células gigantes hepáticas foi observada
posteriormente no curso da infecção e foi a única anormalidade observada no fígado de animais
infectados, sem detecção do antígeno OROV ou replicação viral (SANTOS et al., 2012).
Além da hepatite, a infecção pelo OROV induziu esplenomegalia, ilustrada por um maior
número e área total dos nódulos linfoides. Em humanos, não há relatos de casos de
esplenomegalia decorrentes da infecção. Sabe-se que o baço é um órgão linfoide que inicia e
modula a resposta imune a antígenos carreados pelo sangue. Em particular, a polpa branca é
responsável por essa função (CESTA, 2006). Sendo assim, isso pode explicar a esplenomegalia e
o aumento do número e da área total dos nódulos linfoides (que compõem a polpa branca),
como forma de defesa imune do animal contra o OROV.
Essas alterações encontradas no fígado e no baço dos animais infectados levou à
investigação se, concomitante aos danos teciduais encontrados, a presença do OROV poderia
ser detectada nesses órgãos, assim como no sangue periférico (viremia). No grupo infectado, o
genoma do OROV foi detectado em ambos os órgãos, com maior número de cópias do genoma
no baço do que no fígado. Esses achados correlacionaram-se com o título do OROV de até
1,3x102 PFU/g de fígado e 3,3x102 PFU/g de baço, indicando que a replicação do OROV é
altamente eficiente nesses órgãos. Estudos mostraram que na inoculação experimental de
hamsters, um título de 104.5TCID50/g de tecido foi recuperado de homogenato de fígado com 1
dia pós infecção (RODRIGUES et al, 2011), enquanto em camundongos BALB/c de um dia de
idade, após 5dpi, o OROV foi recuperado de homogenato de cérebro, com título de 103-104
TCID50/g de tecido, mas não de outros órgãos (SANTOS et al., 2012). No entanto, este é o
primeiro estudo a detectar a presença do OROV e avaliar a expressão do genoma tanto no
fígado quanto no baço de camundongos BALB/c. Até o momento, muitos estudos se

59
Menegatto, M.B.S

concentraram na compreensão dos mecanismos de invasão do OROV no sistema nervoso

central (RODRIGUES et al., 2011; SANTOS et al.,2012; 2014). Mais recentemente, estudos com
OROV foram feitos visando encontrar potenciais alvos terapêuticos no combate à infecção
(STUBBS et al., 2021), melhor compreender o papel das glicoproteínas na montagem e secreção
viral (BARBOSA et al., 2023) e elucidar fatores do hospedeiro que contribuem para a penetração
viral (SCHWARZ et al., 2022). Assim, os resultados obtidos aqui ajudarão na melhor
compreensão de aspectos relacionados a patogênese do OROV.
Em seguida, como muitos estudos já mostraram que diferentes vírus podem induzir
estresse oxidativo por diferentes vias, o que pode influenciar diretamente a patogênese viral,
avaliamos a produção de ERO e dos biomarcadores de estresse oxidativo no fígado e baço de
camundongos infectados com OROV. Em ambos os órgãos avaliados, houve maior produção de
ERO decorrentes da infecção. Sabe-se que as ERO podem ser geradas de várias maneiras, e uma
delas é oriunda de células fagocíticas durante a fase de ativação de um processo inflamatório a
fim de eliminar patógenos (HALLIWELL, 1992; PISOSCHI et al., 2015). As ERO podem danificar
todos os tipos de moléculas biológicas e levar a danos oxidativos deletérios a componentes
celulares, como proteínas, lipídios ou DNA (DALLE-DONNE et al., 2003). Alguns desses efeitos
deletérios incluem a oxidação de lipídios e proteínas. Neste trabalho foi mostrado que a infecção
pelo OROV leva ao aumento dos níveis de MDA (um subproduto da peroxidação lipídica) no
fígado e proteína carbonilada no fígado e no baço. A peroxidação lipídica é um processo
biológico contínuo e prejudicial no qual os ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) da membrana
são atacados por ERO (HALLIWELL et al., 1994; WANG et al., 2018). A proteína carbonilada
também é um biomarcador de dano oxidativo, uma vez que pode ser gerada a partir da oxidação
de proteínas pelas ERO (DALLE-DONNE et. al., 2003). Portanto, a presença de danos oxidativos
aos lipídeos e proteínas celulares após a infecção pelo OROV corroboram com a maior produção
de ERO induzida pela infecção em ambos os órgãos aqui analisados.
Relacionado a esses resultados, outra alteração induzida pela infecção observada neste
estudo foi no sistema de defesa antioxidante enzimático, responsável por eliminar as ERO e/ou
minimizar seus efeitos negativos (BIRBEN et al., 2012). A infecção pelo OROV levou a diminuição
da atividade das enzimas SOD e CAT no fígado e baço dos animais, sugerindo assim uma resposta
antioxidante ineficiente ou exaurida, incapaz de prevenir danos oxidativos. Esse desequilíbrio
na homeostase redox devido ao aumento da produção de ERO que danificam as biomoléculas
e/ou levam a uma baixa no sistema antioxidante, culmina no estresse oxidativo (CHATTERJEE,
2016; PILLAI et al., 2019).
O envolvimento do estresse oxidativo na patogênese de outros Orthobunyavirus ainda
é limitado. Em um estudo anterior do nosso grupo, foi avaliada a patogênese hepática do vírus

60
Menegatto, M.B.S

Caraparu (CARV) e o envolvimento do estresse oxidativo e defesas antioxidantes em

camundongos BALB/c com seis semanas de idade. O CARV foi detectado no fígado dos animais
e a histopatologia revelou hepatite aguda, com níveis séricos aumentados de AST/ALT e
expressão hepática de TNF. Ainda, a infecção por CARV não alterou os biomarcadores de
estresse oxidativo, mas causou aumento no conteúdo de glutationa e alterou a expressão e
atividade de SOD (CAMINI et al., 2014). Já para o vírus La crosse (LACV), um dos principais
agentes da encefalite viral pediátrica nos Estados Unidos, foi demonstrado que a infecção
resulta na regulação positiva do alfa estéril e motivo TIR contendo 1 (SARM1), necessário para a
resposta do estresse oxidativo à infecção e contribui para a apoptose neuronal induzida por
LACV (MUKHERJEE et al., 2013).
Uma das consequências do estresse oxidativo é a produção de citocinas pró-
inflamatórias desencadeadas pelo aumento da produção de ERO. De acordo com isso, aqui foi
observado aumento dos níveis de TNF e IFN-γ no soro de animais infectados. TNF e IFN-γ são
polipeptídeos que exercem ações pleiotrópicas em múltiplas funções celulares que regulam a
expressão gênica, reações de defesa do hospedeiro e respostas imunes (YANG et al., 2007). TNF-
α e IFN-γ aumentam a produção mitocondrial de ERO em células tumorais, células endoteliais e
hepatócitos (YANG et al., 2007), o que explica o aumento dos níveis de ERO no fígado e baço de
animais infectados com OROV observado neste estudo. Correlacionando os resultados aqui
encontrados, o dano oxidativo induzido pelas ERO pode levar ao início da sinalização que
desencadeia o processo inflamatório. Além disso, embora a inflamação induza dano oxidativo,
a sequência inversa de eventos também é observada. Assim, a inflamação e o estresse oxidativo
estão intrinsecamente relacionados (CHATTERJEE, 2016).
No que diz respeito à infecção viral, as ERO podem facilitar ou mesmo promover a
multiplicação viral (CAMINI et al., 2017). Quando infectado, o corpo detecta a presença do vírus,
que é então fagocitado pelas células do sistema imunológico. Nessas células, o patógeno ativa
a expressão do complexo NADPH oxidase e óxido nítrico sintase, que é responsável pela maior
produção de ERO. Além disso, os fagócitos ativados pela presença do vírus podem liberar
citocinas pró-oxidantes, como TNF-α e IFN-γ (CAMINI et al., 2017; LIU et al., 2017; SCHWARZ,
1996). Em um primeiro momento, as ERO combatem a infecção e funcionam como mecanismos
de proteção da célula hospedeira (JACBSON, 1996). No entanto, à medida que a multiplicação
viral avança, mais ERO são formadas, levando a um desequilíbrio na homeostase redox (CAMINI
et al., 2017), conforme observado neste estudo.

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7. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste estudo mostraram que camundongos BALB/c com três semanas de
idade são suscetíveis à infecção subcutânea por OROV e desenvolvem uma doença aguda auto-
limitada. A doença é caracterizada pela diminuição da porcentagem de ganho de peso corporal,
diminuição dos parâmetros hematológicos e danos ao fígado (aumento de AST e ALT e presença
de infiltrado inflamatório encontrado na histopatologia) e baço (aumento da massa e número e
área total de órgãos de nódulos na polpa branca) dos animais. Além disso, a infecção também
leva a um desequilíbrio no sistema oxidante-antioxidante, caracterizado por aumento dos níveis
de ERO, MDA e proteína carbonilada, e diminuição da atividade das enzimas antioxidantes SOD
e CAT. O estresse oxidativo induzido também está relacionado ao aumento de citocinas pró-
inflamatórias, TNF-α e IFN-γ, no soro de animais infectados. Assim, uma vez que o ambiente
redox celular é influenciado pela produção e remoção de ERO, hipotetizamos que a
superprodução de ERO e a depleção da defesa enzimática antioxidante foram responsáveis pelo
estresse oxidativo em resposta à infecção por OROV. Este estudo é o primeiro a relatar o
envolvimento do estresse oxidativo na infecção por OROV. Mecanismos adicionais pelos quais
OROV induz e modula o estresse oxidativo e o quanto o estresse oxidativo influencia na
patogênese viral ainda precisam ser elucidados e requerem mais estudos. Uma vez comprovado
que o estresse oxidativo é um evento conspícuo na patogênese do vírus OROV, estudos com
substâncias capazes de modular ou reverter os danos oxidativos, como antioxidantes naturais,
poderão ser conduzidos a fim de encontrar possíveis formas de tratamento para a Febre
Oropouche, uma doença importante, negligenciada e com potencial para re(emergir) no Brasil
e no mundo.

62
Menegatto, M.B.S

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70
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ANEXOS

Anexo 1: Certificado de aprovação do estudo pelo Comitê de Ética Animal

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Anexo II: Artigo publicado como primeira autora no doutorado:

Publicado em maio de 2023 - https://doi.org/10.1099/jgv.0.001857

FI = 5,141
Qualis – A2 (Ciências Biológicas II)

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Anexo III: Artigos publicados como co-autora no doutorado:

a) Artigo original publicado em 2020 - https://doi.org/10.1016/j.virusres.2020.198084

b) Artigo original publicado em 2021 - https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2021.105168

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c) Artigo original publicado em 2021 – https://doi.org/10.1590/0001-3765202120201679

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Anexo IV: Trabalhos apresentados durante o doutorado:

a) IV FAMERP-UTMB – Emerging Infections in the Americas common interests and collaboration

between Brazil and USA – Dezembro/2019 – São José do Rio Preto-SP

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b) XXXI Congresso Brasileiro de Virologia & XV Encontro de Virologia do Mercosul – Novembro de

2020 – online

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c) Encontro dos Saberes – VI Mostra de Pós Graduação – Universidade Federal de Ouro Preto – Ouro
Preto (MG) – 29 de novembro a 3 de dezembro de 2021

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d) IX Simpósio de Microbiologia da UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte (MG)
– 27 a 29 de setembro de 2022

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e) III IBEROAMERICAN Conference on Mass Spectrometry - Rio de Janeiro (RJ) – 10 a 15 de dezembro

de 2022

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f) VII Mostra de Pós Graduação – Encontro dos Saberes – UFOP – Ouro Preto, MG - 12 a 16 de dezembro
de 2022

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