Tese - Betania Maria Soares - Terapia Fotodinâmica em Fungos Dimórficos

BETÂNIA MARIA SOARES
Inibição Fotodinâmica em Fungos:

Abordagem experimental em Candida spp.,
Cryptococcus spp., Sporothrix spp. e
Malassezia furfur
Tese apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Microbiologia do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade Federal
de Minas Gerais como requisito parcial à
obtenção do Grau de Doutor em Ciências
Biológicas: Ênfase em Microbiologia.
Orientadora: Profª. Drª. Patrícia Silva Cisalpino

Co-orientador: Prof. Dr. Marcos Pinotti
Belo Horizonte
Instituto de Ciências Biológicas
Universidade Federal de Minas Gerais
2008
ii
As abordagens experimentais desenvolvidas neste trabalho foram conduzidas em
diferentes laboratórios da UFMG e do IPEN. Os laboratórios e seus responsáveis, nas
respectivas instituições, estão abaixo relacionadas:
1- Laboratório de Micologia, Departamento de Microbiologia, Instituto de
Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais – Profª. Drª.
Maria Aparecida de Resende.
2- Laboratório de Biologia de Microrganismos, Departamento de
Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Minas Gerais – Profª. Drª. Patrícia Silva Cisalpino.
3- Laboratório de Bioengenharia, Departamento de Engenharia Mecânica,
Universidade Federal de Minas Gerais – Prof. Dr. Marcos Pinotti.
4- Centro de Lasers e Aplicações, Instituto de Pesquisas Energéticas e
Nucleares, Universidade de São Paulo – Profª. Drª. Martha Simões Ribeiro
(colaboração do doutorando Renato Araújo Prates).
5- Laboratórios de Nanomateriais e Ressonância Magnética, Departamento de
Física, Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal de Minas Gerais –
Prof. Dr. Maurício Veloso Brant Pinheiro.
6- Laboratório de Imunologia Celular e Molecular, Departamento de
Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade
Federal de Minas Gerais - Prof. Dr. Alfredo Miranda Góes.
Apoio Financeiro
Este trabalho foi realizado com o apoio financeiro da CAPES e do CNPq.
iii
Dedico esta conquista
a meus pais Odete e Alberto
pela compreensão, paciência
e confiança ...
... e a Vó Geralda pelas orações

e sábios exemplos de fé.
iv
“O que faz a gente ser grande é não perder o futuro de vista. É chegar a um
porto fincar a bandeira da conquista e nesse mesmo instante começar a buscar
outros portos. É criar desafios, calcular riscos, avançando sempre, porque a grande
aventura é viver. E a vida é assim como as ondas, que tem um jeito diferente de se
repetir. De prometer descobertas e abrigar todos os tipos de sonhos e embarcações.
O que faz a gente ser grande é ser como o mar: incansável em sua procura pela
onda perfeita. Até descobrir que a perfeição está na própria busca.” (Autor
desconhecido)
v
Agradecimentos
vi
Eu entreguei inteiramente a Vós, Senhor, esta missão que me confiaste. Obrigada
pela força, coragem, discernimento e fé.
A meus pais, que me ensinaram o amor, a esperança e a dignidade, e ajudaram-me

a concluir este sonho.
A vocês, Ana Cláudia e Gério, que estiveram sempre presentes com carinho,
paciência e cumplicidade.
A Cláudio agradeço pelo olhar de apoio, palavras de incentivo, atitudes de amor.

Esta conquista tem a sua presença e o seu amor.
A meus familiares que me incentivaram a seguir em frente.
A D. Lúcia que me acolheu com carinho e dedicou tamanha atenção.
“É inútil tentar resumir certas pessoas, só se pode mesmo seguí-los”

(desconhecido)
Com carinho, respeito e admiração, agradeço e ofereço este sonho concretizado
a minha Orientadora Profª. Drª. Patrícia Silva Cisalpino, pela dedicação,

entusiasmo e exemplo, características primordiais, que me impulsionaram
nesta caminhada e despertaram o interesse pela pesquisa.
ao meu Co-Orientador Prof. Dr. Marcos Pinotti, que me abriu as portas,

acreditou no meu potencial e orientou-me nos momentos de dúvidas e
dificuldades.
à Coordenadora do curso de pós-graduação em Microbiologia, Profª. Drª.

Maria Aparecida de Resende, que se fez presente, apoiando-me nos
momentos difíceis e, com confiança, deu-me a oportunidade de ministrar
aulas nesta Instituição Federal, contribuindo para minha formação como
professora.
vii
A Bete, Lidiane e Daniel pela união, partilha de ideais, alegrias, emoções e
tristezas. As dificuldades desta caminhada uniu-nos, tornou-nos cúmplices e
amigos. Saudades!!
A Eduardo Robson Duarte pelo carinho, apoio e confiança depositados.
A Gerdal, José Cláudio, Marcos, Lívio, Renato e Orley pela parceria, partilha de
conhecimentos, experiências e amizade.
A Walquíria Lopes Borges e Silva. De seu apoio nasceram a tranqüilidade e a

felicidade de ver o sonho concretizado.
A Rosana, Paty Campi e Mila agradeço pelos sorrisos, força, carinho com que me
trataram e grandeza de seus corações.
A Roberta, Suzana, Profª. Daniele, Daniel, Thaissa e Marco Aurélio, pela

experiência, amizade e palavras de incentivo.
A Silvinha (meu orgulho!) e Graciela por cada abraço e olhar de carinho.
A Carol, Cleide, Rodrigo, Wigres, Tatiana, Fábio, Marcilene e Danielle pela ajuda
durante os experimentos (publicação!), carinho e certeza de que fiz amigos tão
especiais no Laboratório de Micologia.
A Patrícia Rangel pela ajuda nos experimentos, troca de experiências e amizade.
Aos Professores do Departamento de Microbiologia, em especial Profª. Maria

Auxiliadora Roque de Carvalho, Prof. Luís de Macedo Farias e Profª. Edel
Figueiredo Barbosa Stancioli, pela confiança e oportunidade de ministrar aulas.
Ao Prof. Maurício Veloso Brant Pinheiro, do Departamento de Física, pela

disponibilidade, partilha de conhecimento e por gentilmente ceder os derivados
fulerenos, testados neste estudo.
viii
A Gina, Iracema, Douglas, Thiago, Fatinha, Tatiana, Luciene, Tânia e Gilvânia
pela amizade. Sentirei saudades!
A Cecília e Ana Paula, da Biblioteca do ICB/ UFMG, pela competência, simpatia e

atenção.
A Selma Reis por me acolher com palavras sinceras de incentivo, estendendo-me a

mão que dá apoio e aliviando minhas aflições.
À Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM), na pessoa

do seu Reitor Prof. Dr. Pedro Ângelo Almeida Abreu.
Ao Vice-Reitor da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri

(UFVJM), Prof. Dr. Donaldo Rosa Pires Júnior, pela contribuição valiosa em minha
formação, como mestre e amigo.
Aos Professores da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri

(UFVJM), em especial Marcos Luciano Pimenta, Leida Calegário Oliveira,
Cristiane Fernanda Fuzer Grael e Antônio Sousa Santos, pela oportunidade e
conhecimentos transmitidos.
Aos funcionários e amigos da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e

Mucuri (UFVJM) pela presença indispensável, competência e dedicação.
Aos Professores componentes desta Banca avaliadora por estarem presentes neste
momento, contribuindo para a realização deste ideal.
À MMOptics, Aptivalux, à Ecco Fibras e ao Departamento de Física por

disponibilizar os equipamentos (fontes de luz) utilizados neste estudo.
À Hypofarma Indústria Farmacêutica Ltda. por ceder os fotossensibilizadores

experimentados no presente trabalho.
ix
A todos que contribuíram e torceram pela concretização deste trabalho, muito
obrigada!
x
Resumo
Estudou-se a susceptibilidade in vitro à inibição fotodinâmica (IFD) de isolados
fúngicos de várias espécies (Cryptococcus spp., Candida spp., Sporothrix spp. e
Malassezia furfur). Estabeleceu-se, inicialmente, um protocolo experimental básico,
selecionando-se o fotossensibilizador (azul de orto-toluidina - AOT) e a fonte de luz
(diodo de emissão de luz – LED, emitindo a 630 nm) que resultaram em maior redução
da viabilidade celular para Cryptococcus e Candida. Determinou-se a ressonância entre
os corantes e a luz emitida pelos equipamentos testados e que o LED, durante a
irradiação luminosa, não produz calor capaz de danificar as células e os tecidos sadios.
A IFD reduziu expressivamente o crescimento de C. gattii com aplicações consecutivas
do fototratamento (redução de Log10 4,58 UFC/ mL) e quando se utilizou menor
concentração do AOT (25 µM) e maior tempo de irradiação pelo LED (9 minutos)
(redução de Log10 4,76 UFC/ mL). Essa dependência foi também observada para
isolados de Candida spp, sensíveis e resistentes ao fluconazol, nos quais os efeitos
fototóxicos causaram tanto alteração da adesão a células epiteliais bucais (redução de
55%) quanto redução de sua viabilidade (redução média de Log10 3,41), observando-se
efeito fungicida após aplicações consecutivas. Para 40 isolados de C. gattii, avaliou-se,
além da ação inibitória da IFD, a sensibilidade à terbinafina, observando-se baixos
valores de concentração inibitória mínima (CIMs, 0,062 a 2 µg/ mL) e atividade
fungistática, com presença de tolerância em 12% das amostras. A IFD apresentou
significativa redução do crescimento de Sporothrix spp. na fase leveduriforme. No
entanto, não foi demonstrado efeito letal para Sporothrix spp. na forma filamentosa.
Não foi demonstrado efeito letal para Malassezia furfur nas condições experimentais
adotadas. A IFD constituiu alternativa eficiente para reduzir in vitro a viabilidade de
células de Cryptococcus spp. e Candida spp.. Porém, as condições experimentais
precisariam ser otimizadas para testes com Sporothrix spp. e Malassezia furfur.
xi
Abstract
The in vitro susceptibility of different fungal species (Cryptococcus spp.,
Candida spp., Sporothrix spp. e Malassezia furfur) to photodymanic inactivation (PDI)
was studied. Initially, a basic protocol was established by selecting the photosensitizer
(orto-toluidine blue - TBO) and the light source (light emitting diode – LED, emitting at
630 nm) that resulted in the highest reduction of cellular viability of Cryptococcus and
Candida. The resonance among the dye and the light emitted by the equipment was
determined. It was also demonstrated that during luminous irradiation the LED didn’t
produce heat enough to damage cells or healthy tissues. PDI expressively reduced C.
gattii growth after successive applications of the phototreatment (reduction of Log10
4.58 CFU/ mL) and when using TBO concentrations of 25 µM and a LED irradiation
time of 9 minutes (reduction of Log10 4.76 CFU/ mL). Such a dependence was also
observed for Candida spp isolates, either sensitive or resistant to fluconazole, to which
the phototoxic effects resulted in altered cell adhesion to buccal epithelial cells
(reduction of 55%) and reduction of cellular viability (average reduction of Log10 3,41),
and fungicide effects were observed after successive applications. Besides the inhibitory
effect of PDI, the susceptibility of 40 C. gattii isolates to terbinafine was determined,
observing low MIC values (0,062 a 2 µg/ mL) and fungistatic activity, with the presence
of tolerance in 12% of the samples. PDI resulted in significant reduction of Sporothrix
spp. yeast growth. On the other hand, the lethal effect wasn’t demonstrated to
Sporothrix spp. filamentous forms. A lethal effect wasn’t either demonstrated to
Malassezia furfur under the experimental conditions adopted. PDI was an efficient
alternative to in vitro reduce the cellular viability of Cryptococcus spp. and Candida
spp. Otherwise, the experimental conditions to further test Sporothrix spp. or
Malassezia furfur would have to be optimized.
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
AM = azul de metileno
ASD = ágar Sabouraud Dextrose
AT = azul de tripan
ATCC = Coleção Americana de Culturas Tipo
CDB = ágar creatinina, dextrose, azul de bromotimol
CEB = Células Epiteliais Bucais
CFM = Concentração Fungicida Mínima
CGB = agar L-canavanina, glicina, azul de bromotimol
CIM = Concentração Inibitória Mínima
CLSI = Instituto de Padronizações Clínicas e Laboratoriais
E = eritrosina
GaAl = gálio-alumínio
GCP = ágar glicina, cicloheximida, vermelho de fenol
HeNe = hélio-néon
HIV = vírus da imunodeficiência humana
InGaAlP = índio-gálio-alumínio-fósforo
IFD = Inibição Fotodinâmica
LASER = luz amplificada por emissão estimulada de radiação
LED = diodo de emissão de luz
LFR = líquido céfalo-raquidiano
Nano = derivado fulereno (C60 Nanopartículas)
P = Ponceau
PDT = Terapia Fotodinâmica
PVP = derivado fulereno poli (N-vinil-pirrolidona)
SNC = sistema nervoso central
TBO = azul de orto-toluidina
UFC = unidade formadora de colônia
UVA = ultra-violeta emitido a 366 nm
UVC = ultra-violeta emitido a 254 nm
VM = verde de malaquita
xiii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: Efeito da inativação fotodinâmica (IFD) na redução do número de células viáveis (Log 10
UFC/ mL) de um isolado de Cryptococcus gattii (ATCC 24065), utilizando irradiação por diodo de
emissão de luz (LED) emitindo a 470 nm e variados fotossensibilizadores [azul de orto-toluidina
(TBO), eritrosina, verde de malaquita e Ponceau (P)] .............................................................................. 46
TABELA 2: Efeito da inativação fotodinâmica (IFD) na redução do número de células viáveis (Log
10 UFC/ mL) de um isolado de Cryptococcus gattii (ATCC 24065), utilizando irradiação por diodo de
(TBO), eritrosina (E), Ponceau (P), verde de malaquita (VM) e azul de tripan (AT)] ............................. 48
TABELA 3: Efeito da inativação fotodinâmica (média de Log 10 UFC/ mL) em Cryptococcus gattii
(ATCC 24065, ATCC 32608) e C. neoformans (ATCC 24067A, ATCC 24607D2 e ATCC 28957),
utilizando azul de metileno a 100, 50 e 25 µg/ mL e diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630
nm por 3 minutos ...................................................................................................................................... 49
TABELA 4: Efeito fototóxico da inibição fotodinâmica (valores médios de Log10 UFC/ mL) em
isolados de Candida parapsilosis (ATCC 22019), C. albicans (ATCC 18804) e C. krusei (ATCC
6258), utilizando diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm por 3 minutos (densidade de
energia de 36 J/ cm2) e azul de metileno (AM) a 100, 50 e 25 µg/ mL .................................................... 50
isolados de Candida spp (ATCC 18804, ATCC 6258) e Cryptococcus spp. (ATCC 32608, ATCC
24067D2), utilizando diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm por 3 minutos (densidade de
energia de 36 J/ cm2) e azul de orto-toluidina (TBO) a 100, 50 e 25 µg/ mL .......................................... 51
TABELA 6: Efeito da inativação fotodinâmica (média de Log 10 UFC/ mL) em Cryptococcus gattii
(ATCC 32608) e C. neoformans (ATCC 24607D2), utilizando azul de orto-toluidina a 25 µg/ mL e
irradiação por 3 minutos com Laser de baixa intensidade Quantum emitindo a 660 nm ......................... 53
isolados de Candida sp. (ATCC 22019, ATCC 18804, ATCC 6258 e ATCC 750), utilizando Laser de
baixa intensidade Quantum emitindo a 660 nm por 3 minutos, azul de metileno (AM) e azul de orto-
toluidina (TBO) a 25 µg/ mL .................................................................................................................... 54
isolado de Candida krusei (ATCC 6258), utilizando lâmpada UV emitindo a 300 nm (UVA), 200 nm
(UVC), diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 470 nm por 3 minutos e fulerol a 6 mg/ mL ........... 54
isolado de Candida parapsilosis (ATCC 22019), utilizando lâmpada UV emitindo a 300 nm (UVA),
diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 470 nm por 3 minutos e como fotossensibilizadores,
55
fulerol a 60 µg/ mL, C60 PVP a 28 µg/ mL e C60 Nano a 9,4 µg/ mL ......................................................
TABELA 10: Efeito fototóxico da luz emitida por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm
associada ao azul de orto-toluidina a 100 µg/ mL em diferentes isolados de Cryptococcus gattii (Log10
UFC/ mL) .................................................................................................................................................. 63
TABELA 11: Diferença de sensibilidade entre os isolados clínicos e ambientais de Cryptococcus

gattii aos efeitos fototóxicos da luz emitida por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm
associada ao azul de orto-toluidina a 100 µg/ mL (Log10 UFC/ mL) .......................................................
64
xiv
TABELA 12: Sensibilidade de um isolado de Cryptococcus gattii (LMM 989) aos efeitos fototóxicos
da luz emitida por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm associada ao azul de orto-
toluidina a 100 µg/ mL, após aplicações consecutivas de IFD (Log10 UFC/ mL) .................................... 65
TABELA 13: Efeito fototóxico da luz emitida por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm
por 9 minutos, associada ao azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µM em 21 isolados de Cryptococcus
gattii (Log10 UFC/ mL) ............................................................................................................................. 67
TABELA 14: Faixa de variação dos valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM),
concentrações fungicidas mínimas (CFM) e quociente CFM/ CIM de isolados clínicos e ambientais de
Crytococcus gattii frente à terfinafina ...................................................................................................... 69
TABELA 15: Valores mínimos, máximos e mediana da redução do número de células viáveis de
Candida sp. (Log10) para cada tratamento ................................................................................................ 73
TABELA 16: Valores mínimos, máximos e mediana da redução do número de Candida spp. aderidas
às células epiteliais bucais (CEB) para cada tratamento ........................................................................... 73
TABELA 17: Valores mínimos, máximos e mediana da redução do número de células viáveis de
Sporothrix spp. (Log10) (fase leveduriforme) para cada tratamento ......................................................... 77
TABELA 18: Efeito fototóxico (média de Log10 UFC/ mL) da inativação fotodinâmica em isolados de
Sporothrix spp. (fase miceliana)., utilizando irradiação por 3 minutos por diodo de emissão de luz
(LED) emitindo a 630 nm e azul de orto-toluidina a 100 µg/ mL ............................................................ 78
isolado de Malassezia furfur (HF 02), utilizando diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm
por 3 minutos (densidade de energia de 36 J/ cm2) e, como fotossensibilizadores, azul de orto-
toluidina (TBO) em solução aquosa, TBO em solução alcoólica e azul de tripan (AT) a 100 µg/ mL .... 80
TABELA 20: Descrição dos 40 isolados de Cryptococcus gattii ............................................................. 106
TABELA 21: Descrição dos 12 isolados de Candida spp. ....................................................................... 108
TABELA 22: Descrição dos 12 isolados de Sporothrix spp. .................................................................... 109
TABELA 23: Efeito fototóxico (Log10 UFC/ mL) da inativação fotodinâmica em 40 isolados de
Cryptococcus gattii, utilizando irradiação por 3 minutos por diodo de emissão de luz (LED) emitindo
a 630 nm e azul de orto-toluidina a 100 µg/ mL ....................................................................................... 110
Cryptococcus gattii utilizando irradiação por 9 minutos por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a
630 nm e azul de orto-toluidina a 25 µM (7,645 µg/ mL) ........................................................................ 112
TABELA 25: Valores de CIM, CFM e o quociente (CFM/CIM) de 48 amostras de leveduras para
terbinafina .................................................................................................................................................
113
Candida spp. utilizando irradiação por 15 minutos por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630
nm e azul de orto-toluidina a 25 µM (7,645 µg/ mL) ............................................................................... 114
TABELA 27: Inibição da adesão de células de 12 isolados de Candida spp. a células epiteliais bucais
(CEB), após inativação fotodinâmica, utilizando irradiação por 15 minutos por diodo de emissão de
luz (LED) emitindo a 630 nm e azul de orto-toluidina a 25 µM (7,645 µg/ mL) (número de leveduras/
50 CEB) .................................................................................................................................................... 115
xv
TABELA 28: Porcentagem de redução da adesão de células de Candida spp., após inativação
fotodinâmica, utilizando irradiação por 15 minutos por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630
nm e azul de orto-toluidina a 25 µM (7,645 µg/ mL) ............................................................................... 116
TABELA 29: Perfil de susceptibilidade (concentrações inibitórias mínimas – CIM) de 10 isolados de

Candida spp (µg/ mL) ao fluconazol ........................................................................................................ 116
Sporothrix spp., utilizando irradiação por 3 minutos por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a
630 nm e azul de orto-toluidina a 100 µg/ mL ......................................................................................... 117
xvi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Representação da molécula do fulereno ................................................................................... 15
FIGURA 2: Representação do Laser de Rubi .............................................................................................. 17
FIGURA 3: Representação de um diodo de emissão de luz (LED) ............................................................. 19
FIGURA 4: Representação do protocolo experimental utilizado nos testes de inativação fotodinâmica

(IFD) ............................................................................................................................................................. 27
FIGURA 5: Efeito da inativação fotodinâmica (IFD) na redução do número de células viáveis (Log10
UFC/ mL) de um isolado de C. gattii (ATCC 24065), utilizando azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µg/
mL e irradiação pelo diodo de emissão de luz (LED) a 630 nm por 3 minutos ........................................... 42
FIGURA 6: Cryptococcus gattii (ATCC 24065) não associado e associado ao azul de orto-toluidina
(TBO) a 100 µg/ mL .................................................................................................................................... 44
FIGURA 7: Cryptococcus gattii (ATCC 24065) associado ao verde de malaquita (VM) a 100 µg/ mL .... 44
FIGURA 8: Cryptococcus gattii (ATCC 24065) associado ao Ponceau (P) a 100 µg/ mL e à eritrosina
(E) a 2 mg/ mL ............................................................................................................................................ 45
FIGURA 9: Efeito da inativação fotodinâmica (IFD) na redução do número de células viáveis (Log 10
(TBO), eritrosina, verde de malaquita e Ponceau (P)] ................................................................................. 46
FIGURA 10: Efeito da inativação fotodinâmica (IFD) na redução do número de células viáveis (Log 10
(TBO), eritrosina (E), Ponceau (P), verde de malaquita (VM) e azul de tripan (AT)] ................................ 48
FIGURA 11: Candida albicans (ATCC 18804) não associada e associada ao azul de orto-toluidina
(TBO) a 100 µg/ mL .................................................................................................................................... 51
FIGURA 12: Avaliação do efeito fototóxico em Cryptococcus gattii (ATCC 24065) do Laser de baixa
intensidade Unit Kondortech, emitindo a 660 nm, em presença do fotossensibilizador verde de
malaquita (VM) a 100 µg/ mL ..................................................................................................................... 52
FIGURA 13: Espectroscopia do azul de metileno (AM) e do azul de orto-toluidina (TBO) a 100, 50 e
25µg/ mL ...................................................................................................................................................... 56
FIGURA 14: Espectroscopia do azul de metileno (AM) e do azul de orto-toluidina (TBO) e um isolado
de Candida albicans (ATCC 18804) isolados e em associação ................................................................... 57
FIGURA 15: Representação gráfica da variação da temperatura durante inativação fotodinâmica (IFD)
por 15 minutos com diodo de emissão de luz (LED) associado ao azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µM.
Temperatura inicial (baseline): 29.6 °C; Temperatura máxima: 35.6 ºC; ∆t(Tmáx. – Tmin.) : 6 °C .................... 57
FIGURA 16: Efeito fototóxico da luz emitida por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm
associada ao azul de orto-toluidina a 100 µg/ mL em diferentes isolados de Cryptococcus gattii .............. 63
FIGURA 17: Avaliação do efeito fototóxico em Cryptococcus gattii (ATCC 24065) do LED emitindo a
630 nm, em presença do fotossensibilizador azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µg/ mL .......................... 64
xvii
FIGURA 18 A: Redução de UFC/ mL (Log10) de uma amostra de Cryptococcus gattii (ATCC 32608)
após inibição fotodinâmica, utilizando azul de toluidina (TBO) a 100 µM e diodo de emissão de luz
(LED) emitindo a 630 nm, com tempos de irradiação de 3 (36J/cm2), 6 (72J/cm2), 9 (108 J/cm2), 12 (144
J/cm2) e 15 minutos (180 J/cm2) ................................................................................................................... 66
FIGURA 18 B: Redução de UFC/ mL (Log10) após inibição fotodinâmica, utilizando azul de toluidina
(TBO) a 100, 50 e 25 µM e LED emitindo a 630 nm, com irradiação de 9 minutos (108 J/cm2) .............. 66
FIGURA 19: Efeitos fototóxicos (Log10 UFC/ mL) da inibição fotodinâmica (IFD), utilizando azul de
orto-toluidina (TBO) a 25 µM e Diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm, com irradiação de
9 minutos (108 J/cm2) em 21 amostras de Cryptococcus gattii ................................................................... 68
FIGURA 20 A: Redução de UFC/ mL (Log10) de uma amostra de Candida albicans (ATCC 18804)
após inibição fotodinâmica, utilizando azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µM e diodo de emissão de luz
(LED) emitindo a 630 nm, com tempos de irradiação de 3 (36J/cm2), 6 (72J/cm2), 9 (108 J/cm2), 12 (144
J/cm2) e 15 minutos (180 J/cm2) ...................................................................................................................
71
FIGURA 20 B: Redução de UFC/ mL (Log10) após inibição fotodinâmica, utilizando azul de toluidina
(TBO) a 100, 50 e 25 µM e LED emitindo a 630 nm, com irradiação de 9 minutos (108 J/cm2) .............. 71
orto-toluidina (TBO) a 25 µM e Diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm, com irradiação de
15 minutos (180 J/cm2) em 12 amostras de Candida spp. ........................................................................... 72
FIGURA 22: Redução da adesão de 12 amostras de Candida sp. a 50 células epiteliais bucais, após
inibição fotodinâmica, utilizando utilizando azul de toluidina (TBO) a 25 µM e LED emitindo a 630
nm, com irradiação de 15 minutos (180 J/cm2) ............................................................................................ 74
FIGURA 23: Adesão a células epiteliais bucais (CEB) de Candida albicans (ATCC 18804) sem
tratamento e após irradiação com diodo de emissão de luz (LED) por 15 minutos com azul de orto-
toluidina (TBO) a 25 µM (inativação fotodinâmica) ................................................................................... 74
orto-toluidina (TBO) a 100 µg/ mL e Diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm, com
irradiação de 3 minutos (36 J/cm2) em 12 amostras de Sporothix spp. (fase leveduriforme) ...................... 78
FIGURA 25: Efeito fototóxico (média de Log10 UFC/ mL) da inativação fotodinâmica em isolados de
Sporothrix spp. (fase miceliana), utilizando irradiação por 3 minutos por diodo de emissão de luz (LED)
emitindo a 630 nm e azul de orto-toluidina a 100 µg/ mL ........................................................................... 79
xviii
SUMÁRIO
I. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................... 1
I.1 – JUSTIFICATIVA ............................................................................................................................ 2
I.2 – REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................................................... 3
I. 2.1 - Cryptococcus spp. ........................................................................................................................ 3
I. 2.2 - Candida spp. ................................................................................................................................. 6
I. 2.3 - Sporothrix spp. ............................................................................................................................. 8
I. 2.4 - Malassezia spp. ............................................................................................................................ 9
I. 2.5 – Agentes antifúngicos ................................................................................................................... 10
I. 2.6 - Inibição Fotodinâmica (IFD) ........................................................................................................ 12
II. OBJETIVOS ........................................................................................................................................ 22
III. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................................. 25
III. 1 – Estabelecimento de protocolo experimental para testes de inibição fotodinâmica (IFD) de
fungos, in vitro ......................................................................................................................................... 26
III. 1. a – Padronização, preparo e tratamento do inóculo ....................................................................... 26

III. 1. b – Seleção das fontes de luz e dos fotossensibilizadores para os experimentos de fotoinibição . 28
III. 1. c – Avaliação da ressonância entre os fotossensibilizadores azul de metileno (AM) e azul de
orto-toluidina (TBO) e o Diodo de emissão de Luz (LED), por meio de espectroscopia .......................
29
III. 1. d – Avaliação da produção de calor durante IFD utilizando tempo de irradiação por 15 minutos 30
III. 2 – Cryptococcus gattii – Avaliação, in vitro, da susceptibilidade de diferentes isolados aos
efeitos fototóxicos da IFD e frente à terbinafina ..................................................................................... 30
a) Avaliação, in vitro, da susceptibilidade de 40 isolados de Cryptococcus gattii aos efeitos

fototóxicos da IFD ................................................................................................................................... 30
b) Avaliação da redução da viabilidade celular de Cryptococcus gattii após consecutivas aplicações

da IFD ...................................................................................................................................................... 31
c) Otimização das condições experimentais para maior redução da viabilidade celular de isolados de
Cryptococcus gattii .................................................................................................................................. 31
d) Avaliação da susceptibilidade de 21 isolados de Cryptococcus gattii à IFD, após otimizadas as

condições experimentais .......................................................................................................................... 33
e) Determinação a susceptibilidade, in vitro, dos isolados de Cryptococcus gattii frente à terbinafina ..

33
III. 3 - Candida spp. – Avaliação, in vitro, da susceptibilidade de diferentes espécies aos efeitos
fototóxicos da IFD e frente ao fluconazol ................................................................................................ 34
a) Otimização das condições experimentais para obter, in vitro, maior redução da viabilidade celular
de diferentes isolados de Candida spp. .................................................................................................... 34
b) Avaliação da susceptibilidade, in vitro, de diferentes espécies de Candida spp. à IFD ...................... 35
xix
c) Avaliação da alteração dos padrões de adesão de Candida spp. a células epiteliais bucais (CEB)
após IFD ................................................................................................................................................... 36
d) Avaliação de maior inativação, in vitro, de Candida spp. após consecutivas aplicações da IFD ....... 37
e) Determinação da susceptibilidade de 12 isolados de Candida spp. ao fluconazol .............................. 37
III. 4 – Sporothrix spp. - Avaliação da susceptibilidade, in vitro, de diferentes isolados de Sporothix
spp. à IFD, nas fases leveduriforme e miceliana ...................................................................................... 38
III. 5 – Malassezia furfur - Avaliação da susceptibilidade, in vitro, à IFD de um isolado clínico

humano de Malassezia furfur ................................................................................................................... 39
III. 6 – Análises estatísticas ...................................................................................................................... 39

IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................................... 41
IV. 1 – Estabelecimento de protocolo experimental, in vitro, para testes de inibição fotodinâmica
(IFD) em fungos ....................................................................................................................................... 42
IV. 1. a – Padronização, preparo e tratamento do inóculo ....................................................................... 42

IV. 1. b – Seleção das fontes de luz e dos fotossensibilizadores para os experimentos de fotoinibição . 43
IV. 1. c – Avaliação a ressonância entre os fotossensibilizadores azul de metileno (AM) e azul de
orto-toluidina (TBO) e o Diodo de Emissão de Luz (LED), por meio de espectroscopia ....................... 55
IV. 1. d – Avaliação da produção de calor durante IFD utilizando tempo de irradiação por 15 minutos 57
IV. 2 – Cryptococcus gattii – Avaliação, in vitro, da susceptibilidade de diferentes isolados de
Cryptococcus gattii aos efeitos fototóxicos da IFD e frente à terbinafina ............................................... 62
a) Avaliação, in vitro, da susceptibilidade de 40 isolados de Cryptococcus gattii aos efeitos

fototóxicos da IFD ................................................................................................................................... 62
b) Avaliação da redução da viabilidade celular de Cryptococcus gattii, após consecutivas aplicações

da IFD ...................................................................................................................................................... 64
c) Otimização das condições experimentais para maior redução da viabilidade celular do isolado de
Cryptococcus gattii ATCC 32608 ............................................................................................................ 65
d) Avaliação da susceptibilidade de 21 isolados de Cryptococcus gattii à IFD, após otimizadas as

condições experimentais .......................................................................................................................... 66
e) Determinação a susceptibilidade, in vitro, dos isolados de Cryptococcus gattii frente à terbinafina . 68

IV. 3- Candida spp. – Avaliação, in vitro, da susceptibilidade de diferentes espécies aos efeitos
fototóxicos da IFD e frente ao fluconazol ................................................................................................ 70
a) Otimização das condições experimentais para obter, in vitro, maior redução da viabilidade celular
de diferentes isolados de Candida spp. .................................................................................................... 70
b) Avaliação da susceptibilidade, in vitro, de diferentes espécies de Candida spp. à IFD, após

otimizadas as condições experimentais .................................................................................................... 72
c) Avaliação da alteração dos padrões de adesão de Candida spp. a células epiteliais bucais (CEB)
após IFD ...................................................................................................................................................
73
xx
d) Avaliação da redução da viabilidade celular de Candida tropicalis CG09, após consecutivas
aplicações da IFD ..................................................................................................................................... 74
e) Determinação da susceptibilidade de 12 isolados de Candida spp. ao fluconazol .............................. 75

IV.3 – Sporothrix spp. - Avaliação da susceptibilidade, in vitro, de diferentes isolados de Sporothix
spp. à IFD, nas fases leveduriforme e miceliana ...................................................................................... 77
a) Susceptibilidade de 12 isolados Sporothix spp. à IFD (fase leveduriforme) ....................................... 77

b) Susceptibilidade de 3 isolados Sporothix spp. à IFD (fase miceliana) ................................................ 78
IV.4 – Malassezia furfur - Avaliação da susceptibilidade, in vitro, à IFD de um isolado clínico
humano de Malassezia furfur (HF 02) ..................................................................................................... 79
V – CONCLUSÕES ................................................................................................................................ 82
VI – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................ 84
VII – ANEXOS ........................................................................................................................................ 105
VII – ANEXO 1 ....................................................................................................................................... 106
VII – ANEXO 2 ....................................................................................................................................... 110
VII – ANEXO 3 ....................................................................................................................................... 118
VII – ANEXO 4 ....................................................................................................................................... 119
xxi
I – Introdução
1
I. 1 - Justificativa
Os fungos têm sido reconhecidos como causa de doenças graves, progressivas,
com elevadas freqüência, morbidade e mortalidade e, além disso, o diagnóstico e
tratamento de infecções fúngicas não ocorrem sem dificuldades. Essas doenças podem
ser classificadas em superficiais ou profundas, e estas, usualmente, disseminam-se para
vários órgãos e tecidos do hospedeiro. Certas espécies fúngicas, tidas até recentemente
como saprófitas, podem ter papel causal em micoses invasivas de hospedeiros
susceptíveis. A incidência dessas micoses oportunistas é elevada, os microrganismos
apresentam susceptibilidade variável às drogas antifúngicas e o diagnóstico, geralmente,
é tardio.
O aumento da sobrevida de pacientes imunocomprometidos e/ ou hospitalizados,
a adaptação do microrganismo à ação das drogas comumente utilizadas, alterações no
comportamento humano (desenvolvimento econômico, urbanização e uso do solo,
globalização do comércio e das viagens internacionais) e a melhora nos métodos de
diagnóstico laboratorial têm contribuído para o crescente relato das doenças causadas
por fungos.
As opções de fármacos utilizados para tratamento das micoses são restringidas
pelo número restrito de formulações, toxicidade dos agentes terapêuticos e carência de
preparações oral e intravenosa, bem como pela ocorrência de significativas interações
com outras drogas e seleção de espécies fúngicas resistentes.
Portanto, devido às várias dificuldades encontradas no tratamento das micoses,
tornam-se relevantes os estudos cujos objetivos atendam, em última análise, tanto ao
isolamento e identificação das espécies fúngicas, à determinação do perfil de
susceptibilidade às drogas empregadas nos tratamentos convencionais, quanto à
avaliação de métodos alternativos, como a inibição fotodinâmica, a qual é revisada e
experimentada no presente trabalho.
2
I. 2 – Revisão de Literatura
O aumento do relato de doenças fúngicas tem sido considerado um problema de
saúde pública, pois estas podem comprometer tanto indivíduos imunossuprimidos em
ambiente hospitalar quanto pessoas susceptíveis na comunidade, apresentando elevados
índices de morbidade, mortalidade e gastos financeiros. Os fungos de importância
clínica podem ser caracterizados como patógenos primários (comumente acometem
indivíduos saudáveis) (Sporothrix spp., Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum,
Paracoccidioides brasiliensis, Cryptococcus gattii) ou oportunistas (necessitam de
estado de imunossupressão do hospedeiro para causarem doença) (Candida spp.,
Malassezia spp., Cryptococcus neoformans., Pneumocystis spp., Trichosporon spp.,
Aspergillus spp., Penicillium marneffei) (BOVERS et al., 2008; NUCCI e MARR,
2005).
Os diversos gêneros e espécies pertencentes ao reino Fungi apresentam a mesma
estrutura celular básica (célula eucariota dotada de parede celular, membranas
citoplasmática e nuclear, organelas), mas diferem quanto a propriedades biológicas
como, por exemplo, capacidade de adesão em Candida albicans, cápsula em
Cryptococcus spp., propriedades lipofílicas em Malassezia spp., dimorfismo em
Sporothrix spp.. Tais características podem contribuir para a adaptação desses
microrganismos a seus nichos ecológicos (solo, madeira em decomposição) e às
condições encontradas na superfície e no interior dos organismos de hospedeiros
humanos e animais (CASADEVALL e PIROFSKI, 2007; LACAZ et al., 2002; LI et al.,
2007; MCFADDEN et al., 2007; POLONELLI et al., 1989). Essas propriedades
(dimorfismo em Sporothrix spp..) podem, ainda, permitir que o fungo responda de
maneira variável às drogas antifúngicas (KOHLER et al., 2006) e, portanto, levaram à
seleção de isolados de Candida spp., Cryptococcus spp., Sporothrix schenckii e
Malassezia furfur para os testes presentes neste estudo.
I. 2.1 - Cryptococcus spp.

O gênero Cryptococcus compreende espécies de leveduras encapsuladas e
distribuídas no ambiente, principalmente em fezes de aves (pombos) (C. neoformans) e
árvores (eucaliptos) (C. gattii). As espécies C. neoformans e C. gattii são classificadas
em sorotipos de acordo com os polissacarídeos capsulares: o sorotipo A corresponde a
C. neoformans variedade grubii, os sorotipos D e AD a C. neoformans var. neoformans
e os sorotipos B e C à espécie C. gattii. C. neoformans e C. gattii representam as
3
principais causadoras de criptococose, cuja principal manifestação clínica é a
meningoencefalite, com 100% de mortalidade se não tratada. As células fúngicas têm
acesso ao hospedeiro através da inalação de leveduras dessecadas ou dos basidiósporos
(células obtidas a partir da reprodução sexuada). Nos alvéolos pulmonares, as células da
levedura são inicialmente expostas aos macrófagos alveolares, podendo ser eliminadas
pelo sistema imunológico do hospedeiro ou sobreviver no interior dos macrófagos e
disseminar para outros órgãos, principalmente o sistema nervoso central (SNC)
(ALVAREZ e CASADEVALL, 2007; BOVERS et al., 2008; JAIN et al, 2006; MA et
al., 2007; MATSUMOTO et al. 2007; RHOME et al. 2007).
As espécies C. neoformans e C. gattii diferem quanto a características
fenotípicas, genotípicas, epidemiológicas, ecológicas e características clínicas da
criptococose. A espécie C. neoformans causa doença disseminada em pacientes
imunossuprimidos, podendo ser isolada a partir de amostras de sangue e urina (CHEN
et al., 2000; SORRELL, 2001; SPEED e DUNT, 1995). C. gattii tem sido caracterizada
pela presença de meningismo (sinais de irritação das meninges: rigidez de nuca,
fotofobia e cefaléia), papiloedema, febre, instabilidade neurológica, pressão
intracraniana elevada, sintomas prolongados, envolvimento focal do sistema nervoso
central de pacientes imunocompetentes, sem disseminação para outros órgãos e com
freqüente seqüela neurológica. No Brasil, a taxa de mortalidade é de 12,5% - 55,5%, de
acordo com estudos epidemiológicos de 1961 a 2000 (CORRÊA et al. 1999 e 2002;
LOPES et al., 1997).
O diagnóstico da criptococose é obtido por meio da visualização de células
leveduriformes encapsuladas, durante o exame micológico direto da amostra clínica
com tinta Nanquim. A cultura pode ser realizada em ágar Sabouraud ou outros meios
que não contenham cicloheximida, com temperatura de incubação de 30 a 35ºC. Em
ágar Sabouraud, as colônias exibem crescimento dentro de 48 a 72 horas, com aspecto
macroscópico típico: colônias úmidas, mucóides, com tonalidade branca a creme. A
cultura contamina-se com facilidade, portanto, requer antibióticos e bifenil dissulfeto a
fim de minimizar o crescimento de contaminantes (KWON-CHUNG e BENNETT,
1992; LACAZ et al., 2002). O ágar Niger ou o ágar L-dopa podem ser utilizados para
indução à produção de melanina. Estes meios de cultura não podem conter mais que
0,1% de glicose, pois maior concentração de glicose pode protelar ou inibir a formação
do pigmento marrom. A produção deste pigmento determina o gênero Cryptococcus
(LACAZ et al., 2002). O ágar Niger tem sido utilizado apenas para isolamento de
4
Cryptococcus spp. a partir de fontes ambientais. Porém, estudos fenotípicos aprovam
sua utilização na rotina clínica, para detecção de colônias morfologicamente diferentes
(com pequena diferença quanto à sensibilidade a drogas antifúngicas), cujas
características não sejam detectáveis em ágar Sabouraud (SUKROONGREUNG et al.,
2001). O diagnóstico diferencial da criptococose inclui: doenças virais (Molluscum
contagiosum, herpes zoster, encefalites de causa viral), bacterianas (tuberculose),
fúngicas (esporotricose, coccidoidomicose, histoplasmose, aspergilose, etc.) e
parasitárias (malária cerebral, toxoplasmose, etc.) (SIDRIM e MOREIRA, 1999).
A identificação das espécies C. neoformans e C. gattii faz-se, geralmente,
através dos meios de CGB (canavanina-glicina e azul de bromotimol), CDB (creatinina
– dextrose e azul de bromotimol) e a prova de assimilação de D-prolina. O gênero
Cryptococcus, com suas diversas espécies, não realiza fermentação de carboidratos e
não produz hifas ou pseudo-hifas em seu estado haplóide, é urease e inositol positivos
(KWON-CHUNG e BENNETT, 1992; LACAZ et al., 2002; POLACHECK e KWON-
CHUNG, 1980).
C. neoformans e C. gattii podem variar seu fenótipo de mucóide para liso,
reversivelmente, facilitando a disseminação para o SNC. Esta flexibilidade fenotípica
ocorre durante a infecção, tanto em hospedeiro imunocomprometido quanto em
imunocompetente. A variante mucóide aumenta a sobrevivência da levedura no interior
dos macrófagos alveolares e a variante lisa facilita a migração através das barreiras
hemato-encefálicas. Estas características estão relacionadas a alterações na cápsula
polissacarídica e parede celular fúngica (JAIN et al., 2006). A cápsula polissacarídica é
composta de glicoronoxilomanana (95%), galactoxilomanana (5%) e manoproteínas
(>1%) e constitui importante fator de virulência, por proteger a célula fúngica da
fagocitose e atividades das enzimas presentes em neutrófilos, monócitos e macrófagos
(BOVERS et al., 2008; ZARAGOZA et al., 2008).
A anfotericina B, em monoterapia ou associada a 5-flucitosina, seguida da
manutenção terapêutica com o fluconazol, permanece como escolha para o tratamento
da criptococose. No entanto, em virtude dos problemas de segurança e toxicidade da
anfotericina B e da 5-flucitosina, novas alternativas terapêuticas tem sido desenvolvidas.
A anfotericina B lipossomal seria uma alternativa terapêutica, pois apresenta efeitos
tóxicos reduzidos, eficácia clínica e doses mais elevadas poderiam ser utilizadas. Uma
outra estratégia para aumentar a efetividade do tratamento da criptococose é a
combinação da anfotericina B e fluconazol. Essa combinação de fármacos apresenta
5
efeito aditivo, podendo ocasionar uma esterilização mais rápida do SNC e redução do
tempo de administração da anfotericina B (BARCHIESI et al., 2000; LARSEN et al.,
2004; ROBINSON et al., 1999).
I. 2.2 - Candida spp.

Candida albicans é um microrganismo comensal humano que coloniza as
superfícies mucosas da cavidade oral, trato gastrintestinal e vagina, sem causar doença.
No entanto, como uma conseqüência do desequilíbrio da relação microrganismo-
hospedeiro, um crescimento excessivo dessas células leveduriformes pode ocasionar
doença nas regiões de mucosa (candidíases orofaríngea ou vaginal) e candidíases
invasivas. C. albicans é o principal agente etiológico dessa micose, porém, espécies de
Candida não-albicans podem estar envolvidas (ANGIOLELLA et al., 2008;
ELLEPOLA et al., 1998). Em países da América Latina, Candida tropicalis e C.
parapsilosis são a segunda causa de candidemia relacionadas à utilização de cateteres
intravenosos, infusões contaminadas e colonização dos profissionais de saúde em
unidades de cuidado intensivo (UTIs). C. glabrata emerge como o segundo agente mais
comum de candidemia nos Estados Unidos, devido à sua reduzida sensibilidade aos
azólicos (fluconazol e voriconazol). C. rugosa, que raramente tem sido considerada
patógeno humano, tem sido isolada de pacientes com candidemia em UTIs nos Estados
Unidos e Brasil (NUCCI e MARR, 2005). C. krusei, multiresistente, tem sido isolada de
pacientes imunossuprimidos com candidemia (FRANCA et al., 2008; PFALER et al.,
2008).
Candidose oral ocorre frequentemente em pacientes portadores de próteses totais
e em pacientes infectados com o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1).
Fatores como próteses, dieta, higiene oral inadequada, uso de medicação oral,
radioterapia, xerostomia, fumo e desordens sistêmicas podem ser considerados
predisponentes à candidíase oral (COELHO et al., 2004; SCULLY et al., 1994;
TOROSANTUCCI et al., 2004). Candidíase vaginal representa significante problema
em mulheres sexualmente ativas. Práticas sexuais envolvendo contatos buco-genitais
podem contribuir para manutenção de Candida spp. em populações sexualmente ativas.
Em muitos pacientes imunossuprimidos e em pós-operatórios de cirurgias intestinais
extensas, Candida spp. pode ocasionar fungemia e infecções sistêmicas graves
(SOUTHERN et al., 2008). O aumento da prevalência de doenças disseminadas
6
causadas por Candida spp. tem se restringido a pacientes submetidos a intervenções
cirúrgicas e quimioterápicas, com deficiências imunológicas (NETEA et al., 2008).
Uma das propriedades importantes de C. albicans é a habilidade de transição
morfológica entre a fase unicelular (leveduriforme) e a fase filamentosa
(pseudomicélio), por meio da formação de tubo germinativo. A fase filamentosa do
fungo apresenta modificações na superfície celular, as quais previnem o reconhecimento
do patógeno pelo sistema imune do hospedeiro, contribuindo para sua patogenicidade e
virulência (LI et al., 2007; NETEA et al., 2008; SOUTHERN et al., 2008;
TOROSANTUCCI et al., 2004). A habilidade do microrganismo de aderir estavelmente
à superfície das células epiteliais do hospedeiro é um pré-requisito à colonização,
invasão tecidual e produção de doença (ELLEPOLA e SAMARANAYAKE, 1998;
HOLLMER et al., 2006; JOHANN et al., 2007; LYON e RESENDE, 2006). Essa
característica permite a C. albicans formar biofilmes (comunidades celulares
fenoticamente diferentes, organizadas em uma matriz extracelular) em superfícies como
próteses e cateteres vasculares, tornando as células leveduriformes mais resistentes ao
sistema de defesa hospedeiro e à atividade de drogas antifúngicas (fluconazol). Os
biofilmes em cateteres e próteses cirúrgicas constituem reservatórios de células
microbianas e podem perpetuar uma fungemia (ADAM et al., 2002; HOLLMER et al.,
2006; WALSH e REX, 2002).
O diagnóstico da candidíase é obtido pela visualização de células leveduriformes
com ou sem brotamento, anotando-se a presença de pseudomicélio. O material clínico
poderá ser cultivado em ágar Sabouraud e incubado a 28 - 35°C por 24 a 48 horas. Os
testes de identificação das leveduras incluem a pesquisa de tubos germinativos, a
avaliação das características bioquímicas (fermentação de carboidratos, assimilação de
fontes de carbono e nitrogênio) e micromorfológicas (microcultivo) (LACAZ et al,
2002; LYON e RESENDE, 2006; KURTZMAN e FELL, 1998).
Para o tratamento das candidíases, é necessário, em primeiro lugar combater as
causas que influenciam na colonização e proliferação das células leveduriformes. Na
terapia das lesões localizadas (candidíase oral ou vaginal), destaca-se o uso da nistatina
e derivados azólicos. Para tratamento de pacientes com candidíases invasivas, o uso de
caspofungina, fluconazol e anfotericina B, em monoterapia ou associada ao fluconazol,
tem sido sugerido (LACAZ et al., 2002; NUCCI e MARR, 2005; SPANAKIS et al.,
2006).
7
I. 2.3 - Sporothrix spp.
A esporotricose constitui uma doença subaguda ou crônica cuja infecção ocorre
geralmente por meio de inoculação traumática de estruturas fúngicas presentes no solo,
vegetação e animais (gato). O agente infectante permanece localizado no local da
inoculação (forma fixa) e nos linfonodos adjacentes (forma linfo-cutânea), podendo, em
pacientes imunossuprimidos, disseminar-se por via hematogênica (MESA-ARANGO et
al., 2002; KOHLER et al., 2007). A forma linfo-cutânea é a variante mais freqüente de
esporotricose, representando 75% dos casos. O agente etiológico é um fungo dimórfico
do gênero Sporothrix (S. schenckii, S. brasiliensis, S. globosa, S. albicans e S.
mexicana) (MARIMON, et al., 2007; RAMOS-E-SILVA et al., 2007). O fungo, à
temperatura ambiente, apresenta-se sob a forma miceliana (saprofítica e infectante) e, a
37°C (organismo hospedeiro) a forma leveduriforme (forma parasitária). Esse
dimorfismo exerce papel importante na virulência, patogênese, interação do fungo com
o organismo hospedeiro e susceptibilidade a drogas antifúngicas (TOLEDO et al., 2000;
TRILLES et al., 2005).
Essa micose geralmente ocorre em casos isolados, famílias pequenas ou em
profissionais (carpinteiros, jardineiros, artesãos). No entanto, uma epidemia de
esporotricose, cuja transmissão foi devido a mordeduras ou arranhaduras de gatos
afetados pelo fungo (zoonose), foi relatada no Rio de Janeiro, com um total de 1137
casos humanos com cultura positiva, em 2006. A ausência de programas de controle da
esporotricose felina e vários fatores relacionados ao comportamento dos gatos podem
contribuir para o aumento de casos clínicos dessa doença (SCHUBACH et al., 2008).
O cultivo do material clínico e as características macro e micromorfológicas das
colônias constituem exames importantes para o diagnóstico da esporotricose, uma vez
que a evidência direta, a partir do material clínico humano, de células leveduriformes de
globosas a ovóides, com ou sem brotamento, em forma de charuto ou navetas, é difícil
(KOHLER et al., 2007; KOHLER, 2008; LACAZ et al., 2002). As espécies
filogenéticas são diferenciadas por características genéticas, morfológicas (morfologia e
pigmentação das colônias e dos esporos) e bioquímicas (crescimento a 30°C,
assimilação de fontes de carbono e nitrogênio) (MARIMON, et al., 2007). Em ágar
Sabouraud dextrose, a forma miceliana de Sporothrix spp. cresce a 25°C por 7 dias,
apresentando colônias coriáceas, com superfície sulcada, de coloração branca a creme.
A diferença de coloração das colônias entre as espécies tem sido demonstrada em ágar
batata dextrose (laranja a laranja-acinzentada) ou ágar Cornmeal (marrom clara a
8
escura), após 21 dias de incubação a 20 – 30°C. O fungo converte-se para a forma
leveduriforme em ágar infusão cérebro-coração com 0,5% de glicose a 35°C por 5 dias,
apresentando colônias de consistência mole, com superfície irregular e coloração de
branca a creme. Diferença macromorfológica significante entre as diferentes espécies na
fase leveduriforme não foi observada (MARIMON et al., 2007). O diagnóstico
diferencial da esporotricose cutânea inclui doenças fúngicas (criptococose,
paracoccidioidomicose, cromoblastomicose, blastomicose norte-americana) e
bacterianas (leishmaniose, tuberculose, pioderma bacteriano, abcessos cutâneos de
tularemia, sífilis primária e infecções atípicas causadas por micobactérias) (RAMOS-E-
SILVA et al., 2007).
Muitos pacientes afetados pela esporotricose requerem prolongada terapia
antifúngica, sendo o itraconazol a droga de escolha em muitos casos, com eficácia
aproximada de 100%. Para doença disseminada, anfotericina B é utilizada na fase inicial
do tratamento e o itraconazol na fase de manutenção de terapia. Em regiões endêmicas
de países em desenvolvimento, uma solução saturada de iodeto de potássio tem sido
utilizada, apesar de sua toxicidade (distúrbios gastrintestinais, disfunção da tireóide,
aumento das glândulas salivares, etc.), por ser um agente terapêutico de baixo custo. Em
lesões cutâneas localizadas, aplicação de compressas de calor (42ºC) ou radiação
infravermelha pode ser utilizada, principalmente em grávidas ou pacientes intolerantes
ao tratamento com antifúngicos (71% de eficácia) (RAMOS-E-SILVA et al., 2007).
I. 2.4 - Malassezia spp.

Os membros do gênero Malassezia fazem parte da microbiota indígena de
homens e animais. A maioria das espécies são leveduras lipofílicas, caracterizadas por
brotamento monopolar e capacidade de formar pseudo-hifas. Lipídios estão presentes na
camada lamelar, estrutura localizada na superfície do envoltório celular e externa à
parede celular fúngica, importante na interação intercelular (MITTAG, 1995). Essas
leveduras colonizam a pele e couro cabeludo, podendo causar dermatites seborréica e
atópica, foliculite, doença disseminada em pacientes imunossuprimidos e pitiríase
versicolor (CHRYSSANTHOU et al., 2001; KANEKO et al., 2007; MORRISON e
WEISDORF, 2000). Pitiríase versicolor é uma infecção superficial do estrato córneo,
caracterizada por manchas hiperpigmentadas (pitiríase versicolor negra) e
hipopigmentadas (pitiríase versicolor alba), localizadas no couro cabeludo, no tronco,
nas axilas e no pescoço. Anteriormente, M. furfur era reconhecida como principal
9
agente etiológico da pitiríase versicolor, no entanto, Morishita e Sei (2006)
demonstraram que M. globosa e M. restricta são as principais espécies comumente
presentes em pacientes com pitiríase versicolor e M. globosa é a causadora dessa doença
devido à sua capacidade de produzir pseudo-hifas, ao contrário da espécie M. restricta.
O diagnóstico micológico das doenças causadas por Malassezia spp. consiste em
visualização de células leveduriformes agrupadas com ou sem brotamento único,
assemelhadas a cachos de uva, e fragmentos de pseudo-hifas curtos e grossos, por meio
do exame direto de amostras clínicas tratadas com hidróxido de potássio a 20% ou pelo
método da fita gomada (pseudo-hifas dificilmente visualizadas). O isolamento em
cultura é possível em meios suplementados com azeite de oliva (por exemplo, ágar
Sabouraud) e meio de Dixon, após 72 horas de incubação a 32°C. As colônias
apresentam aspecto macroscópico cremoso com coloração branca a amarelada
(DUARTE e HAMDAN, 2006; ZAITZ et al., 2000). As espécies do gênero Malassezia
apresentam características morfológicas e bioquímicas similares. A identificação está
baseada no metabolismo de lipídeos, reação de catalase, temperatura de crescimento,
produção de precipitados em ágar Dixon, hidrólise de esculina, assimilação de óleo
castor polietoxilatado (surfactante aniônico) e morfologia celular (KANEKO et al.,
2007). Diagnóstico diferencial deve ser realizado para vitiligo vulgaris,
fotoleucomelanodermatites induzidas por fármacos, pitiríase rósea de Gibert e
papilomatoses confluente ou reticulada (MORISHITA e SEI, 2006).
Os agentes antifúngicos são efetivos contra as leveduras do gênero Malassezia,
após duas semanas de terapia. Esses fármacos podem ser utilizados para tratamento
tópico (imidazólicos, alilaminas e benzilaminas) e oral (itraconazol, fluconazol e
cetoconazol). A utilização de “shampoo” antifúngico é necessária para prevenir a
recidiva da doença (MORISHITA e SEI, 2006).
I. 2.5 – Agentes antifúngicos

A maioria dos agentes antifúngicos interfere com a biossíntese ou integridade
do ergosterol, principal esterol da membrana citoplasmática fúngica, exceto as
equinocandinas, que causam ruptura da parede celular. Os principais fármacos podem
ser agrupados em cinco classes: polienos, azólicos, alilaminas, equinocandinas e outros
agentes (griseofulvina e 5-flucitosina) (CHEN e SORRELL, 2007).
Os azólicos agem principalmente inibindo a enzima citocromo P450, 14α-
desmetilase. Há dois grupos em uso clínico: imidazólicos (cetoconazol e miconazol,
10
com uso limitado a micoses superficiais) e triazólicos (fluconazol e itraconazol). Os
triazólicos apresentam perfil de segurança significantemente maior que os imidazólicos,
apesar de causarem hepatotoxicidade. Voriconazol e posaconazol são triazólicos de
segunda geração, que apresentam amplo espectro de atividade (CHEN e SORRELL,
2007). Elevados valores de concentrações inibitórias mínimas (CIMs) in vitro aos
azólicos têm sido demonstrados em isolados de Candida spp. [C. albicans, C. krusei
(resistência intrínseca), C. rugosa, C. guilliermondii, C. lusitaniae, C. haemulonii e C.
glabrata], Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, Sporothrix spp. (nas formas
leveduriforme e miceliana), entre outros fungos (DA MATTA et al., 2007; ESPINELL-
INGROFF, 2008; GIUSIANO et al., 2006; GOMEZ-LOPEZ et al., 2008; KHAN et al,
2007; KOHLER et al., 2007; MARIMON et al., 2008; MOKADDAS et al, 2007;
SAMONIS et al., 2008; SERENA et al., 2005; TRILLES et al., 2005). Geralmente, a
atividade dos azólicos contra leveduras do gênero Malassezia tem sido eficiente
(MIRANDA et al., 2007; SANCAK et al., 2005).
A anfotericina B apresenta atividade fungicida, amplo espectro e tem sido
utilizada com sucesso no tratamento de micoses sistêmicas. Os fatores limitantes do uso
desse polieno são a necessidade de administração endovenosa e a nefrotoxicidade dose-
dependente (reversível ou irreversível). A preparação lipossomal da anfotericina B
apresenta menores efeitos tóxicos, eficácia clínica e possibilita a utilização de doses
maiores (CHEN e SORRELL, 2007; JANKNEGT, 1992). Poucos isolados de Candida
spp. e Cryptococcus spp. têm mostrado resistência in vitro à anfotericina B (CHEN e
SORRELL, 2007; KHAN et al, 2007; SILVA et al., 2008). Elevados valores de CIM in
vitro têm sido observados para Sporothrix spp. (KOHLER et al., 2006; MARIMON et
al., 2008; TRILLES et al., 2005).
Há três equinocandinas clinicamente importantes: caspofungina, micafungina e
anidulafungina. Essas drogas apresentam atividade contra espécies de Candida e
Aspergillus, eficácia semelhante a da anfotericina B e boa penetração tecidual, apesar
das baixas concentrações no SNC. A toxicidade não é freqüente (reações alérgicas e
relato raro de hepatite) devido ao mecanismo de ação específico (parede celular fúngica)
e há mínima interação com outros fármacos, exceto com ciclosporina. As
equinocandinas apresentam excelente eficiência in vitro, apesar de não serem ativas
contra Cryptococcus spp. e elevados valores de CIM terem sido obsevados para
Candida parapsilosis e Candida guilliermondii (CHEN e SORRELL, 2007;
ESPINELL-INGROFF, 2008).
11
A terbinafina é o tratamento de escolha para onicomicoses, apresentando
excelente atividade contra dermatófitos, apesar de pequeno efeito inibitório no
crescimento de leveduras (Candida spp. e Cryptococcus gattii) (BARROS et al., 2007;
FIGUEIREDO et al., 2007; MORAES, 2008; SANTOS e HAMDAN, 2006; SOARES,
2004). Essa alilamina demonstrou eficácia para inibir in vitro o crescimento de
Sporothrix spp. (KOHLER et al., 2006).
A 5-flucitosina é utilizada para tratamento de criptococose, em associação com a
anfotericina B, devido ao desenvolvimento de resistência in vivo em monoterapia. Os
efeitos colaterais associados ao uso da 5-flucitosina incluem mielossupressão,
ocasionando anemia, trombocitopenia e leucopenia; disfunção hepática, diarréia,
anorexia, náusea e vômito, portanto, os níveis sanguíneos da droga devem ser
monitorados (MITCHELL e PERFECT, 1995; CHEN e SORRELL, 2007).
I. 2.6 - Inibição Fotodinâmica (IFD)

Novas estratégias antimicrobianas têm sido requeridas devido à emergência de
novas espécies de fungos patogênicos e do desenvolvimento de resistência a drogas
convencionais, levando ao aumento da morbidade de doenças que eram tratadas com
relativa facilidade (MAISCH et al., 2007; WAINWRIGHT, 1998). Uma técnica
alternativa e promissora é a inativação fotodinâmica (IFD), na qual a combinação de
uma droga fotossensibilizadora e a luz visível, com adequado comprimento de onda,
causa destruição de células microbianas (DONNELLY et al., 2007 e 2008; MAISCH et
al., 2007). A terapia fotodinâmica (TFD) tem sido utilizada e investigada mundialmente
no tratamento de cânceres e outras doenças como degeneração macular, psoríase,
vitiligo, artrite reumatóide sistêmica, estenoses, arteriosclerose, doenças bacterianas e
fúngicas, dentre outras (SIMPLICIO et al., 2002; PELOI et al., 2008).
Mecanismo de ação da inativação fotodinâmica

A inibição fotodinâmica (IFD) é uma alternativa de tratamento promissora, na
qual três fatores atuam concomitantemente: um corante fotossensibilizador, uma fonte
de luz e o oxigênio. Isoladamente, nem a droga nem a luz tem a capacidade de produzir
o efeito deletério ao sistema biológico testado (MELLO, 2000; PRATES, 2005). Os
fotossensibilizadores podem ligar-se à superfície microbiana e penetrar na célula
(clorina pL-ce6), ligar-se à superfície celular, permanecendo no exterior até que ocorra a
irradiação luminosa e, então, penetrar na célula alvo (azul de orto-toluidina), ou não
12
demonstram ligação com a superfície microbiana e penetram no citoplasma da célula
alvo (rosa bengal) (DEMIDOVA e HAMBLIN, 2005).
A primeira demonstração de que a fotossensibilização pode ser letal às células
microbianas foi realizada por Raab, em 1900. Ele mostrou que pequenas concentrações
de azul de metileno levaram à morte rápida em Paramecium caudatum após exposição
da luz, fato que não ocorreu na ausência da energia luminosa. Trabalhos recentes
enumeram vários produtos que podem ser utilizados como fotossensibilizadores, dentre
os quais estão as hematoporfirinas, o azul de metileno e o azul de orto-toluidina
(PERUSSI, 2007; ZEINA et al., 2001).
A IFD tem seu início quando a molécula do fotossensibilizador associa-se à
superfície da célula-alvo, após incubação em local escuro por determinado tempo, fator
pré-requisito para um eficiente processo de fotoinativação (JACKSON et al.,1999;
KONAN et al., 2002; MONFRECOLA et al., 2004; ZEINA et al., 2001). Alguns
fotossensibilizadores (azul de ortotoluidina, ácido 5-aminolevulínico, TriP[4] e Sylsen
B) ligam-se preferencialmente à membrana citoplasmática. Durante a incubação em
ausência de luz, cargas positivas do corante ligam-se às cargas negativas da superfície
celular (parede celular fúngica) e o fotossensibilizador permanece fora da célula. Após a
emissão de energia luminosa com adequado comprimento de onda, o corante liga-se à
membrana citoplasmática, na qual ocorre a depleção de esteróis (ergosterol) e o
acúmulo de seus derivados polares, que possibilitam a penetração de pequena
quantidade de fotossensibilizador capaz de induzir à inativação de enzimas
intracelulares e das atividades metabólicas celulares, por meio de efeitos oxidativos. A
membrana celular perde sua integridade e sua capacidade de transportar carboidratos,
aminoácidos e íons fosfato (BÖCKING et al., 2000; FUCHS et al., 2007;
LAMBRECHTS et al., 2005; MONFRECOLA et al., 2004; PAARDEKOOPER et al.,
1992, 1993, 1995; SMIJS et al., 2007).
O fotossensibilizador no estado excitado (estado tripleto) pode reagir com
componentes do sistema celular através de transferência de elétrons e hidrogênio
gerando radicais livres como peróxidos, radicais hidroxila, íons superóxidos
(Mecanismo tipo I); ou por transferência de energia do fotossensibilizador excitado para
o oxigênio, principal mecanismo fotodinâmico, gerando oxigênio singleto (estados
eletronicamente excitados imediatamente superiores ao oxigênio molecular no estado
fundamental) (Mecanismo tipo II), resultando em danos irreversíveis e morte celular
(KONAN et al., 2002; MACHADO, 2000; PELOI et al., 2008; PERUSSI, 2007;
13
PRATES, 2005; ZEINA et al., 2001). A interação das espécies reativas de oxigênio com
as moléculas orgânicas não é específica, assim, qualquer macromolécula no interior da
célula pode se tornar alvo durante o processo fotodinâmico (PERUSSI, 2007).
A atividade fotoquímica ocorre apenas quando há uma estreita relação entre
absorção do corante e comprimento de onda da luz emitida pelo equipamento. A banda
de absorção do fotossensibilizador deve ser, portanto, ressonante com a radiação,
absorvendo bem o comprimento de onda emitido (CHAN et al., 2003; PRATES, 2005).
Fotossensibilizadores (Corantes)
Fotofrin, uma porfirina, foi o primeiro fotossensibilizador aprovado para uso
humano e tem sido utilizado com sucesso no tratamento de vários tipos de tumores
cancerígenos. Uma segunda geração de fotossensibilizadores tem sido produzida, com
propriedades comparáveis ou superiores ao Fotofrin, incluindo pureza química,
aumento de absorção de fóton com maior comprimento de onda, melhor retenção
tecidual, rápida liberação dos tecidos normais (clearence), alta produção de espécies de
oxigênio reativo, mínima toxicidade no escuro, e alta seletividade (ALMEIDA et al.,
2004; CHABRIER-ROSELLÓ et al., 2005; PUSHPAN et al., 2002).
De acordo com Garcez Segundo (2002), as pesquisas de corantes estão
concentradas nas porfirinas, que possuem estrutura química heterocíclica similar à da
clorofila e à da hemoglobina. Porém, a toxicidade dos corantes mais utilizados em
inibição fotodinâmica ainda é elevada, tornando viável seu uso apenas em pequenas
concentrações, diminuindo a absorção de luz e, conseqüentemente, sua eficácia. Há
limitações associadas ao uso clínico como: fotossensibilidade prolongada (porfirina
sódica) e náuseas e vômito (ácido 5-aminolevulínico). Portanto, a procura por agentes
fotossensibilizantes menos tóxicos, de maior absorção, mais ressonantes com os
comprimentos de onda dos equipamentos utilizados e mais eficientes tem sido uma
constante (GARCEZ SEGUNDO, 2002). A possibilidade de um composto funcionar
como fotossensibilizador é governada, em parte, pela sua capacidade de absorver luz no
comprimento de onda emitido pela fonte de luz (WILSON e MIA, 1993).
Azul de orto-toluidina
O azul de toluidina (TBO) é um corante fenotiazino catiônico, que possui
molécula de tamanho pequeno, não causa toxicidade no organismo humano, é capaz de
inativar, in vitro, vários agentes microbianos, necessitando para isso de menor
densidade de energia que para inibir as atividades de queratócitos ou fibroblastos. TBO
14
apresenta pico de absorção a 633 nm, boas propriedades fotodinâmicas e afinidade
seletiva por células cancerosas in vivo. Portanto, tem sido utilizado em pacientes como
auxiliar na detecção de certos tipos de cânceres na cavidade oral e trato gastrointestinal
superior. Estas características, adicionadas ao perfil de segurança em tecidos humanos, e
a possibilidade de administração oral sugerem sua investigação como um
fotossensibilizador em IFD (PERUSSI, 2007; TREMBLAY et al., 2002). Zeina et al.
(2001) demonstraram que a fotoinativação de microrganismos residentes na pele
utilizando o azul de metileno, corante fenotiazínico como o TBO, não causou in vitro
toxicidade ou dano ao DNA dos queratócitos.
Xantenos
Eritrosina B, rosa de Bengal, eosina Y e fluoresceína são exemplos desta classe de
fotossensibilizadores. Esses corantes não se ligam à membrana celular microbiana e
localizam-se no citoplasma. A atividade antimicrobiana da eritrosina tem sido
demonstrada em bactérias orais Gram-positivas e negativas e tem aprovação para
utilização na região bucal como evidenciador de placa dentária (PERUSSI, 2007).
Derivados fulerenos
A família fulereno, especialmente o C60, apresenta propriedades físicas,
fotoquímicas e eletroquímicas, que podem ser exploradas em vários campos biológicos
(inibição enzimática, atividade anti-viral, agentes neuroprotetores). Quando expostos à
luz, os derivados fullerenos podem produzir oxigênio singleto. No entanto, dois
principais problemas limitam o uso do C60 e seus derivados em estudos biológicos: a
pequena solubilidade em água e a alta toxicidade. A primeira desvantagem pode ser
parcialmente resolvida por meio da ligação de uma ou mais cadeias solubilizantes na
esfera do C60, porém, em alguns casos, esses derivados hidrossolúveis provocam
toxicidade em culturas de células (Figura 1) (BOSI et al., 2003 e 2004).
Figura 1: Representação da molécula do fulereno (www.google.com.br)
15
Morte Celular
A morte celular causada pela inativação fotodinâmica pode ocorrer por meio de
apoptose (morte programada na qual a célula é sistematicamente desmantelada e envia
sinais para realização de sua fagocitose) ou necrose (morte celular com liberação de
material que pode desencadear reação inflamatória). Isto depende do tipo de célula,
concentração e localização intracelular do fotossensibilizador e dose da luz utilizada
(ALMEIDA et al., 2004).
TBO associa-se preferencialmente à membrana celular, após incubação por 5
minutos, sendo mais efetivo quando permanece em solução (DEMIDOVA e
HAMBLIN, 2005; JACKSON et al., 1999). Evidências experimentais da inativação
fotodinâmica em células Jurkat (células da leucemia humana) demonstraram que, na
região intracelular, este corante pode estar presente no retículo endoplasmático e
complexo de Golgi, sendo capaz de exibir potente citotoxicidade e resposta apoptótica,
após exposição à luz (TREMBLAY et al., 2002).
Fontes de Luz
Luz Amplificada por Emissão Estimulada de Radiação (LASER)
Em 1917, Albert Einstein descobriu o fenômeno da emissão estimulada da luz e,
apenas em 1960, T. H. Maiman construiu o primeiro Laser com meio ativo de rubi
(Figura 2). As novas características da luz gerada pelo Laser, a qual apresentava
características diferentes da luz do sol ou de uma lâmpada incandescente, encontraram
várias aplicações na biologia, possibilitando e facilitando pesquisas. O Laser
possibilitou, por exemplo, o mapeamento de regiões adequadas para a agricultura,
progressos na farmacologia, medições precisas na botânica, automatização de processos
na indústria de laticínios, na qual a proliferação bacteriana deve ser cuidadosamente
controlada (MENDONÇA, 1998).
Produção de luz no Laser
Os elétrons do sistema absorvem a energia fornecida pela fonte externa e são
transferidos do estado fundamental (nível de menor energia) para um estado de
excitação e instabilidade (nível de maior energia). O elétron tende a voltar para seu
estado fundamental e este decaimento energético gera fótons de luz (emissão
espontânea de luz). No Laser, para que este processo de decaimento seja acelerado, a
fonte de energia produz um fóton externo que estimula o decaimento do elétron,
gerando o fóton do sistema (emissão estimulada). Assim, na emissão estimulada, dois
16
fótons emergem juntos (o fóton externo e o fóton gerado no sistema) com a mesma
energia e propagando-se na mesma direção. Estes fótons voltam ao sistema através da
cavidade óptica (espelhos), causando excitação de outros elétrons, produção de novos
fótons e, portanto, amplificação e produção da luz Laser (BAGNATO, 2001).
Figura 2: Representação do Laser de Rubi (www.google.com.br)
Características da Luz Laser

A luz produzida por um Laser apresenta as seguintes características: a)
monocromaticidade, pois a energia do fóton externo e a do fóton produzido no sistema
são as mesmas e apresentam o mesmo comprimento de onda; b) o feixe de luz resultante
propaga-se na mesma direção; e c) a luz Laser é coerente, pois as ondas sucessivas da
radiação apresentam a mesma direção e mesmo sentido, permitindo que se obtenham
maiores concentrações de energia por unidade de superfície e podendo ser medida em
metros chegando, muitas vezes, a quilômetros (AMORIM, 2007; BAGNATO, 2001).
Lasers de baixa intensidade

Os Lasers que emitem em baixa intensidade não causam efeitos térmicos, mas
sim, efeitos fotoquímicos, fotofísicos e/ ou fotobiológicos, quando interagem com
células ou tecidos. Os tecidos biológicos possuem cromóforos (melanina, hemoglobina,
hemomoléculas, porfirinas, citocromo-oxidase, etc.), que, ao absorverem a luz Laser,
produzem estimulação ou inibição de atividades enzimáticas e reações fotoquímicas.
Estas ações determinam uma cascata de reações metabólicas com efeitos terapêuticos
(CRUANES, 1984). Esses Lasers, portanto, podem desempenhar um papel de
normalizadores das funções celulares, sendo denominados “Balanceadores e
Normalizadores de Funções” (OSHIRO e CALDERHEAD, 1991).
17
Os comprimentos de onda mais utilizados nas áreas biomédicas estão na região
espectral compreendida entre 600 nm e 1000 nm, conhecida como “janela
fototerapêutica” na qual a membrana celular apresenta considerável transparência à
radiação eletromagnética, sendo possível boa penetração da luz na pele e nas mucosas,
com risco mínimo de destruição generalizada das células sadias que não possuem o
agente fotossensibilizador (MACHADO, 2000). As mitocôndrias são capazes de
absorver a luz emitida pelos Lasers de emissão visível (600 – 700 nm) e as membranas
celulares absorvem a luz dos Lasers de emissão infravermelha. Esta observação poderia
sugerir a explicação para as diferentes ações desses Lasers de baixa intensidade sobre os
tecidos biológicos (KARU, 1999).
Os Lasers mais utilizados em aplicações clínicas são os de He-Ne e diodo
(semicondutor). Os de He-Ne são Lasers compostos por uma mistura de gases nobres
com predomínio do Hélio (90%) e de Neônio (10%), operando no visível e os Lasers de
diodo (semicondutores) consistem de um sanduíche prótons-nêutrons (p-n), sendo a
radiação emitida pelas laterais entre as camadas do sanduíche. As faces laterais polidas
precisamente perpendiculares ao sanduíche no Laser diodo servem de espelhos da
cavidade ressonante. Neste caso não há a necessidade de espelhos ou de nenhuma outra
estrutura em todo o Laser, exceto a fonte de alimentação, tornando-se um sistema
extremamente compacto. A junção “p-n” de arseneto de gálio é essencialmente um
diodo emissor de luz, o qual é levado à emissão Laser pela passagem de uma corrente
alta (AMORIM, 2007).
Diodos de emissão de luz (LED)
LEDs são diodos especiais que emitem luz por meio de eletroluminescência,
quando conectados a um circuito. Apresentam dois fios, positivo e negativo (fio com
lado mais plano e menor) ligados a um bulbo (Figura 1). O LED opera em tensões
relativamente baixas (um a quatro volts) e correntes entre 10 e 40 milliamperes. A parte
mais importante deste equipamento é o “chip” semicondutor localizado no centro do
bulbo, o qual possui duas regiões “p” (carregada positivamente) e “n” (carregada
negativamente) separadas por uma junção “p-n”. Apenas quando uma tensão suficiente
é aplicada ao fragmento semicondutor, os elétrons atravessam a junção para a região
“p”, combinam com as cargas positivas e formam uma energia elétrica potencial que é
convertida em energia eletromagnética. Um quantum dessa energia é emitido na forma
de um fóton de luz, com a freqüência característica do material semicondutor
18
(geralmente uma combinação de elementos químicos: gálio, arsênio e fósforo) (Figura
3) (BOZKURT e ONARAL, 2004; MANG, 2004).
Figura 3 – Representação de um diodo de emissão de luz (LED). Fonte: www.google.com.br.

Diodos de emissão de luz que emitem diferentes cores são produzidos a partir de
diferentes materiais semicondutores e requerem diferentes energias para produção de
luz. A luz produzida é não coerente, ao contrário daquela produzida por um Laser
(BOZKURT e ONARAL, 2004). Esses sistemas são compactos e necessitam de menor
quantidade de energia para emitir luz com os comprimentos de ondas desejados. Os
equipamentos têm sido fabricados em vários comprimentos de onda (630, 670 e 690
nm) (MANG, 2004).
Inibição Fotodinâmica em fungos

Devido ao crescente número de patógenos fúngicos, infecções nosocomiais,
micoses oportunistas e desenvolvimento de resistência aos antifúngicos, o interesse pela
IFD em fungos tem sido renovado (PERUSSI, 2007). A redução elevada da viabilidade
das células fúngicas e o efeito fungicida têm sido observados em Candida spp. (redução
da formação de tubo germinativo e de biofilme), Trichophyton rubrum (redução da
formação de microconídeos e hifas), Aspergillus fumigatus e Cryptococcus neoformans,
ao utilizar variados fotossensibilizadores [azul de orto-toluidina, azul de metileno,
porfirinas (Sylsens B, DPmme, DP e HP), Fotofrin®, ácido 5-aminolaenulinico (ALA),
TriP[4], PEI-ce6 (clorina), Green 2W], com diferentes concentrações (2 µM a 1000 mg/
mL) e períodos de incubação em ausência de luz (1 minuto a 3 horas) (FRIEDBERG et
al.,2001; FUCHS et al., 2007; JACKSON et al.,1999; STRAKHOVSKAYA et al.,
2002; PELOI et al., 2008; SMIJS et al., 2007; SMIJS et al., 2008; TEICHERT et al.,
2002; WILSON e MIA, 1993). Fontes de radiação vermelha e infravermelha têm sido
testadas, com diferentes tempos de irradiação (30 segundos a 10 minutos): Laser hélio-
neon (HeNe – 632,8 nm), gálio-alumínio (GaAl – 630-685 nm), arseneto de hélio-neon
(HeNeAs – 780-870 nm), arseneto de gálio (GaAs – 904 nm), e LEDs que possuem
19
ampla região de espectro (670 – 950 nm). A comparação dos efeitos terapêuticos com
fontes de luz coerente (laser de baixa intensidade) e incoerente (LED) não demonstrou
diferenças significativas para os mesmos comprimentos de onda, intensidade e tempo de
irradiação (VLADIMIROV, 2004).
A associação entre fotossensibilizadores (azul de orto-toluidina e o Sylsens B) e a
superfície de células fúngicas tem sido viasualizada no período de incubação, em
ausência de luz, ou quando houve falha do processo fotodinâmico. Esse processo
ocorre por meio da diferença de cargas eletrostáticas entre as moléculas dos
fotoabsorvedores e a parede celular fúngica (SMIJS et al., 2007). Após a IFD, alterações
extensas e graves da parede celular (deformações e destruição da parede celular fúngica,
ruptura da hifa) e da membrana citoplasmática podem ocorrer. Esses danos podem levar
ao extravazamento do material intracelular e perda irreversível da viabilidade celular.
Danos menores à parede celular fúngica foram observados também após a exposição ao
Sylsens B isoladamente (FUCHS et al., 2007; JACKSON et al., 1999; LAMBRECHTS
et al., 2005; MONFRECOLA et al., 2004; SMIJS et al., 2007 e 2008).
Perspectivas da Inibição Fotodinâmica

Evidências experimentais mostraram que, durante a IFD, células microbianas
metabolizam rapidamente o agente fotossensibilizador e densidades relativamente
pequenas de luz são requeridas para reduzir substancialmente esta população. Esta
modalidade de tratamento apresenta amplo espectro de atividade, não seleciona
microrganismos resistentes, não causa efeitos celulares mutagênicos e possibilita
ativação do fotossensibilizador, in situ, por meio de fontes de luz não-coerente e visível,
de baixa intensidade, que utilizam tecnologia de baixo custo e requerem menores
medidas de proteção para o operador e o paciente (JORI e RONCUCCI 2006; JORI e
COPPELLOTTI, 2007).
Para obter eficiência na IFD, a distribuição da luz deve ser adequada, homogênea
e suficiente para envolver completamente o volume do tecido alvo e obter o efeito
terapêutico desejado. Uma das vantagens dos Lasers é a utilização de fibras ópticas
(cilíndricas, em forma de balão, cônicas com lentes na extremidade) que permitem a
distribuição da luz diretamente no sítio alvo, otimizando a especificidade e a capacidade
do tratamento. As fibras ópticas devem distribuir energia suficiente, serem compatíveis
com instrumentos clínicos, como o endoscópio, e corresponder ao tamanho e volume do
tecido ou cavidade alvo (MANG, 2004).
20
Quanto à distribuição ideal do fotossensibilizador, essa substância deve ser capaz
de acumular seletivamente o corante no tecido alvo, sem que seja metabolizada pelas
células não-alvo. O fotossensibilizador deve ser incorporado sem perda ou alteração de
sua atividade, ser biodegradável e não imunogênico. Muitos fotossensibilizadores são
hidrofóbicos, característica que permite um acúmulo preferencial em sítios celulares
lipofílicos, porém tal propriedade dificulta a administração intravenosa do corante.
Portanto, sistemas de distribuição como lipossomas, dispersões oleosas, partículas e
conjugados poliméricos têm sido pesquisados (KONAN, 2002).
A seletividade do fototratamento constitui o principal impecilho para tornar o uso
da terapia fotodinâmica mais amplo, pois os fotossensibilizadores utilizados contra
microrganimos podem também ligar-se às células e tecidos humanos e animais (baixa
toxicidade seletiva). Para aumentar a especificidade do fotossensibilizador pelas células
microbianas, têm sido desenvolvidos complexos fotossensibilizadores-lipoproteínas do
soro ou conjugados com anticorpos monoclonais (JORI e RONCUCCI 2006; KONAN,
2002). Estudos sobre a relação entre a estrutura química dos agentes fotossensibilizantes
e sua fototoxicidade em patógenos microbianos têm alcançado a identificação de vários
compostos seletivos com ótimos efeitos citocidas. Derivados fenotiazinas, porfirinas e
ftalocianinas têm sido modificados com introdução de porções catiônicas (grupos
amino-quaternários), longas cadeias de hidrocarbonetos (grupo N-alquil) e aumento do
caráter anfifílico para promover o rompimento da membrana plasmática (JORI e
COPPELLOTTI, 2007).
Recentes avanços na tecnologia de nanopartículas (NP), por exemplo nanotubos
de carbono, têm promovido novas perspectivas à terapia fotodinâmica. As NP podem
melhorar a distribuição dos fotossensibilizadores (FS), ser fotoativas ou podem formar
conjugados (NP-FS) capazes de ativar as moléculas dos FS, após absorver
primariamente a energia luminosa (WILSON e PATTERSON, 2008).
21
II – Objetivos
22
Objetivo Geral
Avaliar a susceptibilidade, in vitro, de amostras de fungos de interesse médico à
inibição fotodinâmica (IFD), empregando gêneros que apresentem características
morfo-fisiológicas distintas, monitorando, paralelamente, a sua susceptibilidade, in
vitro, aos antifúngicos usualmente empregados na terapêutica.
Objetivos Específicos
1. Contribuir para o estabelecimento do protocolo experimental para testes de
inibição fotodinâmica de fungos, in vitro:
a) Preconizar métodos para preparo e tratamento dos inóculos fúngicos, cuja
padronização atenda à metodologia do instituto de padronizações clínicas e
laboratoriais (Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI).
b) Selecionar as fontes de energia e os fotossensibilizadores para experimentos de
fotoinibição, utilizando amostras de referência de Cryptococcus neoformans, C.
gattii, Candida albicans, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis.
c) Determinar se os fotossensibilizadores azul de metileno e azul de orto-toluidina
são ressonantes com o Diodo de Emissão de Luz (LED), por meio de
espectroscopia.
d) Observar a variação de temperatura que pudesse causar danos teciduais durante
a irradiação pelo LED.
2. Em relação às amostras de fungos dos gêneros abaixo discriminados:

2.1 – Cryptococcus gattii: avaliar a susceptibilidade, in vitro, de isolados de
Cryptococcus gattii e C. neoformans à IFD, otimizar as condições experimentais
para a maior redução da viabilidade celular de diferentes amostras de C. gatii,
determinar a inibição, in vitro, do crescimento celular, comparando a
susceptibilidade de isolados clínicos e ambientais de C. gattii à IFD; avaliar se
aplicações consecutivas de IFD possibilitariam maior inativação, in vitro, destas
leveduras, determinar a susceptibilidade dos isolados da referida espécie à
terbinafina.
2.2 - Candida spp.: avaliar a susceptibilidade, in vitro, de diferentes espécies de
Candida isoladas de cavidade oral de pacientes, otimizando as condições
experimentais para a maior redução da viabilidade celular fúngica, verificando,
além da perda de viabilidade celular após o fototratamento, a alteração dos
23
padrões de adesão das leveduras a células epiteliais bucais; avaliar se aplicações
consecutivas de IFD possibilitariam maior inativação, in vitro, das leveduras;
determinar a susceptibilidade dos isolados orais de Candida spp. ao fluconazol.
2.3 – Sporothrix schenckii: avaliar a susceptibilidade, in vitro, de diferentes isolados

de S. schenkii à IFD, nas fases leveduriforme e miceliana.
2.4 – Malassezia furfur: avaliar a susceptibilidade, in vitro, à IFD de um isolado

clínico humano de Malassezia furfur.
24
III - Materiais e Métodos
25
III. 1 – Estabelecimento de protocolo experimental para testes de inibição
fotodinâmica (IFD) de fungos, in vitro
Para proceder aos testes de IFD, foi estabelecido um protocolo experimental, em
associação com Dr. Gerdal Roberto Sousa, Dr. José Cláudio Faria Amorim (Laboratório
de Bioengenharia, Departamento de Engenharia Mecânica, UFMG) e Renato Araújo
Prates (Centro de Lasers e Aplicações, IPEN-CNEN/ SP). Por meio desta metodologia,
o fotossensibilizador testado (azul de orto-toluidina - TBO), mantido em solução a 4°C,
foi associado a uma suspensão de células de Cryptococcus gattii (ATCC 24065) e,
posteriormente, irradiado pela luz, com comprimento de onda específico, emitida por
um equipamento (Diodo de emissão de luz - LED). Para cada teste, foi possível
controlar o crescimento ótimo da levedura, não submetida a qualquer tratamento, a
atividade da luz isoladamente sobre o microrganismo testado, a ação isolada do
fotossensibilizador sobre a amostra de C. gattii, e o resultado da exposição à luz da
levedura associada ao fotossensibilizador. Desta forma, todos os experimentos
utilizaram tubos de vidro (10 x 10 mm) e foram realizados no escuro e protegidos da
ação da luz do ambiente (tubos envoltos por papel alumínio). Com estes tubos, um
inóculo de volume definido, irradiado por período de tempo definido na ausência ou
presença do fotossensibilizador (volume e concentrações definidos), foi testado sem que
um tratamento interferisse no outro. De acordo com essa metodologia, fatores como a
volatilização dos reagentes e a fotossensibilização do TBO foram controlados para
minimizar incertezas durantes os testes.
III. 1. a – Padronização, preparo e tratamento do inóculo
O inóculo foi padronizado, preparado e contado em câmara de Newbauer,
conforme metodologia descrita por Pfaller et al. (1988). O isolado C. gattii ATCC
24065 foi subcultivado em ágar Sabouraud Dextrose (ASD) e incubado a 35oC por 48
horas (fase de crescimento exponencial). Uma massa de células foi recolhida
assepticamente com alça esterilizada e ressuspensa em tubo de ensaio contendo 5 mL de
solução salina 0,85% esterilizada. Após a homogeneização em vórtex, a transmitância
da suspensão foi ajustada para 75 a 77%, correspondente a um inóculo final de 1 – 5 x
106 células/ mL. O inóculo foi aliquotado em tubos de vidro para obter um volume final
de 1000 µL/ tubo (CLSI, 2002).
Procedimento experimental de tratamento dos inóculos fúngicos
Os tubos foram identificados, de acordo com os tratamentos propostos e
presentes na figura 4. Os tubos 1 a 3 (grupos 1 a 3) corresponderam aos controles
26
experimentais: 1000 µL de inóculo sem tratamento (grupo 1), 1000 µL de inóculo
irradiado no fundo do tubo pelo LED por 3 minutos, na ausência do TBO (grupo 2), ou
900 µL de inóculo expostos a 100 µL do TBO (diluição de 1:10 do fotossensibilizador)
sem exposição à luz LED e incubados por 5 minutos no escuro (grupo 3). No tubo 4
(grupo 4), 900 µL de inóculo foram associados a 100 µL do TBO, incubados por 5
minutos no escuro e irradiados por 3 minutos, no fundo do tubo, pela luz LED (IFD).
Após os tratamentos, as suspensões de células de C. gattii foram diluídas e semeadas
em placas de Petri, contendo ASD. As placas foram incubadas a 35°C, por 48 horas, e
as colônias viáveis contadas. Todos os testes foram repetidos por três vezes para obter
reprodutibilidade, e os experimentos foram realizados à temperatura ambiente. Para
certificar a associação entre o fotosensibilizador (TBO) e as células fúngicas, foi
realizado um exame microscópico das células em suspensão do tubo três.
Figura 4: Representação do protocolo experimental utilizado nos testes de inativação fotodinâmica

(IFD).
III. 1. b – Seleção das fontes de luz e dos fotossensibilizadores para os

experimentos de fotoinibição
Experimentos pilotos foram realizados para selecionar a fonte de luz e o
fotossensibilizador, cuja associação poderia resultar em maior redução da viabilidade
27
das células de Cryptococcus gattii, C. neoformans, Candida albicans, C. tropicalis, C.
parapsilosis e C. krusei. O fotossensibilizador e a fonte de luz que produziram maior
redução da viabilidade celular foram utilizados em outros testes.
Fontes de luz
a) Diodo de emissão de luz (LED) (Fisioled, MMoptics, São Paulo, Brasil), fonte
de luz vermelha monocromática emitindo em 630 nm (± 10 nm) com densidade
de energia de 36 J/ cm2 e irradiação por 3 minutos, apresentando potência de 100
mW, intensidade de 200 mW/cm², área de “spot” (ponto de luz) de 1,5 cm2 em
meio ativo de índio, gálio, alumínio e fósforo (InGaAlP).
b) Diodo de emissão de luz (LED) (Fisioled, MMoptics, São Paulo, Brasil), fonte
de luz azul monocromática emitindo em 470 nm (± 10 nm), com densidade de
energia de 36 J/cm2 e irradiação por 3 minutos, apresentando potência de 100
mW, intensidade de 600 mW/ cm², área de “spot” (ponto de luz) de 1,5 cm2 em
meio ativo de índio, gálio, alumínio e fósforo (InGaAlP).
c) Laser de baixa intensidade (QTUMOOB, Quantum, Ecco Fibras, Brasil), fonte
de luz monocromática emitindo em 660nm com densidade de energia de 36 J/
cm2 e irradiação por 3 minutos, apresentando potência de 100 mW, intensidade
de 2 W/ cm², área de “spot” (ponto de luz) de 8mm em meio de arsênio, gálio e
alumínio (AsGaAl).
d) Laser de baixa intensidade (Unit Kondortech, São Carlos, Brasil) fonte de luz
monocromática emitindo em 660 nm, com densidade de energia de 5,4 J/ cm2 e
irradiação por 3 minutos, apresentando potência de 30 mW, intensidade de 30
mW/ cm2, área de “spot” de 1 cm2 em meio de arsênio, gálio e alumínio
(AsGaAl).
e) Lâmpada Ultra-violeta (System Eickhorst, Alemanha) fonte de luz
monocromática emitindo em 254 nm (UVC) e 366 nm (UVA), com potência de
5 W e 3 minutos de irradiação.
Fotossensibilizadores
Em solução aquosa (concentração final de 100 µg/ mL), foram utilizados azul de
orto-toluidina (TBO), azul de metileno (AM), azul de tripan (AT), verde de malaquita
(VM), e Ponceau (P); e, em solução alcoólica, eritrosina (E) (concentração final de 2
28
mg/ mL). Os espectros de absorção foram analisados por espectroscopia e os picos de
absorção apresentaram-se ressonantes com o comprimento de onda da luz produzida
pelos equipamentos testados.
Os fotossensibilizadores TBO, VM, P e E foram utilizados nos testes com LED
emitindo a 470 nm. TBO, AT, P, VM e E foram testados em experimentos com LED
emitindo a 630 nm, sendo que para este último equipamento, foram avaliadas as
atividades fototóxicas do AM e do TBO, ambos a 100, 50 e 25 µg/ mL. Para os
experimentos com o Laser de baixa intensidade Quantum, AM e TBO, ambos a 25 µg/
mL foram testados, e para os testes com Laser de baixa intensidade Unit Kondortech, o
VM a 100 µg/ mL. Derivados fulerenos [fulerol a 60 µg/ mL e 6mg/ mL, C60
complexado com poli (N-vinil-pirrolidona) (PVP) a 28 µg/ mL e C60 Nanopartículas a
9,4 µg/ mL] foram testados com UVA 366 nm, UVC 254 nm e LED emitindo a 470 nm.
Os picos de absorção foram analisados por espectroscopia de absorção óptica e
apresentaram-se ressonantes com o comprimento de onda da luz produzida pelos
equipamentos testados. O fotossensibilizador e a fonte de luz, que levaram à maior
redução do número de células fúngicas viáveis, foram selecionados e utilizados em
outros experimentos com IFD.
III. 1. c – Avaliação da ressonância entre os fotossensibilizadores azul de metileno

(AM) e azul de orto-toluidina (TBO) e o Diodo de emissão de Luz (LED), por meio
de espectroscopia
Para avaliar as bandas de absorção de luz dos fotossensibilizadores AM e TBO,
e selecionar qual destes corantes se apresentaria ressonante com o equipamento
selecionado (LED emitindo a 630 nm), a densidade óptica foi avaliada por meio do
espectrofotômetro UV-2401 PC (Shimadzu®, Japão), no Departamento de Física (ICEX/
UFMG). Para este experimento, a amostra ATCC 18804 de C. albicans foi utilizada.
Uma suspensão de células (1 - 5x106 UFC/ mL) do isolado foi preparada, aliquotada em
tubos de vidro: 1000 µL de inóculo sem fotossensibilizador (tubo 1), 1000 µL de TBO a
25 µg/ mL sem suspensão de levedura (tubo 2), 900 µL de inóculo expostos a 100 µL
de TBO a 25 µg/ mL (tubo 3), 1000 µL de AM a 25 µg/ mL sem suspensão de levedura
(tubo 4) e 900 µL de inóculo expostos a 100 µL de AM a 25 µg/ mL (tubo 5). Os tubos
foram incubados por 5 minutos sob abrigo de luz externa e colocados no
espectrofotômetro para serem medidos os picos de absorção das soluções. Os dados
foram processados por meio de um programa digital “OriginPro 7.5”. A absorção do
29
TBO e do AM a 100, 50 e 25 µg/ mL, sem a suspensão de leveduras, foi também
analisada nesse experimento.
III. 1. d – Avaliação da produção de calor durante IFD utilizando tempo de

irradiação por 15 minutos
Para proceder a este teste, foi utilizada uma amostra clínica de Candida
tropicalis (CG09). No grupo 4 (células leveduriformes tratadas com IFD), durante a
irradiação por 15 minutos, a produção de calor foi controlada através de medidas de
variação da temperatura ao longo do experimento. Para realizar este teste, um Termopar
(tipo T de cobre, com diâmetro de 0,1 mm) foi colocado dentro do tubo e as variações
de temperatura adquiridas e processadas por meio de um programa digital (Termo
Aquisic 1.0, Bios Serviço e Comércio Ltda, Belo Horizonte, Brasil). O Termopar
registrou uma temperatura inicial de 29.6 (±0.1)°C no interior do tubo de vidro.
III. 2 – Cryptococcus gattii
Avaliação, in vitro, da susceptibilidade de diferentes isolados de Cryptococcus gattii

aos efeitos fototóxicos da IFD e frente à terbinafina
a) Avaliação, in vitro, da susceptibilidade de 40 isolados de Cryptococcus gattii aos
efeitos fototóxicos da IFD
Microrganismos
Neste tópico, 40 isolados de origens clínica e ambiental de Cryptococcus gattii
foram utilizados. Três amostras de referência de C. gattii (ATCC 24065, ATCC 32608 e
ATCC 34883 – GSU 836C) foram obtidas do Laboratório de Micologia (Departamento
de Microbiologia, ICB, UFMG) e os demais isolados clínicos e ambientais de C. gattii
foram gentilmente cedidos pela Profª. Drª. Márcia dos Santos Lazera (Fundação
Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ), pela Profª. Drª. Claudete Rodrigues de
Paula (ICB, USP, São Paulo, SP) e pela Profª. Drª. Márcia de Souza Carvalho Melhem
(Instituto Adolfo Lutz – IAL, São Paulo, SP) (Tabela 21 no Anexo 1). A amostra clínica
CGP-BH foi isolada, identificada e testada quanto à susceptibilidade a drogas
antifúngicas (em monoterapia e em combinação) (artigo publicado: Revista
Iberoamericana de Micologia, v. 25, p. 242-245, 2008- Anexo 3) e à IFD. Todas as
amostras, independente de sua origem, foram semeadas em ágar Sabouraud Dextrose
30
(ASD) e preservadas em câmara fria a 4ºC com repiques realizados em intervalos de
três meses neste mesmo meio de cultura.
Procedimento experimental
O azul de orto-toluidina (TBO) (Sigma, St. Louis, MO., USA), com pico de
absorção a 633 nm (JACKSON et al., 1999) e a 100 µg/ mL, e a irradiação com LED a
630 nm por 3 minutos (densidade de energia de 36 J/ cm2) foram selecionados e
utilizados para inibir o crescimento de 40 isolados de Cryptococcus gattii. As
suspensões de células foram preparadas (1 – 5 x106 UFC/ mL), aliquotadas nos tubos de
vidro numerados de 1 a 4 e tratadas conforme metodologia descrita. Após a incubação e
contagem do número de células viáveis, comparações entre as atividades da luz e do
TBO, isoladamente e em associação, foram realizadas bem como verificada a diferença
de susceptibilidade entre as amostras de origem clínica e ambiental de C. gattii.
b) Avaliação da redução da viabilidade celular de Cryptococcus gattii após

consecutivas aplicações da IFD
Para avaliar a obtenção de maior redução da viabilidade das células de C. gattii
com consecutivas aplicações de IFD, um isolado clínico resistente ao fluconazol (LMM
989) foi submetido a duas sessões de IFD. Para isso, um inóculo de células
leveduriformes foi preparado, aliquotado em tubos e submetido aos tratamentos
propostos, utilizando TBO a 100 µg /mL e irradiação com LED emitindo a 630 nm, por
3 minutos (densidade de energia de 36 J/cm2), conforme metodologia descrita. Uma
segunda suspensão de células foi preparada a partir das colônias viáveis que cresceram
nas placas de Petri, correspondentes ao grupo 4 (triplicata do primeiro experimento),
aliquotada em tubos numerados de 1 a 4 e submetida a uma segunda sessão de IFD.
Após o tratamento, as suspensões foram semeadas em placas de Petri contendo ASD e
incubadas por 48 horas a 35ºC, quando foi realizada contagem de colônias viáveis.
c) Otimização das condições experimentais para maior redução da viabilidade celular

de isolados de Cryptococcus gattii.
Para obter condições experimentais que resultassem em maior redução da
viabilidade celular de C. gattii, após a IFD, outras concentrações do TBO e tempos
diferentes de irradiação pelo LED 630 nm (densidade de energia) foram avaliados. Para
esses testes, foi utilizada uma amostra de referência de C. gattii (ATCC 32608).
Efeito da variação dos tempos de irradiação com LED 630 nm em C. gattii
31
Durante esses experimentos, foram testados tempos de irradiação de 3, 6, 9, 12 e 15
minutos (densidade de energia de 36 – 180 J/ cm2), utilizando TBO a 100 µM (30,583
µg/ mL). Os tubos de vidro foram numerados de um a doze (grupos 1 a 12). Os tubos de
um a sete (grupos de 1 a 7) corresponderam aos controles experimentais: inóculo sem
tratamento (grupo 1), irradiação com LED, na ausência do TBO, por 3 (grupo 2), 6
(grupo 3), 9 (grupo 4), 12 (grupo 5) e 15 minutos (grupo 6) e TBO a 100 µM sem
emissão de luz e incubado por 5 minutos no escuro (grupo 7). Nos tubos numerados de
oito a doze (grupos 8 a 12), 100 µL de TBO foram acrescentados a 900 µL da suspensão
de células leveduriformes aliquotadas, incubados por 5 minutos sob proteção de luz
ambiente e, então, irradiados pelo LED por 3 (grupo 8), 6 (grupo 9), 9 (grupo 10), 12
(grupo 11) e 15 minutos (grupo 12) (densidade de energia de 36 – 180 J/cm2). As
suspensões de C. gattii pertencentes a cada tubo foram diluídas e semeadas em placas
de Petri contendo ASD. As placas foram incubadas a 35°C por 48 horas, e as colônias
viáveis contadas. Todos os testes foram repetidos por três vezes para obter
reprodutibilidade, e os experimentos foram realizados à temperatura ambiente.
Efeito da variação das concentrações de TBO em C. gattii
Para testar a atividade de diferentes concentrações de TBO no isolado ATCC 32608 de
C. gattii, os tubos foram identificados em ordem alfabética de A a H. Os tubos de A a E
(grupos A a E) corresponderam aos controles experimentais: inóculo sem tratamento
(grupo A), irradiado por LED 630 nm por 9 minutos (densidade de energia de 108 J/
cm2) na ausência de TBO (grupo B) ou inóculo exposto ao TBO a 100 (30,583 µg/ mL),
50 (15,291 µg/ mL) e 25 µM (7,645 µg/ mL) incubados por 5 minutos sob proteção de
luz externa e na ausência de luz (grupos C, D, E, respectivamente). Nos tubos
identificados de F a H, 100 µL de cada concentração de TBO (100, 50 e 25 µM) foram
adicionados a 900 µL da suspensão aliquotada de leveduras, incubados por 5 minutos
no escuro e, então, irradiados pelo LED 630 nm por 9 minutos (densidade de energia de
108 J/ cm2) (grupos F, G e H, respectivamente). As suspensões de C. gattii pertencentes
a cada tubo foram diluídas e semeadas em placas de Petri contendo ASD, incubadas a
35°C por 48 horas, e as colônias viáveis contadas. Todos os testes foram repetidos por
três vezes para obter reprodutibilidade, e os experimentos foram realizados à
temperatura ambiente.
d) Avaliação da susceptibilidade de 21 isolados de Cryptococcus gattii à IFD, após

otimizadas as condições experimentais
32
Após a otimização das condições experimentais para testes com Cryptococcus
gattii, TBO a 25 µM (7,645 µg/ mL) e irradiação pelo LED 630 nm por 9 minutos
(densidade de energia de 108 J/ cm2) foram selecionados e utilizados em 21 isolados de
C. gattii. As suspensões de células foram preparadas como descrito e aliquotadas em
tubos de vidro numerados de um a quatro (grupos 1 a 4). Os tubos de 1 a 3 (grupos 1 a
3) corresponderam aos controles experimentais: inóculo sem tratamento (grupo 1),
irradiado por LED 630 nm por 9 minutos (densidade de energia de 108 J/ cm2) na
ausência de TBO (grupo 2) ou inóculo exposto ao TBO a 25 µM (7,645 µg/ mL)
incubados por 5 minutos sob proteção de luz externa e na ausência de luz (grupo 3). O
tratamento das células de C. gattii por IFD (TBO associado à luz emitida pelo LED) foi
realizado no tubo quatro (grupo 4). As suspensões de C. gattii pertencentes a cada tubo
foram diluídas e semeadas em placas de Petri contendo ASD, incubadas a 35°C por 48
horas, e as colônias viáveis contadas. Todos os testes foram repetidos por três vezes
para verificar a reprodutibilidade, e os experimentos foram realizados à temperatura
ambiente. A susceptibilidade à IFD observada para os 21 isolados testados foi
comparada com a sensibilidade dos mesmos isolados às drogas antifúngicas (SOARES,
2004).
e) Determinação da susceptibilidade, in vitro, dos isolados de Cryptococcus gattii

frente à terbinafina
Como a susceptibilidade a outras drogas antifúngicas para estes isolados de C.
gattii já era conhecida (SOARES, 2004), o presente estudo avaliou o comportamento da
referida espécie frente à terbinafina. Para este experimento, 40 isolados desta espécie de
levedura foram submetidos aos testes para determinar as concentrações inibitórias
mínimas (CIMs)e concentrações fungicidas mínimas (CFMs). Inóculos de cada amostra
foram preparados e expostos a diluições da droga, de acordo com a metodologia de
microdiluição do CLSI (documento M 27-A2) (CLSI, 2002). Cem microlitros foram
retirados dos pocinhos das microplacas, correspondentes às CIMs e a duas
concentrações superiores à mesma, e semeados em placas de Petri contendo ASD.
Outras concentrações superiores à CIM foram plaqueadas até obter 100% da inibição do
crescimento. As placas foram incubadas por 72 horas a 35º C e a presença de colônias
analisadas. A CFM foi a menor concentração da droga capaz de produzir redução do
inóculo inicial de 103 UFC (100% de inibição de crescimento). Depois de obtidos os
valores de CIM e CFM, foram determinados os quocientes CFM/ CIM e os isolados
33
classificados como sensíveis (valores dos quocientes <32) ou tolerantes (valores dos
quocientes ≥32), verificando o caráter fungicida ou fungistático apresentado pela droga
antifúngica frente aos isolados de C. gattii.
III. 3 - Candida spp.
Avaliação, in vitro, da susceptibilidade de diferentes espécies de Candida spp. aos

efeitos fototóxicos da IFD e frente ao fluconazol
Microrganismos
Doze isolados de Candida spp foram utilizados: 3 amostras de referência (C.
albicans ATCC 18804, C. tropicalis ATCC 750 e C. parapsilosis ATCC 22019, obtidas
da coleção de culturas da Universidade da Geórgia, Atlanta, GA, USA) e 9 isolados
clínicos originados de lesões de mucosas bucais de pacientes portadores de próteses
totais, gentilmente cedidos pela Profª. Drª. Maria Aparecida de Resende (Laboratório de
Micologia, Departamento de Microbiologia, ICB/ UFMG), (seis isolados clínicos de
Candida albicans, duas amostras de C. tropicalis e um isolado de C. parapsilosis)
(Tabela 22 no Anexo 1).
a) Otimização das condições experimentais para obter, in vitro, maior redução da

viabilidade celular de diferentes isolados de Candida spp.
Para obter condições experimentais que resultassem em maior redução da viabilidade
celular de Candida spp., após a IFD, outras concentrações do TBO e tempos diferentes
de irradiação pelo LED (densidade de energia) foram avaliados. Para esses testes, foi
utilizada uma amostra de referência de C. albicans (ATCC 18804).
Efeito da variação dos tempos de irradiação com LED em Candida albicans
Durante esses experimentos, foram testados tempos de irradiação de 3, 6, 9, 12 e 15
minutos (densidade de energia de 36 – 180 J/ cm2), utilizando TBO a 25 µM (7,645 µg/
mL). Os tubos de vidro foram numerados de um a doze (grupos 1 a 12). Os tubos de um
a sete (grupos de 1 a 7) corresponderam aos controles experimentais: inóculo sem
tratamento (grupo 1), irradiação com LED, na ausência do TBO, por 3 (grupo 2), 6
(grupo 3), 9 (grupo 4), 12 (grupo 5) e 15 minutos (grupo 6) e TBO a 100 µM sem
emissão de luz e incubado por 5 minutos no escuro (grupo 7). Nos tubos numerados de
oito a doze (grupos 8 a 12), 100 µL de TBO foram acrescentados a 900 µL da suspensão
de células leveduriformes aliquotadas, incubados por 5 minutos sob proteção de luz
ambiente e, então, irradiados pelo LED por 3 (grupo 8), 6 (grupo 9), 9 (grupo 10), 12
34
(grupo 11) e 15 minutos (grupo 12) (densidade de energia de 36 – 180 J/cm2). As
suspensões de Candida albicans pertencentes a cada tubo foram diluídas e semeadas em
placas de Petri contendo ASD. As placas foram incubadas a 35°C por 48 horas, e as
colônias viáveis contadas. Todos os testes foram repetidos por três vezes para obter
Efeito da variação das concentrações de TBO em Candida albicans
Para testar a atividade de diferentes concentrações de TBO no isolado ATCC 18804 de
Candida albicans, os tubos foram identificados em ordem alfabética de A a H. Os tubos
de A a E (grupos A a E) corresponderam aos controles experimentais: inóculo sem
tratamento (grupo A), irradiado por LED por 9 minutos (densidade de energia de 108 J/
cm2) na ausência de TBO (grupo B) ou inóculo exposto ao TBO a 100 (30,583 µg/ mL),
50 (15,291 µg/ mL) e 25 µM (7,645 µg/ mL) incubados por 5 minutos sob proteção de
luz externa e na ausência de luz (grupos C, D, E, respectivamente). Nos tubos
identificados de F a H, 100 µL de cada concentração de TBO (100, 50 e 25 µM) foi
adicionados a 900 µL da suspensão aliquotada de leveduras, incubados por 5 minutos
no escuro e, então, irradiados pelo LED por 9 minutos (densidade de energia de 108 J/
cm2) (grupos F, G e H, respectivamente). As suspensões de C. albicans pertencentes a
cada tubo foram diluídas e semeadas em placas de Petri contendo ASD, incubadas a
35°C por 48 horas, e as colônias viáveis contadas. Todos os testes foram repetidos por
três vezes para obter reprodutibilidade, e os experimentos foram realizados à
temperatura ambiente.
b) Avaliação da susceptibilidade, in vitro, de diferentes espécies de Candida spp. à IFD

Após a otimização das condições experimentais para testes com Candida spp.
foram selecionados TBO a 25 µM (7,645 µg/ mL) e irradiação com LED por 15
minutos (densidade de energia de 180 J/ cm2), por resultar em maior redução da
viabilidade das células de C. albicans (ATCC 18804), e utilizados para os 12 isolados
de Candida spp. (sete isolados de C. albicans, três amostras de C. tropicalis e dois
isolados de C. parapsilosis). As suspensões de células foram preparadas como descrito
e aliquotadas em tubos de vidro numerados de um a quatro (grupos 1 a 4). Os tubos de 1
a 3 (grupos 1 a 3) corresponderam aos controles experimentais: inóculo sem tratamento
(grupo 1), irradiado por LED por 15 minutos (densidade de energia de 180 J/ cm2) na
ausência de TBO (grupo 2) ou inóculo exposto ao TBO a 25 µM, incubados por 5
minutos sob proteção de luz externa e na ausência de luz (grupo 3). O tratamento das
35
células de Candida spp. pela IFD (TBO associado à luz emitida pelo LED) foi realizado
no tubo quatro (grupo 4). Para certificar a associação entre o fotossensibilizador (TBO)
e as células leveduriformes, um exame microscópico da suspensão do tubo 3 foi
realizado.
As suspensões de Candida spp. pertencentes a cada tubo foram diluídas e
semeadas em placas de Petri contendo ASD, incubadas a 35°C por 48 horas, e as
colônias viáveis contadas. Todos os testes foram repetidos por três vezes para verificar a
c) Avaliação da alteração dos padrões de adesão de Candida spp. a células epitaliais

bucais (CEB) após IFD
Os testes de adesão de 12 isolados de Candida spp. a CEB foram realizados,
com modificações, de acordo com a metodologia descrita por Lyon e Resende (2006).
Preparo das células epiteliais bucais (CEB)
Células epiteliais bucais de indivíduos jovens, saudáveis e adultos foram
coletadas, pela manhã, através da fricção da mucosa bucal com “swabs” de algodão
esterilizados, e ressuspensas em solução salina 0,85% esterilizada. A suspensão
contendo um “pool” de CEB foi lavada 4 vezes para remover microrganismos
associados às células através de centrifugação a 3.500 rpm por 10 minutos. Após a
lavagem das células epiteliais, foi verificada ausência de leveduras associadas às CEB,
antes de proceder aos testes de adesão.
Preparo do inóculo
Os isolados de Candida spp., em fase de crescimento exponencial, foram
inoculados em salina 0,85% esterilizada e a densidade óptica da suspensão ajustada para
1.5 a 520 nm (LYON e RESENDE, 2006). Essas suspensões foram tratadas pela IFD,
utilizando TBO a 25 µM e 15 minutos de irradiação pelo LED (densidade de energia de
180 J/cm2), como anteriormente descrito.
Um mililitro da suspensão de células leveduriformes tratadas (inclusive os
controles do inóculo sem tratamento, irradiado pela luz na ausência do
fotossensibilizador e inóculo exposto ao TBO na ausência da irradiação de luz) foi
adicionado a tubos de ensaio contendo 4 mL de Caldo Sabouraud Dextrose, resultando
em inóculo final de 106 a 107 células/ mL. Em outros tubos, 500 µL desta suspensão
foram adicionados a 500 µL da suspensão de CEB e incubadas a 37°C por uma hora. As
36
suspensões leveduras/ CEB foram filtradas em filtros de policarbonato de 12 µm e
lavadas duas vezes com 50 mL de solução salina 0,85% esterilizada para remover as
células fúngicas que não foram aderidas às CEB. Então, os filtros foram apertados
contra lâminas de vidro, para permitir a aderência das células epiteliais às mesmas. As
lâminas foram secadas ao ar, fixadas na chama do bico de Bunsen e coradas pelo
método de Gram. Cinqüenta CEB foram observadas em cada lâmina e o número de
células leveduriformes aderidas foi quantificado através de microscopia óptica a um
aumento de 400x. Todos os testes foram repetidos por três vezes para obter
d) Avaliação de maior inativação, in vitro, de Candida spp., após consecutivas

aplicações da IFD
Para avaliar a obtenção de maior redução da viabilidade das células de Candida
spp. com outras aplicações de IFD, uma amostra de Candida tropicalis resistente ao
fluconazol (CG09) foi submetida a duas sessões de IFD. Para isso, um inóculo de
células leveduriformes foi preparado, aliquotado em tubos e submetido aos tratamentos
propostos, utilizando TBO a 25 µM e irradiação com LED por 15 minutos (densidade
de energia de 180 J/cm2), conforme metodologia descrita. Uma segunda suspensão de
células foi preparada a partir das colônias viáveis que cresceram nas placas de Petri
correspondentes ao grupo 4 (triplicata do primeiro experimento), aliquotada em tubos
numerados de 1 a 4 e submetida a uma segunda sessão de IFD. Após o tratamento, as
suspensões foram semeadas em placas de Petri contendo ASD e incubadas por 48 horas
a 35ºC, quando foi realizada contagem de colônias viáveis.
e) Determinação da susceptibilidade de 12 isolados de Candida spp. ao fluconazol

A susceptibilidade ao fluconazol dos 12 isolados de Candida spp. foi
determinada através do método de microdiluição do CLSI (CLSI, 2002), e seu
comportamento frente ao azólico foi analisado e comparado àquele obtido a partir dos
experimentos de IFD.
37
III. 4 – Sporothrix spp.
Avaliação da susceptibilidade, in vitro, de diferentes isolados de Sporothrix spp. à

IFD, nas fases leveduriforme e miceliana
Microrganismos
Doze isolados de Sporothrix spp. foram utilizados: 2 amostras de referência
(ATCC 201679 e ATCC 201681), 4 isolados humanos, 6 isolados animais (gato, cão e
cavalo), gentilmente cedidos pela Drª. Lidiane Meire Kohler (Laboratório de Micologia,
Departamento de Microbiologia, ICB/ UFMG) (Tabela 23 no Anexo 1). Para os testes
com a forma miceliana, 3 amostras de Sporothrix spp. foram utilizadas (experimento
piloto).
Preparo do inóculo
Fase leveduriforme
Os isolados de Sporothrix spp. foram subcultivados em ágar infusão cérebro-
coração (BHI) suplementado com 0,5% de glicose e incubados a 35oC por 5 dias (fase
de crescimento exponencial na forma leveduriforme). Uma massa de células foi
recolhida assepticamente com alça esterilizada e ressuspensa em tubo de ensaio
contendo 5 mL de solução salina 0,85%, esterilizada. Após a homogeneização em
vórtex, a transmitância da suspensão foi ajustada para 60%, correspondente a um
inóculo final de 1 – 5 x 106 células/ mL (KOHLER et al., 2008).
Fase miceliana
As amostras de Sporothrix spp. foram cultivadas em tubos contendo ágar batata
suplementado com glicose, incubadas a 28°C por sete dias. A estes tubos foram
acrescentados cinco mililitros de salina 0,85% esterilizada e realizada a raspagem das
colônias, com auxílio de uma alça de platina. A suspensão de conídios e hifas foi
transferida para tubos esterilizados. Após a sedimentação das partículas mais pesadas (3
a 5 minutos), o sobrenadante foi transferido para tubo esterilizado e a transmitância da
suspensão ajustada para 80 a 82%, correspondendo a 2 – 2,5 x 106 células/ mL
(KOHLER, 2008).
A susceptibilidade à IFD dos isolados de Sporothrix spp. foi determinada tanto
para a forma leveduriforme (12 isolados) quanto para a miceliana (3 isolados),
conforme metodologia estabelecida, utilizando TBO a 100 µg/ mL e irradiação com
LED, emitindo a 630 nm, por 3 minutos (densidade de energia de 36 J/ cm2). As
38
suspensões tratadas foram semeadas em placas de Petri contendo ágar BHI
suplementado com 5% de glicose e incubadas a 35ºC por 5 dias, quando foi realizada a
contagem das colônias viáveis.
III. 5 – Malassezia furfur
Avaliação da susceptibilidade, in vitro, à IFD do isolado clínico humano de

Malassezia furfur HF02
Microrganismo
O isolado clínico de Malassezia furfur testado (HF 02) foi gentilmente cedido
pelo Prof. Dr. Eduardo Robson Duarte (Setor de Zootecnia, Núcleo de Ciências
Agrárias da UFMG, NCA/ UFMG, Campus Montes Claros).
Preparo do inóculo
A amostra de Malassezia furfur foi subcultivada em ágar Dixon e incubada a
o
32 C por 5 dias (fase de crescimento exponencial). Uma massa de células foi recolhida
assepticamente com alça esterilizada e ressuspensa em tubo de ensaio contendo 5 mL de
solução salina 0,85% esterilizada. Após a homogeneização em vórtex, a absorbância da
suspensão foi ajustada para 1,0 a 660 nm, correspondente a um inóculo final de 1 – 5 x
107 células/ mL (DUARTE e HAMDAN, 2006).
A susceptibilidade à IFD do isolado de Malassezia furfur foi determinada,
conforme metodologia estabelecida, utilizando os fotossensibilizadores azul de orto-
toluidina (TBO), solução alcoólica de TBO e azul de Tripan (AT) a 100 µg/ mL, e
irradiação com LED, emitindo a 630 nm, por 3 minutos (densidade de energia de 36 J/
cm2).
III. 6 – Análises estatísticas

Os resultados obtidos foram analisados por meio de métodos não-paramétricos,
devido às características das variáveis (CIM, CFM, UFC/ mL, número de leveduras
aderidas a CEB), que não são números fracionados ou não apresentam distribuição
normal (distribuição Gaussiana). Análise estatística foi realizada para os experimentos
com Cryptococcus gattii, Candida spp. e Sporothrix spp. (na fase leveduriforme).
Para os experimentos com IFD, os testes de Friedman e Wilcoxon foram
utilizados para comparar os resultados obtidos a partir dos experimentos com IFD,
39
comparando os quatro grupos de cada experimento entre si e aos pares, respectivamente.
Mann-Whitney foi utilizado para comparar os dados da susceptibilidade à IFD de
isolados clínicos e ambientais de C. gattii e entre os resultados obtidos para os isolados
de C. gattii e Candida spp..
Para os experimentos de susceptibilidade de C. gattii frente a terbinafina a
drogas antifúngicas (CIMs e CFMs), o teste de Mann-Whitney foi utilizado para
comparar entre os resultados obtidos para os isolados clínicos e ambientais. Para todos
os testes estatísticos, foi utilizado um valor de p=0,01, que corresponde à confiabilidade
de 99% dos dados, exceto para o teste de Mann-Whitney (p=0,05) (SAMPAIO, 2002).
40
IV – Resultados e Discussão
41
IV. 1 – Estabelecimento de protocolo experimental, in vitro, para testes de inibição
fotodinâmica (IFD) em fungos
IV. 1. a – Padronização, preparo e tratamento do inóculo
Os resultados mostraram que não houve diferença significativa entre o número
de células viáveis, presentes nos controles de Cryptococcus gattii ATCC 24065, sem
tratamento, da irradiação do LED, sem TBO (Grupos 1 e 2). TBO sem a irradiação da
luz causou pequena redução do crescimento do isolado leveduriforme (redução de Log10
0,41). Redução expressiva do número de células viáveis (redução de Log10 1,81)
ocorreu após exposição da amostra C. gattii ATCC 24065 à IFD (Grupo 4) (Figura 5).
6.5
6.0
5.5
Log10 UFC/ mL
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4
Figura 5: Efeito da inativação fotodinâmica (IFD) na redução do número de células viáveis (Log 10 UFC/
mL) de C. gattii ATCC 24065, utilizando azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µg/ mL e irradiação pelo
diodo de emissão de luz (LED) a 630 nm, por 3 minutos. Controles experimentais: sem tratamento
(grupo 1), irradiação, por 3 minutos, pelo LED emitindo a 630 nm, sem fotossensibilizador (grupo 2),
TBO a 100 µg/ mL, sem a luz (grupo 3). Irradiação pelo LED, por 3 minutos, com TBO a 100 µg/ mL
(grupo 4).
A padronização da metodologia para os experimentos com inibição fotodinâmica

(IFD) consiste em controlar as condições experimentais e minimizar incertezas durantes
os testes. Fatores como a irradiação da luz emitida pelo equipamento testado (potência
do aparelho, localização do feixe de luz durante a irradiação), os fotossensibilizadores
(volumes das suspensões tratadas, concentração e fotossensibilização do corante
utilizado), ausência de incidência de luz externa devem ser considerados. Os testes
devem ser realizados de modo que um tratamento não interfira no outro. A maioria dos
artigos utiliza placas de poliestireno (48 a 96 pocinhos) ou placas de Petri, irradiadas
pelo fundo ou por meio de fibras ópticas (BLISS et al., 2004; DEMIDOVA e
HAMBLIN, 2005; FUCHS et al., 2007; JACKSON et al., 1999; KAMP et al., 2005;
42
LAMBRECHTS et al., 2005; PELOI et al., 2008), porém o uso de tubos tem sido
descrito em estudos que mostraram os efeitos tóxicos em experimentos, in vitro, com
IFD (FRIEDBERG et al., 2001; MONFRECOLA et al.,2004). A dificuldade de evitar a
irradiação incorreta ou incompleta de luz em vários pocinhos ou nas placas de Petri,
devido à proximidade entre os mesmos ou ao espalhamento do inóculo, levou à opção
pelo estabelecimento de uma metodologia que utilizasse tubos de vidro. Com esses
tubos, um inóculo de volume definido, porém maior, irradiado por período de tempo
definido (controle de incidência do feixe de luz) na ausência ou presença do
fotossensibilizador (volume e concentrações definidos) foi testado. Os resultados
mostraram que um tratamento não interferiu no outro e a metodologia estabelecida foi
eficiente para exibir os efeitos fototóxicos da IFD em Cryptococcus gattii ATCC 24065
(redução de Log10 1,81 do número de células viáveis). No entanto, as condições
experimentais dos testes in vitro, por exemplo, o volume e a homogeneidade da
suspensão, interferem no efeito do fototratamento e diferem das condições encontradas
in vivo. Quanto maior o volume, maior a dificuldade de penetração da luz, e em uma
suspensão heterogênea, apenas algumas células poderão ser sensibilizadas, resultando
em morte de pequena quantidade de microrganismo e interpretação errônea dos
resultados. Diferentes fotossensibilizadores e fontes de luz foram testados, bem como
otimizadas as concentrações e os tempos de irradiação, para obter maior redução da
viabilidade celular.
IV. 1. b – Seleção das fontes de luz e dos fotossensibilizadores para os experimentos

de fotoinibição
As seleções do fotossensibilizador e da fonte de luz adequados foram realizadas
para Cryptococcus neoformans, C. gattii, Candida albicans, C. parapsilosis, C.
tropicalis e C. krusei, de acordo com a metodologia acima descrita. O
fotossensibilizador e a fonte de luz que produziram maior redução da viabilidade celular
foram utilizados em outros testes.
a) Inibição fotodinâmica de um isolado de Cryptococcus gattii (ATCC 24065),

utilizando diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 470 nm e os fotossensibilizadores
azul de orto-toluidina (TBO), Ponceau (P), verde de malaquita (VM), a 100 µg/ mL e
eritrosina (E), a 2 mg/ mL.
43
Exames microscópicos mostraram que os fotossensibilizadores testados
associaram-se às células de C. gattii ATCC 24065, após 5 minutos de incubação, sob
proteção de luz externa (Figuras 6 a 8), pois as células fúngicas apresentaram-se coradas
por estas substâncias.
A B
Figura 6: Cryptococcus gattii ATCC 24065 não associado (A) e associado (B) ao azul de orto-toluidina
(TBO) a 100 µg/ mL.
Figura 7: Cryptococcus gattii ATCC 24065 associado ao verde de malaquita (VM) a 100 µg/ mL.
44
A B
Figura 8: Cryptococcus gattii ATCC 24065 associado ao Ponceau (P) a 100 µg/ mL (A) e à eritrosina (E)
a 2 mg/ mL (B).
Os resultados mostraram que não houve diferença significativa entre o número

de células viáveis, presentes nos controles da levedura, sem tratamento, da irradiação do
LED, sem os fotossensibilizadores, e dos fotossensibilizadores, sem a irradiação da luz.
Desse modo, a luz emitida a 470 nm ou os fotossensibilizadores, isoladamente, não
causaram toxicidade às células de C. gattii (Tabela 1 e figura 9, A – F). VM e P não
foram eficientes, durante a IFD, (Tabela 1 e figura 9, I e J) por não inibirem o
crescimento das células da levedura testada. A redução do número de células viáveis
ocorreu após exposição da amostra ATCC 24065 à IFD, utilizando o TBO (redução de
Log10 2,5) e a E (redução de Log10 2,09) (Tabela 1 e figura 9, G e H) irradiados pelo
LED emitindo a 470 nm, quando comparados ao controle sem tratamento. O TBO e a E
apresentaram resultados mais interessantes, com pequena vantagem para o TBO. Esses
corantes foram selecionados para outros experimentos preliminares de IFD (Tabela 1).
45
Tabela 1: Efeito da inativação fotodinâmica (IFD) na redução do número de células viáveis (Log 10 UFC/
mL) de Cryptococcus gattii ATCC 24065, utilizando irradiação por diodo de emissão de luz (LED)
emitindo a 470 nm e variados fotossensibilizadores [azul de orto-toluidina (TBO), eritrosina (E), verde de
malaquita (VM) e Ponceau (P)]
Tratamentos Média do número de células Faixa de valores

viáveis (Log10 UFC/ mL) (Log10 número de células viáveis/ mL)
A 6,40 6,25 – 6,52
B 6,20 5,78 – 6,52
C 6,41 6,32 – 6,48
D 6,21 6,07 – 6,28
E 6,01 5,60 – 6,20
F 6,39 6,32 – 6,50
G 3,90 0 – 5,30
H 4,31 0 – 5,85
I 6,12 6,07 – 6,18
J 6,43 6,23 – 6,52
Controles experimentais: sem tratamento (A), irradiação, por 3 minutos, por diodo de emissão de luz
(LED) emitindo a 470 nm, sem fotossensibilizadores (B), azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µg/ mL,
sem a luz (C), eritrosina (E) a 2 mg/ mL, sem a luz (D), verde de malaquita (VM) a 100 µg/ mL, sem a
luz (E), Ponceau (P) a 100 µg/ mL, sem a luz (F). Irradiação pelo LED, por 3 minutos, com TBO (G),
irradiação pelo LED, por 3 minutos, com E (H), irradiação pelo LED, por 3 minutos, com VM (I), e
irradiação pelo LED, por 3 minutos, com P (J).
6.5
6.0
5.5
Log 10 UFC/ mL
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
A B C D E F G H I J
Figura 9: Efeito da inativação fotodinâmica (IFD) na redução do número de células viáveis (Log 10 UFC/
mL) de Cryptococcus gattii ATCC 24065, utilizando irradiação por diodo de emissão de luz (LED)
emitindo a 470 nm e variados fotossensibilizadores [azul de orto-toluidina (TBO), eritrosina (E), verde de
malaquita (VM) e Ponceau (P)]. Controles experimentais: sem tratamento (A), irradiação, por 3 minutos,
por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 470 nm, sem fotossensibilizadores (B), TBO a 100 µg/
mL, sem a luz (C), E a 2 mg/ mL, sem a luz (D), VM a 100 µg/ mL, sem a luz (E), P a 100 µg/ mL, sem a
luz (F). Irradiação pelo LED, por 3 minutos, com TBO (G), irradiação pelo LED, por 3 minutos, com E
(H), irradiação pelo LED, por 3 minutos, com VM (I), e irradiação pelo LED, por 3 minutos, com P (J).
46
b) Inibição fotodinâmica de um isolado de Cryptococcus gattii (ATCC 24065),
utilizando diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm e os fotossensibilizadores
azul de orto-toluidina (TBO), eritrosina (E), Ponceau (P), verde de malaquita (VM) e
azul de Tripan (AT).
Os dados obtidos não indicaram diferença expressiva entre os controles da
levedura, sem tratamento, da irradiação do LED, sem os fotossensibilizadores, e dos
fotossensibilizadores, sem a irradiação da luz. Desse modo, a luz ou os
fotossensibilizadores, isoladamente, não causaram toxicidade às células de C. gattii,
exceto TBO e VM que mostraram pequena toxicidade (Tabela 2 e figura 10, A – F). E,
P e AT não foram eficientes durante a IFD, (Tabela 2 e figura 10, I, J e L) por não
inibirem o crescimento das células da levedura testada. Apesar da redução expressiva
apresentada com a irradiação da E pelo o LED emitindo a 470 nm (LED azul), esse
corante não mostrou resultado satisfatório quando irradiado pelo LED emitindo a 630
nm (LED vermelho). A redução do número de células viáveis ocorreu após exposição
da amostra ATCC 24065 à IFD, utilizando o TBO (redução de Log10 1,94) e o VM
(redução de Log10 0,8), irradiados pelo LED emitindo a 630 nm (Tabela 2 e figura 10, H
e K). O TBO foi o fotossensibilizador mais eficiente e selecionado para outros
experimentos com IFD (Tabela 2).
47
Tabela 2: Efeito da inativação fotodinâmica (IFD) na redução do número de células viáveis (Log 10
UFC/ mL) de Cryptococcus gattii ATCC 24065, utilizando irradiação por diodo de emissão de luz (LED)
emitindo a 630 nm e variados fotossensibilizadores [azul de orto-toluidina (TBO), eritrosina (E), Ponceau
(P), verde de malaquita (VM) e azul de tripan (AT)].
Tratamentos Média do número de células Faixa de valores

viáveis (Log10 UFC/ mL) (Log10 número de células viáveis/ mL)
A 6,24 6,02 – 6,46
B 6,34 6,13 – 6,55
C 5,81 5,70 – 5,93
D 6,38 6,35 – 6,42
E 6,25 6,21 – 6,29
F 5,50 5,31 – 5,69
G 6,14 6,10 – 6,19
H 4,30 4,00 – 4,60
I 6,45 6,38 – 6,52
J 6,38 6,29 – 6,48
K 5,44 5,38 – 5,51
L 6,52 6,48 – 6,56
Controles experimentais: sem tratamento (A), irradiação, por 3 minutos, por diodo de emissão de luz
(LED) emitindo a 630 nm, sem fotossensibilizadores (B), azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µg/ mL,
sem a luz (C), eritrosina (E) a 2 mg/ mL, sem a luz (D), Ponceau (P) a 100 µg/ mL, sem a luz (E), verde
de malaquita (VM) a 100 µg/ mL, sem a luz (F), e azul de tripan (AP) a 100 µg/ mL, sem a luz (G).
Irradiação pelo LED, por 3 minutos, com TBO (H), irradiação pelo LED, por 3 minutos, com E (I),
irradiação pelo LED, por 3 minutos, com P (J), irradiação pelo LED, por 3 minutos, com VM (K), e
irradiação pelo LED, por 3 minutos, com AT (L).
7
6
Log10 UFC/ mL
5
4
3
2
1
0
A B C D E F G H I J K L
Figura 10: Efeito da inativação fotodinâmica (IFD) na redução do número de células viáveis (Log 10
UFC/ mL) de Cryptococcus gattii ATCC 24065, utilizando irradiação por diodo de emissão de luz (LED)
emitindo a 630 nm e variados fotossensibilizadores [azul de orto-toluidina (TBO), eritrosina (E), Ponceau
(P), verde de malaquita (VM) e azul de tripan (AT)]. Controles experimentais: sem tratamento (A),
irradiação, por 3 minutos, por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm, sem
fotossensibilizadores (B), azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µg/ mL, sem a luz (C), eritrosina (E) a 2
mg/ mL, sem a luz (D), Ponceau (P) a 100 µg/ mL, sem a luz (E), verde de malaquita (VM) a 100 µg/
mL, sem a luz (F), e azul de tripan (AP) a 100 µg/ mL, sem a luz (G). Irradiação pelo LED, por 3
minutos, com TBO (H), irradiação pelo LED, por 3 minutos, com E (I), irradiação pelo LED, por 3
minutos, com P (J), irradiação pelo LED, por 3 minutos, com VM (K), e irradiação pelo LED, por 3
minutos, com AT (L).
48
c) Inibição fotodinâmica de C. gattii (ATCC 24065, ATCC 32608) e C. neoformans
(ATCC 24067A, ATCC 24607D2 e ATCC 28957), utilizando LED emitindo a 630 nm e o
fotossensibilizador azul de metileno (AM) a 100, 50 e 25 µg/ mL.
Os resultados mostraram que a luz ou o corante, isoladamente, não apresentam
atividade inibitória sobre o crescimento das células de C. gattii e C. neoformans, apesar
do azul de metileno a 50 e 25 µg/ mL apresentar pequena toxicidade, em ausência de
luz, para o isolado de C. neoformans ATCC 24067A (Tabela 3, D e E). Apesar do azul
de metileno apresentar maior atividade fototóxica a 25 µg/ mL, não produziu efeitos
fototóxicos eficientes (redução média de Log10 0,79) ao ser irradiado pelo LED, por 3
minutos (densidade de energia de 36 J/ cm2) (Tabela 3). A sensibilidade ao
fototratamento foi similar entre os isolados das duas espécies de Cryptococcus.
Tabela 3: Efeito da inativação fotodinâmica (média de Log 10 UFC/ mL) em Cryptococcus gattii (ATCC
24065, ATCC 32608) e C. neoformans (ATCC 24067A, ATCC 24607D2 e ATCC 28957), utilizando
azul de metileno a 100, 50 e 25 µg/ mL e diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm por 3
minutos.
Tratamentos ATCC ATCC ATCC ATCC ATCC
24065 32608 24067A 24067D2 28957
A 6,03 6,01 6,21 6,39 6,31
B 6,04 6,11 6,15 6,40 6,31
C 6,05 6,09 6,03 6,25 6,19
D 6,11 6,02 5,69 6,24 6,18
E 6,20 6,02 5,94 6,11 6,04
F 6,06 5,91 5,82 6,11 5,79
G 5,87 5,79 5,83 6,17 5,94
H 5,31 5,69 5,27 5,28 5,45
Controles experimentais: sem tratamento (A), irradiação por 3 minutos por diodo de emissão de luz
(LED) emitindo a 630 nm, sem fotossensibilizadores (B), azul de metileno (AM) a 100 µg/ mL, sem a luz
(C), AM a 50 µg/ mL, sem a luz (D), AM a 25 µg/ mL, sem a luz (E). Irradiação pelo LED, por 3
minutos, com AM a 100 µg/ mL (F), com AM a 50 µg/ mL (G), e com AM a 25 µg/ mL (H).
d) Inibição fotodinâmica em isolados de Candida albicans, C. parapsilosis e C. krusei

utilizando diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm e o fotossensibilizador
azul de metileno (AM), a 100, 50 e 25 µg/ mL.
Os resultados mostraram que a luz ou o corante, isoladamente, não apresentam
atividade inibitória sobre o crescimento das células de Candida parapsilosis (ATCC
22019), C. albicans (ATCC 18804) e C. krusei (ATCC 6258) (Tabela 4). O azul de
metileno não produziu efeitos fototóxicos eficientes ao ser irradiado pelo LED, por 3
minutos (densidade de energia de 36 J/ cm2), nas três concentrações testadas (Tabela 4).
49
Tabela 4: Efeito fototóxico da inibição fotodinâmica (valores médios de Log10 UFC/ mL) em isolados de
Candida parapsilosis ATCC 22019, C. albicans ATCC 18804 e C. krusei ATCC 6258, utilizando diodo
de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm por 3 minutos (densidade de energia de 36 J/ cm2) e azul de
metileno (AM) a 100, 50 e 25 µg/ mL
Tratamentos ATCC 22019 ATCC 18804 ATCC 6258

Grupo 1 6,58 6,65 6,59
Grupo 2 6,63 6,59 6,60
Grupo 3 6,55 6,52 6,50
Grupo 4 6,54 6,43 6,46
Grupo 5 6,56 6,38 6,27
Grupo 6 6,47 6,30 6,46
Grupo 7 6,41 6,30 6,31
Grupo 8 6,03 6,05 6,39
Controles experimentais: sem tratamento (Grupo 1), irradiação, por 3 minutos, por diodo de emissão de
luz (LED) emitindo a 630 nm, sem fotossensibilizadores (Grupo 2), azul de metileno (AM) a 100
(Grupo 3), 50 (Grupo 4) e 25 µg/ mL (Grupo 5), sem a luz. Irradiação pelo LED, por 3 minutos, com
AM a 100 (Grupo 6), 50 (Grupo 7) e 25 µg/ mL (Grupo 8).
e) Inibição fotodinâmica em isolados de Candida spp. e Cryptococcus spp., utilizando

diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm e o fotossensibilizador azul de orto-
toluidina (TBO), a 100, 50 e 25 µg/ mL.
Exames microscópicos demonstraram que TBO associou-se às células de C.
albicans ATCC 18804, após 5 minutos de incubação, sob proteção de luz externa
(Figura 11 A e B), pois as células fúngicas apresentaram-se coradas em azul, conforme
mostrado para C. gattii ATCC 24065 (Figura 6, página 44). Os dados obtidos
mostraram que a luz emitida pelo LED ou o TBO, isoladamente, não apresentaram
efeitos fototóxicos em C. albicans ATCC 18804, C. krusei ATCC 6258, C. gattii ATCC
32608 e C. neoformans ATCC 24067 D2 (Tabela 5). O crescimento dos isolados ATCC
18804, ATCC 6258 e ATCC 32608 foi reduzido após aplicação luz emitida pelo LED,
após exposição ao TBO a 50 e 25 µg/ mL (IFD), sendo a maior inibição do crescimento
produzida pela concentração de 25 µg/ mL. O isolado ATCC 24067 D2 apresentou
expressiva sensibilidade aos efeitos fototóxicos do TBO a 25 µg/ mL, irradiado pelo
LED a 630 nm (redução de Log10 4,10 UFC/ mL). Portanto, o TBO foi selecionado para
outros experimentos de IFD.
50
Figura 11: Candida albicans ATCC 18804 não associada (A) e associada (B) ao azul de orto-toluidina
(TBO) a 100 µg/ mL.
Candida albicans ATCC 18804, C. krusei ATCC 6258, Cryptococcus gattii ATCC 32608 e C.
neoformans ATCC 24067D2, utilizando diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm por 3 minutos
(densidade de energia de 36 J/ cm2) e azul de orto-toluidina (TBO) a 100, 50 e 25 µg/ mL
Tratamentos ATCC 18804 ATCC 6258 ATCC 32068 ATCC 24067D2

Grupo 1 6,33 6,32 6,16 6,45
Grupo 2 6,31 6,35 6,15 6,49
Grupo 3 6,13 6,30 6,20 6,52
Grupo 4 6,43 6,15 6,43 6,21
Grupo 5 6,33 6,06 6,11 6,21
Grupo 6 6,25 6,16 6,03 5,78
Grupo 7 5,64 5,95 5,46 4,82
Grupo 8 5,08 5,40 5,10 2,35
luz (LED) emitindo a 630 nm, sem fotossensibilizadores (Grupo 2), azul de orto-toluidina (TBO) a 100
(Grupo 3), 50 (Grupo 4) e 25 µg/ mL (Grupo 5) sem a luz. Irradiação pelo LED, por 3 minutos, com
TBO a 100 (Grupo 6), 50 (Grupo 7) e 25 µg/ mL (Grupo 8).
No presente trabalho, o TBO foi o fotossensibilizador capaz de produzir maiores

efeitos fototóxicos em células leveduriformes, independentemente do gênero e do
isolado fúngico testado nestes experimentos preliminares (Candida spp. ou
Cryptococcus spp.), pois esse corante apresenta pequena molécula e uma carga
molecular intrínseca catiônica.
51
f) Inibição fotodinâmica de C. gattii ATCC 24065, utilizando Laser Unit Kondortech
emitindo a 660 nm e verde malaquita (VM) a 100 µg/ mL
O Laser de baixa intensidade Unit Kondortech, ao estimular o
fotossensibilizador verde de malaquita a 100 µg/ mL, não apresentou atividade
fototóxica, por não produzir redução do número de colônias viáveis do isolado ATTC
24065 de C. gattii (Figura 12). Este Laser não foi testado com outros corantes, por
apresentar menor potência (30 mW) que os outros equipamentos utilizados (100 mW),
pois quanto menor for a energia luminosa liberada pelo equipamento, menores serão os
efeitos fototóxicos. Resultado semelhante foi mostrado no estudo de Sousa (2007).
Figura 12: Avaliação do efeito fototóxico em Cryptococcus gattii ATCC 24065 do Laser de baixa
intensidade Unit Kondortech emitindo a 660 nm, em presença do fotossensibilizador verde de malaquita
(VM) a 100 µg/ mL. Controles experimentais: sem tratamento (A), irradiação, por 3 minutos, por Laser
de baixa intensidade Unit Kondortech emitindo a 660 nm, sem fotossensibilizadores (B), VM a 100 µg/
mL, sem a luz (C). Irradiação, por 3 minutos, por Laser de baixa intensidade Unit Kondortech emitindo a
660 nm, em presença do fotossensibilizador verde de malaquita (VM) a 100 µg/ mL (D).
g) Inibição fotodinâmica de C. gattii ATCC 32608 e C. neoformans ATCC 24607 D2,

utilizando Laser Quantum emitindo a 660 nm e azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µg/
mL
Os dados obtidos mostraram que a luz ou o corante, isoladamente, não
apresentam atividade inibitória sobre o crescimento das células de C. gattii e C.
neoformans. Apesar do azul de orto-toluidina apresentar atividade fototóxica a 25 µg/
52
mL, quando do uso da luz Laser, os efeitos fototóxicos não foram tão eficientes
(redução média de Log10 0,79) (Tabela 6) quanto aos efeitos produzidos após o TBO ser
irradiado por 3 minutos (densidade de energia de 36 J/ cm2) pelo LED emitindo a 470
nm (redução de Log10 2,5) (Figura 9 e tabela 1, página 46) ou pelo LED emitindo a
630nm (redução de Log10 1,94) (Figura 10 e tabela 2, página 48).
Tabela 6: Efeito da inativação fotodinâmica (média de Log 10 UFC/ mL) em Cryptococcus gattii ATCC
32608 e C. neoformans ATCC 24607 D2, utilizando azul de orto-toluidina a 25 µg/ mL e irradiação por 3
minutos com Laser de baixa intensidade Quantum emitindo a 660 nm.
Tratamentos ATCC 32608 ATCC 24067 D2

(média e faixa de valores) (média e faixa de valores)
A 6,41 6,39 – 6,44 6,35 6,27 – 6,43
B 6,22 6,22 – 6,23 6,36 6,33 – 6,40
C 6,31 6,30 – 6,32 6,29 6,26 – 6,33
D 5,94 5,87 – 6,01 5,82 5,79 – 5,85
Controles experimentais: sem tratamento (A), irradiação por 3 minutos por Laser de baixa intensidade
Quantum emitindo a 660 nm, sem fotossensibilizadores (B), azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µg/ mL,
sem a luz (C). Irradiação pelo Laser de baixa intensidade Quantum, por 3 minutos, com TBO a 25 µg/ mL
(D).
h) Inibição fotodinâmica em isolados de Candida spp. utilizando Laser de baixa

intensidade Quantum emitindo a 660 nm, por 3 minutos, azul de metileno (AM) e azul
de orto-toluidina (TBO) a 25 µg/ mL.
Redução significativa não foi observada quando do uso do Laser de baixa
intensidade Quantum emitindo a 660 nm, após 3 minutos de irradiação do azul de
metileno (AM) e do azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µg/ mL (Tabela 7). TBO não foi
eficiente, em presença da luz Laser, ao contrário dos resultados obtidos após irradiação
deste fotossensibilizador com LED emitindo a 630 nm (Tabela 5, página 51).
53
Candida parapsilosis ATCC 22019, C. albicans ATCC 18804, C. krusei ATCC 6258 e C. tropicalis
ATCC 750, utilizando Laser de baixa intensidade Quantum emitindo a 660 nm por 3 minutos, azul de
metileno (AM) e azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µg/ mL
Tratamentos ATCC 22019 ATCC 18804 ATCC 6258 ATCC 750

Grupo 1 6,43 6,47 6,38 6,37
Grupo 2 6,23 6,26 6,30 6,33
Grupo 3 6,39 6,28 6,29 6,22
Grupo 4 6,45 6,22 6,28 6,24
Grupo 5 6,26 6,23 6,28 6,28
Grupo 6 6,22 6,11 6,30 6,21
Controles experimentais: sem tratamento (Grupo 1), irradiação, por 3 minutos, por Laser de baixa
intensidade Quantum emitindo a 660 nm, sem fotossensibilizadores (Grupo 2), azul de metileno (AM)
(Grupo 3) e orto-toluidina (TBO) (Grupo 4) a 25 µg/ mL, sem a luz. Irradiação pelo Laser de baixa
intensidade Quantum, por 3 minutos, com AM (Grupo 5) e TBO (Grupo 6) a 25 µg/ mL.
i) Inibição fotodinâmica de de Candida krusei ATCC 6258, utilizando diodo de emissão

de luz (LED) emitindo a 470 nm, UVC emitindo a 254 nm, UVA emitindo a 366 nm por
3 minutos, e fulerol a 6 mg/ mL, como fotossensibilizador.
A energia luminosa emitida pelos equipamentos testados, ou o fulerol,
isoladamente, não foram suficientes para produzir inibição do crescimento da levedura.
Redução significativa (média Log10 1,88) foi observada, apenas após o uso da UVA
associada ao fulerol (Tabela 8). Este fotossensibilizador apresentou-se mais eficiente,
nas condições experimentais descritas, que AM e TBO a 25 µg/ mL irradiados pelo
LED emitindo a 630 nm (Tabelas 4 e 5, páginas 50 e 51).
Tabela 8: Efeito fototóxico da inibição fotodinâmica (valores médios de Log10 UFC/ mL) de Candida
krusei ATCC 6258, utilizando lâmpada UV emitindo a 366 nm (UVA), 254 nm (UVC), diodo de emissão
de luz (LED) emitindo a 470 nm por 3 minutos e fulerol a 6 mg/ mL
Tratamentos Média de Log10 UFC/ mL Faixa de valores (Log10 UFC/ mL)

Grupo 1 6,48 6,41 – 6,55
Grupo 2 6,51 6,49 – 6,53
Grupo 3 6,46 6,40 – 6,52
Grupo 4 6,23 6,22 – 6,25
Grupo 5 6,43 6,43 – 6,44
Grupo 6 6,44 6,36 – 6,53
Grupo 7 6,10 6,06 – 6,14
Grupo 8 4,60 4,30 – 4,90
luz (LED) emitindo a 470 nm (Grupo 2), UVC emitindo a 254 nm (Grupo 3) e UVA emitindo a 366 nm
(Grupo 4), sem fotossensibilizadores, fulerol (F) a 6 mg/ mL (Grupo 5), sem a luz. Irradiação pelo LED
(Grupo 6), UVC (Grupo 7) e UVA (Grupo 8), por 3minutos, com F.
54
j) Inibição fotodinâmica de Candida parapsilosis ATCC 22019 utilizando diodo de
emissão de luz (LED) emitindo a 470 nm, UVA emitindo a 366 nm, por 3 minutos,
fulerol a 60 µg/ mL, C60 PVP a 28 µg/ mL e C60 Nanopartículas a 9,4 µg/ mL, como
fotossensibilizadores.
Nenhuma redução eficiente do crescimento de células viáveis de C. parapsilosis
foi evidenciada, quando do uso dos derivados fulerenos (Fulerol, C60PVP e C60Nano),
isoladamente ou após irradiação com os equipamentos testados (UVA e LED emitindo a
470 nm) (Tabela 9).
Tabela 9: Efeito fototóxico da inibição fotodinâmica (valores médios de Log10 UFC/ mL) de Candida
parapsilosis ATCC 22019, utilizando lâmpada UV emitindo a 300 nm (UVA), diodo de emissão de luz
(LED) emitindo a 470 nm por 3 minutos e como fotossensibilizadores, fulerol a 60 µg/ mL, C60 PVP a 28
µg/ mL e C60 Nano a 9,4 µg/ mL

Grupo 1 6,58 6,54 – 6,62
Grupo 2 6,62 6,59 – 6,66
Grupo 3 6,67 6,60 – 6,78
Grupo 4 6,57 6,53 – 6,61
Grupo 5 6,52 6,46 – 6,56
Grupo 6 6,53 6,48 – 6,57
Grupo 7 6,63 6,58 – 6,66
Grupo 8 6,52 6,50 – 6,53
Grupo 9 6,49 6,38 – 6,58
Grupo 10 6,64 6,57 – 6,70
Grupo 11 6,57 6,56 – 6,58
Grupo 12 6,48 6,47 – 6,49
Controles experimentais: sem tratamento (Grupo 1), irradiação, por 3 minutos, por UVA (Grupo 2)
diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 470 nm (Grupo 3), sem fotossensibilizadores, fulerol (F) a 60
µg/ mL (Grupo 4), C60PVP a 28 µg/ mL (Grupo 5) eC60Nano a 9,4 µg/ mL (Grupo 6), sem a luz.
Irradiação do F por UVA (Grupo 7), irradiação do C60PVP por UVA (Grupo 8) irradiação do C60Nano
por UVA (Grupo 9). Irradiação do F pelo LED (Grupo 10), irradiação do C60PVP pelo LED (Grupo
11), e irradiação do C60Nano pelo LED (Grupo 12).
IV. 1. c – Avaliação da ressonância entre os fotossensibilizadores azul de metileno

(AM) e azul de orto-toluidina (TBO) e o Diodo de Emissão de Luz (LED), por meio
de espectroscopia
Ambos fotossensibilizadores AM e TBO apresentaram maiores bandas de
absorção a 100 µg/ mL, que foram se reduzindo à medida que suas concentrações foram
diminuindo. Maior quantidade de luz pode ser absorvida com maior número de
moléculas do corante (maior concentração), até que o sistema esteja saturado. AM a 25
µg/ mL apresentou maior absorção a, aproximadamente, 650 nm com um pico a 600
nm. TBO a 25 µg/ mL apresentou maior absorção de 600 a 640 nm, aproximadamente.
55
Portanto, TBO apresentou-se mais ressonante com o comprimento de onda emitido pelo
diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm (± 10), que o AM (Figura 13).
3,0 AM100
AM50
2,5 AM25
Absorção óptica (arb. units)

AOT100
AOT25
2,0
AOT50
1,5
1,0
0,5
0,0
-0,5
300 400 500 600 700 800 900
Comprimento de onda (nm)
Figura 13: Espectroscopia do azul de metileno (AM) e do azul de orto-toluidina (TBO) a 100, 50 e 25µg/
mL.
Os dados, obtidos a partir das espectroscopias presentes no figura 14, mostram

que a suspensão da levedura, isoladamente, não é capaz de absorver energia luminosa
na faixa de 300 a 900 nm. A associação desta suspensão de células ao AM ou ao TBO
possibilita a absorção da luz nas mesmas bandas de absorção apresentada pelos
fotossensibilizadores. O TBO foi selecionado para outros experimentos de IFD, por
apresentar-se mais ressonante com LED a 630 nm. Amorim (2007) obteve o mesmo
resultado entre o TBO e o LED.
56
3,0
Ca
2,5 AOT
AM
Absorção óptica (arb. units)

Ca AOT
2,0 Ca AM
1,5
1,0
0,5
0,0
300 400 500 600 700 800 900
Comprimento de onda (nm)
Figura 14: Espectroscopia do azul de metileno (AM) e do azul de orto-toluidina (TBO) e um isolado de
Candida albicans (ATCC 18804) isolados e em associação.
IV. 1. d – Avaliação da produção de calor durante IFD, utilizando tempo de

irradiação por 15 minutos
Durante a irradiação por 15 minutos com LED, a temperatura no interior do tubo
de vidro variou por 6ºC (∆t = 6ºC) com uma temperatura mínima (Tmin.) de 29.6
(±0.1)°C e temperatura máxima (Tmax.) de 35.6 (±0.1)°C. A temperatura estabilizou-se
após 1 minuto de irradiação pela luz emitida por LED (Figura 15).
40
35
Temperature (ºC)
30
25
Temperatura (°C)
20
15
10
5
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tempo de irradiação (minutos)
Irradiation time (minutes)
Figura 15: Representação gráfica da variação da temperatura durante inativação fotodinâmica (IFD) por
15 minutos com diodo de emissão de luz (LED) associado ao azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µM.
Temperatura inicial (baseline): 29.6 °C; Temperatura máxima: 35.6 ºC; ∆t(Tmáx. – Tmin.) : 6 °C.
57
Os resultados dos experimentos preliminares de IFD com isolados de
Cryptococcus spp. mostraram que a luz emitida pelos equipamentos testados ou os
fotossensibilizadores, isoladamente, não causaram toxicidade às células fíngicas, pois
para que ocorra a inibição fotodinâmica, é necessário que ambos estejam presentes, luz
e fotossensibilizador. Dentre os fotossensibilizadores testados, o azul de orto-toluidina
(TBO) a 100 µg/ L foi o corante que produziu maior redução do número de células
leveduriformes viáveis, quando irradiado, por 3 minutos, pelo LED emitindo a 470 nm
(luz azul) (redução de Log10 2,5) e 630nm (luz vermelha) (redução de Log10 1,94),
apesar de ter apresentado pequena toxicidade, quando incubado em ausência de luz.
Esta toxicidade ocorreu, possivelmente, em virtude da alta concentração do
fotossensibilizador, pois os corantes fenotiazinos eram utilizados como agentes
antimicrobianos, antes do advento da penicilina (WAINWRIGHT, 2003). Esse corante
apresentou efeito fototóxico importante, também, a 25 µg/ mL, principalmente em C.
neoformans ATCC 24067 D2 (redução de Log10 4,10 UFC/ mL). No entanto, para C.
gattii ATCC 32608, a redução do crescimento celular com TBO a 25 µg/ mL irradiado
com LED emitindo a 360 nm (redução de Log10 1,06) foi menor que a inibição obtida
com o referido corante a 100 µg/ L, após irradiação com LED vermelho (630 nm)
(redução de Log10 1,94) . A uma menor concentração, as moléculas do
fotossensibilizador estão mais dispersas, podem se associar, mais facilmente, às células-
alvo e serem sensibilizadas pela luz, resultando em maior efeito fototóxico. Jakson et al.
(1999) observaram que concentrações mais elevadas de TBO podem produzir menores
efeitos fototerapêuticos, pois os sítios de ligação do fotossensibilizador às células
tornam-se saturados. Assim, não terão eficiência, os fótons formados a partir da
excitação das moléculas do corante que não se ligaram à célula-alvo. Portanto, esse
corante foi selecionado para outros testes (Tabelas 1, 2 e 5, páginas 46, 48 e 51,
respectivamente). A E apresentou redução expressiva de células fúngicas viáveis após
irradiação com o LED emitindo a 470 nm (LED azul), e o mesmo não ocorreu após esse
corante ser irradiado pelo LED emitindo a 630 nm. Diferença de efeito fototóxico
ocorreu, possivelmente, devido à maior ressonância entre a E e o comprimento de onda
da luz emitida pelo LED a 470 nm do que a luz emitida pelo LED a 630 nm. Ao
contrário da E, os experimentos com VM resultaram em redução do número de células
fúngicas, quando irradiado pelo LED 630 nm, e isso, possivelmente, deve-se a sua
maior ressonância com esta fonte de luz. Os outros corantes testados não foram
eficientes, possivelmente, pela produção de oxigênio singleto em quantidade
58
insuficiente (pequeno rendimento quântico) ou pequena absorção da luz emitida pelas
fontes de luz testadas, assim, outros testes devem ser realizados para elucidar esta
questão. Dentre as variadas fontes de luz testadas, os LEDs 470 nm e 630 nm, ao
irradiar o TBO, produziram efeitos fototóxicos importantes em Cryptococcus gattii.
Apesar do LED a 470 nm apresentar maior inibição do crescimento celular da levedura,
que o LED a 630 nm, este foi selecionado para uso nos próximos experimentos de IFD
em C. gattii, uma vez que a luz emitida a 630 nm apresenta maior penetração tecidual
que a luz emitida a 470 nm.
Os dados obtidos a partir dos experimentos pilotos com Candida spp. levaram à
seleção do azul de orto-toluidina a 25 µg/ mL e do LED emitindo a 630 nm, dentre os
variados fotossensibilizadores e fontes de luz testados, para outros experimentos de IFD
em Candida spp., por produzirem maior redução do número de células leveduriformes
viáveis. A IFD apresentou efeitos fototóxicos eficientes em C. krusei, ao utilizar o
fulerol irradiado pela UVA, pois o corante apresenta maior ressonância à luz emitida
neste comprimento de onda que aos outros comprimentos de onda utilizados (LED a
470 nm e UVC). O mesmo resultado não foi obtido para os experimentos com UVA,
LED a 470 nm, F, PVP e Nano, pois devem ser adaptados os volumes das suspensões e
as concentrações do fotossensibilizadores. Apesar de a UVA apresentar atividade
superficial e produzir efeitos como a peroxidação lipídica da membrana celular e a
formação de radicais e dímeros no DNA, conforme observado por Chicaro et al. (2004),
os testes com essa fonte de luz devem ser otimizados e experimentados para utilização
no controle de população microbiana.
A associação do fotossensibilizador à superfície da célula alvo é pré-requisito
para um processo fotodinâmico eficiente (MONFRECOLA et al., 2004;
LAMBRECHTS et al., 2005; JORI e RONCUCCI, 2006; SMIJS et al. 2007a e 2008).
No presente estudo, uma incubação por 5 minutos, na ausência de luz, foi suficiente
para a associação do TBO às superfícies das células fúngicas. De acordo com Jackson et
al. (1999), um tempo de incubação maior que 10 minutos não causa alterações na
viabilidade de células de Candida albicans. TBO foi mais eficiente em mediar a morte
celular quando permaneceu em suspensão (STRAKHOVSKAYA et al., 2002;
LAMBRECHTS et al., 2005; JORI e RONCUCCI, 2006).
TBO liga-se preferencialmente à membrana citoplasmática, como outros
corantes (ácido 5-aminolevulínico e o TriP[4]). Durante a incubação no escuro, o
corante carregado positivamente liga-se à superfície celular carregada negativamente,
59
permanecendo externo à célula. Após a irradiação, alterações nas propriedades físicas
da membrana são induzidas pela depleção do ergosterol e acúmulo de seus derivados
polares, permitindo a penetração de pequenas quantidades do fotossensibilizador, que
levam à inativação das enzimas intracelulares e interrupção do metabolismo
(BÖCKING et al., 2000; MONFRECOLA et al., 2004; JORI e RONCUCCI, 2006). A
função de barreira da membrana citoplasmática é perdida e sua capacidade de
transportar carboidratos, aminoácidos e fosfato é inibida (PAARDEKOOPER et al.,
1992 e 1993).
Smijs et al. (2007a) mostraram que o fotossensibilizador Sylsens B localiza-se
associado à parede celular de Trichophyton rubrum, antes da irradiação da luz ou
quando não houve sucesso da IFD, e após a irradiação da luz, com eficiência da IFD, o
corante penetra no interior celular. O mesmo grupo de pesquisadores (2007b) relatou
que conforme os diferentes meios, nos quais os fotossensibilizadores estão
solubilizados, o pH ótimo para cada fotossensibilizador e a presença de outras
moléculas catiônicas interferem na efetividade da IFD. Smijs et al. (2008) observararam
que a IFD (Sylsens B e luz policromática com filtros, com emissão de luz a 580 – 870
nm, intensidade de 30mW/ cm2) é mais efetiva nas fases iniciais da germinação dos
microconídeos de Trichophyton rubrum que após a formação de hifas.
Testes com devivados fulerenos em IFD têm sido descritos em bactérias
(Mycobacterim tuberculosis e Escherichia coli). Os derivados fulerenos catiônicos
apresentaram eficiência em reduzir a viabilidade dessas células procariotas, em
concentrações pequenas (5 µg/ mL), ao contrário dos derivados aniônicos (BOSI et al.,
2000; MASHINO et al., 1999). No presente estudo, a redução da viabilidade celular foi
obtida em C. krusei com o fulerol a 6 mg/ mL, e a redução da concentração desse
fotossensibilizador (60 µg/ mL) não ocasionou inibição do crescimento de C.
parapsilosis. Portanto, estas condições experimentais devem ser otimizadas e os novos
testes realizados, para obter maior redução do número de células viáveis e padronização
dos resultados.
O uso do Laser de baixa intensidade e LEDs, associados a
fotossesibilizadores adequados (azul de metileno, azul de toluidina, Green 2W, dentre
outros), tem mostrado eficiência em IFD (FRIEDBERG et al., 2001; JACKSON et al.,
1999; WILSON E MIA,1993). No presente estudo, os efeitos fototóxicos eficazes,
obtidos com LED, não foram visualizados, durante os experimentos com Laser. Essa
diferença de atividade entre os equipamentos pode ter ocorrido devido ao volume
60
utilizado (1 mL). A luz coerente emitida pelo Laser sensibiliza a área inferior do tubo,
podendo não irradiar a porção superior da suspensão, portanto, moléculas do
fotossensibilizador associadas às células fúngicas não serão excitadas e não ocorrerá a
fotossensibilização letal. A luz emitida pelo LED é divergente, capaz de irradiar todo o
volume da suspensão de células, resultando em redução mais significativa do número de
células viáveis. Apesar de pertencerem à mesma classe de fotossensibilizadores
fenotiazínicos, houve diferença de atividade fotóxica quando do uso do TBO e do AM,
após irradiação pelo LED a 630 nm. A ausência de efeitos fototóxicos eficientes nos
experimentos que utilizaram o AM pode ser explicada, em parte, pela menor
ressonância entre este corante e o LED a 630 nm.
Wilson e Mia (1993) obtiveram 100% de inibição do crescimento, in vitro, de C.
albicans após associar o azul de metileno ao Laser AsGa (660nm e potência de 11 mW)
e o azul de orto-toluidina ao Laser hélio neônio (HeNe) (632,8 nm e potência de 7,3
mW). Jackson et al. (1999) visualizaram redução, in vitro, do crescimento de Log10 3 e
Log10 5,2 após fotoinibição das formas leveduriformes e de pseudomicélios de C.
albicans, resistente ao fluconazol, utilizando o laser HeNe (potência de 35 mW, doses
variáveis de 4,2 a 42 J e emissão a 638,8 nm) e como fotossensibilizador o TBO. Os
estudos, in vitro, de Friedberg et al. (2001) obtiveram 100% de redução do número de
células de Aspergillus fumigatus ao testarem o fotossensibilizador Green 2W e luz laser
(emissão a 630 nm). Teichert et al. (2002) obtiveram redução de Log10 2,74, após
irradiação com laser diodo (664 nm) e azul de metileno (concentrações de 250 – 500 µg/
mL). Marinho (2006) observou 77,17% de inibição, in vitro, de Candida spp., após
irradiação do azul de metileno (100 µg/ mL) com laser diodo (InGaAlP, emissão a 685
nm, potência de 35 mW, densidades de energia de 100 a 450 J/ cm2) (maior
porcentagem de morte foi obtida com menor densidade de energia). Amorim (2007)
obteve redução, in vitro, de 68,1% e 56% da viabilidade celular de T. rubrum, após
irradiação por três minutos do azul de orto-toluidina (25 µg/ mL), com LED (potência
100 mW, emissão a 630 nm, intensidade de 0,5 w/ cm2 e densidade de energia de 90 J/
cm2) e laser diodo (AsGaAl, potência 100 mW, emissão a 660 nm, intensidade de 2 w/
cm2 e densidade de energia de 360 J/ cm2), respectivamente. Esse autor demonstrou que
o LED apresentou uma ação fototóxica mais eficiente que o Laser, pois, a emissão de
uma luz divergente possibilitou irradiação de um volume maior do inóculo de células de
T. rubrum. O uso da luz com banda de emissão estreita (por exemplo, Laser e LED)
permite a irradiação da luz com um comprimento de onda que pode selecionar
61
especificamente um fotossensibilizador. Os LEDs são compactos e requerem pequena
energia para produzir o comprimento de onda desejado, e têm sido desenvolvidos com
vários comprimentos de onda, incluindo 630, 670 e 690 nm (MANG, 2004).
Zeina et al. (2001) e Bliss et al. (2004) inibiram, respectivamente, 100% e 90%,
do crescimento de C. albicans, utilizando 10 – 60 minutos de irradiação com luz
policromática associada a diferentes fotossensibilizadores (azul de metileno e Fotofrin®,
respectivamente). Os LEDs geram menor calor que as lâmpadas halógenas (TESHIMA
et al., 2003).
IV. 2 – Cryptococcus gattii
Avaliação, in vitro, da susceptibilidade de diferentes isolados de Cryptococcus gattii

aos efeitos fototóxicos da IFD e frente à terbinafina
a) Avaliação, in vitro, da susceptibilidade de 40 isolados de Cryptococcus gattii aos
efeitos fototóxicos da IFD
Após análise estatística dos resultados, considerando 1% de probabilidade de
erro (p=0.01), foi verificada redução significante do número de células viáveis no grupo
3 (redução de Log10 0,42 UFC/ mL) (p <0.01), demonstrando que o TBO a 100 µg/ mL
apresentou toxicidade às células de C. gattii, sem exposição à luz (diferença estatística
entre os grupos 1 e 3) (Tabela 10, figuras 16 e 17 e tabela 24, no Anexo 2). A mesma
diferença não foi observada entre os grupos 1 e 2 (p >0.01), demonstrando que a luz
irradiada na ausência do fotossensibilizador não apresentou efeito inibitório para as
células fúngicas testadas. Significante diferença estatística (p <0.01) foi observada entre
os grupos 1 e 4, demonstrando que o TBO, após exposição à luz emitida pelo LED,
inibiu, significativamente, o crescimento de células viáveis de C. gattii (redução de
Log10 1,56 UFC/ mL). Diferença quanto à susceptibilidade à IFD de isolados clínicos e
ambientais foi observada (p<0.05) (Tabela 11 e tabela 24, no Anexo 2). Os isolados
ambientais de C. gattii apresentaram menor sensibilidade à IFD que os isolados
clínicos, possivelmente, devido à adaptação do isolado fúngico de origem ambiental à
radiação solar presente em seu hábitat (eucaliptos), ao contrário das condições
encontradas no hospedeiro.
62
Tabela 10: Efeito fototóxico da luz produzida pelo diodo de emissão de luz (LED) a 630 nm associada ao
azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µg/ mL em diferentes isolados de Cryptococcus gattii (Log10 UFC/
mL)
Tratamentos Mediana Valores Mínimos Valores Máximos

Grupo 1 6,43a 5,63 6,50
a
Grupo 2 6,26 5,75 6,44
Grupo 3 6,01b 6,01 6,58
Grupo 4 4,87c 0 5,57
a, b, c – valores significativamente diferentes, considerando intervalo de confiança de 99% (p=0.01)

Controles experimentais: sem tratamento (grupo 1), irradiação, por 3 minutos, por diodo de emissão de
luz (LED) emitindo a 630 nm, sem fotossensibilizadores (grupo 2), azul de orto-toluidina (TBO) a 100
µg/ mL, sem a luz (grupo 3). IFD: irradiação pelo LED, por 3 minutos, com TBO a 100 µg/ mL (grupo
4).
6.5 a a
b
6.0
5.5
Log10 UFC/ mL
5.0
4.5 c
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
a, b, c – valores significativamente diferentes, considerando intervalo de confiança de 99% (p=0.01)

Figura 16: Efeito fototóxico da luz emitida por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm
associada ao azul de orto-toluidina a 100 µg/ mL em diferentes isolados de Cryptococcus gattii. Controles
experimentais: sem tratamento (grupo 1), irradiação, por 3 minutos, por diodo de emissão de luz (LED)
emitindo a 630 nm, sem fotossensibilizadores (grupo 2), azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µg/ mL, sem
a luz (grupo 3). IFD: irradiação pelo LED, por 3 minutos, com TBO a 100 µg/ mL (grupo 4).
63
Figura 17: Avaliação do efeito fototóxico em Cryptococcus gattii ATCC 24065 do LED emitindo a 630
nm, em presença do fotossensibilizador azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µg/ mL. Controles
experimentais: sem tratamento (A), irradiação, por 3 minutos, por LED, sem fotossensibilizadores (B),
TBO a 100 µg/ mL, sem a luz (C). IFD: irradiação, por 3 minutos, por LED emitindo a 630 nm, em
presença do fotossensibilizador azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µg/ mL (D).
Tabela 11: Diferença de sensibilidade entre os isolados clínicos e ambientais de Cryptococcus gattii aos
efeitos fototóxicos da luz emitida por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm associada ao
azul de orto-toluidina a 100 µg/ mL (Log10 UFC/ mL).
Origem Mediana Valores Mínimos Valores Máximos

Clínica 5,08a 0 5,30
Ambiental 5,54b 0 5,57
a, b – valores significativamente diferentes, considerando intervalo de confiança de 95% (p=0.05)
b) Avaliação da redução da viabilidade celular de Cryptococcus gattii, após

Os dados mostraram que o número de células viáveis foi significativamente
reduzido (redução de Log10 4,58 UFC/ mL), após uma segunda aplicação de IFD,
mesmo que a redução com uma aplicação tenha sido pequena (redução de Log10 1,08
UFC/ mL). Isso, possivelmente, ocorreu porque algumas células que não foram
sensibilidazadas na primeira aplicação foram envolvidas na segunda sessão, ou
possivelmente, porque as células, que sobreviveram à primeira sessão, foram
danificadas e tornaram-se mais sensíveis a uma nova aplicação do fototratamento. Este
fato foi verificado com o crescimento das colônias nos controles da segunda aplicação,
o qual foi menor que o crescimento celular presente nos controles da primeira aplicação.
O TBO a 100 µg/ mL apresentou pequena toxicidade, em ausência de luz, para as
células da amostra testada (Tabela 12).
64
Tabela 12: Sensibilidade de um isolado de Cryptococcus gattii LMM 989 aos efeitos fototóxicos da luz
emitida por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm associada ao azul de orto-toluidina (TBO)
a 100 µg/ mL, após aplicações consecutivas de IFD (Log10 UFC/ mL).
Aplicações Tratamentos Media Log10 UFC/ mL

Grupo 1 6,16
Grupo 2 6,25
Primeira
Grupo 3 5,98
Grupo 4 5,08
Grupo 1 5,91
Grupo 2 5,65
Segunda
Grupo 3 5,27
Grupo 4 1,33
Controles experimentais: sem tratamento (grupo 1), irradiação, por 3 minutos, por diodo de emissão de
luz (LED) emitindo a 630 nm, sem fotossensibilizadores (grupo 2), azul de orto-toluidina (TBO) a 100
µg/ mL, sem a luz (grupo 3). Irradiação pelo LED, por 3 minutos, com TBO a 100 µg/ mL (grupo 4).
c) Otimização das condições experimentais para maior redução da viabilidade celular

do isolado Cryptococcus gattii ATCC 32608.
Os resultados dos testes demonstraram redução expressiva do crescimento de C.
gattii ATCC 32068 utilizando diferentes tempos de irradiação do LED emitindo a 630
nm (3, 6, 9, 12 e 15 minutos) (densidade de energia de 36 - 180 J/cm2) (média da
redução de Log10 0,24, Log10 1,20, Log10 6,09, Log10 3,32 e Log10 4,76,
respectivamente). Os dados obtidos por meio dos testes da variação das concentrações
do azul de orto-toluidina [100 µM (30,583 µg/ mL), 50 µM (15,291 µg/ mL) e 25 µM
(7,645 µg/ mL)] mostraram redução expressiva (Log10 3,39, Log10 6,16 e Log10 6,16,
respectivamente) na viabilidade das células leveduriformes. Portanto, esses dados
levaram à seleção do TBO a 25 µM e 9 minutos de irradiação com LED (densidade de
energia de 108 J/cm2) (Figura 18 A e B). Quanto menor a concentração, maiores os
efeitos fototerapêuticos e quanto maior o tempo de aplicação, maior a dose de energia
disponível para sensibilizar as células associadas ao fotossensibilizador e maior será a
redução da viabilidade celular. Jackson et al. (1999) observaram, in vitro, também esta
dependência entre o tempo de irradiação e a redução de células viáveis. Porém, no
presente estudo, 9 minutos e não 15 minutos foi o tempo que produziu maior morte
celular.
65
7
6
5
Log10 (media)
4
3
2
1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Grupos
Figura 18 A: Redução de UFC/ mL (Log10) de Cryptococcus gattii ATCC 32608 após inibição
fotodinâmica, utilizando azul de toluidina (TBO) a 100 µM e diodo de emissão de luz (LED) emitindo a
630 nm, com tempos de irradiação de 3 (36J/cm2), 6 (72J/cm2), 9 (108 J/cm2), 12 (144 J/cm2) e 15
minutos (180 J/cm2). Controles: levedura sem tratamento (Grupo 1), irradiação por diodo de emissão de
luz (LED) emitindo a 630 nm, por 3 (Grupo 2), 6 (Grupo 3), 9 (Grupo 4), 12 (Grupo 5) e 15 minutos
(Grupo 6), sem fotossensibilizador, e atividade do azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µM (Grupo 7), em
ausência de luz. Irradiação do TBO por LED (IFD), por 3 (Grupo 8), 6 (Grupo 9), 9 (Grupo 10), 12
(Grupo 11) e 15 minutos (Grupo 12).
7
6
Log10 (media)
5
4
3
2
1
0
A B C D E F G H
Grupos
Figura 18 B: Redução de UFC/ mL (Log10) após inibição fotodinâmica em Cryptococcus gattii ATCC
32608, utilizando azul de toluidina (TBO) a 100, 50 e 25 µM e LED emitindo a 630 nm, com irradiação
de 9 minutos (108 J/cm2). Controles: levedura sem tratamento, (A), Irradiação por diodo de emissão de
luz (LED) emitindo a 630 nm, por 9 minutos (B), atividade do azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µM
(C), 50 µM (D) e 25 µM (E), em ausência de luz. Irradiação do TBO a 100 µM (IFD) (F), IFD do TBO a
50 µM (G) e IFD do TBO a 25 µM (H), utilizando o LED, por 9 minutos.
d) Avaliação da susceptibilidade de 21 isolados de Cryptococcus gattii à IFD, após

otimizadas as condições experimentais
A otimização das condições experimentais para experimentos com C. gattii
(irradiação por 9 minutos com LED emitindo a 630 nm e TBO a 25 µM) foram
66
aplicadas para os 21 isolados de C. gattii. Com um intervalo de 99% de confiança
(p=0,01), não foi observada diferença estatística (p>0,01) entre os grupos controles 1, 2
e 3 (levedura sem tratamento, irradiação pelo LED na ausência de fotossensibilizador e
TBO a 25 µM sem exposição à luz, respectivamente) (Tabela 13, Figura 19 e tabela 25
no Anexo 2). Portanto, as atividades da irradiação do LED ou TBO a 25 µM,
isoladamente, não reduziram a viabilidade de células de C. gattii (Tabela 13, figura 19 e
tabela 25 no Anexo 2). As células tratadas com IFD (grupo 4), porém, exibiram
diferença estatística significante (p< 0.01), quando comparadas aos controles
experimentais. O tratamento com IFD produziu redução média de 70% do crescimento
celular (média de Log10 4.32). Todos os isolados apresentaram baixos valores de CIMs
para a anfotericina B (0,015 – 1 µg/ mL) e a terbinafina (0,062 – 2 µg/ mL). Elevados
valores de CIMs foram obtidos para fluconazol (4 – 64 µg/ mL) e itraconazol (0,015 –
2 µg/ mL) (SOARES, 2004). Trinta e oito por cento dos isolados (8/ 21) tiveram o seu
crescimento celular inibido em 100% após a IFD, sendo que, desses isolados, três
apresentaram elevados valores de CIMs para o fluconazol (16 – 64 µg/ mL) e para o
itraconazol (0,25 – 2 µg/ mL) (Anexo 2). O isolado clínico CGP-BH (Anexo 3)
apresentou elevados valores de CIMs in vitro para o itraconazol (≥2 µg/ mL), a
terbinafina (≥4 µg/ mL) e para o fluconazol (≥64 µg/ mL), sendo que, in vivo, a terapia
com este fármaco não funcionou. Contudo, este isolado foi inibido em 100% pelo
fototratamento.
Tabela 13: Efeito fototóxico da luz emitida por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm por 9
minutos, associada ao azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µM em 21 isolados de Cryptococcus gattii
(Log10 UFC/ mL).
Tratamentos Mediana Valores Mínimos Valores Máximos

Grupo 1 6,11a 6,03 6,45
Grupo 2 6,14a 6,06 6,41
Grupo 3 6,06a 6,01 6,39
b
Grupo 4 4,87 0 4,31
a – valores equivalentes; b – valores significativamente diferentes, considerando intervalo de confiança de

99% (p=0.01). Controles experimentais: sem tratamento (grupo 1), irradiação por, 9 minutos, por diodo
de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm, sem fotossensibilizadores (grupo 2), azul de orto-toluidina
(TBO) a 25 µM, sem a luz (grupo 3). IFD: irradiação do TBO a 25 µM pelo LED, por 9 minutos (grupo
4).
67
a a a
6.5
6.0
5.5
UFC/ mL (log10)
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0 b
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Figura 19: Efeitos fototóxicos (Log10 UFC/ mL) da inibição fotodinâmica (IFD), utilizando azul de orto-
toluidina (TBO) a 25 µM e Diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm, com irradiação de 9
minutos (108 J/cm2) em 21 amostras de Cryptococcus gattii. Controles: levedura sem tratamento, (Grupo
1), irradiação por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm, por 9 minutos, (Grupo 2), atividade
do azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µM (Grupo 3). IFD: irradiação do TBO a 25 µM pelo LED, por 9
minutos (Grupo 4). a – valores equivalentes; b – valores significativamente diferentes, considerando
intervalo de confiança de 99% (p=0.01).
e) Determinação da susceptibilidade, in vitro, dos isolados de Cryptococcus gattii

frente à terbinafina
Os resultados dos testes de microdiluição, in vitro, mostraram que todas as
amostras fúngicas testadas apresentaram baixos valores de CIMs (0,062 a 2 µg/ mL)
para a terbinafina, exceto o isolado CGP-BH, que apresentou CIM ≥4µg/ mL (valor
considerado de “resistência”, segundo GUPTA e KOHLI., 2003). Em todas as amostras
testadas, os valores da CFM foram maiores que aqueles obtidos para CIM,
demonstrando que a terbinafina apresentou atividade fungistática frente aos isolados de
C. gattii. Ao analisar o quociente obtido entre os valores da CFM e da CIM, 12% das
amostras testadas foram consideradas tolerantes à atividade da terbinafina (quociente
≥32). A análise estatística dos dados não mostrou diferença estatística entre a
susceptibilidade dos isolados clínicos e ambientais frente a esta alilamina (p> 0,05)
(Tabela 14 e tabela 26, no Anexo 2). O isolado CGP foi tratado com IFD, conforme
metodologia descrita, e foi inibido em 100%, independentemente da concentração
utilizada para o azul de toluidina (100 µg/ mL ou 25 µM), apesar de apresentar elevadas
CIM para terbinafina (≥4µg/ mL), 5-flucitosina (≥ 64 µg/ mL), fluconazol (≥ 64 µg/
mL) e itraconazol (≥ 2 µg/ mL) nos testes de susceptibilidade a drogas antifúngicas. As
amostras de C. neoformans, C. parapsilosis ATCC 22019 e C. krusei ATCC 6258,
utilizadas para comparações, apresentaram o mesmo comportamento das amostras de C.
gattii.
68
A terbinafina tem apresentado pequeno efeito inibitório no crescimento de
leveduras (Candida spp. e Cryptococcus gattii) (FIGUEIREDO et al., 2007; MORAES,
2008). Ryder et al. (1998) obtiveram valores de CIMs entre 0,062 e 0,25 µg/ mL para
isolados de Cryptococcus spp. No presente estudo, as amostras de C. gattii testadas
apresentaram baixos valores de CIMs (0,062 a 2 µg/ mL) para a terbinafina, exceto o
isolado CGP-BH (CIM ≥4µg/ mL). Apesar dos baixos valores de CIMs, 12% das
amostras testadas foram consideradas tolerantes à atividade da terbinafina (quociente
CFM/ CIM ≥32) e a droga apresentou atividade fungistática frente aos isolados de C.
gattii.
Tabela 14: Faixa de variação dos valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM), concentrações
fungicidas mínimas (CFM) e quociente CFM/ CIM de isolados clínicos e ambientais de Crytococcus
gattii frente à terbinafina
Origem das amostras CIM1 CFM2 CFM/ CIM

a a
Clínica 0,125 – 4 µg/ mL 1 – 8 µg/ mL 2 – 64a
Ambiental 0,062 – 1 µg/ mLa 2 – 8 µg/ mLa 4 – 64a
1
CIM: Concentração Inibitória Mínima; 2CFM: Concentração Fungicida mínima; a – valores equivalentes
Pequena diferença quanto à susceptibilidade de isolados clínicos e ambientais

tem sido demonstrada para testes com drogas antifúngicas, nos quais valores mais
baixos de CIMs têm sido demonstrados para os isolados ambientais que para os
clínicos, que estão mais expostos ao fármacos nas condições encontradas no hospedeiro
(ALVES et al., 2001; MORAES, 2000; SOARES, 2004). No presente trabalho, não foi
verificada diferença significativa (p> 0,05) entre a sensibilidade de isolados clínicos e
ambientais frente à terbinafina, no entanto, os isolados clínicos tiveram maior
susceptibilidade à IFD que os isolados ambientais (p< 0,05).
O primeiro relato de IFD em Cryptococcus spp. foi descrito por Fuchs et al.
(2007). Esses autores verificaram, in vitro, a redução de células viáveis de Log10 2 de
um isolado de Cryptococcus neoformans à IFD utilizando o fotossensibilizador PEI-ce6
(clorina) irradiado por laser diodo com fibra óptica (intensidade de 100 mW/ cm2 e
densidade de energia variável de 0 – 16 J/ cm2), e, após cinco aplicações, uma maior
penetração do fotossensibilizador proporcionou maior taxa de morte celular e não foi
detectada resistência. No presente trabalho, não foi verificada a presença de isolados
resistentes à IFD, mesmo após aplicações consecutivas. Resistência ao fototratamento
não tem sido descrita, até o momento, uma vez que a morte da célula microbiana é um
69
processo que ocorre em vários sítios celulares, e não tem efeito mutagêncico (JORI e
RONCUCCI, 2006).
IV. 3- Candida spp.

Os resultados obtidos a partir da avaliação da susceptibilidade, da alteração dos
padrões de adesão de diferentes espécies de Candida spp. a células epiteliais bucais
(CEB), in vitro, à IFD, após otimizadas as condições experimentais, descritos nos itens
abaixo relacionados (IV.3. a, b, c, d) eos dados obtidos a partir da avaliação da produção
de calor durante a IFD (item IV. 1. d), foram reunidos e aceitos para na revista Journal
of Photochemistry and Photobiology B: Biology, v. 94, em 2009 (Anexo 4).
a) Otimização das condições experimentais para obter, in vitro, maior redução da

viabilidade celular de Candida albicans ATCC 18804
Os resultados dos testes demonstraram redução expressiva do crescimento da
linhagem de C. albicans ATCC 18804, utilizando diferentes tempos de irradiação do
LED emitindo a 630 nm (3, 6, 9, 12 e 15 minutos) (densidade de energia de 36 - 180
J/cm2) (média da redução de Log10 0,28, Log10 0,83, Log10 1,75, Log10 2,16 e Log10
3,95, respectivamente). Os dados obtidos por meio dos testes da variação das
concentrações do azul de orto-toluidina [100 µM (30,583 µg/ mL), 50 µM (15,291 µg/
mL) e 25 µM (7,645 µg/ mL)] mostraram redução expressiva (Log10 1,46, Log10 2,01 e
Log10 3,47, respectivamente) na viabilidade das células de C. albicans. Portanto, esses
dados levaram à seleção do TBO a 25 µM e 15 minutos de irradiação com LED
(densidade de energia de 180 J/cm2) (Figuras 20 A e B).
70
Figura 20 A: Redução de UFC/ mL (Log10) de Candida albicans ATCC 18804 após inibição
fotodinâmica, utilizando azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µM e diodo de emissão de luz (LED) emitindo
a 630 nm, com tempos de irradiação de 3 (36J/cm2), 6 (72J/cm2), 9 (108 J/cm2), 12 (144 J/cm2) e 15
minutos (180 J/cm2).
7
6
5
Log10 (media) 4
3
2
1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Groups
Grupos
Controles: levedura sem tratamento (Grupo 1), Irradiação por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a
630 nm, por 3 (Grupo 2), 6 (Grupo 3), 9 (Grupo 4), 12 (Grupo 5) e 15 minutos (Grupo 6), sem
fotossensibilizador), e atividade do azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µM (Grupo 7), em ausência de luz.
Irradiação do TBO por LED (IFD), por 3 (Grupo 8), 6 (Grupo 9), 9 (Grupo 10), 12 (Grupo 11) e 15
minutos (Grupo 12).
Figura 20 B: Redução de UFC/ mL (Log10) após inibição fotodinâmica em Candida albicans ATCC
18804, utilizando azul de toluidina (TBO) a 100, 50 e 25 µM e LED emitindo a 630 nm, com irradiação
de 9 minutos (108 J/cm2).
7
6
(media)
5
4
3
10
Log
2
1
0
1 2 3 4 5 6 7 8
Grupos
Groups
Controles: levedura sem tratamento, (Grupo 1), irradiação por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a
630 nm, por 9 minutos (Grupo 2), atividade do azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µM (Grupo 3), 50
µM (Grupo 4) e 25 µM (Grupo 5), em ausência de luz. Irradiação do TBO a 100 µM (IFD) (Grupo 6),
IFD com TBO a 50 µM (Grupo 7) e IFD com TBO a 25 µM (Grupo 8), utilizando o LED, por 9
minutos.
71
b) Avaliação da susceptibilidade, in vitro, de diferentes espécies de Candida spp. à IFD,
após otimizadas as condições experimentais
A otimização das condições experimentais (irradiação por 15 minutos com LED
emitindo a 630 nm e TBO a 25 µM) foi utilizada em sete isolados de C. albicans, três
de C. tropicalis e dois de C. parapsilosis. Com um intervalo de 99% de confiança, as
análises estatísticas não foram significativas (p >0.01) entre os grupos controles 1, 2 e 3
(leveduras sem tratamento, irradiação pelo LED sem TBO e TBO a 25 µM em ausência
de luz, respectivamente). Assim, as atividades da irradiação pelo LED ou TBO,
isoladamente, não produziram redução na viabilidade celular de Candida spp. (Figura
21, tabela 15 e tabela 27 no Anexo 2). As células tratadas com IFD (grupo 4), porém,
mostraram diferença estatística significante (p <0,01), quando comparados aos controles
experimentais. A IFD mostrou uma redução significante (p< 0,01) no crescimento
celular (média de Log10 3,41) (Figura 21, tabela 15 e tabela 27 no Anexo 2). O padrão
de susceptibilidade de Candida spp. à IFD foi similar entre os diferentes isolados
(tabela 27 no Anexo 2).
a a a
6.5
6.0
5.5
UFC/ mL (log10)
5.0
4.5
b
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
toluidina (TBO) a 25 µM e Diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm, com irradiação de 15
minutos (180 J/cm2) em 12 amostras de Candida spp.. Controles: levedura sem tratamento, (Grupo 1),
irradiação por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm, por 15 minutos (Grupo 2), atividade
do azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µM (Grupo 3). IFD: irradiação do TBO a 25 µM pelo LED, por 15
minutos (Grupo 4). a – valores equivalentes; b – valores significativamente diferentes, considerando
intervalo de confiança de 99% (p=0.01).
72
Tabela 15: Valores mínimos, máximos e mediana da redução do número de células viáveis de Candida
sp. (Log10) para cada tratamento.
Tratamentos Mediana Valores mínimos Valores máximos

Grupo 1 6,37a 6,05 6,99
Grupo 2 6,42a 6,16 6,99
Grupo 3 6,37a 6,07 6,97
Grupo 4 3,41b 1,33 4,41
a – valores equivalentes; b – valores significativamente diferentes, considerando intervalo de confiança de
99% (p=0.01). Controles: levedura sem tratamento, (Grupo 1), irradiação por diodo de emissão de luz
(LED) emitindo a 630 nm, por 15 minutos (Grupo 2), atividade do azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µM
(Grupo 3). IFD: irradiação do TBO a 25 µM com LED, por 15 minutos (Grupo 4).
c) Avaliação da alteração dos padrões de adesão de Candida spp. a células epiteliais

bucais (CEB) após IFD
Para a inibição da adesão de Candida spp. às CEB (Figura 22, tabela 16, figura
23 e tabela 28 no Anexo 2), as análises estatísticas não mostraram diferença significante
(p >0.01) entre os grupos controles 1, 2 e 3, que prova que a ação do LED e do TBO
usados individualmente não causa inibição da adesão de Candida spp. às CEB. A
inibição da adesão às CEB no grupo 4 foi em média 55%, embora houvesse substancial
variabilidade entre diferentes isolados (tabela 29, no Anexo 2). É interessante notar que
dois isolados de C. albicans apresentaram uma elevada redução da viabilidade celular
(média de redução de Log10 5,20) e da adesão às CEB (média de redução de 61,5%). Ao
contrário, um isolado de C. albicans e uma de C. parapsilosis mostraram menor
redução na viabilidade celular (média de redução de Log10 2,15) e menor inibição da
adesão às CEB (média de 34,5%) (Tabelas 28 e 29, no Anexo 2).
Tabela 16: Valores mínimos, máximos e mediana da redução do número de Candida spp. aderidas às
células epiteliais bucais (CEB) para cada tratamento.

Grupo 1 82a 36 189
Grupo 2 54,2a 38 237
Grupo 3 61,5a 30 197
Grupo 4 33b 23 133
Controles: levedura sem tratamento, (Grupo 1), irradiação por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a
630 nm, por 15 minutos (Grupo 2), atividade do azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µM (Grupo 3). IFD:
irradiação do TBO a 25 µM com LED, por 15 minutos (Grupo 4).
a – valores equivalentes, considerando p=0.01
b – Valores significantemente diferentes, considerando p=0.01.
73
a
110 a
100 a
número de leveduras
90
80
aderidas
70 b
60
50
40
30
20
10
0
Figura 22: Redução da adesão de 12 amostras de Candida spp. a 50 células epiteliais bucais, após
inibição fotodinâmica, utilizando azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µM e Led emitindo a 630 nm, com
irradiação de 15 minutos (180 J/cm2). Controles: levedura sem tratamento, (Grupo 1), irradiação por
diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm, por 15 minutos (Grupo 2), atividade do azul de orto-
toluidina (TBO) a 25 µM (Grupo 3). IFD: irradiação do TBO a 25 µM com LED, por 15 minutos
(Grupo 4).
Figura 23: Adesão a células epiteliais bucais (CEB) de Candida albicans ATCC 18804, sem tratamento
(A) e, após irradiação com diodo de emissão de luz (LED) por 15 minutos com azul de orto-toluidina
(TBO) a 25 µM (inativação fotodinâmica) (B) (original dimensions: 2038 x 819 pixels).
d) Avaliação da redução da viabilidade celular de Candida tropicalis CG09, após

A partir do experimento acima descrito, o isolado de C. tropicalis CG09
apresentou redução de Log10 1,85 após uma nova sessão de IFD por 5 minutos, redução
de Log10 2,11 após nova sessão de IFD por 10 minutos e Log10 6,11 após nova
aplicação de IFD por 15 minutos, quando comparado ao controle da levedura sem
tratamento (grupo1). A segunda aplicação de IFD de 15 minutos resultou em redução de
100% da viabilidade do isolado CG09.
74
e) Determinação da susceptibilidade de 12 isolados de Candida spp. ao fluconazol
A susceptibilidade dos isolados de Candida spp. ao fluconazol foi realizada
apenas para conhecer o perfil das amostras e contrapor com os resultados obtidos pelo
tratamento com a IFD. Os valores de CIMs variaram 0,5 a 128 µg/ mL. Quatro amostras
apresentaram perfil de resistência ao fluconazol (≥128 µg/ mL) (C. albicans IB05, C.
parapsilosis 200, C. tropicalis CG09 e 750) (Tabela 30, no Anexo 2) e uma aplicação
única de IFD produziu redução do crescimeto celular numa faixa de Log10 2,05 a Log10
4,85, e da adesão às CEB em 60% e 66%.
O desenvolvimento de resistência às drogas antifúngicas convencionais
representa uma importante causa de falha terapêutica. Neste estudo, a IFD mostrou
significante inibição do crescimento (p< 0,01) de isolados com elevados valores de CIM
em Candida spp. e Cryptococcus. Um isolado de C. tropicalis resistente ao fluconazol
foi submetido a novas sessões de IFD com 5, 10 e 15 minutos de irradiação com LED e
100% de inibição da viabilidade celular foi obtida após a segunda aplicação de 15
minutos. Jackson et al. (1999) obtiveram redução de Log10 1,3 na viabilidade celular de
C. albicans resistente ao fluconazol.
Zeina et al. (2001) avaliaram a susceptibilidade, in vitro, de isolados de C.
albicans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermitis, Streptococcus pyogenes,
Corynebacterium minutissium e Propionibacterium acnes à IFD, [azul de metileno (100
µg/ mL) e uma fonte de luz policromática (lâmpada de 250 W e intensidade de 1,6 – 42
mW/ cm2 com filtros, para obter comprimentos de onda entre 400 e 700 nm)] e
observaram que o isolado de C. albicans apresentou uma menor sensibilidade ao
tratamento que as espécies bacterianas testadas, por ser um microrganismo eucariótico.
Strakhovskaya et al. (2002) fotossensibilizaram, in vitro, isolados de diferentes origens
de C. albicans e C. guilliermondii [luz policromática com filtro (intensidade de
500mW/ cm2, comprimento de onda entre 400 – 600 nm e densidades de energia de 4,5
J/cm2 para C. albicans e 3 J/cm2 para C. guilliermondii) e com o fotossensibilizador
fotoditazina (clorina com concentrações de 2 – 20 µM e variados períodos de
incubação)]. Os autores observaram que após 30 segundos de tratamento já houve
inibição do crescimento celular e acima de 10 minutos de exposição, não houve
alteração dos resultados. No presente trabalho, a sensibilidade à IFD foi independente
da origem das amostras, variável entre isolados de C. albicans e similar entre as
espécies testadas. Teichert et al. (2002) testaram, em modelo murino imunossuprimido,
a susceptibilidade de leveduras do gênero Candida à IFD, com azul de metileno
75
(concentrações de 250 – 500 µg/ mL) e Laser diodo (664 nm), e observaram que a
redução da viabilidade das células fúngicas foi dependente da concentração do
fotossensibilizador (maior redução foi obtida com concentrações maiores).
A eficiência da atividade inibitória da IFD no crescimento, na formação de
biofilme e produção de tubo germinativo por C. albicans tem sido mostrada, utilizando
variados fotossensibilizadores (Fotofrin, azul de metileno, azul de toluidina) e fontes
de luz (Laser emitindo a 683 nm, lâmpada de mercúrio, LEDs) (BLISS et al. 2004;
CHABRIER-ROSELLÓ, 2005; DONNELLY et al., 2007; MUNIN et al., 2007; PELOI
et al., 2008). A ausência de diferença significativa quanto à sensibilidade entre as
diferentes espécies de Candida spp. à IFD foi observada por Marinho (2006) e Sousa et
al. (2006), que testaram a atividade in vitro de IFD em C. albicans, C. dubliniensis, C.
krusei e C. tropicalis.
A capacidade de aderência a células hospedeiras e superfícies é considerada pré-
requisito para o sucesso da colonização e posterior infecção de Candida spp. Assim,
tratamentos capazes de inibir a adesão dessas leveduras podem suprimir sua
patogenicidade (ELLEPOLA e SAMARANAYAKE, 1998; LYON e RESENDE,
2006). O presente trabalho mostrou que a IFD inibiu a adesão de Candida spp. a células
epiteliais bucais (média de 55%). Alterações na hidrofobicidade e cargas eletrostáticas
da superfície celular fúngica podem ter ocorrido após o fototratamento, no entanto,
outros testes devem ser realizados para confirmar este fato.
Estudos obtiveram inibição da adesão a células epiteliais humanas por drogas
antifúngicas (fluconazol, nistatina, cetoconazol e 5-flucitosina) e derivados de plantas
(derivados de amirina). O fluconazol pode inibir a adesão dessas leveduras a células
epiteliais bucais com 24.36% - 65.3% de eficiência (ELLEPOLA e
SAMARANAYAKE, 1998; LYON e RESENDE, 2006; JOHANN et al., 2007). De
acordo com Ellepola et al. (1999), a alteração na adesão de Candida spp. pode ocorrer
devido à ação das drogas antifúngicas na membrana citoplasmática. A redução da
adesão das leveduras por meio da IFD, possivelmente, pode ocorrer devido aos danos
produzidos na superfície das células fúngicas.
76
IV.3 - Sporothrix spp.
a) Susceptibilidade de 12 isolados de Sporothrix spp. à IFD (fase leveduriforme)

Com um intervalo de 99% de confiança, as análises estatísticas não mostraram
diferença significativa (p >0.01) entre os grupos controles 1, 2 e 3 (células fúngicas sem
tratamento, irradiação pelo LED sem TBO e TBO a 100 µg/ mL, em ausência de luz,
respectivamente). Assim, as atividades da irradiação pelo LED ou TBO, isoladamente,
não produziram redução na viabilidade celular de Sporothrix spp. (Figura 24 e tabela
18). As células tratadas com IFD (grupo 4), porém, mostraram diferença estatística
significante (p <0.01), quando comparado aos controles experimentais. A IFD mostrou
uma redução mediana de Log10 0,89 no crescimento celular (Figura 24 e tabela 18). O
padrão de susceptibilidade de Sporothrix spp. à IFD foi variável entre os diferentes
isolados (Tabela 31, no Anexo 2).
Tabela 17: Valores mínimos, máximos e mediana da redução do número de células viáveis de Sporothrix
spp. (Log10) (Forma leveduriforme) para cada tratamento.

Grupo 1 6,55 a 5,70 6,73
Grupo 2 6,55a 5,87 6,77
Grupo 3 6.53a 5,89 6,69
Grupo 4 5,69b 0 6,27
Controles: fungo sem tratamento, (Grupo 1), irradiação por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a
630 nm, por 3 minutos (Grupo 2), atividade do azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µg/ mL (Grupo 3).
IFD: irradiação do TBO a 100 µg/ mL com LED, por 3 minutos (Grupo 4).
a – valores equivalentes, considerando p=0.01
b – Valores significantemente diferentes, considerando p=0.01.
77
a a a
6.5
6.0 b
5.5
Log10 UFC/ mL
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
toluidina (TBO) a 100 µg/ mL e Diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm, com irradiação de 3
minutos (36 J/cm2) em 12 amostras de Sporothix spp. (forma leveduriforme). Controles: fungo sem
tratamento, (Grupo 1), irradiação por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm, por 3 minutos
(Grupo 2), atividade do azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µg/ mL (Grupo 3). IFD: irradiação do TBO a
100 µg/ mL com LED, por 3 minutos (Grupo 4).
a – valores equivalentes, considerando p=0.01; b – Valores significantemente diferentes, considerando
p=0.01.
b) Susceptibilidade de 3 isolados Sporothrix spp. à IFD (fase miceliana)

Os resultados demonstraram que os isolados na forma miceliana apresentaram
menor sensibilidade à IFD que suas formas leveduriformes, exceto o isolado G5,
utilizando as mesmas condições experimentais (Tabela 19 e figura 25).
Tabela 18: Efeito fototóxico (média de Log10 UFC/ mL) da inativação fotodinâmica em isolados de
Sporothrix spp. (forma miceliana), utilizando irradiação, por 3 minutos, por diodo de emissão de luz
(LED) emitindo a 630 nm e azul de orto-toluidina a 100 µg/ mL.
Amostras Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4

G13 6,37 6,24 6,35 6,16
G5 6,01 5,91 6,02 5,74
625 6,10 6,21 6,21 5,94
Controles: fungo sem tratamento (Grupo 1), irradiação por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a
78
6.5
6.0
5.5
Log10 UFC/ mL
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Figura 25: Efeito fototóxico (média de Log10 UFC/ mL) da inativação fotodinâmica em isolados de
Sporothrix spp. (forma miceliana), utilizando irradiação, por 3 minutos, por diodo de emissão de luz
(LED) emitindo a 630 nm e azul de orto-toluidina a 100 µg/ mL. Controles: fungo sem tratamento
(Grupo 1), irradiação por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm, por 3 minutos (Grupo 2),
atividade do azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µg/ mL (Grupo 3). IFD: irradiação do TBO a 100 µg/
mL com LED, por 3 minutos (Grupo 4).
IV.4 – Malassezia furfur
Avaliação da susceptibilidade, in vitro, à IFD de um isolado clínico humano de

Malassezia furfur (HF 02)
Os dados obtidos mostraram que a luz ou fotossensibilizadores, isoladamente,
não reduziram a viabilidade da amostra de Malassezia furfur testada, inclusive TBO em
solução alcoólica. Redução de Log10 0,47 foi verificada, após IFD, utilizando TBO a
100 µg/ mL, em solução alcoólica (Tabela 20). A pequena redução apresentada deve-se,
possivelmente, à formação de micelas entre a suspensão da levedura (lipofílica) e as
soluções de fotossensibilizadores.
79
Tabela 19: Efeito fototóxico da inibição fotodinâmica (valores médios de Log10 UFC/ mL) em
Malassezia furfur HF 02, utilizando diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm, por 3 minutos,
(densidade de energia de 36 J/ cm2) e, como fotossensibilizadores, azul de orto-toluidina (TBO) em
solução aquosa, TBO em solução alcoólica e azul de tripan (AT) a 100 µg/ mL

Grupo 1 7,42 7,28 – 7,56
Grupo 2 7,21 7,14 – 7,29
Grupo 3 7,01 6,83 – 7,19
Grupo 4 7,14 7,05 – 7,23
Grupo 5 7,23 7,19 – 7,27
Grupo 6 7,23 7,09 – 7,37
Grupo 7 6,95 6,79 – 7,11
Grupo 8 7,12 7,06 – 7,18
luz (LED) emitindo a 630 nm, sem fotossensibilizadores (Grupo 2), azul de orto-toluidina (TBO) a 100
µg/ mL, em solução aquosa (Grupo 3), TBO a 100 µg/ mL, em solução alcoólica (Grupo 4), azul de
tripan (AT) a 100 µg/ mL, em solução aquosa (Grupo 5), sem a luz. Irradiação, por 3 minutos, pelo LED
com TBO, em solução aquosa (Grupo 6), com TBO, em solução alcoólica (Grupo 7) e com AT, em
solução aquosa (Grupo 8).
Nas condições, in vitro, utilizadas neste estudo, M. furfur não apresentou

significante susceptibilidade à IFD. Porém, Kim e Kim (2007) relataram o sucesso da
terapia fotodinâmica em paciente com pitiríase versicolor nas axilas direita e esquerda.
Os autores utilizaram creme ácido 5-aminolevulínico a 20% (4 horas de incubação no
escuro) e irradiação com LED (630 ± 50 nm, 100 mW/ cm2, densidade de energia de 70
J/ cm2 a 80 J/ cm2). Esse tratamento foi repetido após 2 semanas com densidade de
energia de 10 J/ cm2. O paciente foi avaliado, após 4 semanas, quando não havia
mancha escurecida e, após 3 meses, permaneceu sem sinais de reinfecção e com os
exames micológicos diretos negativos.
Os perfis de susceptibilidade de Sporothrix spp. e M. furfur à IFD foram obtidos
a partir de experimentos preliminares (TBO a 100 µg/ mL e 3 minutos de irradiação
com LED). Uma menor sensibilidade à IFD foi obtida para esses isolados, sugerindo
que a diferença entre o arranjo das estruturas celulares pode interferir na eficiência do
tratamento fotodinâmico, provavelmente, na associação do fotossensibilizador à
superfície fúngica. A modificação estrutural da parede celular de Sporothrix spp., após
sua conversão da fase leveduriforme à miceliana, pode também alterar a sensibilidade
desses isolados à susceptibilidade às drogas antifúngicas e a relação com o hospedeiro
(KOHLER et al., 2006). A presença dos lipídios na camada lamelar do envoltório
celular de M. furfur pode ter constituído barreira à penetração dos corantes utilizados,
que possuem caráter hidrofílico. Assim, novos corantes e outros veículos devem devem
selecionados, de acordo com as características biológicas de Sporothrix spp. e M. furfur,
80
e novos testes realizados. Apesar do perfil de susceptibilidade à IFD entre Candida spp.
e Cryptococcus gattii apresentarem semelhança, os isolados de Candida spp.
necessitaram de maior exposição à luz (15 minutos), que C. gattii (9 minutos).
Possivelmente, a diferença nas estruturas celulares dessas leveduras contribuiu para a
obtenção desses resultados. Variação quanto à sensibilidade ao fototratamento tem sido
observada em estudos cujos microrganismos apresentaram estrutura celular diferente. e
Assim, as condições experimentais devem ser otimizadas de acordo com as
características biológicas desses fungos. Zeina et al. (2001) relataram que o caráter
eucariótico de Candida albicans contribuiu para sua menor sensibilidade, in vitro, à
IFD. Smijs et al. (2008) observaram que os microconídeos, em fase inicial de
germinação, são mais sensíveis à IFD que as hifas. Assim, a estrutura celular fúngica
pode interferir na eficiência dos efeitos fototóxicos, e a diferença quanto ao
metabolismo e à superfície celular deve ser considerada no momento da realização dos
testes.
81
V- Conclusões
82
Uma vez analisados e processados os dados e obtido a informação gerada
conjuntamente com as respectivas análises, foram observados resultados que
apresentam o seguinte conjunto de conclusões:
1. No que tange ao estabelecimento do protocolo experimental, a

metodologia utilizada foi eficiente ao detectar a atividade inibitória da IFD
e proporcionou reprodutibilidade experimental, com o mínimo de
incertezas durante os testes. Mas, o volume de suspensão utilizado pode ter
interferido nos resultados dos testes com Laser e luz ultra-violeta.
2. Em relação às fontes de luz, concluiu-se que o LED a 630 nm pôde ser

utilizado com eficiência, por irradiar uma maior área e proporcionar
redução da viabilidade celular, sem produção de calor.
3. Os resultados obtidos a partirda análise de variados fotossensibilizadores

permitiram concluir que o TBO foi o corante mais eficiente, pois se
apresentou mais ressonante com a fonte de luz selecionada (LED a 630
nm) e proporcionou maior redução de células fúngicas.
4. As informações obtidas a partir da análise dos dados presentes neste estudo

permitiram concluir que as estruturas celulares dos diversos tipos de
fungos afetaram o efeito fototóxico da IFD, provocando diferença de
sensibilidade ao tratamento proposto.
5. Com relação às condições que ocasionaram uma maior redução da

viabilidade celular fúngica, objetivo de estudo do presente trabalho, pôde-
se identificar que as mesmas, de acordo com os resultados obtidos, foram
as seguintes: seleção de adequados fotossensibilizadores e fontes de luz,
aumento do tempo de irradiação, utilização de menor concentração de
fotossensibilizador e aplicações consecutivas da IFD.
83
VI – Referências Bibliográficas
84
ADAM, B.; BAILLIE, G. S.; DOUGLAS L. J. Mixed species biofilms of Candida
albicans and Staphylococcus epidermidis. Antimicrob. Agents, v. 51, p. 344-349, 2002.
ALMEIDA, R. D.; MANADAS, B. J.; CARVALHO, A. P.; DUARTE, C. B.

Intracellular signaling mechanisms in photodynamic therapy. Biochim. Biophys. Acta.,
v.1704, p. 59-86, 2004.
ALVAREZ, M; CASADEVALL, A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation

after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages. BMC Immunol., v. 8,
p. 16, 2007.
ALVES, S. H., OLIVEIRA, L. T., COSTA, J. M., LUBECK, I., CASALI, K. A.,
VAINSTEIN, M. H. In vitro susceptibility to antifungal agents of clinical and
environmental Cryptococcus neoformans isolated in Southern of Brazil. Rev. Inst. Med.
trop. S. Paulo. v. 43, p. 267-270, 2001.
AMORIM, J. C. F. Ação fototóxica do laser em baixa intensidade e diodo de emissão

de luz (LED) na viabilidade do fungo Trichophyton rubrum: estudo in vitro. Belo
Horizonte: UFMG, 2007. 85 p.. Tese de Doutorado em Engenharia Mecânica,
Departamento de Engenharia Mecânica, Universidade de Minas Gerais, 2007.
ANGIOLELLA, L.; STRINGARO, A. R.; DE BERNARDIS, F.; POSTERARO, B.;

BONITO, M.; TOCCACIELI, L.; TOROSANTUCCI, A.; COLONE, M.;
SANGUINETTI, M.; CASSONE, A.; PALAMARA, A. T. Increase of virulence and its
phenotypic traits in drug-resistant strains of Candida albicans. Antimicrob. Agents
Chemother. v. 52, p. 927-936, 2008.
BAGNATO, V. S. Os fundamentos da luz Laser. Física na escola., v. 2, p. 1-8, 2001.
BARCHIESI, F.; SCHIMIZZI, A. M.; CASELLI, F.; NOVELLI, A.; FALLANI, S.;
GIANNINI, D.; ARZENI, D.; DI CESARE, S.; DI FRANCESCO, L. F.; FORTUNA,
M.; 1 GIACOMETTI, A.; CARLE, F.; MAZZEI, T.; SCALISE, G. Interactions
between Triazoles and Amphotericin B against Cryptococcus neoformans. Antimicrob.
Agents Chemother. v. 44, p. 2435–2441, 2000.
85
BARROS, M. E. S.; SANTOS, D. A.; HAMDAN, J. S. Evaluation of susceptibility of
Trichophyton mentagrophytes and Trichophyton rubrum clinical isolates to antifungal
drugs using a modified CLSI microdilution method (M38-A). Antimicrob. Agents
Chemother. v. 56, p. 514-518, 2007.
BLISS, M. J., C. E. BIGELOW, T. H. FOSTER, C. G. HAIDARIS. Susceptibility of

Candida species to photodynamic effects of photofrin. Antimicrob. Agents Chemother.
v. 48, p. 2000-2006, 2004.
BÖCKING, T.; BARROW, K. D.; NETTING, A. G.; CHILCOTT, T. C.; COSTER, H.

G. L.; HÖFER, M. Effects of singlet oxygen on membrane sterols in the yeast
Sccharomyces cerevisiae. Eur. J. Biochem., v. 267, p. 1607-1618, 2000.
BOSI, S.; DA ROS, T.; CASTELLANO, S.; BANFI, E.; PRATO, M.

Antimycobacterial activity of ionic fullerene derivatives. Bioorganic Med. Chem.
Letters. v. 10, p. 1043-1045, 2000.
BOSI, S.; DA ROS, T.; GIAMPIERO, S.; PRATO, M. Fullerene derivates: an attractive
tool for biological applications. Eur. J. Med. Chem., v. 38, p. 913-923, 2003.
BOSI, S.; FERUGLIO, L.; DA ROS, T.; GIAMPIERO, S.; GREGORETTI, B.;
TERDOSLAVICH, M.; DECORTI, G.; PASSAMONTI, S.; MORO, S.; PRATO, M.
Hemolytic effects of water-soluble fullerene derivatives. J. Med. Chem., v. 47, p. 6711-
6715, 2004.
BOVERS, M.; HAGEN, F.; BOEKHOUT, T. Diversity of the Cryptococcus

neoformans-Cryptococcus gattii species complex. Rev. Iberoam. Micol. V. 25, p. S4-
S12, 2008.
BOZKURT, A. & ONARAL, B. Safety assessment of near infrared light emitting

diodes for diffuse optical measurements. BioMedical Engineering OnLine, 2004.
86
CASADEVALL, A.; PIROFSKI, L. Accidental virulence, cryptic pathogenesis,
martians, lost hosts, and the pathogenicity of environmental microbes. Eukaryotic Cell.,
v. 6, p. 2169-2174, 2007.
CHABRIER-ROSELLÓ, Y.; FOSTER, T. H.; PÉREZ-NAZARIO, N.; MITRA, S.;

HAIDARIS, C. G. Sensitivity of Candida albicans germ tubes and biofilms to
photofrin-mediated phototoxicity. Antimicrob. Agents Chemother. v. 49, p. 4288-4295,
2005.
CHAN, Y and LAI, CH, Bactericidal effects of different laser wavelengths on

periodontopathic germs in photodynamic therapy. Lasers Med Sci. v. 18, p. 51-5. 2003.
CHEN, S. C. A.; SORRELL, T. C. Antifungal agents. Med. J. Australia., v. 187, p. 404-

409, 2007.
CHEN, Y. C., CHANG, S. C., SHIH, C. C., HUNG, C. C., LUH, K. T., PAN, Y. S.,
HSIEH, W. C. Clinical features and in vitro susceptibilities of two varieties of
Cryptococcus neoformans in Taiwan. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., v.30, p.175-183.
2000.
CHICARO, P.; PINTO, E.; COLEPICOLO, P.; LOPES, J. L. C.; LOPES, N. P.

Flavonoids from Lychnophora passerina (Asteraceae): potential antioxidants and UV-
protectants. Biochem. System. Ecol., v. 32, p. 239-243, 2004.
CHRYSSANTHOU, E.; BROBERGER, U.; PETRINI, B. Malassezia pachydermatis

fungaemia in a neonatal intensive care unit. Acta. Paediatr., v. 90, p. 323-327, 2001.
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE. 2002. Reference

method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; Approved Standard
(M27-A2)-Second Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute. West Valley
Road, Wayne, Pennsylvania.
87
COELHO, C. M. P.; SOUSA, Y. T. C. S.; DARÉ, A. M. Z. Denture-related oral
mucosal lesions in a brasilian school of dentistry. J. Oral Rehabilitation. v. 31, p. 135-
139, 2004.
CORRÊA, M. P. S. C.; OLIVEIRA, E. C.; DUARTE, R. R. B. S.; PARDAL, P. P. O.;

OLIVEIRA, F. M.; SEVERO, L. C. Criptococose em crianças no estado do Pará, Brasil.
Soc Bras Med Trop., v. 32, p. 505-508, 1999.
CORRÊA M. P. S. C.; SEVERO, L. C.; OLIVEIRA, F. M.; IRION, K.; LONDERO, A.

T. The spectrum of computerized tomography (CT) findings in central nervous system
(CNS) infection due to Cryptococcus neoformans var. gattii in imunocompetent
children. Inst Med Trop., v. 44, p. 283-287, 2002.
CRUANES, J. C. La terapia laser, hoy. Barcelona: Centro de Documentación Laser de

Meditec, S.A, p.53, 1984.
DA MATTA, D. A.; DE ALMEIDA, L. P.; MACHADO, A. M.; AZEVEDO, A. C.;

KUSANO, E. J.; TRAVASSOS, N. F.; SALOMÃO, R.; COLOMBO, A. L. Antifungal
susceptibility of 1000 Candida bloodstream isolates to 5 antifungal drugs: results of a
multicenter study conducted in São Paulo, Brazil, 1995-2003. Diagn. Microbiol. Infect.
Dis., v. 57, p. 399-404, 2007.
DEMIDOVA, T. N.; HAMBLIN, M. R. Effect of cell-photosensitizer binding and cell

density on microbial photoinactivation. Antimicrob. Agents Chemother., v. 49, p. 2329-
2335, 2005.
DONNELLY, R. F.; MCCARRON, P. A.; TUNNEY, M. M.; WOOLFSON, A. D.

Potential of photodynamic therapy in treatment of fungal infections of the mouth.
Desing and characterization of a mucoadhesive patch containg toluidine blue O. J.
photochem. Photobiol. B: Biol., v. 86, p. 59-69, 2007.
DONNELLY, R. F.; MCCARRON, P. A.; TUNNEY, M. M. Antifungal photodynamic

therapy. Microbiol. Research., v. 163, p. 1-12, 2008.
88
DORA JM, KELBERT S, DEUTSCHENDORF C, CUNHA VS, AQUINO VR, DOS
SANTOS RP, GOLDANI LZ. Cutaneous cryptococcosis due to Cryptococcus gattii in
immunocompetent hosts: case report and review. Mycopathologia, v. 161, p. 235-238,
2006.
DUARTE, E. R.; HAMDAN, J. S. Susceptibility of yeast isolates from cattle with otitis
to aqueous solution of povidone iodine and to alcohol-ether solution. Medical
Mycology, v. 44, p. 369 – 373, 2006.
ELLEPOLA, A. N.; SAMARANAYAKE, L. P. The effect of limited exposure to

antimycotics on the relative cell-surface hydrophobicity and the adhesion of oral
Candida albicans to buccal epithelial cells. Arch Oral Biol., v. 43, p. 879-887,1998.
ELLEPOLA, A. N.; PANAGOADA, G. J.; SAMARANAYAKE, L. P. Adhesion of oral

Candida species to human buccal epithelial cells following brief exposure to nystatin.
Oral Microbiol. Immunol., v. 14, p. 358-363, 1999.
ESPINELL-INGROFF, A. Mechanisms of resistance to antifungals agents: Yeasts and

filamentous fungi. Rev. Iberoam. Micol., v. 25, p. 101-106, 2008.
FIGUEIREDO, V. T.; SANTOS, D. A.; RESENDE, M. A.; HAMDAN, J. S.

Identification and in vitro antifungal susceptibility testing of 200 clinical isolates of
Candida spp. Responsible for fingernail infections. Mycopathologia, v. 164, p. 27-33,
2007.
FRANCA, J. C. B.; RIBEIRO, C. E. L.; QUEIROZ-TELLES, F. Candidemia in a

Brazilian tertiary care hospital: incidence, frequency of different species, risk factors
and antifungal susceptibility. Rev. Soc. Bras. Med. Trpo., v. 41, p. 23-28, 2008.
FRIEDBERG, J. S.; SKEMA, C.; BAUM, E. D., BURDICK, J.; VINOGRADOV, S.

A.; WILSON, D. F.; HORAN, A. D.; NACHAMKIN, I. In vitro effects of
photodynamic therapy on Aspergillus fumigatus. J. Antim. Chemother. v. 48, p: 105-
107. 2001.
89
FUCHS, B. B.; TEGOS, G. P.; HAMBLIN, M. R.; MYLONAKIS, E. Susceptibility of
Cryptococcus neoformans to photodynamic inactivationis associated with cell wall
integrity. Antimicrob. Agents Chemother., v. 51, p. 2929-2936, 2007.
GARCEZ-SEGUNDO, A. S. Laser em baixa intensidade associado a

fotossensibilizador para redução bacteriana intracanal comparado ao controle
químico. São Paulo: USP, 2002. (Tese de Doutorado). Instituto de Pesquisas Nucleares.
Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo, 2002.
GIUSIANO, G.; MANGIATERRA, M.; GARCIA SAITO, V.; ROJAS, F.; GÓMEZ,
V.; DÍAZ M. C. Fluconazole and itraconazole resistance of yeasts isolated from the
bloodstream and catheters of hospitalized pediatric patients. Chemother. V. 52, p. 254-
259, 2006.
GÓMEZ-LÓPEZ, A.; ZARAGOZA, O.; DOS ANJOS MARTINS, M.; MELHEN, M.

C.; RODRIGUÉZ-TUDELA, J. L.; CUENCA-ESTRELLA, M. In vitro susceptibility of
Cryptococcus gattii clinical isolates. Clin. Microbiol. Infect., v. 14, p. 727-730, 2008.
GUPTA, A. K.; KOHLI, Y. In vitro susceptibility testing of ciclopirox, terbinafine,

ketoconazole and itraconazole against dermatophytes and nondermatophytes, and in
vitro evaluation of combination antifungal activity. British J. Dermat., v. 149, p. 296 –
305, 2003.
HOLLMER, C.; ESSMANN, M.; AULT, K.; LARSEN, B. Adherence and blocking of
Candida albicans to cultured vaginal epithelial cells: treatments to decrease adherence.
Infect. Dis. Obst. Gynecol., v. 2006, p. 1-6, 2006.
IWATA, K.; YAMASHITA, T.; OHSUMI, M.; BABA, M.; NAITO, N.; TAKI, A.;
YAMADA, N. Comparative morphological and biological studies on the itraconazole-
and ketoconazole-resistant mutans of Cryptococcus neoformans. J Med Vet Mycol., v.
28, p. 77-90, 1990.
90
JACKSON, Z., S. MEGHJI, A. MACROBERT, B. HENDERSON, M. WILSON.
Killing of the yeast and hyphal forms of Candida albicans using a light-activated
antimicrobial agent. Lasers Med. Sci. v. 14; p. 150-157. 1999.
JAIN, N.; LI, L.; MCFADDEN, D. C.; BANARJEE, U.; WANG, X.; COOK, E.;
FRIES, B. C. Phenotypic switching in a Cryptococcus neoformans variety gattii strain is
associated with changes in virulence and promotes dissemination to the central nervous
system. Infect. Immunity, v. 74, p. 896-903, 2006.
JANKNEGT R, DE MARIE S, BAKKER-WOUDENBERG IA, CROMMELIN DJ.

Liposomal and lipid formulations of amphotericin B Clinical pharmacokinetics. Clin
Pharmacokinet., v. 23, p. 279-291, 1992.
JOHANN, S.; SOLDI, C.; LYON, J. P.; PIZZOLATTI, M. G.; RESENDE, M. A.

Antifungal activity of the amyrin derivatives and in vitro inhibition of Candida albicans
adhesion to human epithelial cells, Lett. Appl. Microbiol., v. 45, p. 148-153, 2007.
JORI, G.; COPPELLOTTI, O. Inactivation of pathogenic microorganisms by

photodynamic techniques: mechanistic aspects and perspective applications. Free
Radical Biol. Med., v. 43, p. 711-719, 2007.
JORI, G.; RONCUCCI, G. Photodynamic Therapy in Microbial Infections, Adv. Clin.

Exp. Med., v. 15, p. 421-426, 2006.
KAMP, H.; TIETZ, H. -J.; LUTZ, M.; PIAZENA, H.; SOWYRDA, P.; LADEMANN,
J.; BLUME-PEYTAVI, Y. Antifungal effect of 5-aminolevulinic acid PDT in
Trichophyton rubrum. Mycoses, v.48, p. 101-107, 2005.
KANEKO, T.; MAKIMURA, K.; ABE, M.; SHIOTA, R.; NAKAMURA, Y.; KANO,
R.; HASEGAWA, A.; SUGITA, T.; SHIBUYA, S.; WATANABE, S.; YAMAGUCHI,
H.; ABE, S.; OKAMURA, N. Reviser culture-based system for identification of
Malassezia species. J. Clin. Microbiol., v. 45, p. 3737-3742, 2007.
91
KARU, T. Primary and secondary mechanisms of action of visible to near-IR radiation
on cells. J. Photochem. Photobiol. B., v. 49, p.1-17. 1999.
KIM, Y. J.; KIM, Y. C. Successful treatment of pityriasis versicolor with 5-

aminolevulinic acid photodynamic therapy. Arch. Dermatol., v. 143, p. 1218-1220,
2007.
KHAN, Z. U.; RANDHAWA, H. S.; KOWSHIK, T.; CHOWDHARY, A.; CHANDY,

R. Antifungal susceptibility of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii
isolates from decayed wood of trunk hollows of Ficus religiosa and Syzygium cumini
trees in north-western India. J. Antimicrob. Chemot., v. 60, p. 312-316, 2007.
KOHLER, L. M.; SOARES, B. M.; SANTOS, D. A.; BARROS, M. E. S.; HAMDAN,

J. S. In vitro susceptibility of isolates of Sporothrix schenckii to amphotericin B,
itraconazole, and terbinafine: comparison of yeast and mycelial forms. Can. J.
Microbiol., v. 52, p. 1-5, 2006.
KOHLER, L. M.; HAMDAN, J. S.; FERRARI, T. C. Successful treatment of a

disseminated Sporothrix schenckii infection and in vitro analysis for antifungal
susceptibility testing. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., v. 58, p. 117-120, 2007.
KOHLER, L. M. Complexo Sporothrix schenckii: susceptibilidade às drogas

antifúngicas. Belo Horizonte: UFMG, 2008. 139 p. Tese de Doutorado em
Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais,
2008.
KONAN, Y. N; GURNY, R; ALLEMANN, E. State of the art in the delivery of

photosensitizers for photodynamic therapy. J Photochem Photobiol B. v. 66, p. 89-106.
2002.
KURTZMAN, C. P; FELL, J. W. The Yeasts, a taxonomic study, 4th ed. Amsterdam:

Elseviers Scientific. v. 35, p. 165-168. 1998.
92
KWON-CHUNG, K. J.; BENNETT, J. E. Cryptococcosis. In:…(eds.). Medical
Mycology. Philadelphia: Le & Febiger, 1992, p. 397-447.
LACAZ, C. S.; RODRIGUES, M. C. Sorotipagem de Cryptococcus neoformans. Rev

Bras Méd., v. 40, p. 293-300, 1983.
LACAZ, C.S., PORTO, E., MARTINS, J. E. C; HEINS-VACCARI, E.M.; DE MELO,

N. T. Criptococose. In: ... (eds.). Tratado de Micologia Médica Lacaz. 9ed. São Paulo.
Sarvier. 2002. p. 416-440.
LAMBRECHTS, S. A. G.; AALDERS, M. C. G.; VAN MARLE J. Mechanistic study

of the photodynamic inactivation of Candida albicans by a cationic porphirin,
Antimicrob. Agents Chemother., v. 49, p. 2026-2034, 2005.
LARSEN, R. A.; BAUER, M.; THOMAS, A.M.; GRAYBILL, J. R. Amphotericin B

and fluconazole, a potent combination therapy for cryptococcal meningitis. Antimicrob
Agents Chemother., v. 48, p. 985-991, 2004.
LI, Y.; SU, C.; MAO, X.; CAO, F.; CHEN, J. Roles of Candida albicans Sfl1 in hyphal
development. Eukaryotic Cell, v. 6, p. 2112-2121, 2007.
LOPES, J. O.; COSTA, J.M.; STREHER, L. A.; CLOCK, C.; PINTO, M. S.; ALVES,
S. H. Criptococose não associada à AIDS no Rio Grande do Sul: relato de oito casos e
revisão da literatura sul-riograndense. Soc Bras Med Trop., v. 30, p. 369-372, 1997.
LYON, J. P.; RESENDE, M.A. Correlation between adhesion, enzyme production, and
susceptibility to fluconazole in Candida albicans obtained from denture wearers. Oral
Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod., v. 102, p. 632-638, 2006.
MA, H.; CROUDACE, J. E.; LAMMAS, D. A.; MAY, R. C. Direct cell-to-cell spread
of a pathogenic yeast. BMC Immunology, v. 8: 15, 2007.
MACHADO, A. E. H. Terapia fotodinâmica: princípios, potencial de aplicação e

perspectives. Química Nova, v. 23, p. 237-243, 2000.
93
MAISCH, T.; BAIES, J.; FRANZ, B.; MAIER, M.; LANDTHALER, M.; SZEIMIES,
R.-M. The role of singlet oxygen and oxygen concentration in photodynamic
inactivation of bacteria. J. Laser Med. Science, v. 104, p. 7223-7228, 2007.
MANG, T.S. Lasers and light sources for PDT: past, present and future, Photodiag.
Photodyn. Ther. v. 1, p. 43-48, 2004.
MARIMON, R.; CANO, J.; GENÉ, J.; SUTTON, D. A.; KAWASAKI, M.; GUARRO,
J. Sporothrix brasiliensis, S. globosa, and S. mexicana, three new Sporothrix species of
clinical interest. J. Clin. Microbiol., v. 45, p. 3198-3206, 2007.
MARIMON, R.; SERENA, C.; GENÉ, J.; CANO, J.; GUARRO, J. In vitro antifungal
susceptibilities of five species of Sporothrix. Antimicrob Agents Chemother., v. 52, p.
732-734, 2008.
MARINHO, S. A. Efeito da terapia fotodinâmica (PDT) sobre culturas de Candida sp.

e de células epiteliais: estudo in vitro. Porto Alegre: PUC-RS, 2006. p. 161. Tese de
Doutorado em Odontologia, Faculdade de Odontologia, Pontifícia Universidade
Católica do Rio Grande do Sul, 2006.
MASHINO, T.; OKUDA, K.; HIROTA, T.; HIROBE, M.; NAGANO, T.;
MOCHIZUKI, M. Inhibition of E. coli growth by fullerene derivatives and inhibition
mechanism. Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, v. 9, p. 2959-2962, 1999.
MATSUMOTO, M. T.; FUSCO-ALMEIDA, A. M.; BAEZA, L. C.; MELHEM, M. S.

C.; MENDES-GIANNINI, M. J. S. Genotyping, serotyping and determination of
mating-type of Cryptococcus neoformans clinical isolates from São Paulo state, Brazil.
Rev. Inst. Méd. Trop. S. Paulo, v. 49, p. 41-47, 2007.
McFADDEN, D. C., FRIES, B. C.; WANG, F.; CASADEVALL, A. Capsule Structural

heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans. Eukaryotic Cell, v.
6, p. 1464-1473, 2007.
MELLO, J.B. Gpm, Laser em odontologia, ed. Santos. São Paulo. p. 81-82. 2000.
94
MENDONÇA, P. E. M. F. The LASER in Biology. Rev. Bras. Ensino de Física, vol.
20, p. 86-94,1998.
MESA-ARANGO, A. C.; REYES-MONTES, M. R.; PÉREZ-MEJÍA, A.; NAVARRO-

BARRANCO, H.; SOUZA, V.; ZÚÑIGA, G.; TORIELLO, C. Phenotyping and
genotyping of Sporothrix schenckii isolates according to geographic origin and clinical
form of sporotrichosis. J. Clin. Microbiol., v. 40, p. 3004-3011, 2002.
MITCHELL, T. C.; PERFECT, J. R. Cryptococcosis in the era of AIDS - 100 years

after the discovery of Cryptococcus neoformans. Clin. Microbiol. Rev. v. 8, p. 515-548.
1995.
MIRANDA, K. C.; DE ARAÚJO, C. R.; COSTA, C. R.; PASSOS, X. S.; DE FÁTIMA

LISBOA FERNANDES, O.; DO ROSÁRIO RODRIGUES SILVA, M. Antifungal
activities of azoles agents against the Malassezia species. Int. J. Antimicrob. Agents, v.
29, p. 281-284, 2007.
MITTAG, H. Fine structural investigation of Malassezia furfur. II. The envelope of

yeast cells. Mycoses, v. 38, p. 13-21, 1995.
MOKADDAS, E. M.; AL-SWEIH, N. A.; KHAN, Z. U. Species distribuition and

antifungal susceptibility of Candida bloodstream isolates in Kuwait: a 10-year study. J.
Med. Microb., v. 56, p. 255-259, 2007.
MONFRECOLA, G., E. M. PROCACCINI, M. BEVILACQUA, A. MANCO, G.

CALABRÓ, AND P. SANTOIANNI. In vitro effect of 5-aminolaevulinic acid plus
visible light on Candida albicans. Photochem. Photobio. v. 3, p. 419-422. 2004.
MORAES, E. M. P. Composição lipídica parcial e susceptibilidade a drogas

antifúngicas de 15 amostras de Cryptococcus neoformans var. gattii. Belo Horizonte:
UFMG, 2000. 101p.. Dissetação de Mestrado em Microbiologia, Instituto de Ciências
Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, 2000.
95
MORAES, R. Avaliação das características clínicas e laboratoriais dos episódios de
candidúria ocorridos em pacientes atendidos em hospitais da região metropolitana de
Belo Horizonte, MG. Belo Horizonte: UFMG, 2008. 113 p. Dissertação de Mestrado em
Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais,
2008.
MOREIRA, T. A.; FERREIRA, M. S.; RIBAS, R. M.; BORGES, A. S. Criptococose:

estudo clínico-epidemiológico, laboratorial e das variedades do fungo em 96 pacientes.
Rev Soc Bras Med Trop., v. 39, p. 255-258, 2006.
MORERA-LOPEZ, Y.; TORRES-RODRÍGUEZ, J. M.; JIMÉNEZ-CABELLO, T.;

BARÓ-TOMÁS, T. Cryptococcus gattii: in vitro susceptibility to the new antifungal
albaconazole versus fluconazole and voriconazole. Medical Mycology, v. 43, p. 505-
510, 2005.
MORISHITA, N.; SEI, Y. Microreview of pityriasis versicolor and Malassezia species.

Mycopathologia, v. 162, p. 373-376, 2006.
MORRISON, V. A.; WEISDORF, D. J. The spectrum of Malassezia infections in the

bone marrow transplant population. Bone Marrow Transplant., v. 26, p. 645-648, 2000.
MUNIN, E.; GIROLDO, L. M.; ALVES, L. P.; COSTA, M. S. Study of germ formation
by Candida albicnas after photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). J
Photochem Photobiol B., v. 88, p. 16-20, 2007.
NETEA, M. G.; VAN DE VEERDONK, F.; VERSCHUEREN, I.; VAN DER MEER,
J. W. M.; KULLBERG, B. J. Role of TLR1 and TLR6 in the host defense against
disseminated candidiasis. FEMS Immunol. Med. Microb., v. 52, p. 118 – 123, 2008.
NUCCI, M.; MARR, K. A. Emerging fungal diseases. Emerging Infections, v. 41,

p.521-526, 2005.
96
OSHIRO, T.; CALDERHEAD, R.G. The development of low reactive-level laser
therapy (LLLT) and its present status. J Clin Laser Med and Surg. v. 9, p. 267-275,
1991.
PAARDEKOOPER, M.; VAN DEN BROEK, P.J.; DE BRUIJNE, A.W.; ELFERINK,

J.G.; DUBBELMAN, T.M.; VAN STEVENINCK, J. Photodynamic treatment of yeast
cells with the dye toluidine blue: all-or-none loss of plasma membrane barrier
properties. Biochim. Biophys. Acta., v. 1108, p. 86-90, 1992.
PAARDEKOOPER, M.; DE BRUIJNE, A.W.; VAN STEVENINCK, J.; VAN DEN

BROEK, P.J. Inhibition of transport systems in yeast by photodynamic treatment with
toluidine blue. Biochim. Biophys. Acta., v. 1151, p. 143-148, 1993.
PAARDEKOOPER, M.; DE BRUIJNE, A.W.; VAN STEVENINCK, J.; VAN DEN

BROEK, P.J. Intracellular damage in yeast cells caused by photodynamic treatment
with toluidine blue. Photochem. Photobiol., v. 61, p. 84-89, 1995.
PASQUALOTTO, A. C.; SEVERO, C. B.; OLIVEIRA, F. M,; SEVERO, L. C.

Cryptococcemia. An analysis of 28 cases with emphasis on the clinical outcome and its
etiologic agent. Rev Iberoam Micol., v. 21, p. 143-146, 2004.
PELOI, L. S.; SOARES, R. R. S.; BIONDO, A. E. G.; SOUZA, V. R.; HIOKA, N.;
KIMURA, E. Photodymnamic effect of light-emitting diode light on cell growth
inhibition induced by methylene blue. J. Biosci., v. 33, p. 231-237, 2008.
PERUSSI, J. R. Inativação fotodinâmica de microrganismos. Química Nova, v. 30, p.

988-994, 2007.
PFALLER, M. A., BURMEISTER, L., BARTLETT, M. S., RINALDI, M. G.

Multicenter evaluation of four methods of yeast inoculum preparation. J. Clin.
Microbiol. v. 26, p. 1437-1441, 1988.
97
PFALLER, M. A.; DIEKEMA, D. J.; GIBBS, D. L.; NEWELL, V. A.; NAGY, E.;
DOBIASOVA, S.; RINALDI, M.; BARTON, R.; VESELOV, A.; THE GLOBAL
ANTIFUNGAL SURVEILLANCE GROUP. Candida krusei, a multidrug-resistant
opportunistic fungal pathogen: geographic and temporal trends from the ARTEMIS
DISK antifungal surveillance program, 2001 to 2005. J. Clin. Microbiol., v. 46, p. 515-
521, 2008.
POLACHECK, I.; KWON-CHUNG, K. J. Creatinine metabolism in Cryptococcus

neoformans and Cryptococcus bacillisporus. J Bacteriol. , v. 142, p.15-20, 1980.
POLONELLI, L.; CONTI, S.; CAMPANI, L.; MORACE, G.; FANTI, F. Yeast killer
toxins and dimorphism. J. Clin. Microb., v. 27, p. 1423-1425, 1989.
POSTERARO, B.; SANGUINETTI, M.; SANGLARD, D.; LA SORDA, M.; BOCCIA,

S.; ROMANO, L.; MORACE, G.; FADDA, G. Identification and characterization of a
Cryptococcus neoformans ATP binding casset (ABC) transporter-enconding gene,
CnAFR1, involved in the resistance to fluconazole. Molecular Microbiology, v. 47, p.
357-371, 2003.
PRATES, R. A. Verde malaquita como fotossensibilizador em terapia fotodinâmica:

Ação bactericida sobre Actinobacillus actinomycetemcomitans - um estudo in-vitro.
São Paulo. IPEN, 2005. 37p. Dissertação (Mestrado Profissionalizante em Laser em
Odontologia) – Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, 2005.
PUSHPAN, S. K.; VENKATRAMAN, S.; ANAND, V. G.; SANKAR, J.;

PARMESWARAN, D.; GANESAN, S.; CHANDRASHEKAR, T. K. Porphyrins in
photodinamic therapy – a search for ideal phoptsensitizers. Curr Med Chem Anti-Canc
Agents. v. 2, p. 187-207, 2002.
RAMOS-E-SILVA, M.; VASCONCELOS, C.; CARNEIRO, S.; CESTARI, T.

Sporotrichosis. Clinics Dermathol., v. 25, p. 181-187, 2007.
98
RHOME, R.; MCQUISTON, T.; KECHICHIAN, T.; BIELAWSKA, A.; HENNIG, M.;
DRAGO, M.; MORACE, G.; LUBERTO, C.; DEL POETA, M. Biosynthesis and
imunogenicity of glucosylceramide in Cryptococcus neoformans and other human
pathogens. Eukaryotic Cell, v. 6, p. 1715-1726, 2007.
ROBINSON, P. A., BAUER, M., LEAL, M. A. E., EVANS, S. G., HOLTON, P. D.,
DIAMOND, D. M., LEEDOM, J. M., LARSEN, R. A. Early mycological treatment
failure in AIDS associated cryptococcal meningitis. Clin. Infect. Dis., v. 28, p. 82-92,
1999.
ROZENBAUM, R.; GONÇALVES, A. J. R.; WANKE, B.; CAIUBY, M. J.;

CLEMENTE, H.; LAZÉRA, M. S.; MONTEIRO, P. C. F.; LONDERO, A. T.
Cryptococcus neoformans varieties as agent of cryptococcosis in Brazil.
Mycopathologia, v. 119, p. 133-136,1992.
RYDER, N. S., WAGNER, S., LEITNER, I. In vitro activities of terbinafine against

cutaneous isolates of Candida albicans and other pathogenic yeasts. Antimicrob. Agents
Chemother. v. 42, p. 1057-1061, 1998.
SAMONIS, G.; KOFTERIDIS, D. P.; SALOUTROS, E.; GIANNOPOULOU, K. P.;

NTZIORA, F.; CHRISTIDOU, A.; MARAKI, S.; FALAGAS, M. E. Candida albicans
versus non-albicnas bloodstream infection in patients in a tertiary hospital: an analysis
of microbiological data. Scand. J. Infect. Dis., v. 40, p. 414-419, 2008.
SAMPAIO, I.B.M. Estatística aplicada à experimentação animal, segunda ed.,

FEPMVZ, Belo Horizonte, 2002.
SANCAK, B.; AYHAN, M.; KARADUMAN, A.; ARIKAN, S. In vitro activity of

ketoconazole, itraconazole and terbinafine against Malassezia strains isolated from
neonates. Mikrobiyol Bul., v. 39, p. 301-308, 2005.
SANTOS, D. A.; HAMDAN, J. S. In vitro antifungal oral drug and drug-combination

activity against onychomycosis causative dermatophytes. Medical Mycology, v. 44, p.
357-362, 2006.
99
SAR, B.; MONCHY, D.; VANN, M.; KEO, C.; SARTHOU, J. L.; BUISSON, Y.
Increasing in vitro resistance to fluconazole in Cryptococcus neoformans cambodian
isolates: april 2000 to march 2002. J Antimicrob Chemother., v. 54, p. 563-565, 2004.
SCHUBACH, A.; BARROS, M. B. L.; WANKE, B. Epidemic sporotrichosis. Curr.

Opin. Infect. Dis., v. 21, p. 129-133, 2008.
SCULLY, C.; EL-KABIR, M.; SAMARANAYAKE L. P. Candida and Oral

Candidosis: a review. Crit. Rev. Oral Biol. M., v. 5, p. 125-157, 1994.
SERENA, C.; FERNÁNDEZ-TORRES, B.; PASTOR, F. J.; TRILLES, L.; LAZÉRA,

M. S.; NOLARD, N.; GUARRO, J. In vitro interactions of micafungin with others
antifungal drugs against clinical isolates of four species of Cryptococcus. Antimicrob.
Agents Chemother., v. 49, p. 2994-2996, 2005.
SIDRIM, J.J.C.; MOREIRA, J.L.B. Fundamentos Clínicos e Laboratoriais da

Micologia Médica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1999.
SILVA, P. R.; RABELO, R. A. S.; TERRA, A. P. S.; TEIXEIRA, D. N. S.

Susceptibility to antifungal agents among Cryptococcus neoformans varities isolated
from patients at a university hospital. Rev. Bras. Méd. Trop., v. 41, p. 158-162, 2008.
SIMPLÍCIO, F. I.; MAIONCHI, F.; HIOKA, N. Terapia fotodinâmica: aspectos

farmacológicos, aplicações e avanços recentes no desenvolvimento de medicamentos.
Química Nova, v. 25, p. 801-807, 2002.
SMIJS, T. G. M.; BOUWSTRA, J. A.; SCHUITMAKER, H. J.; TALEBI, M.; PAVEL,

S. A. novel ex vivo skin model to study the susceptibility of the dermatophyte
Trichophyton rubrum to photodynamic treatment in different growth phases. J.
Antimicrob. Chemother., v. 59, p. 433-440, 2007a.
SMIJS, T. G. M.; BOUWSTRA, J. A.; TALEBI, M.; PAVEL, S. A. Investigation of

conditions involved in the susceptibility of the dermatophyte Trichophyton rubrum to
photodynamic treatment. J. Antimicrob. Chemother., v. 60, p. 750-759, 2007b.
100
SMIJS, T. G. M.; MULDER, A. A.; PAVEL, S.; ONDERWATER, J. J.; KOERTEN, H.
K.; BOUWSTRA, J. A. Morphological changes of the dermatophyte Trichophyton
rubrum after photodynamic treatment: a scanning electron microscopy study. Medical
Mycology, v. 46, p. 315-325, 2008.
SOARES, B. M. Comparação de três metodologias para testes de susceptibilidade a

antifúngicos de 40 amostras de Cryptococcus neoformans var. gattii. Belo Horizonte:
UFMG, 2004. p. 105. Dissertação de Mestrado em Microbiologia, Instituto de Ciências
Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, 2004.
SORRELL, T. C. Cryptococcus neoformans var. gattii. Med. Mycol. v. 39, p. 155-168,

2001.
SOUZA, S. C.; JUNQUEIRA, J. C.; BALDUCCI, I.; KOGA-ITO, C. Y.; MUNIN, E.;
CARDOSO, A. O. Photosensitization of different Candida species by low power laser
light, J. Photochem. Photobiol. B: Biol., v. 83, p. 34-38, 2006.
SOUSA, G. R. Análise comparativa da emissão de luz por LED e Lasers emitindo no

vermelho do espectro eletromagnético na redução bacteriana de bactérias
periodontopatogênicas: estudo in vitro. Belo Horizonte: UFMG, 2007. p. 123. Tese de
Doutorado em Engenharia Mecânica, Departamento de Engenharia Mecânica,
Universidade Federal de Minas Gerais, 2007.
SOUTHERN, P.; HORBUL, J.; MAHER, D.; DAVIS, D. A. C. albicans colonization of

human mucosal surfaces. Plos ONE, v. 3, p. 1-9, 2008.
SPANAKIS, E. K.; APERIS, G.; MYLONAKIS, E. New agents for the treatment of
fungal infections: clinical efficacy and gaps in coverage. Clin. Infect. Dis., v. 43, 1060-
1068, 2006.
SPEED, B.; DUNT, D. Clinical and host differences between infections with the two
varieties of Cryptococcus neoformans. Clin. Intect. Dis. v. 21, p. 28-34, 1995.
101
STRAKHOVSKAYA, M. G.; BELENIKINA, N. S.; IVANOVA, E. V.; CHEMERIS,
YU. K.; STRANADKO, E. F. The photodynamic Inactivation of the yeast Candida
guilliermondii in the presence of photodithazine, Microbiology., v. 71, p. 345-348,
2002.
SUKROONGREUNG, S.; LIM, S.; TANTIMAVANICH, S.; EAMPOKALAP, B.;

CARTER, D.; NILAKUL, C.; KULKERATIYUT, S.; TANSUPHASWADIKUL, S.
Phenotypic switching and genetic diversity of Cryptococcus neoformans. J. Ciln.
Microb., v. 39, p. 2060-2064, 2001.
TAY, S. T.; HARYANTY, T. T.; NG, K. P.; ROHANI, M. Y.; HAMIMAH, H. In vitro
susceptibilities of Malaysian clinical isolates of Cryptococcus neoformans var. grubii
and Cryptococcus gattii to five antifungal drugs. Mycoses., v. 49, p. 324-330, 2006.
TE DORSTHORST, D. T. A.; VERWEIJ, P. E.; MELETIADIS, J.; BERGERVOET,

M.; PUNT, N. C.; MEIS, J. F. G. M.; MOUTON, J. W. In vitro interaction of
flucytosine combined with amphotericin B or fluconazole against thirty-five yeast
isolates determined by both the fractional inhibitory concentration index and the
response surface approach. Antimicrob Agents Chemother., v. 46, p. 2982-2989, 2002.
TEICHERT, M. Treatment of oral candidiasis with methylene blue-mediated

photodynamic therapy in an immunodeficient murine model, Oral Surg Oral Med Oral
Pathol Oral Radiol Endod., v. 93, p. 155-160, 2002.
TESHIMA, W.; NOMURA, Y.; TANAKA, N.; URABE, H.; OKAZAKI, M.;
NAHARA, Y. ESR study of camphorquinone/amine photoinitiator systems using blue
light-emitting diodes. Biomaterials, v. 24, p. 2097-2103, 2003.
TOLEDO, M. S.; LEVERY, S. B.; STRAUS, A. H.; TAKAHASHI, H. K. Dimorphic

expression of cerebrosides in the mycopathogen Sporothrix schenckii. J. Lipid
Research, v. 41, p. 797-806, 2000.
102
TOROSANTUCCI, A.; ROMAGNOLI, G.; CHIANI, P.; STRINGARO, A.; CRATERI,
P.; MARIOTTI, S.; TELONI, R.; ARANCIA, G,; CASSONE, A.; NISINI, R. Candida
albicans yeast and germ tube forms interfere differently with human monocyte
differentiation into dendritic cells: a novel dimorphism-dependent mechanism to escape
the host’s immune response. Infect. Immunity, v. 72, p. 833-843, 2004.
TREMBLAY, J-F.; DUSSAULT, S.; VIAU, G.; GAD, F.; BOUSHIRA, M.;
BISSONNETTE, R. Photodynamic therapy with toluidine blue in Jurkat cells:
cytotoxicity, subcellular localization and apoptosis induction. Photochem. Photobiol.
Sci., v. 1, p. 852-856, 2002.
TRILLES, L.; FERNÁNDEZ-TORRES, B.; LAZÉRA, M.S.; WANKE, B.;

SCHUBACH, A. O.; PAES, R. A.; INZA, I.; GUARRO, J. In vitro antifungal
susceptibilities of Sporothrix schenckii in two growth phases. Antimicrob. Agents
Chemother., v. 49, p. 3952-3954, 2005.
VLADIMIROV, Y. A.; OSIPOV, A. N.; KLEBANOV, G. I. Photobiological Principles

of Therapeutic Applications of Laser Radiation. Biochemistry. v. 69, p. 81-90. 2004.
WAINWRIGHT, M. Photodinamic antimicrobial chemotherapy (PACT). J. Antimicrob.

Chemother. v. 42, p. 13-28, 1998.
WALSH, T. J.; REX, J. H. All catheter-related candidemia is not the same: assessment
of the balance between the risks and benefits of removal of vascular catheters. Clin.
Infect. Dis., v. 34, p. 600-602, 2002.
WILSON, M.; MIA, N. Sensitization of Candida albicans to killing by low-power laser

light. J. Oral Pathol. Med. v. 22, p. 354-357, 1993.
WILSON, B. C.; PATTERSON, M. S. The physics, biophysics and technology of

photodynamic therapy. Phys. Med. Biol., v. 53, p. R61–R109, 2008.
ZAITZ, C.; RUIZ, L. R. B.; SOUZA, V. M. Dermatosis associated with yeast form
Malassezia genus. An. Bras. Dermatol., v. 75, p. 129-142, 2000.
103
ZARAGOZA, O.; CUENCA-ESTRELLA, M.; REGADERA, J.; RODRÍGUEZ-
TUDELA, J. L. The capsule of the fungal pathogen Cryptococcus neoformans
paradoxically inhibits invasive growth. The Open Mycology J., v. 2, p. 29-39, 2008.
ZEINA, B.; GREENMAN, J.; PURCELL, W. M.; DAS, B. Killing of cutaneous

microbial species by photodynamic therapy. British J. Dermol. v.144, p. 274-278, 2001.
104
VII – Anexos
105
Anexo 1:
Tabela 20: Descrição dos 40 isolados de Cryptococcus gattii
Isolado Fonte Origem Geográfica

Coleção de culturas da
ATCC 24065 Referência Universidade
da Georgia (Atlanta, GA, EUA)
ATCC 32608 Referência Universidade
ATCC 34883
Referência Universidade
(GSU 836 C)
Rio de Janeiro
23/10993 Clínico - líquor
Rio de Janeiro
29/10893 Clínico - líquor
Clínico - Tubo de Ceará
146/5503
cultura
Clínico - Tubo de Piauí
197/5168
cultura
FIOCRUZ, RJ
560/MPG-PI Clínico - líquor
Ambiental – Madeira FIOCRUZ, RJ
384/RJ-36
em decomposição
Ambiental - Madeira em FIOCRUZ, RJ
99/6934
decomposição
100/6933
decomposição
484/FOA-PI
decomposição
547/OTTI-97-PI-10
decomposição
547/OTTI-97-PI-11
decomposição
Parque do Ibirapuera, SP.
ICB 82 Ambiental - folhas de eucalipto,
Ambiental - folhas de eucalipto Parque do Ibirapuera, SP.
ICB 133
ICB 179
ICB 180
ICB 181
ICB 182
106
ICB 183
LMM FIOCRUZ, RJ
Clínico - líquor
818
FIOCRUZ, RJ
LMM 839 Clínico - líquor
FIOCRUZ, RJ
FIOCRUZ, RJ
FIOCRUZ, RJ
FIOCRUZ, RJ
FIOCRUZ, RJ
Instituto Adolfo Lutz (IAL), SP
139 H/ 03 Clínico - sangue
L-28/ 02 Clínico - líquor
1913 ER Clínico - líquor
135L/ 03 Clínico - líquor
196L/ 03 Clínico - líquor
L 02/ 99 Clínico - líquor
Centro Geral de Pediatria,
CGP-BH Clínico - líquor Belo Horizonte
107
Tabela 21: Descrição dos 12 isolados de Candida spp.
Isolado Espécie e Fonte Origem Geográfica

ATCC 18804 Candida albicans, Referência Coleção de culturas da
Universidade da Georgia
(Atlanta, GA, EUA)
ATCC 22019 Candida parapsilosis, Referência Coleção de culturas da
(Atlanta, GA, EUA)
ATCC 750 Candida tropicalis, Referência Coleção de culturas da
(Atlanta, GA, EUA)
ATCC 6258 Candida krusei, Referência Coleção de culturas da
(Atlanta, GA, EUA)
IA05 Candida albicans – lesões de mucosa Laboratório de Micologia, ICB/
oral em paciente HIV negativos UFMG
IB04 Candida albicans – lesões de mucosa Laboratório de Micologia, ICB/

IB19 Candida albicans – lesões de mucosa Laboratório de Micologia, ICB/

109 Candida albicans – lesões de mucosa Laboratório de Micologia, ICB/

AB19 Candida albicans – lesões de mucosa Laboratório de Micologia, ICB/

MOC18 Candida albicans – lesões de mucosa Laboratório de Micologia, ICB/

200 Candida parapsilosis – lesões de Laboratório de Micologia, ICB/

mucosa oral em paciente HIV negativos UFMG
IB13 Candida tropicalis – lesões de mucosa Laboratório de Micologia, ICB/

CG09 Candida tropicalis – lesões de mucosa Laboratório de Micologia, ICB/

108
Tabela 22: Descrição dos 12 isolados de Sporothrix spp.

ATCC 201679 Referência – isolado humano, forma Laboratório de Micologia, ICB/
linfocutânea UFMG
ATCC 201681 isolado humano, forma disseminada Laboratório de Micologia, ICB/

UFMG
MYC-3 isolado humano, forma cutânea-fixa Laboratório de Micologia, ICB/

UFMG
270 isolado humano, forma cutânea-fixa Laboratório de Micologia, ICB/

UFMG

UFMG

UFMG
G7 gato Laboratório de Micologia, ICB/

UFMG

UFMG
MYC-7 cão Laboratório de Micologia, ICB/

UFMG
CV cavalo Laboratório de Micologia, ICB/

UFMG
UFMG

UFMG
109
Anexo 2:
1 – Cryptococcus spp.
Tabela 23: Efeito fototóxico (Log10 UFC/ mL) da inativação fotodinâmica em 40

isolados de Cryptococcus gattii, utilizando irradiação, por 3 minutos, por diodo de
emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm e azul de orto-toluidina a 100 µg/ mL.

ATCC 24065 6,11 6,11 5,70 4,30
ATCC 32608 6,11 6,08 5,48 4,70
ATCC 34883 (GSU 836 C) 6,11 6,11 6,00 4,48
23/10993 6,23 6,07 6,03 5,15
29/10893 6,02 6,02 5,80 4,60
146/5503 6,15 6,08 5,81 4,90
197/5168 6,11 6,04 5,88 0
560/MPG-PI 6,15 6,03 6,01 4,30
384/RJ-36 6,11 6,04 4,30 4,95
99/6934 6,08 5,77 5,68 4,90
100/6933 6,08 5,91 5,57 4,78
484/FOA-PI 6,05 6,26 6,06 4,30

547/OTTI-97-PI-10 6,13 6,06 6,02 4,60
547/OTTI-97-PI-11 6,10 6,06 5,78 4,48
ICB 82 6,34 6,35 6,58 5,54
ICB 133 6,09 6,16 6,26 5,04
ICB 179 5,99 6,07 5,43 0
ICB 180 6,15 6,16 5,72 5,23
ICB 181 6,37 6,30 5,67 5,57
ICB 182 6,36 6,25 5,98 4,85
ICB 183 6,50 6,28 6,05 4,90

LMM 818 5,82 5,75 5,77 4,90
LMM 839 6,06 6,21 5,95 5,30
LMM 886 6,20 6,08 6,10 4,00
LMM 900 6,24 6,44 6,00 4,70
LMM 901 6,27 6,38 6,10 0
LMM 989 6,16 6,25 5,98 5,08
139 H/ 03 5,90 6,08 5,96 0
L-28/ 02 5,72 6,03 5,84 4,48
110
1913 ER 6,05 6,05 5,81 4,30
L-58/ 00 5,92 6,04 5,83 4,70
L-26/ 01 6,07 6,13 6,18 4,60
135L/ 03 6,02 6,05 6,21 4,00
L-24/ 01 6,15 6,12 6,01 4,00
196L/ 03 5,63 6,12 6,03 4,00
L 02/ 99 6,03 6,02 6,13 4,30
L 02/ 00 6,13 6,40 6,09 4,30
L 25/ 01 6,03 5,99 6,00 4,30
L 27/ 01 6,23 6,28 5,70 4,30
CGP-BH 6,10 6,35 6,14 0
111
isolados de Cryptococcus gattii utilizando irradiação, por 9 minutos, por diodo de
emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm e azul de orto-toluidina a 25 µM (7,645 µg/
mL).
ATCC 34883 (GSU 836 C) 6,45 6,37 6,38 0
ATCC 24065 6,45 6,39 6,39 4,31
ATCC 32608 6,03 6,15 6,07 4,24
L-58/ 00 6,09 6,15 6,17 4,31
L-26/ 01 6,34 6,38 6,30 4,16
L-24/ 01 6,17 6,13 6,13 2,24
L 27/ 01 6,09 6,10 6,01 0
135L/ 03 6,21 6,23 6,24 2,00
196L/ 03 6,03 6,16 6,11 4,00
1913 ER 6,28 6,22 6,24 4,00
L 02/ 99 6,11 6,14 6,06 0
LMM 818 6,15 6,11 6,07 0
LMM 989 6,17 6,15 6,10 2,16
CGP-BH 6,37 6,40 6,34 0
23/ 10993 6,20 6,12 6,05 0
29/ 10893 6,17 6,14 6,21 0
99/ 6934 6,36 6,41 6,31 2,00
547/OTTI-97-PI-10 6,37 6,25 6,26 0

547/OTTI-97-PI-11 6,06 6,06 6,13 2,16
ICB 180 6,12 6,36 6,29 2,00
ICB 181 6,26 6,31 6,22 2,16
Controles: fungo sem tratamento (Grupo 1), irradiação por diodo de emissão de luz (LED)
emitindo a 630 nm, por 9 minutos (Grupo 2), atividade do azul de orto-toluidina (TBO) a 25
µM (Grupo 3). IFD: irradiação do TBO a 25 µM com LED, por 9 minutos (Grupo 4).
112
Tabela 25: Valores de CIM, CFM e o quociente (CFM/CIM) de 48 amostras de leveduras para terbinafina
Amostras CIM (µg/ mL) CFM (µg/ mL) CFM/CIM Amostras CIM (µg/ mL) CFM (µg/ mL) CFM/CIM
1 ATCC 24065 0,125 8 64 25 LMM-900 1 8 8
2 ATCC 32608 2 8 4 26 LMM-901 1 8 8
3 ATCC 34883 0,25 8 32 27 LMM-989 0,5 1 2
4 23/10993 0,125 2 16 28 LMM-991 0,5 2 4
5 146/5503 0,25 2 8 29 139H/03 1 8 8
6 29/10893 0,25 4 16 30 1913ER 0,25 1 4
7 560/MPG-PI 1 8 8 31 135L/03 0,25 4 16
8 384/RJ-36 0,25 2 8 32 196L/03 0,25 2 8
9 99/6934 0,062 4 64 33 L-58/00 0,5 4 8
10 100/6933 0,062 2 32 34 L-28/02 0,5 8 16
11 197/5168 1 8 8 35 L-27/01 0,5 8 16
12 484/FOA-PI 1 8 8 36 L-26/01 0,5 2 4
13 547/OTTI/94-PI-10 1 8 8 37 L-250/01 0,5 8 16
14 547/OTTI/94-PI-11 0,5 8 4 38 L-24/01 0,5 8 16
15 ICB-179 1 8 8 39 L-02/99 0,5 8 16
16 ICB-180 0,5 4 8 40 L-02/00 0,5 4 8
17 ICB-181 0,5 2 4 41 CGP-BH 4 8 2
18 ICB-182 0,5 2 4 42 ATCC 24067A 2 8 4
19 ICB-183 1 4 4 43 ATCC 24067D2 2 8 4
20 ICB-82 0,5 2 4 44 ATCC 28957 0,25 1 4
21 ICB-133 0,062 2 32 45 ATCC 62066 0,5 2 4
22 LMM-818 2 8 4 46 GSUF 3502A 0,125 8 64
23 LMM-839 0,25 0,5 2 47 ATCC 6258 1 2 2
24 LMM-886 0,5 8 16 48 ATCC 22019 0,25 4 16
1-7, 11,22-41 = Amostras clínicas de Cryptococcus gattii; 8-10 e 12-21 = Amostras ambientais de Cryptococcus gattii; 47 e 48 = Amostras Candida spp.;
42-46 = Amostras de Cryptococcus neoformans.
113
2 – Candida spp.
isolados de Candida spp. utilizando irradiação, por 15 minutos, por diodo de emissão de
luz (LED) emitindo a 630 nm e azul de orto-toluidina a 25 µM (7,645 µg/ mL).

IA05 6,37 6,51 6,42 2,83
IB04 6,38 6,46 6,25 4,41
IB19 6,45 6,42 6,46 1,33
109 6,19 6,31 6,07 2,66
AB19 6,37 6,36 6,33 4,10
MOC18 6,36 6,16 6,32 1,33
ATCC 18804 6,58 6,58 6,43 4,36
ATCC 22019 6,37 6,48 6,20 4,04
200 6,99 6,99 6,97 1,43
750 6,28 6,19 6,25 1,43
IB13 6,35 6,42 6,22 4,00
CG09 6,05 6,35 6,26 4,00
114
Tabela 27: Inibição da adesão de células de 12 isolados de Candida spp. a células
epiteliais bucais (CEB), após inativação fotodinâmica, utilizando irradiação por 15
minutos por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm e azul de orto-toluidina
a 25 µM (7,645 µg/ mL) (número de leveduras/ 50 CEB).

IA05 157 145 93 62
IB04 40 51 48 27
IB19 189 237 197 133
109 72 107 111 56
AB19 94 54 42 30
MOC18 59 55 35 26
ATCC 18804 53 40 47 25
ATCC 22019 36 48 50 23
200 94 92 73 38
750 79 38 30 29
IB13 85 62 75 36
CG09 129 52 78 44
115
Tabela 28: Porcentagem de redução da adesão de células de Candida spp., após
inativação fotodinâmica, utilizando irradiação, por 15 minutos, por diodo de emissão de
luz (LED) emitindo a 630 nm e azul de orto-toluidina a 25 µM (7,645 µg/ mL)
Amostras Grupo 1 Grupo 4 Porcentagem (%)

IA05 157 62 61
IB04 40 27 33
IB19 189 133 30
109 72 56 22
AB19 94 30 68
MOC18 59 26 56
ATCC 18804 53 25 53
ATCC 22019 36 23 36
200 94 38 60
750 79 29 63
IB13 85 36 58
CG09 129 44 66
Mediana: 55%; Valor mínimo: 22%; Valor máximo: 68%
Grupo 1: fungo sem tratamento; Grupo 4 irradiação do azul de orto-toluidina (TBO) a 25 µM por diodo
de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm, por 15 minutos.
Tabela 29: Perfil de susceptibilidade (concentrações inibitórias mínimas – CIM) de 10

isolados de Candida spp (µg/ mL) ao fluconazol.
Amostras Valores de CIM (µg/ mL)

IA05 128
IB04 4,00
IB19 0,50
109 0,50
AB19 0,25
MOC18 1,00
ATCC 18804 2,00
ATCC 22019 2,00
200 128
750 128
IB13 1,00
CG09 128
116
3 – Sporothrix spp.
isolados de Sporothrix spp. (forma leveduriforme), utilizando irradiação, por 3 minutos,
por diodo de emissão de luz (LED) emitindo a 630 nm e azul de orto-toluidina a 100 µg/
mL.

ATCC 201679 6,58 6,57 6,69 6,27
ATCC201681 6,43 6,20 6,46 4,82
MYC-3 6,31 6,26 6,26 5,02
270 6,67 6,39 6,39 4,72
442 6,18 6,01 6,10 5,66
625 6,73 6,77 6,69 5,80
G7 6,38 6,34 6,38 5,58
G33 6,41 6,44 6,64 5,22
MYC-7 5,70 5,87 5,89 4,59
CV 6,07 5,96 6,22 0,00
G5 6,63 6,63 6,59 5,84
G13 6,01 5,87 6,14 4,00
630 nm, por 3 minutos, (Grupo 2), atividade do azul de orto-toluidina (TBO) a 100 µg/ mL (Grupo 3).
117
Anexo 3:
Artigo publicado na Revista Iberoamericana de Micologia. v. 25, p. 242-245, 2008.
Anexo 4:
Artigo publicado no Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. v. 94, p.
65-70, 2009.
118

Tese - Betania Maria Soares - Terapia Fotodinâmica em Fungos Dimórficos

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BETÂNIA MARIA SOARES

Inibição Fotodinâmica em Fungos:

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Orientadora: Profª. Drª. Patrícia Silva Cisalpino

... e a Vó Geralda pelas orações

A meus pais, que me ensinaram o amor, a esperança e a dignidade, e ajudaram-me

A Cláudio agradeço pelo olhar de apoio, palavras de incentivo, atitudes de amor.

A meus familiares que me incentivaram a seguir em frente.

A D. Lúcia que me acolheu com carinho e dedicou tamanha atenção.

“É inútil tentar resumir certas pessoas, só se pode mesmo seguí-los”

Com carinho, respeito e admiração, agradeço e ofereço este sonho concretizado

a minha Orientadora Profª. Drª. Patrícia Silva Cisalpino, pela dedicação,

ao meu Co-Orientador Prof. Dr. Marcos Pinotti, que me abriu as portas,

à Coordenadora do curso de pós-graduação em Microbiologia, Profª. Drª.

A Walquíria Lopes Borges e Silva. De seu apoio nasceram a tranqüilidade e a

A Roberta, Suzana, Profª. Daniele, Daniel, Thaissa e Marco Aurélio, pela

A Silvinha (meu orgulho!) e Graciela por cada abraço e olhar de carinho.

A Patrícia Rangel pela ajuda nos experimentos, troca de experiências e amizade.

Aos Professores do Departamento de Microbiologia, em especial Profª. Maria

Ao Prof. Maurício Veloso Brant Pinheiro, do Departamento de Física, pela

A Cecília e Ana Paula, da Biblioteca do ICB/ UFMG, pela competência, simpatia e

A Selma Reis por me acolher com palavras sinceras de incentivo, estendendo-me a

À Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM), na pessoa

Ao Vice-Reitor da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri

Aos Professores da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri

Aos funcionários e amigos da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e

À MMOptics, Aptivalux, à Ecco Fibras e ao Departamento de Física por

À Hypofarma Indústria Farmacêutica Ltda. por ceder os fotossensibilizadores

TABELA 11: Diferença de sensibilidade entre os isolados clínicos e ambientais de Cryptococcus

TABELA 20: Descrição dos 40 isolados de Cryptococcus gattii ............................................................. 106

TABELA 21: Descrição dos 12 isolados de Candida spp. ....................................................................... 108

TABELA 22: Descrição dos 12 isolados de Sporothrix spp. .................................................................... 109

TABELA 29: Perfil de susceptibilidade (concentrações inibitórias mínimas – CIM) de 10 isolados de

FIGURA 1: Representação da molécula do fulereno ................................................................................... 15

FIGURA 2: Representação do Laser de Rubi .............................................................................................. 17

FIGURA 3: Representação de um diodo de emissão de luz (LED) ............................................................. 19

FIGURA 4: Representação do protocolo experimental utilizado nos testes de inativação fotodinâmica

III. 1. a – Padronização, preparo e tratamento do inóculo ....................................................................... 26

a) Avaliação, in vitro, da susceptibilidade de 40 isolados de Cryptococcus gattii aos efeitos

b) Avaliação da redução da viabilidade celular de Cryptococcus gattii após consecutivas aplicações

d) Avaliação da susceptibilidade de 21 isolados de Cryptococcus gattii à IFD, após otimizadas as

e) Determinação a susceptibilidade, in vitro, dos isolados de Cryptococcus gattii frente à terbinafina ..

b) Avaliação da susceptibilidade, in vitro, de diferentes espécies de Candida spp. à IFD ...................... 35

III. 5 – Malassezia furfur - Avaliação da susceptibilidade, in vitro, à IFD de um isolado clínico

III. 6 – Análises estatísticas ...................................................................................................................... 39

IV. 1. a – Padronização, preparo e tratamento do inóculo ....................................................................... 42

a) Avaliação, in vitro, da susceptibilidade de 40 isolados de Cryptococcus gattii aos efeitos

b) Avaliação da redução da viabilidade celular de Cryptococcus gattii, após consecutivas aplicações

d) Avaliação da susceptibilidade de 21 isolados de Cryptococcus gattii à IFD, após otimizadas as

e) Determinação a susceptibilidade, in vitro, dos isolados de Cryptococcus gattii frente à terbinafina . 68

b) Avaliação da susceptibilidade, in vitro, de diferentes espécies de Candida spp. à IFD, após

e) Determinação da susceptibilidade de 12 isolados de Candida spp. ao fluconazol .............................. 75

a) Susceptibilidade de 12 isolados Sporothix spp. à IFD (fase leveduriforme) ....................................... 77

I. 2.1 - Cryptococcus spp.

I. 2.2 - Candida spp.

I. 2.4 - Malassezia spp.

I. 2.5 – Agentes antifúngicos

I. 2.6 - Inibição Fotodinâmica (IFD)

Mecanismo de ação da inativação fotodinâmica

Figura 1: Representação da molécula do fulereno (www.google.com.br)

Figura 2: Representação do Laser de Rubi (www.google.com.br)

Características da Luz Laser

Lasers de baixa intensidade