Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Cincias da Sade Faculdade de Farmcia

Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas

FORMAS FARMACUTICAS SEMI-SLIDAS DE USO TPICO CONTENDO NIFEDIPINA: DESENVOLVIMENTO GALNICO E AVALIAO BIOFARMACOTCNICA

Ana Karla De Santis

Rio de Janeiro 2008

Ana Karla De Santis

Formas Farmacuticas Semi-slidas de Uso Tpico Contendo Nifedipina: Desenvolvimento Galnico e Avaliao Biofarmacotcnica

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Mestre em Cincias Farmacuticas.

Orientadora: Profa Dra Elisabete Pereira dos Santos Co-Orientadora: Dra Zaida Maria Faria de Freitas

Ana Karla De Santis

Rio de Janeiro 2008

Ana Karla De Santis

S236f

Santis, Ana Karla De. Formas farmacuticas semi-slidas de uso tpico contendo nifedipina:desenvolvimento galnico e avaliao biofarmacotcnica / Ana Karla De Santis; orientadora Elisabete Pereira dos Santos; co-orientadora Zaida Maria Faria de Freitas. Rio de Janeiro: UFRJ, Faculdade de Farmcia, 2008. x, 156p. :il. ; 30 cm. Dissertao (Mestrado em Cincias Farmacuticas) UFRJ, Faculdade de Farmcia, 2008. 1. Nifedipina. 2 Liberao de frmacos. 3. Estudos reolgicos. I. Santos, Elisabete Pereira dos. II. Freitas, Zaida Maria Faria de. CDD:615.19

FORMAS FARMACUTICAS SEM-ISLIDAS DE USO TPICO CONTENDO NIFEDIPINA: DESENVOLVIMENTO GALNICO E AVALIAO BIOFARMACOTCNICA Orientadora ____________________________________________________ Profa Dra Elisabete Pereira dos Santos Faculdade de Farmcia - UFRJ Co-Orientadora ____________________________________________________ Dra Zaida Maria Faria de Freitas Faculdade de Farmcia - UFRJ Banca Examinadora

____________________________________________________ Prof Dr Eduardo Ricci Jnior Faculdade de Farmcia - UFRJ ____________________________________________________ Prof. Dr. Davi Pereira de Santana Departamento de Farmcia - UFPE

____________________________________________________ Profa Dra Nadia Maria Volpato Faculdade de Farmcia - UFRS

DEDICATRIA

A Deus, pela Sua manifestao em iluminao, fora, determinao e perseverana, que me permitiram concluir este trabalho.

A meus pais, Amlia e Jos Carlos, exemplos de dedicao e trabalho, cujo amor, conforto, apoio e incentivo sempre me impulsionaram.

Ao meu marido Fbio, pela compreenso, cooperao, companheirismo e amor.

queles que procuram deixar sua contribuio para o bem da humanidade.

AGRADECIMENTOS

minha orientadora, Profa. Dr

a.

Elisabete Pereira dos Santos, que me

acolheu e me proporcionou a oportunidade de realizar este trabalho.

Dr

a.

Zaida Maria Faria de Freitas, colega de vrios anos de trabalho na

Farmcia Universitria da UFRJ, pela coorientao neste projeto, pelo empenho em providenciar os recursos materiais e tambm o apoio moral, nos meus momentos de crise.

Aos meus pais, que sempre apostam na minha capacidade e se empenham de corpo e alma para proporcionar - me as oportunidades de caminhar em busca dos meus sonhos, e que vibram com cada uma de minhas conquistas como se fossem suas.

Ao meu marido, que se superou em cooperao moral, sentimental e intelectual neste perodo to conturbado para que eu pudesse concluir mais este projeto de vida.

Farmcia Universitria da UFRJ e toda a sua equipe, que participam da minha vida h tantos anos, pelo ambiente agradvel e acolhedor, apoio fsico e estrutural durante o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Laboratrio de Controle de Qualidade de Frmacos e Medicamentos LabCQ, aqui representado pelas sempre solcitas Eliane, Tailane e Maria, pelo apoio tcnico e incentivo.

Venicio Feo da Veiga (IMPPG) pela colaborao nos trabalhos de microscopia ptica de luz polarizada.

Profa. Dr

a.

Lycia de Brito Gitirana do Laboratrio de Histologia Animal e

Comparada (DHE-ICB-UFRJ) pela colaborao na caracterizao histolgica dos estratos cutneos de pele suna.

Ao Instituto de Zootecnia da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, ao Prof Everton, coordenador da Fazenda e toda a sua equipe, pela gentileza e cooperao no fornecimento das orelhas sunas.

Ao Prof. Dr. Marcio Nele de Souza (Escola de Qumica da UFRJ) e Kelly (LADEQ) pela colaborao nos ensaios de reologia.

Ao Prof. e amigo Marcos Kneip Fleury pela colaborao nos ensaios de microscopia ptica, e por dar aquela fora para suavizar os momentos difceis com palavras de incentivo.

equipe da Biblioteca Setorial da Faculdade de Farmcia da UFRJ pela eficincia e simpatia na colaborao em localizar literatura para compor este trabalho. 7

s minhas alunas, e agora colegas de profisso, Talita Brunoro e Marcela Ribeiro, pela disposio e barvura em aceitar o desafio do estgio, sem as quais o trabalho teria sido muito, muito mais rduo.

s minhas amigas Glucia Miranda e Brbara Lorca, e colegas Mariana Sato e Vnia Bucco por compartilharem os momentos de alto astral, e tambm os de baixo, quando nos animvamos umas s outras.

s professoras Sheila Garcia e Mnica Freiman pelas suas contribuies atravs da comisso de acompalhamento, ao longo do desenvolvimento deste trabalho.

Profa. Dr a. Gisella Ortiz, pelo apoio e delicadeza no exerccio do papel de coodenadora do Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas da UFRJ.

Aos professores Nadia Maria Volpato, Davi Pereira de Santana e Eduardo Ricci Junior, pela pronta disposio em contribuir com este trabalho.

todos aqueles que intimamente sabem ter contribudo de maneira direta ou indireta para a concretizao deste trabalho.

Agradecimento especial minha amiga Lais Bastos da Fonseca, que muito me ensinou e me conduziu, durante todo este trabalho.

O universo est cheio de coisas mgicas, esperando pacientemente que nossa inteligncia se torne mais aguda. Eden Phillpotts

RESUMO A nifedipina (NFD) uma substncia do tipo das dihidropiridinas, antagonista do clcio. preconizada primordialmente para tratamento de doena cardiovascular. Entretanto, a sua aplicao tem sido descrita para o tratamento de leses cutneas oriundas de doena vascular perifrica e de lceras diabticas. Alguns autores reportam sucesso no tratamento de pacientes portadores de leses cutneas refratrias aos tratamentos tradicionais aplicando nifedipina (NFD) em base organogel de lecitina e polaxamer 407 (PLO), por via tpica. A eficcia da terapia tpica depende das caractersticas de liberao do frmaco, do veculo e da farmacocintica da substncia ativa no tecido cutneo, e portanto, de como ela se difunde atravs da pele. Neste estudo foram desenvolvidas trs formulaes contendo 8% de NFD: PLO+NFD, PLO+NFD+Transcutol e EMUL (uma emulso o/a sem PLO), que foram estudadas quanto s caractersticas fsico-qumicas e quanto ao comportamento biofarmacotcnico. Um sistema bicompartimental de difuso vertical com membrana sinttica (acetato de celulose) e membrana natural (pele suna) foi empregado para avaliar in vitro a taxa de liberao e a avaliao da penetrao, e eventual permeao do frmaco, respectivamente. Todas as amostras foram analisadas por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE), com mtodo previamente validado. Os ensaios de liberao in vitro resultaram em um fluxo de frmaco normalizado por rea, correspondente a 4,026 0,081; 6,26 0,288 e 6,389 0,254 g/cm2/h para PLO+NFD+Transcutol, PLO+NFD e EMUL, respectivamente. A quantidade de NFD liberada por rea no apresentou diferena estatisticamente significativa entre as trs formulaes com p> 0,05, pela ANOVA com = 0,05. A quantidade de NFD nos estratos cutneos da pele suna diminuiu com a profundidade, desta maneira, na derme foi detectada menor quantidade de frmaco aps aplicao das formulaes PLO+NFD, PLO+NFD+Transcutol e EMUL, e uma pequena quantidade foi quantificada na soluo receptora aps 24 horas. As formulaes PLO+NFD, PLO+NFD+Transcutol e EMUL apresentaram um perfil de penetrao cutnea na epiderme e na derme estatisticamente diferente ao nvel de 5%, com p<0,0001. Em todas as formulaes detectou-se maior quantidade de NFD na epiderme em relao derme. A interao quanto solubilidade entre ativos e excipientes determina a atividade termodinmica dos frmacos nas preparaes semi-slidas e penetrao nas camadas cutneas. Face aos resultados obtidos, a incorporao da NFD em diferentes formulaes com PLO e/ou Transcutol alterou esse parmetro fsico-qumico, conforme esperado. Uma vez que o transcutol aumentou a solubilidade do ativo nas formulaes e promoveu sua penetrao nos estratos cutneos: epiderme e derme. Palavras chave: nifedipina, transcutol, polaxamer, organogel de lecitina e pluronic.

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ABSTRACT

Nifedipine (NFD) is a dihydropyridine calcium antagonist and is commonly prescribed to cardiovascular conditions. Its use in cutaneous lesions related to diabetes and cardiovascular conditions have also been described. Topic NFD formulations based on poloxamer 407 and lecithin organogel have been suggested as an alternative means to treat wounds that are refractory to conventional procedures. Topic treatment effectiveness relies on drug release features and its pharmacokinetics in cutaneous tissues, as well as how it diffuses through skin; vehicle properties are also of major importance. This work presents three 8% NFD formulations PLO+NFD, PLO+NFD+Transcutol, and EMUL (a PLO free o/w emulsion) and studies their physicochemical properties and its biopharmacotechnical behavior. A bicompartmental vertical diffusion system using either a synthetic (cellulose acetate) and a natural (swine skin) membrane was used to assess drug release and penetration in vitro, and possible permeation. All samples were analysed with a High Performance Liquid Chromatography (HPLC) validated protocol. PLO+NFD+Transcutol, PLO+NFD and EMUL showed, respectively, 4,026 0,081, 6,26 0,288 and 6,389 0,254 g/cm2/h drug flux in vitro. The amount of NFD released had no statistically significant difference among formulations; p > 0,05 and = 0,05. In the swine skin layers, the amount of NFD decreased with depth. Therefore, a smaller amount of the drug was detected in dermis after PLO+NFD+Transcutol, PLO+NFD and EMUL formulations were applied, and a small amount was quantified in the receptor solution after 24 h. PLO+NFD+Transcutol, PLO+NFD and EMUL formulations penetration patterns were different from the 5% level, p<0,0001. A higher amount of NFD was detected in epidermis for all formulations, in comparison to that found in dermis. Relative solubility of active principle and vehicle determines drug thermodynamics in semi-solid preparations and penetration into cutaneous layers. Results show NFD altered this physicochemical parameter when added to PLO and/or Transcutol formulations, as expected. Transcutol increased drug solubility and promoted its penetration into cutaneous layers: dermis and epidermis.

Keywords: nifedine, transcutol, poloxamer, pluronic lecithin organogel.

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LISTA DE FIGURAS Pgina Figura 1 - Representao esquemtica da pele mostrando as possveis rotas de penetrao. Figura 2 - Representao esquemtica da estrutura da camada crnea. Figura 3 Representao esquemtica de uma clula de difuso na qual o compartimento doador contm o difusante na concentrao C. Figura 4 - Difuso atravs de um filme fino, onde as molculas do soluto difundem da zona de maior concentrao (C1), para a de menor concentrao (C2). As concentraes em ambos os lados do filme so mantidas constantes. No estado de equilbrio, as concentraes permanecem constantes em todos os pontos do filme. O perfil de concentrao dentro do filme linear e o fluxo constante. Figura 5 - Perfil para penetrao em funo do tempo de um frmaco ideal que se difunde atravs da pele humana. Aps a instalao do estado de difuso estacionrio. Figura 6 - Estrutura qumica da Nifedipina Figura 7 - Paciente com cicatriz hipertrfica antes do tratamento (a) e aps trs semanas (b) de tratamento tpico com nifedipina. Figura 8 - Diagrama esquemtico da preparao de organogis de lecitina, proposto por Kumar e Ktare (2005). Frmacos lipoflicos so solubilizados na fase orgnica, enquanto compostos hidroflicos podem ser solubilizados na fase polar. Para a preparao do PLO, o co-surfactante (polaxamer) adicionado fase polar. Figura 9 - rea posterior da aurcula suna: A e B so recomendadas para utilizao experimental. Figura 10 - Seringas tipo luer lock com o corpo vedado com parafilme na extremidade anterior Figura 11 - Seringas conectadas, uma outra pela extremidade anterior, utilizando-se o adaptador (extrusor). Figura 12 - Mecanismo de extruso: o contedo das seringas foi homogeneizado empurrando-se lentamente um mbolo por vez. 12 34 34 37 39

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45 48 56

63 69 70 70

Pgina Figura 13 - Acondicionamento da preparao em pote plstico preto par proteo contra a luminosidade. Figura 14 - Esquema do reparo das amostras para determinao da exatido Figura 15 - Remetro ARES -TA utilizado nas medidas de viscosidade. Figura 16 - Etapas realizadas validao da metodologia para extrao da NFD dos estratos cutneos: epiderme e derme. Corte dos segmentos de pele (a) (b) e (c); separao dos extratos cutneos (d) (e) (f); adio de NDF (g); transferncia para eppendorf (h); adio de fase mvel extratora (i); agitao em vortex (j); centrifugao (k); filtrao para eppendorf mbar (l). Figura 17 - Sistema de difuso vertical montado com membrana artificial de acetato de celulose Figura 18 - Aplicao da amostra de formulao no compartimento doador do sistema de difuso. Figura 19 - Espectro de absorbncia obtido durante o doseamento da NFD pelo mtodo de espectrofotometria de absoro ultravioleta (UV). Figura 20 - Resoluo do cromatograma da matria prima NFD empregando as seguintes condies: fase mvel H2O:AcN:MeOH (50:25:25), fluxo 1 mL/min, coluna C18 (15 cm) e concentrao da amostra 100 g/mL. Figura 21 - Anlise do cromatograma da NFD por arranjo de foto diodos, mostrando a pureza do sinal, modificando de intensidade nos tempos entre 3,20 3 3,70 minutos. Figura 22 - Espectros de varredura no UV-vis de 200 a 1000 nm das amostras: Branco (solvente), Padro (NFD+solvente), Placebo (excipintes) e Amostra (formulao contendo NFD) Figura 23 - Solues obtidas para a curva padro realizada pelo mtodo de UVvis para o doseamento da NFD. Figura 24 - Grficos da recuperao isotrmica da consistncia aps a determinao da curva de consistncia para as amostras em estudo: (a) PLO base, (b) PLO+NFD, (c) PLO+NFD+ TC e (d) EMUL. 13 71 83 86 92

93 85 102 102

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Figura 25 - Grficos obtidos no estudo da temperatura de transio sol-gel das amostras (com rplicas dos ensaios) de PLO base (a), PLO+NFD (b) e PLO+NFD+ TC (c), medindo-se a viscosidade em funo da temperatura a uma taxa de cisalhamento constante.. Figura 26 - Mostra as microestruturas das formulaes observadas por MO simples no aumento de 100X. PLO base (a), PLO+NFD (b), PLO+NFD+ TC (c) e EMUL (d). Figura 27 - Fotomicrografias das formulaes observadas por MO de imerso com luz polarizada no aumento de 100X. PLO base (a), PLO+NFD (b), PLO+NFD+ TC (c) e EMUL (d).contendo as medidas aleatrias: relativa homogeneidade no tamanho das micelas nas formules contendo PLO, na ordem de 0,8 m. Na formulao EMUL foi possvel observar uma maior heterogeneidade e um tamanho mdio maior das micelas, na ordem de 2,4 m, onde as maiores chegaram a 10,4 m, neste campo de observao Figura 28 - Eluio de solues padro de NFD em trs concentraes: a) 0,063 g/mL, b) 0,15 g/mL, c) 0,5 g/mL. O tempo de reteno foi de 9,6 minutos. Figura 29 - Representao grfica das curvas analticas, obtidas por CLAE, em trs experimentos diferentes. Figura 30 - Quantidade de NFD liberada por rea. Erro de barras indica erro padro da mdia (e.p.m.). Figura 31 - Fotomicrografia em microscopia de luz da amostra pele suna submetida ao processo de separao de epiderme e derme. Colorao: hematoxilina-eosina; Barra = 20m. Figura 32 - Curvas analticas de NFD 0,34 a 5,04 g/mL Figura 33 - Cromatogramas obtidos no experimento de extrao da NFD da pele suna empregando solvente gua:acetonitrila:metanol (50:25:25), para a avaliao da especificidade do mtodo. A) soluo padro de NFD, b) branco da epiderme, c) epiderme na presena de NFD, d) branco da derme, e) derme na presena de NFD. Tempo de reteno da NFD = 16 min. Figura 34 - Massas absolutas de NFD extradas da epiderme e derme aps 24 horas de contato das formulaes com a pele, em uma rea de 1,54 cm2. 14

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LISTA DE TABELAS

Pgina Tabela 1 - Principais formulaes comercializadas no Brasil farmacuticas contendo NFD 50 101 101 105 108 108 108 109 110 110 116 117 124 127

Tabela 2 - Resultados dos testes de perda por dessecao e ponto de fuso da NFD de acordo com a F. Brs IV (1996). Tabela 3 - Anlise quantitativa (doseamento) da matria prima pr espectrofotometria de absoro de acordo com a F. Brs IV (1996). Tabela 4 - Anlise estatstica da regresso linear das curvas padro Tabela 5 Resultados do teste de exatido para PLO base+ TC Tabela 6 Resultados do teste de exatido para PLO base Tabela 7 Resultados do teste de exatido para EMUL base Tabela 8 - Resultados das analises de teor de NFD nas trs formulaes em estudo, armazenadas temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Tabela 9 - Valores de pH apresentados pelas formulaes em estudo Tabela 10 - Valores da viscosidade aparente a uma taxa de cisalhamento de 500 (s-1), para as formulaes em estudo. Tabela 11 - Valores de G`e G`` comparados entre as formulaes PLO base (sem frmaco e sem transcutol) e PLO+NDF+Trc. Tabela 12 - Faixa de temperatura que compreende a transformao sol-gel, bem como o valor mdio, na formulao PLO+NFD Tabela 13 - Valores obtidos para a solubilidade da NFD nas solues testadas: Tabela 14 - Apresenta os resultados das respostas obtidas para as cinco concentraes de NFD, preparadas em triplicata, em cada dia de anlise, seus desvios padro (DP), desvios padro relativos (DPR)e parmetros da curva. Tabela 15 - Fluxo no estado estacionrio (Jss) para cada uma das formulaes estudadas 15

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Pgina Tabela 16 - Recuperao mdia de NFD dos tecidos para trs nveis do frmaco e seus DPR. de 1,54 cm2, aps 24 horas de contato com a formulao. Tabela 17 - Massas de NFD obtidas da derme e da epiderme suna em uma rea Tabela 18 - Quantidade de NFD (g/mL) encontrada no meio receptor aps 24h de ensaio. 133

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LISTA DE ABREVIATURAS

ANOVA Anlise de varincia CLAE Cromatografia lquida de alta eficincia CTZ - Cetononazol DP Desvio padro DPR Desvio padro relativo EC Estrato crneo EPM Erro padro da mdia FB Farmacopia Brasileira G- Mdulo elstico G - Mdulo viscoso H2O:AcN:MeOH Mistura eluente de gua, acetonitrila e metanol IC Coeficiente angular da curva analtica IPM Miristato de isopropila IPP Palmitato de isopropila Jss Fluxo no estado estacionrio Kp Coeficiente de partio LabCq Laboratrio de Controle de Qualidade da FF-UFRJ LD Limite de deteco LO Organogel de lecitina LQ Limite de quantificao NFD Nifedipina nm Nanmetro PA pro analisi PaS - Pascal PDA Arranjo de fotodiodo PLO Gel de lecitina e polaxamero
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PVC Cloreto de polivinila r Coeficiente de correlao de Pearson r2 Coeficiente de determinao s-1 Taxa de cisalhamento / segundo SUPAC Scale-Up and Postapproval Changes TC Transcutol monometil ter de dietilenoglicol UFRRJ Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro USP United States Pharmacopeia UV Ultravioleta UV-PDA Detector ultravioleta com arranjo de fotodiodo UV-Visvel Ultravioleta-visvel Nvel de significncia g Micrograma L Microlitro m Micrmetro Delta

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SUMRIO

Pgina 1 INTRODUO 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral 2.2 Objetivos especficos 3 REVISO BIBLIOGRGICA 3.1 Pele 3.2 Penetrao de Frmacos pela Pele 3.3 Aspectos Fsico-Qumicos da Absoro Percutnea 3.3.1 Efeitos do Frmaco na Penetrao Cutnea 3.3.2 Efeitos do Veculo na Penetrao Cutnea 3.4 A Niifedipina (NFD) 3.4.1 Propriedades Fsico-qumicas da Nifedipina (NFD) 3.4.2 Aplicaes da NFD para o Uso Tpico 3.5 Formulaes Semi-Slidas de Uso Tpico 3.5.1 Organogel de Lecitina e Polaxamer 407 (PLO) 3.5.1.1 Composio do Organogel 3.5.1.1.1 A Lecitina 3.5.1.1.2 O Solvente Orgnico 3.5.1.1.3 O Solvente Polar 3.5.1.1.4 O Polaxamer 407 24 29 29 29 31 31 33 36 41 43 44 44 45 51 52 53 53 54 54 55

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Pgina 3.5.1.1.5 O Monoetil ter de Dietileniglicol - Transcutol (TC) 3.5.2 Reologia dos Semi-slidos 3.5.2.1 Sistemas No Newtonianos 3.5.2.2 Tixotropia 3.5.3 Estudos in vitro 4 MATERIAL E MTODOS 4.1 Material 4.1.1 Equipamentos e Acessrios 4.1.2 Reagentes e Matrias-primas 4.1.3 Substncia Qumica de Referncia (sqr) e Formulaes 4.2 Mtodos 4.2.1 Composio e Tcnica de Preparao das Formulaes Desenvolvidas 4.2.1.1 Formulao PLO+NFD: base PLO contendo 8% de nifedipina 4.2.1.1.1.Tcnica de Preparo da Formulao PLO+NFD 4.2.1.2 Formulao PLO+NFD+TC: base PLO contendo 8% de nifedipina e 10% de transcutol 4.2.1.2.1 Tcnica de Preparo da Formulao PLO+NFD+TC 4.2.1.3 Formulao EMUL: base PLO contendo 8% de nifedipina 4.2.1.3.1 Tcnica de Preparo da Formulao EMUL 4.2.2 Anlise da Matria-prima Nifedipina 4.2.2.1 Perda por Dessecao 4.2.2.2 Anlise Quantitativa (Doseamento) por Espectrofometria de Absoro Ultravioleta (UV) 56 57 57 59 60 64 64 64 66 67 67 67 68 68 71 72 73 73 74 74 75

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Pgina 4.2.2.3 Anlise Qualitativa do Pico da NFD Matria-prima por CLAE com Detector de UV com Arranjo de Foto Diodos (PDA) 4.2.3 Anlise Quantitativa da NFD nas Formulaes por Espectrofotometria de Absoro no Ultravioleta visvel (UV-visvel) Reao Colorimtrica 4.2.3.1 Preparo das Solues de Trabalho 4.2.3.1.1 Soluo de cido Sulfrico 4M 4.2.3.1.2 Soluo de Molibdato de Amnio 0,02M em cido sulfrico 4M 4.2.3.1.3 Soluo tampo de cido ctrico 0,1 M com fosfato de sdio 0,2 M de pH = 4,0 4.2.3.2 Preparo das amostras de formulao para determinao de teor de NFD 4.2.3.3 Preparo do placebo 4.2.3.4 Preparo do branco 4.2.3.5 Preparo da Curva Analtica 4.2.3.6 Validao do mtodo espectrofotomtrico 4.2.3.6 1 Especificidade 4.2.3.6 2 Linearidade 4.2.3.6 3 Exatido 4.2.3.6 4 Preciso intra e inter dia 4.2.3.6 5 Limite de deteco (LD) e quantificao (LQ) 4.2.4 Caracterizao Geral das Formulaes 4.2.4.1 Determinao do pH 4.2.4.2 Determinao da Reologia 4.2.4.3 Determinao do aspecto morfolgico por microscopia ptica 4.2.4.4 Determinao do teor do frmaco nas formulaes 21 76 77 77 77 78 78 78 79 80 80 81 81 82 82 84 84 85 85 85 86 87

Pgina 4.2.5 Liberao in vitro Atravs de Membrana Sinttica 4.2.5.1 Estudo da solubilidade da NFD e escolha da soluo receptora 4.2.5.2 Estabelecimento das condies analticas para a NFD por CLAE 4.2.5.2.1 Parmetros da validao da metodologia analtica para a NFD nas amostras por CLAE 4.2.5.2.2 Validao da metodologia para extrao da NFD dos estratos cutneos: epiderme e derme 4.2.5.2.3 Metodologia para extrao da NFD da epiderme e derme suna 4.2.5.2.4 Estudo de Liberao in vitro 4.2.5.2.5 Ensaio de liberao in vitro da NFD das formulaes semi-slidas 4.2.6 Permeao / Penetrao Atravs de Membrana Natural de Pele Suina 4.2.6.1 Preparo da pele suna 4.2.6.2 Montagem do sistema de difuso 4.2.6.3 Caracterizao Histolgica dos Estratos de Cutneos 4.2.6.4 Mtodos em Microscopia de Luz 5 RESULTADOS E DISCUSSO 5.1 Anlise da Matria-Prima Nifedipina (NFD) 5.2 Caracterizao Geral das Formulaes 5.2.1 Validao do Mtodo para a Anlise Quantitativa da NFD nas Formulaes por Espectrofotometria de Absoro no UV-Vis Reao Colorimtrica 5.2.1.1 Especificidade 5.2.1.2 Linearidade 5.2.1.3 Preciso 5.2.1.4 Exatido 22 87 87 88 89 90 91 93 94 96 96 97 98 99 101 101 103 103 104 105 107 107

Pgina 5.2.1.5 Determinao do Teor de NFD nas Formulaes 5.2.2 Determinao do pH 5.2.3 Determinao da Reologia 5.2.4 Verificao do Aspecto Morfolgico das Formulaes por Microscopia ptica (MO) 5.2.5 Liberao in vitro Atravs de Membrana Sinttica 5.2.5.1 Estudo da Solubilidade da NFD para a Escolha da Soluo Receptora para os Ensaios de Liberao e Permeao/ Penetrao Cutnea 5.2.5.2 Condies Analticas para a Anlise da NFD nas Amostras por CLAE 5.2.5.2.1 Curva Analtica 5.2.5.3 Resultados dos Ensaios de Liberao in vitro Atravs de Membrana Sinttica de Acetato de Celulose 5.2.6 Permeao / Penetrao Atravs de Membrana Natural de Pele Suna 5.2.6.1 Caracterizao Histolgica dos Fragmentos de Pele Suna Separao da Epiderme e Derme 5.2.6.2 Validao da Metodologia para a Extrao da NFD de Epiderme e Derme Suna 5.2.6.2.1 Caracterizao da Seletividade, da Recuperao e Preciso da Extrao da NFD da Epiderme e Derme Suna. 5.2.6.3 Resultados da Penetrao / Permeao in vitro das Formulaes contendo NFD 6 CONCLUSES 7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 109 110 110 119 123 124

125 126 128 131 132 133 133 135 141 145

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1. INTRODUO

Segundo Ansel; Popovick e Allen (2007) a biofarmacotcnica definida como a rea de estudo que abrange as relaes entre as cincias, qumica, fsica e biologia, segundo sua aplicao aos frmacos, sua ao e s formas farmacuticas. Ainda de acordo com os autores, formas farmacuticas de aplicao tpica liberam o frmaco na pele, para o tratamento de alteraes drmicas, logo a pele o rgo alvo. A via tpica tem sido considerada como uma alternativa de interesse para a administrao de frmacos (BARRY, 2001; KENDAL, CHONG, COCK, 2007), uma vez que, estas terapias apresentam boa adeso por parte dos pacientes (TORSIELLO e KOPACK 2000; ISRAEL, 2003). A pele constitui a principal interface biolgica entre o organismo humano e o meio ambiente (SAIJA et al., 1998; HADGRAFT, 2001; MARQUELE-OLIVEIRA, 2007; WILLIAMS, 2005; CEVEC e VIERL, 2006; SILVA et al. 2007), apresenta fundamental importncia na manuteno da homeostase orgnica, como controle de perda de gua, proteo contra agentes qumicos e fsicos provenientes do meio ambiente (HADGRAFT, 2001; SILVA et al. 2007). Devido a estas propriedades, a pele tambm representa a principal barreira a ser vencida pelos frmacos, principalmente, devido sua camada mais externa, o estrato crneo (EC) (HADGRAFT, 2001; WILLIAMS, 2005; CEVEC e VIERL, 2006). O EC, um tecido queratinizado e se comporta como uma membrana artificial semipermevel. As molculas das substncias ativas, geralmente, penetram essa membrana por difuso passiva. Assim, a velocidade de difuso de um frmaco atravs 24

dessa camada da pele depende da concentrao do mesmo no veculo, de sua solubilidade, do coeficiente de difuso e do coeficiente de partio entre o EC e o veculo. As substncias que tm caractersticas de solubilidade tanto em gua quanto em lipdios so boas candidatas difuso atravs do EC, bem como nas camadas epidrmica e drmica (SURBER et al., 1990, FREITAS, 2005). A cicatrizao de ferimentos tem recebido muita ateno por parte dos profissionais de sade, campo no qual tem-se observado crescente aplicao de formulaes de uso tpico (KINCAID, 2002; HELMKE, 2004). Uma vez que, a aplicao destas preparaes pode produzir resultados positivos em tratamentos de fissuras anais, lceras venosas e diabticas e cicatrizes hipertrficas (HELMKE, 2004). A carncia de tratamentos para leses cutneas uma das principais preocupaes para os pacientes diabticos, pois podem acarretar a perda de unhas, ps, dedos e, em alguns casos, de membros completos (WYNN, 2004). Existe uma grande variedade de terapias que incluem cirurgias com tcnicas de reconstruo vascular, objetivando aumentar o fluxo sanguneo para a leso; assim como, a utilizao de fatores de crescimento, como interleucina-6 e queratincitos (BENNETT et al apud WYNN, 2004, HAIHONG Li, 2007). Entretanto, estas promissoras terapias ainda so muito onerosas, assim, muitos pacientes preferem optar pelo tratamento com formulaes tpicas (WYNN, 2004). A nifedipina (NFD) uma substncia do tipo das dihidropiridinas, antagonista do clcio, sendo preconizada primordialmente para tratamento de doena cardiovascular (RANG, et. al.. 2003). Abbas e cols. (2003) relataram que o tratamento tpico com NFD promoveu a cicatrizao na pele de ratos sadios e diabticos. De acordo com estes autores, a NFD foi capaz de promover a cicatrizao na fase inflamatria do processo, 25

entretanto no produziu modificaes sensveis na fase de maturao e no afetou a fase de proliferao da reparao tecidual. Alm disso, a aplicao tpica da NFD tem sido descrita para o tratamento em humanos com leses cutneas oriundas de doena vascular perifrica (BRANDT et. al.1983; ANTROPOLI et. al. 1999); de lceras diabticas (TORSIELLO E KOPACK, 2000, WYNN,2004) e cicatrizes hipertficas (ISRAEL, 2003, HELMKE, 2004). As formulaes empregadas no tratamento das afeces tpicas so preparaes de consistncia semi-slidas destinadas a serem aplicadas sobre a pele ou sobre determinadas mucosas a fim de exercer uma ao local ou de promover a passagem de princpios medicamentosos atravs do estrato creo. Dependendo do seu comportamento reolgico e da sua bioadeso, os semislidos podem aderir superfcie de aplicao por perodos suficientemente longos at serem removidos. Essa propriedade auxilia a prolongar a liberao do frmaco no local de aplicao, apresentando vantagens em termos de facilidade de aplicao (IDSON; LAZARUS, 2001). Atualmente, novos veculos para a aplicao tpica de frmacos tm sido desenvolvidos com o objetivo de permitir a cicatrizao de leses cutneas persistentes que no respondem aos tratamentos tradicionais (ISRAEL,2003). Entre eles encontramse o gel de polaxamer 407, que tem sido indicado para o tratamento de queimaduras e como pele artificial (PAOLETTI, 2004), e o PLO (gel de lecitina e polaxamer), tambm descrito pela sua capacidade de promover a penetrao cutnea de frmacos (TORSIELLO e KOPACKI, 2000, KINCAID, 2002, ISRAEL 2003). De acordo com Torsiello e Kopack (2000), formulaes semi-slidas contendo 8% de NFD induziram a vasodilatao local sem provocar efeitos sistmicos. Acredita26

se que o referido frmaco possa promover um bloqueio do influxo de clcio para a musculatura lisa, diminuindo o tnus vascular, facilitando o fluxo sanguneo e a irrigao tecidual, promovendo a cicatrizao de ferimentos (TORSIELLO e KOPACK 2000, WYNN, 2004). Segundo Ansel, Popovick e Allen (2007), a resposta biolgica a um frmaco resultado de sua interao com os receptores celulares ou sistemas enzimticos importantes, e decorrem de uma alterao dos processos biolgicos anteriores administrao do frmaco. A magnitude da resposta biolgica relaciona-se com a concentrao que o frmaco atinge em seu local de ao, e essa concentrao depende da dose administrada, da quantidade absorvida e da distribuio no local, e da velocidade e da quantidade eliminada do corpo. A constituio fsica e qumica do frmaco, particularmente a solubilidade lipdica, o grau de ionizao e o tamanho molecular determinam, em grande parte, sua capacidade de produzir sua atividade biolgica. Sendo assim, importante avaliar as propriedades fsico-qumicas das formulaes semi-slidas (microscopia, pH, viscosidade, teor do ativo). Assim como, a determinao da velocidade de liberao do frmaco destas preparaes e a penetrao/permeao do mesmo nas camadas da pele. Desta forma, pode-se prover o controle de qualidade das formulaes sob aspecto biofarmacotcnico. Nos estudos de liberao in vitro, pode ser empregado um modelo bicompartimental, conhecido como clula de difuso vertical e membrana sinttica (UNITED STATES PHARMACOPEA, 1997). Para tal, podem-se empregar membranas artificiais como acetato de celulose, nitrato de celulose e polissulfona (HAIGH; SMITH, 1994), as quais no oferecem resistncia passagem do frmaco do compartimento 27

doador para o compartimento receptor, proporcionando, desta forma, a quantificao do frmaco neste ltimo, em funo da partio entre o veculo e o meio aceptor. No sistema de clulas de difuso, pode-se tambm utilizar pele natural (humana ou animal) para conhecer o comportamento biofarmacotcnico de uma formulao, no que diz respeito penetrao e/ou permeao do frmaco. Dentre os vrios tipos de pele animal (rato, cobaio, camundongo com e sem plo, macaco rhesus, cobra) que podem ser utilizadas, recentemente, tem-se empregado a pele suna devido a sua similaridade com a pele humana. (HAIGH; SMITH, 1994; SEKKAT; KALIA; GUY, 2002; MEDI; SINGH, 2003). O conhecimento do comportamento dessas formulaes sob aspecto de biodisponibilidade in vivo e liberao in vitro permite aprimoramento dos produtos e melhor controle quando se fazem necessrias alteraes de escala produtiva (de pequena para grande escala) e/ou componentes da formulao ps-aprovao do medicamento (FREITAS, 2005).

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2. 2.1.

OBJETIVOS Objetivo geral Desenvolvimento, caracterizao e avaliao biofarmacotcnica de formulaes

tpicas contendo nifedipina, parauso no tratamento de leses cutneas oriundas de doena vascular perifrica e de lceras diabticas.

2.2.

Objetivos especficos

1. Desenvolvimento galnico de formulaes de uso tpico contendo 8% de NFD; 2. Avaliao das propriedades fsico-qumicas das formulaes desenvolvidas; 3. Determinao do teor da NFD de trabalho a partir de padro farmacopico para sua utilizao como padro secundrio; 4. Determinao do teor de NFD nas formulaes por UV-vis; 5. Avaliao da formao da microemulso por microscopia ptica; 6. Avaliao de parmetros reolgicos das formulaes; 7. Avaliao da taxa de liberao de NFD in vitro, empregando clulas de difuso vertical com membrana artificial (acetato de celulose); 8. Avaliao da penetrao e permeao de NFD empregando clulas de difuso com membrana natural (pele suna); 9. Determinao do meio aceptor adequado para os ensaios de liberao e penetrao e permeao;

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10. Desenvolvimento de metodologia analtica para a determinao da NFD nas formulaes em estudo e nos ensaios de liberao e permeao/penetrao cutnea; 11. Preparao da pele suna para os ensaios de penetrao e permeao. 12. Caracterizao histolgica dos segmentos cutneos: epiderme e derme.

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3. REVISO BIBLIOGRFICA

3.1. A PELE

A pele constitui a principal interface biolgica do organismo humano com o meio ambiente e, devido a esta funo de barreira, representa um rgo-alvo em potencial para estmulos externos de reaes oxidativas como radiao ultravioleta, ao do oznio, incidncia de radiao ionizante, alm da ao de diferentes agentes qumicos txicos (SAIJA et al., 1998, HADGRAFT, 2001; WILLIAMS, 2005; CEVEC e VIERL, 2006, MARQUELE-OLIVEIRA, 2007). A elasticidade uma das funes mais essenciais da pele constitui-se na proteo contra agresses mecnicas e assegurada por uma estrutura que se deforma reversvelmente. um tecido vivo e complexo com caractersticas viscoelsticas, composto por camadas heterogneas (REIHSNER, BALOGH, MENZEL 1995; REIHSNER, MENZEL, 1998; HADGRAFT, 2001, WU, DONG, SMUTZ, 2003; WILLIAMS, 2005; CEVEC e VIERL, 2006, PAILLER-MATTEI, 2007). A pele humana composta principalmente por trs camadas: epiderme, derme e hipoderme ou tecido adiposo subcutneo, que se apresenta como um tecido extremamente viscoso e macio. A derme consiste em uma rede de colgeno entremeada por fibras elsticas, e elementos linfticos, coberto por uma camada epidrmica. A espessura das camadas da pele sofre muitas variaes em funo da idade, stio anatmico e do estado de hidratao. Geralmente, a espessura da epiderme apresenta-se entre 40 e 48 m. A espessura da derme apresenta-se maior

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que 800 m e menor que 1.500 m, e por fim, a espessura da hipoderme muito dependente do stio anatmico e do estado nutricional do indivduo (AGACHE, 2000). A camada epidrmica composta por clulas parcialmente queratinizadas, que so progressivamente desidratadas durante a sua migrao para a superfcie externa da pele, constituindo o estrato crneo (EC) (HADGRAFT, 2001). O EC constitui a camada mais externa da pele, atuando como barreira protetora para o organismo contra os fatores agressivos do meio ambiente; limitando a perda de gua , a entrada de microorganismos e agentes qumicos txicos (ELIAS, 1983). Permite ainda, sensaes como presso, frio e calor, que so detectadas por terminaes nervosas especficas posicionadas na pele, sob a epiderme. Os cornecitos so unidos por uma matriz intercelular lipdica, resultando em uma estrutura que costuma ser referida como uma parede com tijolos e argamassa composta por queratina, lipdeos e desmossomos (ELIAS, 1983; FUCHS, RAGHAVAN, GETTING, 2002; NEMES, STEINERT, 1999; KENDALL, FOONG CHONG, COCK, 2007). O EC constitui-se de uma camada heterognea que contm cerca de 40% de queratina (protena), 40% de gua e 18 a 20% de lipdeos, principalmente triglicerdeos, cidos graxos livres, colesterol e fosfolipdeos. (HADGRAFT, 2001, FLORENCE e ATTWOOD, 2003). A epiderme vivel localiza-se logo abaixo do EC e composta por uma faixa de clulas vivas, incluindo clulas de Langehans com alta sensibilidade imunolgica, queratincitos, clulas tronco e melancitos. Ao contrrio da camada mais profunda constituda pela derme, a epiderme vivel carece de vasos sangneos e terminaes nervosas, o que confere caractersticas importantes de stio indolor e no invasivo para a veiculao de frmacos. As clulas de Langehans so responsveis pela captao e 32

processamento de materiais estranhos, a fim de gerar uma resposta imunolgica efetiva (CHEN, HAYNES, NEEDLE, 2002). Provavelmente uma das fues mais importantes da pele seja a capacidade de funcionar como barreira para a difuso molecular, que assegurada pela camada mais externa, o EC (KALIA et.al., 2001, HADGRAFT, 2001). No entanto, importante lembrar, que embora o EC apresente baixa permeabilidade, ele no totalmente impermevel, a exemplo da pele saudvel ntegra (MARKS, 2004). O EC est exposto a uma grande variabilidade de agentes qumicos do ambiente, que podem afetar suas estruturas e suas funes (SILVA et al, 2007).

3.2 PENETRAO DE FRMACOS PELA PELE

Os meios pelos quais molculas de um frmaco podem penetrar a pele incluem a penetrao atravs do EC, ou atravs dos anexos cutneos (folculos pilosos, ductos sudorparos, gldulas sebceas e sudorparas) (Figura 1). Entretanto, como estes ltimos representam uma frao pequena da rea superficial da pele, admite-se que a penetrao de frmacos por estas vias seja comparativamente de menor importncia (HADGRAFT, 2001; HADGRAFT, LANE, 2005; KRETSUS et. al., 2008).

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transcelular

intercelular folicular glandular

Figura 1. Representao esquemtica da pele mostrando as possveis rotas de Penetrao. (HADGRAFT, 2001).

Molculas de frmaco podem atravessar o EC por via transcelular ou intercelular, como mostra a figura 2, contudo mais difcil determinar diferenas entre estas vias (JUNGINGER, 1992; HADGRAFT, 2001, KRETSUS et. al., 2008).

Figura 2. Representao esquemtica da estrutura da camada crnea. (Adaptado de JUNGINGER, 1992).

34

Um estudo realizado por Albery e Hadgraft (1979) identificou a importncia da rota intercelular considerando a espessura da pele, entretanto a natureza dos canais intercelulares no era completamente conhecida. Posteriormente, identificou-se a natureza destes canais como contendo uma mistura de ceramidas, cidos graxos livres e seus steres, colesterol e seus sulfatos, e que estes lipdeos arranjavam-se em uma estrutura de bicamadas (HADGRAFT, 2001). Desta maneira, atribuiu-se a

impermeabilidade da pele dois fatores principais: ao caminho tortuoso e ao problema de partio repetida e da difuso atravs da estrutura de bicamadas (HADGRAFT, 2001). Entre os fatores controladores da penetrao cutnea de frmacos pela pele esto: a hidratao do EC, a temperatura, o pH, a concentrao e as caractersticas moleculares, tanto do frmaco quanto dos componentes da formulao. O grau de absoro pode ser determinado pela hidratao do EC, uma vez que o aumento da hidratao diminui a resistncia do mesmo, provavelmente por provocar um intumescimento das estruturas compactas da camada cornificada e a criao de canais aquosos que permitem a difuso de frmacos. Sabe-se que o pH influencia no percentual de ionizao das molculas e, embora apenas molculas no ionizadas passem prontamente por membranas lipdicas, sabe-se que molculas ionizadas efetivamente penetram no EC at um determinado nvel, e uma vez que estas apresentam maior hidrossolubilidade do que as molculas neutras em soluo saturada ou prxima da saturao, elas podem exercer uma contribuio significativa para o fluxo total. A temperatura no sofre grandes variaes durante o uso clnico de preparaes de uso tpico, uma vez que, o uso de roupas em quase todo o corpo podem prevenir amplas flutuaes de temperatura e das velocidades de penetrao (AULTON, 2005). 35

3.3. ASPECTOS FSICO-QUMICOS DA ABSORO PERCUTNEA

Para que um frmaco possa ser absorvido e eliminado do organismo, bem como para que possa alcanar o stio de ao em determinada clula faz-se necessrio ocorrer difuso atravs das membranas biolgicas (SINKO, 2008). Assim, para que um frmaco aplicado topicamente possa fazer efeito local ou sistmico preciso que seja capaz de atravessar o EC. Este se comporta como uma barreira semi-permevel difuso passiva, sem evidenciar processos metablicos de transporte

(CEVEC,VIERL,2006). A difuso passiva pode ser definida como um processo pelo qual a diferena de concentrao reduzida por um fluxo espontneo de matria. Nesse processo fisicoqumico o soluto passa espontaneamente de uma regio de alta concentrao para outra de baixa concentrao, enquanto as molculas de solvente movem-se na direo contrria, assim, admite-se que o fluxo do soluto estabelecido como conseqncia (FLORENCE e ATTWOOD, 2003) De acordo com Florence e Attwood (2003) a expresso que relaciona o fluxo de material ao gradiente de concentrao definida como a primeira lei de Fick, cuja equao descreve o processo de difuso sob condies de equilbrio estacionrio, onde o gradiente de concentrao no muda com o tempo. Hadgraft (2001) descreve que a equao de primeira lei de Fick usada para descrever o fluxo no estado estacionrio pode ser simplificada pela seguinte equao: J = D K C h

36

onde J o fluxo por unidade de rea, D o coeficiente de difuso na pele, K o coeficiente de partio do frmaco entre pele e veculo, C a diferena de concentrao atravs da pele e h o comprimento do caminho difusional atravs da pele. Como nos experimentos de difuso passiva, a soluo do compartimento receptor constantemente removida e substituda por outra poro de solvente a fim de manter a concentrao baixa, a esta condio denomina-se condio sink, como mostra a Figura 3.

Figura 3 - Representao esquemtica de uma clula de difuso na qual o

compartimento doador contm o difusante na concentrao C. Fonte: SINKO, 2008 Enquanto a primeira lei de Fick descreve o fluxo, ou taxa de difuso por unidade de rea, no estado estacionrio, a segunda lei de Fick refere-se a uma mudana de concentrao do difusante ao longo do tempo a uma distncia qualquer, isto significa um fluxo em estado no estacionrio (SINKO, 2008). Portanto, a segunda lei de Fick estabelece que a velocidade de mudana de concentrao em um elemento de volume interno ao campo difusional proporcional velocidade de mudana no gradiente de 37

concentrao naquele ponto do campo, e a constante de proporcionalidade o coeficiente de difuso (FLORENCE e ATTWOOD, 2003). Logo, a segunda lei de Fick a equao de transporte de massa que enfatiza a variao da concentrao em funo do tempo em determinado local e no a difuso de massa atravs de uma unidade de rea por unidade de tempo. Ela determina que a concentrao em funo do tempo em uma determinada regio seja proporcional alterao no gradiente de concentrao naquela regio do sistema (SINKO, 2008). Desta maneira a segunda lei de Fick pode ser definida pela equao: dC = D d2C dt dx2

onde dC a concentrao de difusante em um determinado volume que muda em funo do tempo dt e D d2C representam as quantidades difundidas em funo da distncia dx2 (SINKO, 2008). No estado de equilbrio dC/dt = 0, e a segunda lei de Fick pode ser lida como:

J = D (C1-C2) h Como usualmente o termo D/h designado como resistncia difusional R, pode-se escrever a equao da seguinte maneira:

J = C1-C2 R onde J o fluxo, C1-C2 a diferena de concentrao entre os compartimentos doador (C1) e receptor (C2) e R a resistncia difusional (SINKO, 2008). 38

A difuso ocorre no sentido de maior concentrao (C1) para a de menor concentrao (C2). Aps certo tempo o estado estacionrio atingido e as concentraes passam a ser constante em todos os pontos da membrana (SINKO, 2008), como mostra a Figura 4.

Figura 4 - Difuso atravs de um filme fino, onde as molculas do soluto difundem da zona de maior concentrao (C1), para a de menor concentrao (C2). As concentraes em ambos os lados do filme so mantidas constantes. No estado de equilbrio, as concentraes permanecem constantes em todos os pontos do filme. O perfil de concentrao dentro do filme linear e o fluxo constante. Fonte: SINKO (2008).

Entretanto, para a pele, antes de ser alcanada a penetrao estacionria, podese observar um aumento da velocidade de difuso ao longo do tempo, e uma fase de latncia torna-se aparente (FLORENCE e ATTWOOD, 2003), como mostra a Figura 5.

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Figura 5 - Perfil para penetrao em funo do tempo de um frmaco ideal que se difunde atravs da pele humana. Aps a instalao do estado de difuso estacionrio. Fonte: FLORENCE e ATTWOOD (2003).

Isto ocorre porque formas farmacuticas de ao modificada, como os semislidos de uso tpico, podem no exibir o processo de estado estacionrio durante o tempo inicial da liberao. No grfico da Figura 5 observa-se uma condio inicial de estado no-estaciorio, seguida de uma condio onde a velocidade de difuso constante, e o sistema se apresenta em estado estacionrio, onde a curva se apresenta linear. Extrapolando-se a poro da linha em estado de equilbrio at o eixo do tempo, observa-se um ponto de insero denominado tempo de latncia ou lag time (tL), que o tempo necessrio para que o difusante estabelea um gradiente de concentrao uniforme dentro da membrana que separa o compartimento doador do receptor (SINKO, 2008). O tempo de latncia ou lag time (tL) pode ser determinado pela equao: tL = h2 6D onde h o comprimento difusional e D a difuso. 40

3.3.1 Efeitos do Frmaco na Penetrao Cutnea

O efeito do frmaco na penetrao cutnea depende do seu coeficiente de difuso atravs da pele, da sua concentrao na formulao e do seu coeficiente de partio leo/gua (Ko/a) (CEVC et..al., 1995, GANEM-QUINTANAR et. al. 1997, AULTON, 2005). O coeficiente de difuso de um frmaco na pele sofre influncia do seu tamanho e forma molecular, da sua carga (CEVC et..al., 1995), mas tambm depende do estado da matria do meio de difuso (MCDAYD; DEASY, 1995, AULTON, 2005). Na pele os valores mais baixos de difusibilidade so observados dentro da matriz complexa do EC. Em temperatura constante pode-se dizer que a difusibilidade de um frmaco em um veculo tpico ou na pele dependente das propriedades do frmaco e do meio de difuso, bem como da interao entre eles (MCDAYD; DEASY, 1995, AULTON, 2005). O caminho mais importante de transporte das molculas solveis em gua o transcelular, que envolve a passagem atravs das clulas e espaos intercelulares, enquanto o transporte de molculas lipossolveis presumivelmente a via intercelular (FLORENCE e ATTWOOD, 2003, KRETSUS, 2008). Como j foi dito, a permeao de frmacos segue a lei de Fick, considerando-se que o luxo do frmaco proporcional a um gradiente de concentrao por toda a fase de barreira (FLORENCE e ATTWOOD, 2003; KRETSUS, 2008). Para que isto ocorra preciso que a soluo doadora seja saturada e, isto pode ser obtido aplicando-se sistemas de co-solventes (GANEM-QUINTANAR et. al. 1997, AULTON, 2005). Entretanto a atividade termodinmica de um frmaco na fase doadora ou na membrana pode ser alterada pela modificao do pH, pela formao de complexos ou pela 41

presena de tensoativos, micelas ou mesmo pelos co-solventes. Com a aplicao de sistemas co-solventes o coeficiente de partio do frmaco entre a membrana e a mistura de solventes geralmente cai medida que a solubilidade em sistemas solventes aumenta. De modo que no importante solubilizar demais um frmaco se o objetivo promover a penetrao (AULTON, 2005). O coeficiente de partio determinado pelas propriedades do frmaco e tambm do veculo, uma vez que este representa a fase doadora e a pele, a fase receptora (GANEM-QUINTANAR et. al. 1997; HADGRAFT, LANE, 2005; KRETSUS, 2008). No caso de um frmaco ser mais solvel no EC do que no veculo no qual est apresentado, a concentrao no EC poder ser mais alta do que a do veculo, de maneira que conforme se observa a depleo nas camadas de contato do veculo com a pele, a natureza da formulao determinar a velocidade com que as camadas de contato sero reabastecidas por difuso, e em conseqncia, determinar a velocidade de absoro (FLORENCE e ATTWOOD, 2003; KRETSUS, 2008). Quanto ao tamanho e forma moleculares, possvel imaginar que molculas pequenas penetrem de modo mais rpido que as grandes. Entretanto, o papel do coeficiente de partio dominante, de modo que se torna difcil estudar o efeito da forma molecular sem alterar as caractersticas de solubilidade, conseqentemente, muito pouco conhecido a respeito do tamanho e forma moleculares na penetrao na pele (GANEM-QUINTANAR et. al. 1997; AULTON, 2005).

42

3.3.2 Efeito do Veculo na Penetrao Cutnea

Como se pode observar na primeira lei de Fick (expressa no item 3.3), o veculo tem influncia na absoro de frmacos, pois uma das variveis justamente o coeficiente de partio dos frmacos (MCDAYD; DEASY, 1995, HO, CHEN, SHEU, 2000; FLORENCE e ATTWOOD, 2003; BABU et. al.2007). Alterando-se a composio do veculo de modo a diminuir neste a solubilidade do frmaco, possvel se observar um aumento da permeabilidade deste frmaco. Assim, a atividade termodinmica do frmaco torna-se o fator limitante da atividade biolgica. De modo que, aumentando-se a solubilidade do frmaco no veculo pela adio de um co solvente, reduz-se o coeficiente de partio em relao pele. Por outro lado, aumentando-se a quantidade de frmaco que pode ser incorporada no veculo o favorece-se o gradiente de concentrao. Pode-se dizer que o veculo capaz de afetar a penetrao somente quando a liberao do frmaco constituir o fator limitante (MCDAYD; DEASY, 1995, HO, CHEN, SHEU, 2000; FLORENCE e ATTWOOD, 2003, KANG et.al.2007). Enquanto todo o gradiente de atividade estiver contido no veculo, no se observa influncia das propriedades da pele, pois a concentrao do frmaco no veculo, o coeficiente de difuso do frmaco no sistema e a sua solubilidade sero os fatores significativos. Quando estes fatores no forem importantes, a atividade termodinmica do frmaco no veculo ser o nico fator significativo (GWAK, CHUN,2001 ;FLORENCE e ATTWOOD, 2003, BABU et. al.2007). Pode-se dizer, ento, que o formulador pode manipular a biodisponibilidade do frmaco a partir de formulaes semi-slidas em

43

suspenso pela alterao do coeficiente de difuso, da concentrao total ou da solubilidade do frmaco (AULTON, 2005, LIU et.al. 2006). Todas as formulaes semi-slidas que contm partculas finamente

pulverizadas do frmaco, nas quais a atividade termodinmica semelhante quela do frmaco slido (onde a concentrao do frmaco solvel muito menor do que a do frmaco suspenso), apresentaro a mesma velocidade de penetrao, desde que a passagem do frmaco pela pele constitua o fator limitante (GANEM-QUINTANAR et. al. 1997, FLORENCE e ATTWOOD, 2003, BABU et. al.2007). Para que um frmaco em suspenso possa ter ao, preciso que apresente alguma solubilidade no veculo, para que exista uma soluo saturada do frmaco na fase contnua. Desta maneira somente o material solvel penetrar no EC, e a camada esgotada do veculo ser, ento reabastecida pela dissoluo de partculas suspensas e pela difuso das molculas do frmaco para a camada esgotada (FLORENCE e ATTWOOD, 2003, BABU et. al.2007).

3.4 A Nifedipina

uma substncia do tipo das dihidropiridinas, antagonista do clcio, sendo denominados como bloqueadores dos canais de clcio (Rang et al., 2003).

3.4.1 Propriedades fsico-qumicas

A nifedipina (NFD) (Figura 6) apresenta-se como cristais amarelos, com ponto de fuso na faixa de 172-174. Ela praticamente insolvel em gua; levemente solvel 44

em lcool; muito solvel em clorofrmio ou acetona. As solues so extremamente fotossensveis. Apresenta coeficiente de partio octanol / gua (Log P) igual a 2,2 (GENNARO, 2000; MOFFA, OSSELTON, WIDDOP, 2004).

Figura 6 - Estrutura qumica da Nifedipina

Sabe-se que a solubilidade da NFD em gua, e sua biodisponibilidade so muito baixas, alm de possuir um tempo de meia-vida muito curto. (BOLDRI et. al. 1994). Adicionalmente, a NFD mais bem absorvida no intestino delgado, com substancial efeito de metabolizao heptica (SORKIN, CLISSLOD, BROGDEN, 1985).

3.4.2 Aplicaes da NFD para o Uso Tpico

Consideraes acerca da farmacologia da NFD so descritas apenas para o uso sistmico do frmaco, segundo Rang e colaboradores (2003):

45

Os antagonistas dos canais de clcio afetam diferentes processos fisiolgicos, incluindo a secreo, contrao muscular, funo plaquetria e liberao de neurotransmissores. Entretanto, seus principais efeitos so produzidos no corao e no msculo liso vascular. Todas as substncias de cada uma das trs classes de antagonistas do clcio (fenilalquilaminas, dihidropiridinas e benzotiazepinas) ligam-se subunidade 1 do canal de clcio cardaco do tipo L, porm em stios distintos, cada um dos quais interage de modo alostrico entre si e com a estrutura de comporta do canal, impedindo indiretamente a difuso do Ca2+ atravs do seu poro no canal aberto. As dihidropiridinas do tipo antagonista (nifedipina) ligam-se seletivamente aos canais no modo O (quando ele no se abre em resposta despolarizao), favorecendo, assim, este estado de no abertura. A NFD, assim como a maioria das dihidropiridinas, exerce maior efeito sobre o msculo liso. No msculo liso vascular, os antagonistas do clcio causam dilatao arteriolar generalizada, mas no causam grande alterao venosa. As dihidropiridinas produzem acentuada vasodilatao sem grande efeito direto sobre o corao, enquanto que outros antagonistas do clcio so menos seletivos. Embora o mecanismo de ao pelo qual a NFD aplicada topicamente promova a cicatrizao de ferimentos no esteja completamente elucidado, acredita-se que ela promova um bloqueio do influxo de clcio para a musculatura lisa e assim diminua o tnus vascular facilitando o fluxo sanguneo e a irrigao tecidual (TORSIELLO e KOPACK 2000, WYNN, 2004). A nifedipina (NFD) preconizada primordialmente para tratamento de doena cardiovascular (RANG, et. al.. 2003). Entretanto, Squillante e cols (1998) estudaram a otimizao da promoo de penetrao cutnea da NFD em pele de camundongos sem pelo. Os autores verificaram valores de fluxo quatro vezes maiores que os requeridos 46

para distribuir uma dose oral equivalente no homem, sugerindo que, de acordo com o veculo escolhido, a distribuio percutnea de NFD em doses usuais pode ser aplicada clinicamente. Um estudo desenvolvido por Abbas e cols. (2003) aplicou tratamento tpico com NFD a fim de promover a cicatrizao na pele de ratos sadios e diabticos. De acordo com estes autores, a NFD foi capaz de promover a cicatrizao na fase inflamatria do processo, entretanto no produziu modificaes sensveis na fase de maturao e no afetou a fase de proliferao da reparao tecidual. Entretanto, a aplicao tpica da NFD tem sido descrita para o tratamento em humanos com leses cutneas oriundas de doena vascular perifrica (BRANDT et. al.1983; ANTROPOLI et. al. 1999); de lceras diabticas (TORSIELLO E KOPACK, 2000, WYNN,2004) e cicatrizes hipertficas (ISRAEL, 2003, HELMKE, 2004). De acordo com Torsiello e Kopack (2000), uma mulher diabtica de quarenta e trs anos apresentava significativos danos decorrentes do diabetes, incluindo uma ferida no calcanhar direito. Devido ao longo perodo de sete anos sem cicatrizao, foi decidido pela aplicao de nifedipina tpica para acelerar o processo, induzindo a vasodilatao local sem provocar efeitos sistmicos. Para tal, foi prescrito uma formulao semi-slida, organogel de lecitina e Pluronic (PLO) com 8% de nifedipina, para ser administrada 1 mL pela paciente duas vezes ao dia. Foi observada cicatrizao em um perodo de seis a oito semanas. Efeitos adversos no foram observados pelos autores com esta terapia. Problemas que tornam as lceras diabticas de difcil cicatrizao incluem fluxo sanguneo inadequado para as reas da ferida e o aumento do risco de infeces.

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Desta forma, formulaes contendo bloqueadores de canal de clcio, como a nifedipina, tm mostrado eficcia neste propsito (HELMKE,2004). Outro caso relatado por Torsiello e Kopack (2000), um menino de oito anos, submetido a uma cirurgia ortopdica h anos, apresentava uma cicatriz hipertrfica que prejudicava a correo cirrgica, alm de comprometer o suprimento de sangue para a regio (Figura 7a). Para contornar o problema, foi necessrio inserir um expansor para tecido na cicatriz que foi mantido por quatro dias. Este procedimento ocasionou necrose com quatro dias de ps-operatrio. Aps a remoo do expansor, a rea foi tratada com nifedipina tpica para acelerar a cicatrizao e prevenir a formao de nova cicatriz hipertrfica. Para tal, foi prescrito uma formulao semi-slida, PLO com 2% de nifedipina (20 mg/mL), para ser administrado 1 mL, duas vezes ao dia. Aps trs semanas foi observada completa cicatrizao (figura 7b).

Figura 7 - Paciente com cicatriz hipertrfica antes do tratamento (a) e aps trs semanas (b) de tratamento tpico com nifedipina. (Torsiello e Kopack, 2000).

De acordo com Lee (apud HELMKE,2004) cicatrizes hipertrficas formam-se devido ao excesso de colgeno produzido durante a fase de remodelamento da cicatrizao e podem reduzir a mobilidade da rea se a cicatriz for muito extensa. A

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aplicao tpica de bloqueadores de canal de clcio tem mostrado grande eficcia na reduo da formao dessas cicatrizes. Israel (2003) relatou o caso de um homem de cinqenta e cinco anos que apresentava fratura de todos os dedos do p esquerdo, do tornozelo e da tbia aps um acidente de trabalho. Observou-se o desenvolvimento de uma grande lcera na perna do paciente. Durante dois anos, mdicos dedicaram-se ao tratamento da lcera utilizando tcnicas de drenagem linftica e curetagem, que aumentaram a rea da leso. Duas formulaes de uso tpico (uma para controle da dor e outra para a revascularizao tecidual contendo NFD em PLO) foram utilizadas no tratamento por quarenta e dois dias. Foi prescrita uma aplicao ao dia, por trs semanas, na clnica. Aps este perodo o paciente foi orientado a continuar o tratamento em casa por mais vinte e um dias, realizando a aplicao das formulaes duas vezes ao dia, retornando a clinica uma vez por semana. Aps o quadragsimo segundo dia j no se fizeram necessrias visitas a clinica. Este protocolo mostrou que a terapia tpica para a revascularizao tecidual apresentou resultados satisfatrios, reduzindo o tempo de internao do paciente. No mercado brasileiro, a NFD encontrada apenas sob a forma de compridos e cpsulas contendo de 10 a 60 mg do frmaco, descritas no Dicionrio de Especialidades Farmacuticas (DEF, 2007/2008). As principais formulaes farmacuticas contendo NFD comercializadas no Brasil esto relacionadas na tabela 1 (DEF, 2007/2008).

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Tabela 1 - Principais formulaes farmacuticas contendo NFD comercializadas no Brasil (DEF, 2007) Medicamento Apresentao Fabricante Substncia Ativa
Adalat Adalat oros Adalat oros Adalat oros Adalat retard Adalat retard Adalex retard Cardalin retard Caprilat Caprilat Dilaflux Dilaflux Dialflux retard Dilavax Ioncord Ioncord Neo fedipina Neo fedipina Nifedax Nideficard cp Nideficard cp Nifedipress retard Nifedipress retard Nifelat Nifelat Nioxil Nioxil Normopress Orosprevent Orosprevent Orosprevent Oxicord Oxicord Oxicord retard Oxicord retard Prenilan rtd Prenilan rtd Prenilan rtd 10mg / 60 caps 30 mg / 15 comp 60 mg / 15 comp 20 mg / 15 comp 20 mg / 30 comp 10 mg / 30 comp 20 mg / 30 comp 20 mg / 30 comp 10 mg / 30 comp 20 mg / 20 comp 10 mg / 60 caps 10 mg / 30 comp sublingual 20 mg / 20 comp 10 mg / 30 comp 40 mg / 20 comp 20 mg / 20 comp 10 mg / 30 comp 20 mg / 30 comp 10 mg / 30 comp 10 mg / 30 comp 20 mg / 30 comp 10 mg / 30 comp 20 mg / 30 comp 25+10 mg / 28 caps 50+20 mg / 28 caps 10 mg / 30 comp 20 mg / 20 comp 20 mg / 30 comp 20+100 mg / 28+7 comp 30+100 mg / 28+7 comp 60+100 mg / 28+7 comp 20 mg / 20 comp 10 mg / 30 comp 20 mg / 30 comp 20 mg / 60 comp 10 mg / 30 comp 20 mg / 30 comp 20 mg / 60 comp Bayer Bayer Bayer Bayer Bayer Bayer Heralds Solvay farma Hearst Hearst Medley Medley Medley Sanval Diffucap-chemobras Diffucap-chemobras Neo qumica Neo qumica Royton Kinder Kinder Medquimica Medquimica Biossinttica Biossinttica Geolab Geolab Delta Bayer Bayer Bayer Biossintetica Biossintetica Biossintetica Biossintetica Laboris Laboris Laboris Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipina Nifedipina nifedipino nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Atenolol+nifedipino Atenolol+nifedipino Nifedipino Nifedipino nifedipino Nifedipino+acido acetilsalicilico Nifedipino+acido acetilsalicilico Nifedipino+acido acetilsalicilico Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino Nifedipino

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3.5. Formulaes Semi-Slidas de Uso Tpico

A utilizao de formulaes tpicas para o tratamento de leses cutneas apresenta inmeras vantagens: preservam o frmaco da ao do pH do estmago; promovem efeito local quando a distribuio sistmica no desejada (WAGNER et al.1002, ROBERTS, 1996) ou quando promovem efeitos adversos (HELMKE, 2004; DUBEY et al 2007). As formulaes semi-slidas de uso tpico so as que se destinam aplicao sobre a pele. Do ponto de vista farmacotcnico as mais utilizadas so classificadas como pomadas, cremes, gis, pastas e emplastros (ANSEL; POPOVICK; ALLEN, 2007). Entretanto, sob o ponto de vista fsico-qumico as preparaes semi-slidas tm sido classificadas como organogis, hidrogis e cremes (SINKO, 2008). Elas podem ser classificadas, quanto solubilidade, em lipoflicas (gordurosas) de fase nica como as bases hidrofbicas, as bases de absoro e os lipogis, ou lipoflicas bifsicas, como emulses gua/leo; e em hidroflicas (miscveis com gua) de fase nica como os macrogols e os hidrogis e hidroflicas bifsicas como emulses leo/gua (FLORENCE e ATTWOOD, 2003). Ou podem ser classificadas, ainda, conforme o tipo de sistema de liberao drmica, em curativos oclusivos, adesivos transdrmicos oclusivos, materiais lipoflicos, bases de absoro, bases emulsificantes, emulses a/o, emulses o/a, umectantes e ps (AULTON, 2005). Uma ampla variedade de matrias-primas est disponvel para a preparao de uma forma farmacutica. De acordo, com a literatura, os mais utilizados so: glicerdios; ceras; hidrocarbonetos; silicones polioxietilenoglicis e homlogos; gis de produtos 51

minerais: bentonita; silcio; gis de polmeros orgnicos: alginatos, gelose, pectina, metilcelulose e carboximetilcelulose, amido (PRISTA; ALVES; MORGADO, 1995; LE HIR, 1997). Atualmente, novos veculos para a aplicao tpica de frmacos tm sido desenvolvidos com o objetivo de permitir a cicatrizao de leses cutneas persistentes que no respondem aos tratamentos tradicionais (ISRAEL,2003). Entre eles encontramse o gel de polaxamer 407, que tem sido indicado para o tratamento de queimaduras e como pele artificial (PAOLETTI, 2004), e o PLO (gel de lecitina e polaxamer), tambm descrito pela sua capacidade de promover a penetrao cutnea de frmacos (TORSIELLO e KOPACKI, 2000, KINCAID, 2002, ISRAEL 2003). importante avaliar as propriedades fsico-qumicas das formulaes semislidas (microscopia, pH, reologia, teor do ativo). Assim como, a determinao da velocidade de liberao do frmaco destas preparaes e a penetrao/permeao do mesmo nas camadas da pele. Desta forma, pode-se prover o controle de qualidade das formulaes sob aspecto biofarmacotcnico.

3.5.1. Organogel de Lecitina e Polaxamer 407 (Pluronic Lecitin Organogel -PLO)

PLOs so microemulses, semelhantes a um gel, compostas por fosfolipdios (lecitina), solvente orgnico apropriado, gua e Polaxamer 407 (Pluronic F127). As fases, semelhantes a um gel, consistem de uma rede tridimensional de micelas cilndricas reversas emaranhadas, imobilizando a fase contnua, promovendo a gelificao. Segundo Kumar e Katare (2005), o PLO capaz de promover a penetrao 52

cutnea de frmacos at as camadas mais profundas. A melhora na distribuio tpica de frmacos atribuda, principalmente, solubilidade bifsica do frmaco, ao seu particionamento desejado e modificao da funo de barreira da pele pelos componentes do PLO (KUMAR e KATARE, 2005).

3.5.1.1 Composio do Organogel

A matriz do organogel consiste de um surfactante (lecitina) como molculas gelificantes, um solvente orgnico no polar como fase externa ou contnua, e um agente polar, usualmente gua. (KUMAR e KATARE, 2005).

3.5.1.1.1 A Lecitina

Vrios estudos demonstraram a importncia da lecitina estar em sua forma in natura , que contm cidos graxos insaturados afim de produzir o estado semelhante a um gel (WALDE et al., 1990; WENDEL, 1995; CAPITANI et al, 1996; HANAHAN, 1997; SCHNEIDER, 1997; SHUMILINA et al 1997; SHCHIPUNOV, 2001) A insaturao nas molculas fosfolipdicas desejada para a formao do organogel de lecitina devido ao efeito de auto-agregao entre essas molculas e a formao de microestruturas. A insaturao contribui para o fator volume da regio no polar das molculas fosfolipdicas e pode afetar o parmetro de empacotamento crtico (CPP), favorecendo a formao de estruturas micelares reversas. A lecitina deve conter 53

pelo menos 95% de fosfatidilcolina para a preparao do organogel. (SCARTAZZINI E LUISI, 1988; SCHURTENBERGER et al,1990; SHCHIPUNOV, 2001).

3.5.1.1.2 O Solvente Orgnico

O solvente orgnico tambm desempenha papel importante na gelificao das molculas do organogel (SCARTAZZINI E LUISI, 1988; SHCHIPUNOV, 2001). Uma grande variedade de solventes so capazes de formar gel em presena de lecitina, entretanto, os steres de cidos graxos so particularmente interessantes para as aplicaes tpicas dos Organogis de Lecitina (LOs), por exemplo, o miristato de isopropila (IPM) e o palmitato de isopropila (IPP). Isto se deve ao seu poder de promover a penetrao cutnea em adio a sua natureza biocompatvel e biodegradvel (MOORE, 1982; PARSAEE,2002).

3.5.1.1.3 O Solvente Polar

O agente polar atua como um agente formador e estabilizador, e tem papel crucial no processo de gelificao. A habilidade de gelificar do solvente polar determinada pelas suas propriedades fsico-qumicas (SHCHIPUNOV e SHUMILINA, 1995; SHCHIPUNOV e SHUMILINA, 1996; SHCHIPUNOV e HOFFMANN, 1998). Os solventes polares gelificadores devem apresentar alta tenso superficial, relativa permissividade (constante dieltrica), polaridade do solvente (ndice de polaridade), e 54

uma forte tendncia formao de pontes de hidrognio. A gua o agente polar comumente mais empregado (SHCHIPUNOV e SHUMILINA, 1995).

3.5.1.1.4 O Polaxamer 407

O Polaxamer 407 (Pluronic F127) um polmero sinttico que tem sido incorporado aos LOs pelas suas caractersticas como co-surfactante e estabilizador, tornando possvel a constituio dos organogis com lecitina de relativa pureza (75%) (BERTI e LIPSKYS, 1995; CRANDALL, 2001). Denomina-se Polaxamer (Pluronic) a uma srie de copolmeros no inicos e estreitamente relacionados de xido de etileno e xido de propileno (COLLETT et al, 2000). So tambm denominados lutris e foram aplicados primariamente em preparaes farmacuticas como surfactantes, emulsificantes, agentes suspensores e estabilizadores. Os LOs contendo polaxamer so denominados, ento, como organogis de lecitina e polaxamer (PLO), organogel de polaxamer, organogel de pluronic, PLO gel, ou simplesmente PLOs (KUMAR e KATARE, 2005). A Figura 8 mostra uma proposta para a preparao do PLO, segundo Kumar e Ktare (2005).

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Adio do aditivo polar

Adio da Lecitina de soja Fase Externa aprisionada (Solvente Orgnico) Rede Tridimensional de micelas cilndricas emaranhadas Solvente apolar Disperso da Lecitina de soja em solvente apolar Estgio 2. Adio do aditivo polar Organogel

Estgio 1. Solubilizao da lecitina em meio orgnico Parmetros Crticos Concentrao molar da lecitina Natureza do solvente apolar Agitao e temperatura

Estgio 3. Formao Espontnea do Organogel com as molculas de frmaco solveis

Parmetros Crticos Concentrao molar do aditivo polar Natureza do aditivo polar Temperatura

Figura 8 Diagrama esquemtico da preparao de organogis de lecitina, proposto por Kumar e Ktare (2005). Frmacos lipoflicos so solubilizados na fase orgnica, enquanto compostos hidroflicos podem ser solubilizados na fase polar. Para a preparao do PLO, o co surfactante (polaxamer) adicionado fase polar. Fonte: KUMAR e KATARE, 2005.

3.5.1.1.5 O Monoetil ter de Dietileniglicol - Transcutol (TC)

O Monoetil ter de dietilenoglicol, ou, Transcutol (TC) tambm chamado de etoxi diglicol, dietileno glicol etil ter ou, ainda carbitol. lquido incolor, de odor suave e agradvel. higroscpico e miscvel com gua e com os solventes orgnicos mais comuns (USP 24, 1999; ASH e ASH, 1995). O TC um lquido higroscpico que apresenta miscibilidade com solventes polares e apolares. reconhecido como um potente promotor da permeao cutnea devido sua atoxicidade e biocompatibilidade com a pele, alm de suas excelentes propriedades solubilizadoras. Entretanto, so tambm descritas suas propriedades, como veculo isolado ou em mistura com gua, objetivando aumentar a retenao de

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ativos na pele sem promover concomitantemente a permeao cutnea (RITSCHEL et.al.,1991; GODWIN KIM FELTON,2002).

3.5.2 Reologia dos Semi-slidos

O estudo do comportamento reolgico das formas farmacuticas semi-slidas importante devido sua natureza complexa e passvel de influenciar seus processos de fabricao, embalagem e utilizao (FREITAS, 2006, SINKO,2008). Atravs da reologia pode-se descrever o fluxo de lquidos e a deformao de slidos. A resistncia ao escoamento, ou fluxo, expressa atravs da viscosidade de modo que, quanto maior for a viscosidade, maior ser tambm a resistncia (BARRY, 1974 apud BENTLEY et.al.1999; SINKO, 2008). As formas farmacuticas semi-slidas aplicadas neste trabalho constituem-se de disperses heterogneas e possuem propriedades reolgicas complexas, e por este motivo no se pode expressar a viscosidade em termos de um valor absoluto, como se faz para lquidos simples (FREITAS, 2006; SINKO, 2008). A reologia de um produto especfico pode afetar a aceitao por parte do paciente, a estabilidade fsica e, eventualmente, a sua biodisponibilidade. As propriedades reolgicas podem influir ainda na seleo do equipamento de fabricao a ser utilizado (RICCI, 2002; FREITAS, 2006, SINKO, 2008).

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3.5.2.1 Sistemas No-newtonianos

Segundo os tipos de fluxo e a deformao, os materiais que no seguem a lei de fluxo de Newton so classificados como no-newtonianos (SINKO, 2008), e a maioria dos fluidos farmacuticos no segue essa lei, pois a viscosidade varia com a velocidade de cisalhamento (AULTON, 2005). Comportamento no-newtoniano observado em disperses heterogneas, como disperses coloidais, emulses e suspenses (SINKO, 2008), atualmente muito aplicadas a sofisticados sistemas de liberao baseados em polmeros (AULTON, 2005). Segundo o fluxo, os sistemas no-newtonianos podem se apresentar como plsticos (ou de Bringham), pseudoplsticos ou dilatantes (FLORENCE e ATTWOOD, 2003, AULTON, 2005, SINKO, 2008). Os sistemas que apresentam fluxo do tipo plstico no fluem at que determinado valor de cisalhamento, denominado valor cedncia, seja ultrapassado e a valores menores do que o valor de cedncia o material se comporta como um slido (AULTON, 2005). Nos sistemas que apresentam fluxo do tipo dilatante observa-se um aumento da viscosidade com o aumento da velocidade de cisalhamento (AULTON, 2005). Neste trabalho ser dada maior nfase aos sistemas que apresentam fluxo do tipo pseudoplstico, nos quais se observa a fluidez logo assim que uma tenso de cisalhamento aplicada e, portanto, no h valor de cedncia (AULTON, 2005, SINKO, 2008). A viscosidade de um sistema pseudoplstico diminui com o aumento da tenso de cisalhamento, entretanto, no h um valor unvoco de viscosidade que possa ser considerado caracterstico. As viscosidades so calculadas como a inclinao da 58

tangente curva em um ponto especfico e so conhecidas como viscosidades aparentes, apenas tendo significado indicando-se a tenso de cisalhamento na qual a determinao foi realizada (AULTON, 2005, SINKO, 2008). Por este motivo a representao mais satisfatria para a viscosidade de sistemas pseudoplsticos feita por meio de uma curva de consistncia (AULTON, 2005, SINKO, 2008). De acordo com Sinko (2000) o reograma curvado dos sistemas pseudoplsticos decorrente da ao de cisalhamento sobre molculas de cadeia longa de materiais como os polmeros lineares. medida que a tenso de cisalhamento aumentada, as molculas desordenadas passam a alinhar seu eixo longitudinal na direo do fluxo. Esta orientao reduz a resistncia interna no material, permitindo assim uma maior velocidade de cisalhamento para cada tenso de cisalhamento sucessiva. Alm disso, parte do solvente associado s molculas pode ser liberada, resultando em um abaixamento efetivo da concentrao e do tamanho das molculas dispersas, o que ir tambm abaixar a viscosidade aparente (SINKO, 2008).

3.5.2.2 Tixotropia

A tixotropia pode ser descrita como um fenmeno no qual se observa a recuperao isotrmica e relativamente lenta da consistncia, perdida pelo

cisalhamento de um material deixado em repouso (REINER e SCOTT-BLAIR, 1967 apud. SINKO, 2008). Embora o termo deva ser aplicado apenas a uma transformao isotrmica do tipo sol-gel, tornou-se comum descrever como tixotrpico qualquer

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material que exiba um decrscimo reversvel de sua viscosidade aparente dependente do tempo (AULTON, 2005). Os sistemas tixotrpicos geralmente so constitudos por partculas assimtricas ou macromolculas, que so capazes de interagir mediante vrias ligaes secundrias, produzindo uma frouxa estrutura tridimensional, de forma que o material tem aspecto de gel quando no foi submetido ao cisalhamento. (AULTON, 2005). Conforme um cisalhamento aplicado e o fluxo inicia, a estrutura comea a se desintegrar medida que os pontos de contato so desfeitos e as partculas se alinham umas em relao s outras. Desta maneira o material sofre uma transformao de gel para sol e apresenta uma quebra da estrutura. Quando a tenso de cisalhamento retirada, a estrutura inicia sua reestruturao. Este processo de reestruturao constituise de uma restaurao progressiva da consistncia conforme as partculas assimtricas entram em contato umas com as outras por efeito do movimento browniano aleatrio (SINKO, 2008).

3.5.3 Estudos In Vitro

Os testes de liberao in vitro das substncias ativas tm chamado muita ateno aps a edio do GUIDANCE FOR INDUSTRY - FDA (UNITED STATES, 1997). De acordo com a edio do GUIDANCE FOR INDUSTRY - FDA (UNITED STATES, 1997), a liberao in vitro do frmaco uma propriedade da formulao que o contm. A velocidade de liberao dos produtos tpicos dermatolgicos pode ser 60

medida empregando um sistema bicompartimental como clula de difuso vertical com membrana sinttica e meio aceptor adequado. A membrana sinttica serve como um suporte para separar a formulao do meio receptor, devendo ser quimicamente inerte para no reagir com a formulao ou com o meio aceptor, e no deve ser limitante da velocidade nos processos de liberao do frmaco, sendo empregados acetato de celulose, nitrato de celulose e polisulfona (HAIGH e SMITH, 1994). A soluo receptora deve ser compatvel com a metodologia analtica empregada para quantificao do frmaco (FREITAS, 2005). Solues receptoras como misturas hidro-alcolicas e gua so empregadas como meio aceptor, obedecendo a condio sink, ou seja, o volume empregado cinco vezes maior que o ponto de saturao do frmaco (ZATZ, 1995). Segundo o GUIDANCE FOR INDUSTRY - FDA (1997) o meio receptor pode consistir de tampo aquoso, meio hidroalcolico ou qualquer outro tipo, com a justificativa apropriada. De acordo com Siewert e cols. (2003), dependendo da solubilidade do frmaco, o meio receptor pode necessitar conter surfactantes. Os dados obtidos podem ser empregados como medida de equivalncia para produtos de formulaes semi-slidas sujeitas a alteraes especificadas pela SUPAC (Scale-Up and Postapproval Changes), ou seja, como controle de qualidade para assegurar a uniformidade lote a lote dos produtos (GUIDANCE FOR INDUSTRY - FDA, 1997; SHAH; ELKINS; WILLIANS, 1999; FLYNN et al., 1999). A atividade termodinmica e a viscosidade tm um efeito dominante sobre a liberao da substncia ativa do veculo (DAVIS; KHANDERIA, 1972). A velocidade de liberao do frmaco da formulao pode ser manipulada pela mudana da sua

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concentrao, variao do coeficiente de partio e aumento de sua solubilidade na formulao (WELIN-BERGER; NEELISSEN; BERGENSTAHL, 2001). Pesquisas crescentes tm sido realizadas em busca do aparato mais adequado para avaliar a velocidade de liberao in vitro para produtos tpicos dermatolgicos, uma vez que, oficialmente, no existe uma padronizao que possa ser aplicada para todas as formulaes semi-slidas. Sendo assim, encontram-se descritos na literatura vrios modelos de clulas de difuso, tipos de membranas artificiais, que so empregados na avaliao da velocidade de liberao in vitro de frmacos em diferentes formas farmacuticas (KNORST; NEUBERT; WOHLRAB, 1997; REGE; VILIVALAM; COLLINS, 1998; KIERSTAN et al., 2001; WELIN-BERGER; NEELISSEN; BERGENSTAHL, 2001; WISSING; MLLER, 2002; GALLAGHER; TROTTED; HEARD, 2003; CSKA et al., 2005). A avaliao in vitro da penetrao e permeao cutnea de frmacos tambm pode ser avaliada por um sistema bicompartimental de difuso vertical, empregando membrana natural. Dentre os vrios tipos de pele animal (rato, cobaio, camundongo com e sem pele, macaco rhesus, cobra) que podem ser utilizadas, recentemente, temse empregado a pele suna devido a sua similaridade com a pele humana (HAIGH; SMITH, 1994; LOPES; KANEKO, 2000; SEKKAT; KALIA; GUY, 2002; MEDI; SINGH, 2003). A pele de orelha suna tem sido empregada em pesquisas de produtos dermatolgicos para uso humano. Neste contexto as camadas da pele de maior importncia so a epiderme e a derme (BHATTI, SCOTT, DYER, 1989; MEYER, ZSCHEMISCH, 2002). Entretanto h uma regio especfica da poro posterior da 62

orelha suna que mais adequada na aplicao como modelo de correlao para a pele humana (MEYER et.al.2007), como mostra a figura 9.

Figura 9: rea posterior da aurcula suna: A e B so recomendadas para utilizao experimental.

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4 MATERIAL E MTODOS

4.1 MATERIAL

4.1.1 Equipamentos e Acessrios

Agitador mecnico Phoenix tipo Vortex modelo AP 56 Balana analtica Bioprecisa modelo FA2104N Bales volumtricos de 100,0 mL, 50,0 mL e 10,0 mL, marca Quimex Bquer de 50, 100, 250 e 500 mL marca Quimex Centrfuga Beckman Coulter Avanti J25; Coluna cromatogfica Hibar LiChrosorb RP 18 de 5 e15 cm; Cromatgrafo lquido de alta eficincia WATERS bomba modelo 510, detector de UV modelo 486 e integrador modelo 746;

Cubetas de cristal de quartzo com caminho ptico de 1.0 cm Destilador QUIMIS modelo NT 425 Espectrofotmetro Cary50 Espectrofotmetro SHIMADZU UV modelo 2401PC Espectrofotmetro SP-220 Bioespectro equipado com software Win-Spec verso 2.3.1

Estantes para tubo de ensaio Grau de vidro marca Quimex

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Microscpio ptico com luz polarizada Zeiss, modelo Axioplan 2 acoplado cmera digital Colorview XS e programa gerenciador de imagens AnalySIS

Microscpio ptico Olympus, modelo BH-100, com objetiva de 100X, equipado com cmera digital Olympus DP-10 e software de captura de imagens FlashPath

Membrana de acetato de celulose, marca Sigma: 27 mm de dimetro, tamanho do poro 0,2 m, 43 mm de espessura

Micro tubos tipo eppendorf mbar Papel de filtro quantitativo 12,5 cm de dimetro com 25 mm de porosidade Vetec

Parafilm M American National Can Pipetas automticas: 20, 200, 1000 e 5000L, marca Gilson Pipetas para semi-slidos Brand Transferpepttor 1000 L Placa aquecedora marca Corning PC 351 Potencimetro Model 2000 VWR Scientific Provetas de 50, 100, 250 1000 mL marca Quimex Remetro marca Ares TA Instruments, com geometria do tipo cone e placa, equipado com elemento Peltier para controle de temperatura.

Seringas de 30 mL estreis Seringas tipo luer-lock com extrusor Sistema de difuso composto por: bquer de vidro 140 ML, suporte cilndrico orifcio 1,4 mm, garra metlica, montado no prprio laboratrio.

Termmetro Tubos de ensaio marca Quimex 65

Ultra-som Thorton T14 Stock Sceintific Unidade filtrante descartvel MILLIPORE poro 0,45 Millex

4.1.2 Reagentes e Matrias-primas

Acetonitrila grau CLAE

Lote: 709273/ Fornecedor: Tedia Lote: 950920/ Fornecedor: Isofar

cido ctrico grau farmacutico cido srbico

Fornecedor: Farmos Lote: 0501618/ Fornecedor: Vetec LoteA57/ Fornecedor: Farmos

cido sulfrico PA

Cloreto de sdio grau farmacutico Lauril sulfato de sdio Emulium Delta Etanol P.A

Lote: HN6J100505/ Fornecedor: Spectrum

Lote:09855BR6/ Forncedor: Brasquim

Lote:0603264/ Fornecedor: Vetec Lote:7760951/ Fornecedor: Gerbras

Fosfatidil colina (lecitina 75%)

Fosfato de potssio monobsico grau farmacutico Lote: 23017 Fornecedor: Henrifarma Fosfato dissdico dibsico grau farmactico Lote: 23017 Fornecedor: Hnrifarma Metanol grau CLAE Metanol PA Lote: 502018/ Fornecedor: Tedia

Lote: 0606981/ Fornecedor: Vetec Lote:0704339/ Fornecedor: Vetec Lote: NFD/012/00-08 Fornecedor: Deg Lote: I1/ Fornecedor: USP 66

Molibdato de amnio PA

Nifedipina matria-prima (padro de trabalho) Nifedipina padro USP

Metilparabeno (Nipagin) Propilparabeno (Nipazol) Palmitato de isopropila

Lote:03001129/ Fornecedor: Galena Lote:FI 1611/ Fornecedor: Purifarma Lote:185642/ Forncedor: Farmos Lote: 027K0033/ Fornecedor: Sigma

Polaxamer (Pluronic F127) Polissorbato 80

Lote: 131683/ Fornecedor: Via Farma Fornecedor: Farmos

Sorbato de potssio Transcutol CG Vaselina lquida

Lote: 450629012/ Fornecedor: Brasquim Lote: IQA 3753/ Fornecedor: Sarfam

4.1.3 Substncia Qumica de Referncia (SQR) e Formulaes

Nifedipina padro USP

Lote: I1/ Fornecedor: USP

4.2 MTODOS 4.2.1 Composio e Tcnica de Preparao das Formulaes Desenvolvidas

As formulaes estudadas sero descritas neste trabalho como: 1- PLO+NFD base PLO contendo 8% de nifedipina; base PLO contendo 8% de nifedipina e 10% de transcutol,;

2- PLO+NFD+TC 3- EMUL

base emulsionada o/a contendo 8% de nifedipina.

67

4.2.1.1 Formulao PLO+NFD: base PLO contendo 8% de nifedipina Fase aquosa: Polaxamer 407 Sorbato de Potssio gua destilada qsp Fase oleosa: Palmitato de isopropila Lecitina de soja cido srbico Formulao PLO+NFD: Nifedipina Fase oleosa Fase aquosa 8g 2 ml 10mL 10g 10g 0,2 g 10g 0,1g 50 mL

qsp

4.2.1.1.1.Tcnica de Preparo da Formulao PLO+NFD

Para o preparo da fase aquosa, os componentes foram pesados separadamente e transferidos para um bquer de vidro de 240 ml contendo 25 ml de gua gelada. Foram adicionados mais 75 mL de gua gelada, sob lenta homogeneizao com auxilio de basto de vidro. Cobriu-se com filme plstico e deixouse em repouso de um dia para o outro, sob refrigerao (FONSECA e FERREIRA, 2005). O preparo da fase oleosa realizou-se pesando os componentes

separadamente. Em seguida o cido srbico foi adicionado lecitina e ao palmitato de isopropila em um bque de vidro de 250 ml. Foi feita uma lenta homogeneizao com 68

basto de vidro. O recipiente foi coberto com filme plstico e deixado em repouso de um dia para o outro. Observou-se a formao de mistura de consistncia lquida no dia seguinte. Armazenou-se em frasco vedado, temperatura ambiente, e acondicionou-se em pote plstico preto para proteo contra a luminosidade (FONSECA e FERREIRA, 2005). A formulao PLO+NFD foi obtida pesando-se a nifedipina (NFD) em recipiente apropriado utilizando-se balana analtica. A NFD foi triturada em gral de vidro com auxlio de pistilo tambm de vidro, a fim de reduzir o tamanho das partculas. O volume necessrio da fase oleosa foi medido com o auxlio de uma seringa plstica de 30ml e subseqentemente foi adicionado ao gral contendo a NDF triturada onde foi feita homogeneizao por triturao. O corpo da seringa tipo luer lock foi vedado com parafilme na extremidade anterior, como mostra a figura 10, e a fase oleosa contendo NFD foi acondicionada na seringa pela extremidade posterior. Em outra seringa tipo luer lock foi medido o volume necessrio de fase aquosa, de maneira idntica ao processo para a fase oleosa.

Figura 10 - Seringas tipo luer lock com o corpo vedado com parafilme na extremidade anterior.

69

Os mbolos de cada uma das seringas foram encaixados na parte posterior de cada uma respectivamente. As vedaes das extremidades anteriores das duas seringas foram retiradas, os mbolos foram empurrados para eliminar o ar residual e as seringas foram conectadas, uma outra pela extremidade anterior, utilizando-se o adaptador (extrusor), como mostra a figura 11.

Figura 11 - Seringas conectadas, uma outra pela extremidade anterior, utilizando-se o adaptador (extrusor).

O contedo das seringas foi homogeneizado empurrando-se lentamente um mbolo por vez (mecanismo de extruso), como mostra a figura 12. O processo foi executado no menos que cinco vezes, at se obter uma preparao homognea.

Figura 12 - Mecanismo de extruso: o contedo das seringas foi homogeneizado empurrando-se lentamente um mbolo por vez.

70

A preparao foi acondicionada em pote plstico preto para proteo contra a luminosidade, como mostra a figura 13. Todos os processos com a presena da NFD foram realizados ao abrigo da luz.

Figura 13 - Acondicionamento da preparao em pote plstico preto para proteo contra a luminosidade

4.2.1.2 Formulao PLO+NFD+TC: base PLO contendo 8% de nifedipina e 10% de transcutol Fase aquosa:
Polaxamer 407 Sorbato de Potssio gua destilada qsp 10g 0,1g 50 mL

Fase oleosa:
Palmitato de isopropila Lecitina de soja Sorbato de potssio 10g 10g 0,2 g

Formulao:
Nifedipina Transcutol Fase oleosa Fase aquosa 8g 10 g 2 ml 10mL

q.s.p.

71

4.2.1.2.1 Tcnica de Preparo da Formulao PLO+NFD+TC

A preparao da fase aquosa e da fase oleosa foi realizada pelo mesmo processo descrito para as fases aquosa e oleosa da formulao PLO+NFD. Para a obteno da formulao, a nifedipina (NFD) foi pesada em recipiente apropriado utilizando-se balana analtica e, posteriormente foi triturada em gral de vidro com auxlio de pistilo tambm de vidro, a fim de reduzir o tamanho das partculas do p. O Tanscutol foi adicionado e homogeneizado por triturao. O volume necessrio da fase oleosa foi medido com o auxlio de uma seringa plstica de 30ml e subseqentemente foi adicionado ao gral contendo a NFD triturada e o Tanscutol, e novamente foi feita homogeneizao por triturao. O corpo da seringa tipo luer lock foi vedado com parafilme na extremidade anterior e a fase oleosa contendo NFD foi acondicionada na seringa pela extremidade posterior. Em outra seringa tipo luer lock foi medido o volume necessrio de fase aquosa, de maneira idntica ao processo para a fase oleosa. Os mbolos de cada uma das seringas foram encaixados na parte posterior de cada uma respectivamente. As vedaes das extremidades anteriores das duas seringas foram retiradas, os mbolos foram empurrados para eliminar o ar residual e as seringas foram conectadas, uma outra pela extremidade anterior, utilizando-se o adaptador (extrusor). O contedo das seringas foi homogeneizado empurrando-se lentamente um mbolo por vez (mecanismo de extrso). O processo foi executado no menos que cinco vezes, at se obter uma preparao homognea. A preparao foi acondicionada em pote plstico preto para proteo contra a luminosidade. 72

4.2.1.3 Formualo EMUL: base emulsionada o/a contendo 8% de nifedipina Fase oleosa:
Emulium Delta (lcool cetlico + estearato de glicerila + estearato de PEG75 + Ceteth20 + Esteareth20) Vasilina liquida Propilparabeno

6g 2g 0,1 g

Fase aquosa:
Metilparabeno gua destilada q.s.p. 0.1 g 100 g

Formulao:
Nifedipina EMUL q.s.p. 8g 100 g

4.2.1.3.1 Tcnica de Preparo da Formulao EMUL

Para o preparo da fase aquosa, o metilparabeno foi pesado, adicionado em 60 ml de gua destilada e levado para aquecimento em caneco de ao inox (200 ml) at 80C. Para o preparo da fase oleosa, o lcool cetlico + estearato de glicerila + estearato de PEG75 + Ceteth20 + Esteareth20 (Emulium Delta), o propilparabeno e a vaselina lquida foram pesados separadamente. Posteriormente foram acondicionados em um outro caneco de ao, previamente tarado, e levados para aquecimento at 75C. A fase aquosa (a 80C) foi vertida sobre a fase oleosa (a 75C), sob agitao constante e vigorosa. A agitao da preparao foi mantida at a temperatura ambiente. O volume (p/p) foi completado para 100 g com gua destilada e a preparao 73

foi homogeneizada. Acondicionou-se em pote plstico preto para proteo contra a luminosidade. Para o preparo da formulao EMUL a NFD foi pesada e triturada em gral de porcelana previamente tarado. Adicionou-se a emulso at completar 100 g e homogeneizou-se. A formulao foi acondicionada em pote plstico preto para proteo contra a luminosidade.

4.2.2 Anlise da Matria-prima Nifedipina

Realizou-se a anlise da matria-prima de nifedipina (NFD) a fim de utiliz-la como padro secundrio. Para isto foram realizados os testes de: perda por dessecao; doseamento pelo mtodo farmacopico de espectrofometria de absoro no ultravioleta (UV), preconizado pela Farmacopia Brasileira IV, comparando-se com padro farmacopico USP, cedido pelo Laboratrio de Controle de Qualidade de Frmacos e Medicamentos da Faculdade de Farmcia (LabCQ-FF/UFRJ); anlise de pureza do pico por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) com dispositivo de arranjo de foto diodos, obedecendo as condies cromatogrficas preconizadas pela Farmacopia Brasileira (F. Brs IV, 1996).

4.2.2.1 Perda por Dessecao

Foi seguido o procedimento geral descrito na Farmacopia Brasileira IV (1996). As anlises foram feitas em triplicata. 74

As anlises foram realizadas ao abrigo da luz, devido foto sensibilidade da NFD.

4.2.2.2 Anlise Quantitativa (Doseamento) por Espectrofometria de absoro Ultravioleta (UV)

O doseamento da NFD matria-prima foi realizado por espectrofotometria de ultravioleta, como descrito na Farmacopia Brasileira IV, objetivando-se determinar o seu teor, a fim de emprega-la como padro secundrio. Todas as anlises foram realizadas ao abrigo da luz, devido foto sensibilidade da NFD. Para a construo da curva analtica, uma soluo-padro de NFD foi preparada, pesando-se exatamente cerca de 25,0 mg do padro farmacopico da NFD, que foram transferidos quantitativamente para balo volumtrico de 50,0 mL. Ao balo foram adicionados 40 mL de etanol e o balo foi levado para solubilizao em equipamento de ultra-som por cinco minutos; aps os quais completou-se o volume no balo para 50,0 mL com etanol e homogeneizou-se o contedo. Foram preparadas trs solues, a partir da soluo-padro: retirando-se alquotas de 1,0 mL para balo volumtrico de 100,0 mL; 1,0 mL para balo de 50,0 mL e 3,0 mL para balo de 100,0 mL. Os volumes dos trs bales foram completos com etanol, obtendo-se solues de concentraes tericas iguais a 0,005 mg/mL, 0,010 mg/mL e 0,015 mg/mL, respectivamente.

75

Para as amostras de NFD matria-prima foram pesadas exatamente cerca de 50 mg da matria-prima, que foram leses cutneas para balo volumtrico de 50,0 mL. Adicionou-se 40 mL de etanol ao balo e este foi levado para solubilizao em equipamento de ultra-som por cinco minutos; aps os quais completou-se o volume no balo para 50 mL com etanol. Uma alquota de 1,0 mL foi transferida para balo de 100,0 mL e o volume foi completado com etanol. Foi obtida uma soluo-amostra na concentrao de 0,01 mg/mL. Foram feitas cinco pesadas da matria-prima de NFD em dois dias diferentes. As leituras foram realizadas no comprimento de onda de 230 nm.

4.2.2.3 Anlise Qualitativa do Pico da NFD Matria-prima por CLAE com Detector de UV com Arranjo de Foto Diodos (PDA)

A realizao desta anlise foi feita com base no mtodo proposto pela Farmacopia Brasileira IV (1996) com a finalidade de se observar a pureza do pico da NFD matria-prima. A NFD foi identificada cromatograficamente por um sistema CLAE isocrtico equipado com coluna C18, pr coluna (C18). A fase mvel foi composta de gua:acetonitrila:metanol na proporo 50:25:25. O comprimento de onda de deteco foi fixado em 235 nm, correspondente ao mx encontrado por espectrofotometria de varredura na regio do UV, o fluxo foi fixado em 1,0 mL / min.

76

4.2.3. Anlise Quantitativa da NFD nas Formulaes por Espectrofotometria de Absoro no Ultravioleta visvel (UV-visvel) com Reao Colorimtrica

A quantificao da NFD nas formulaes foi realizada por espectrofotometria de absoro no UV-visivel, tomando-se por base o mtodo proposto por Rahman e Azmi (2005), com o objetivo de se determinar o teor de NFD nas formulaes em estudo. O mtodo colorimtrico proposto por Rahman e Azmi (2005), fundamenta-se na oxidao da NFD com molibdato de amnio. O molibdato reduzido assume colorao azul e mensurado em 830 nm. Este mtodo mostrou-se especfico para a NFD, uma vez que os seus produtos de degradao no reagem com os regentes aplicados na reao (RAHMAN, AZMI 2005). Para verificar o comprimento de onda de mxima absoro (mx), foram realizadas varreduras na regio do visvel para a NDF em cada matriz das formulaes.

4.2.3.1 Preparo das solues de trabalho

4.2.3.1.1 Soluo de cido Sulfrico 4M

Para o preparo da soluo de cido sulfrico 4M, 98,02 g de cido sulfrico concentrado foram pesados e transferidos para balo volumtrico de 250,0 mL. Foi adicionada gua destilada em pequenas pores at completar o volume de 250,0 mL. O procedimento foi conduzido em banho refrigerado devido energia liberada pela reao exotrmica entre o cido sulfrico e a gua. 77

4.2.3.1.2 Soluo de Molibdato de Amnio (0,02M em cido sulfrico 4M)

Para o preparo desta soluo, 6,18g de molibdato de amnio foram pesados e transferidos para balo volumtrico de 250,0 mL. O volume foi completado at 250,0 mL com a soluo de cido sulfrico 4M.

4.2.3.1.3 Soluo tampo de cido ctrico (0,1 M com fosfato de sdio 0,2 M de pH = 4,0) Foram pesados 15,11 g de cido ctrico e adicionados a 78,70 mL de gua destilada em bquer de 100 mL, para a obteno a soluo de cido ctrico 0,1 M. (MORITA E ASSUMPO, 1998). Foram pesados 14,189 g de fosfato de sdio dibsico monohidratado e transferidos para um balo volumtrico de 500,0 mL. O volume foi completado com gua destilada para 500 mL. (MORITA E ASSUMPO, 1998). As solues obtidas foram transferidas para um bquer de 1000 mL e o pH foi verificado com potencimetro.

4.2.3.2 Preparo das amostras das formulaes para determinao de teor de NFD

As anlises foram realizadas ao abrigo da luz, devido fotossensibilidade da NFD.

78

Foram pesados 312,5 mg (o equivalente a 25,0 mg de NFD) de formulao em bquer de vidro. Ao bquer contendo a formulao foram adicionados 40 mL de metanol e levado para homogeneizao em ultra-som por 3 minutos. O contedo do bquer foi transferido quantitativamente para balo volumtrico de 50,0 mL e o volume foi completado com metanol. Deste balo foi, ento, transferida uma alquota de 0,5 mL para tubo de ensaio contendo 5mL de soluo tampo de pH 4,0 e 1,4 mL de soluo cida de molibdato de amnio. O tudo de ensaio foi vedado, agitado e levado para aquecimento em banho-maria a 100C por 20 minutos, aps os quais o tubo foi resfriado a temperatura ambiente. O contedo do tubo de ensaio foi transferido quantitativamente para balo volumtrico de 10,0 mL e o volume foi completado com gua destilada. A amostra foi filtrada por papel de filtro para tubo de ensaio. A leitura da amostra foi feita em 830 nm. A anlise foi realizada em triplicata, em dois dias seguidos.

4.2.3.3 Preparo do placebo

Foram pesados 312,5 mg da matriz de cada formulao sem a adio da NFD, e seguiu-se exatamente o mesmo procedimento realizado para as amostra contendo NFD. A anlise foi realizada em triplicata, em dois dias seguidos.

79

4.2.3.4 Preparo do branco

A um tubo de ensaio contendo 5mL de soluo tampo de pH 4,0 e 1,4 mL de soluo cida de molibdato de amnio foi adicionada uma alquota de 0,5 mL de metanol. O tubo de ensaio foi vedado, agitado e levado para aquecimento em banhomaria a 100C por 20 minutos, aps os quais o tubo foi resfriado a temperatura ambiente. O contedo do tubo de ensaio foi transferido quantitativamente para balo volumtrico de 10,0 mL e o volume foi completado com gua destilada.

4.2.3.5 Preparo da Curva Analtica

A cada dia de anlise, foi realizada uma curva analtica para a boa execuo dos procedimentos, alm da avaliao da qualidade do sistema. Em cada dia de anlise uma soluo estoque de NFD foi preparada pesando-se 50 mg de NFD padro de trabalho com teor de 99,94%. A massa de NFD foi transferida quantitativamente para balo volumtrico de 100 mL. Ao balo foram adicionados 80 mL de metanol e o balo foi levado para homogeneizao em ultra-som por cinco minutos, aps os quais o volume foi completado para 100,0 mL com metanol. Desta soluo-estoque foram retiradas cinco alquotas, a fim de ser obtida uma curva analtica com cinco pontos. Foram retiradas alquotas de 100 L, 300 L, 500 L, 700 L e 900 L que foram transleses cutneas para cinco tubos de ensaio contendo 5mL de soluo tampo de pH 4,0 e 1,4 mL de soluo cida de molibdato de amnio. Os tubos de ensaio foram vedados, agitados e levados para banho-maria a 100C por 20 minutos, aps os quais os tubos foram resfriados a temperatura ambiente. Os 80

contedos dos tubos foram transferidos quantitativamente para balo volumtrico de 10,0 mL e o volume foi completado com gua destilada. Foram obtidas cinco solues de concentrao terica 0,005 mg/mL, 0,015 mg/mL, 0,025 mg/mL, 0,035 mg/mL e 0,045 mg/mL, respectivamente.

4.2.3.6 Validao do mtodo espectrofotomtrico

A validao tem o objetivo de demonstrar que o mtodo analtico proposto apropriado para a determinao quantitativa da NFD nas formas farmacuticas semislidas empregadas neste estudo. De acordo com a Resoluo RE n 899 de 2003, a validao de mtodos quantitativos para a determinao do princpio ativo em produtos farmacuticos envolve critrios como especificidade, linearidade e intervalo de confiana, preciso, limites de deteco e quantificao e, exatido / recuperao.

4.2.3.6 1 Especificidade

Para a verificao da especificidade do mtodo foram preparados placebos, ou amostras das bases das formulaes isentas de NFD, conforme descrito no item 4.2.3.3. Foram preparadas, tambm, amostras do branco, conforme descrito no item 4.2.3.4 e amostras do padro conforme descrito no item 4.2.3.5. As amostras foram analisadas por espectrofotometria de varredura com comprimentos de onda entre 200 e 1000 nm. 81

4.2.3.6 2 Linearidade

A linearidade foi avaliada pela anlise de cinco concentraes diferentes de NFD, na faixa de concentrao de 0,005 mg/mL a 0,045 mg/mL. Foram preparadas trs curvas analticas, em dois dias diferentes. A linearidade foi determinada pela anlise de regresso linear com o auxlio do programa Excel (Microsoft, 2002).

4.2.3.6 3 Exatido

A estimativa da exatido foi realizada pelo mtodo de adio do padro, onde quantidades conhecidas da substncia de referncia do analito so adicionadas s diluies do placebo, realizando-se a anlise quantitativa do analito. (Brasil. Res RE n 899, 2003). Foi preparada uma soluo-estoque de concentrao igual a 0,4 mg/mL, pesando-se exatamente cerca de 20,0 mg de NFD que foram transleses cutneas quantitativamente para balo volumtrico de 50,0 mL. Ao balo foram adicionados 40 mL de metanol e o balo foi levado para homogeneizao em ultra-som por 5 minutos, aps os quais o volume foi completado com metanol. Foram preparados nove placebos, ou amostras das bases das formulaes isentas de NFD, pesando-se exatamente cerca de 312,5 mg da matriz de cada formulao em bqueres de vidro. Aos bqueres contendo a formulao foram adicionados 40 mL de metanol e estes foram levados para homogeneizao em ultrasom por 3 minutos. O contedo dos bqueres foram transferidos quantitativamente para bales volumtricos de 50,0 mL. A trs bales contendo o placebo foram adicionadas 82

alquotas de 2,5 mL, a outros trs foram adicionadas alquotas de 3,13 mL e aos trs ltimos foram adicionadas alquotas de 3,75 mL da soluo-estoque. Os volumes dos bales foram completados para 50,0 mL. Foram obtidas amostras de concentrao igual a 0,02 mg / mL, 0,025 mg / ml e 0,03 mg / ml. De cada um dos bales foi retirada uma alquota de 1,0 mL, as quais foram tranferidas para tubos de ensaio contendo 5mL de soluo tampo de pH 4,0 e 1,4 mL de soluo cida de molibdato de amnio, cada tubo. Os tubos de ensaio foram vedados, agitados e levados para banho-maria a 100C por 20 minutos, aps os quais os tubos foram resfriados a temperatura ambiente. Os contedos dos tubos foram transferidos quantitativamente para balo volumtrico de 10,0 mL e o volume foi completado com gua destilada. As amostras foram filtradas por papel de filtro para tubo de ensaio. A leitura das amostras foi feita em 830 nm. A figura 14 mostra o esquema de preparao das amostras para o ensaio de exatido

0,4mg/mL 2,5mL

20mg NFD

40mL metanol at 50mL 3,75mL

* Ultra som 5 * Avolumar com metanol

3,13mL

0,3125g PLO 9 vezes 1mL 1 1mL 2 1mL 3 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL

5mL sol. tampo + 1,4mL molibdato * Filtrar * Leitura em 830nm

* Tampar * Agitar

100C 20

Resfriar

avolumar com gua destilada

Figura 14: Esquema do reparo das amostras para determinao da exatido

83

4.2.3.6 4 Preciso intra e inter dia

representada pela avaliao da proximidade dos resultados obtidos em uma srie de medidas de uma amostragem mltipla de uma mesma mostra. Neste trabalho a preciso foi calculada atravs da avaliao dos parmetros estatsticos da curva analtica.

4.2.3.6 5 Limite de deteco (LD) e quantificao (LQ)

Estes limites foram calculados pelo mtodo baseado nos parmetros da curva analtica (Brasil. Resoluo RE n 899, 2003; RIBANI et al., 2004) O limite de deteco foi expresso pela equao a seguir:

LD = DPa x 3
IC

Onde: DP representa a estimativa do desvio padro do intercepto com o eixo Y e IC representa a inclinao ou coeficiente angular da curva analtica

Critrios similares de LD porem ser aplicados para o limite de quantificao, adotando-se uma relao 10:1, a partir da seguinte equao:

LQ = DPa x 10
IC

Os limites foram calculados para todas as formulaes estudadas. 84

4.2.4 Caracterizao Geral das Formulaes

As formulaes preconizadas neste estudo foram caracterizadas quanto aos ensaios para a determinao do pH, viscosidade, reologia e aspecto morfolgico por microscopia ptica, a fim de estudar as suas caractersticas fsicas. As caractersticas qumicas foram determinadas em funo do teor do frmaco e o comportamento biofarmacotcnico, atravs dos ensaios de liberao e penetrao / permeao cutnea.

4.2.4.1 Determinao do pH

O pH das formulaes foi determinado atravs de potencimetro Model 2000 VWR Scientific, previamente calibrado com as solues tampo pH 7,0 e pH 4,0 (Merck, reagentes), temperatura ambiente, sem diluio do produto (PRISTA, ALVES, MORGADO, 1995; LE HIR, 1997).

4.2.4.2 Determinao da Reologia

A viscosidade foi medida utilizando-se um remetro Ares da TA Instruments (Figura 15). O controle de temperatura foi realizado utilizando-se um elemento Peltier, a geometria utilizada foi cone e placa e as anlises foram realizadas em temperaturas

85

entre (-)10 e 50 C com taxa de aquecimento de 2 C/min, em freqncia de 1Hz e deformao de 1%.

Figura 15 - Remetro ARES -TA utilizado nas medidas de viscosidade.

4.2.4.3 Determinao do aspecto morfolgico por microscopia ptica

O aspecto morfolgico das formulaes foi observado por microscopia ptica simples e por microscopia ptica com luz polarizada. Para as duas tcnicas utilizou-se aumento de 100X com imerso. Ambos os equipamentos encontram-se acoplados a cmera digital para a captura de imagens. Nas fotos obtidas por microscopia de luz polarizada foi possvel realizar medidas aleatrias dos tamanhos das micelas nas formulaes, com auxlio de programa gerenciador de imagen, AnalySIS.

Para a preparao das amostras, uma pequena quantidade da formulao foi aplicada sobre uma lmina de vidro e sobre a amostra foi aplicada uma lamnula de vidro. A face da lmina com a superfcie contendo amostra e lamnula foi virada para 86

baixo e o conjunto foi delicadamente pressionado sobre uma superfcie rgida, a fim de produzir um filme delgado de amostra. A lmina foi, ento observada ao microscpio. (CARASTRAN, 2007)

4.2.4.4 Determinao do teor do frmaco nas formulaes

Esta anlise foi feita aps a validao do mtodo proposto no item 4.2.3 e teve como objetivo verificar a quantidade de NFD efetivamente encontrada nas formulaes. As amostras foram preparadas como descrito no item 4.2.3.2.

4.2.5 Liberao in vitro Atravs de Membrana Sinttica

4.2.5.1. Estudo da solubilidade da NFD e escolha da soluo receptora

A solubilidade da NFD foi estudada em diferentes solues correntemente utilizadas na avaliao dos perfis de liberao e penetrao e/ou permeao de preparaes semi-slidas de uso tpico. A determinao da solubilidade da NFD nas solues receptoras foi realizada por espectrofotometria de absoro no UV-visivel, tomando-se por base o mtodo proposto por Rahman e Azmi (2005). Foram testadas: soluo de gua e etanol (1:1) (a), soluo de gua e etanol (1:1) adicionada de 0,5% lauril sulfato de sdio (b), gua adicionada de 0,5% lauril

87

sulfato de sdio (c), tampo fosfato pH 7,4 adicionado de 0,5% lauril sulfato de sdio (d). As amostras para a determinao da solubilidade foram preparadas adicionandose uma quantidade em excesso de NFD a um volume definido de cada uma das solues. Estas suspenses foram mantidas sob agitao e protegidas da luminosidade durante 24 horas, a temperatura ambiente em torno de 23 1C. Aps este perodo, as suspenses foram centrifugadas a 3000 rpm por 5 minutos. Alquotas de 1,0 mL para as solues b e c e de 0,1 mL para as solues a e b do sobrenadante foram filtradas para tubo de ensaio contendo 5 mL de soluo tampo pH 4,0 e 1,4 mL de soluo cida de molibdato de amnio. O tubo de ensaio foi vedado, agitado e levado para aquecimento em banho-maria a 100C por 20 minutos, aps os quais o tubo foi resfriado a temperatura ambiente. O contedo do tubo de ensaio foi transferido quantitativamente para balo volumtrico de 10,0 mL e o volume foi completado com gua destilada. A amostra foi filtrada por papel de filtro para tubo de ensaio. A leitura da amostra foi feita em 830 nm. O valor da concentrao foi calculado empregando-se a equao da reta obtida atravs de curva de padro, como apresentado no item 4.2.3.6.2.

4.2.5.2 Estabelecimento das condies analticas para a NFD por CLAE

As condies analticas para CLAE foram seguidas conforme metodologia descrita na Farmacopia Brasileira IV (1996). A quantidade de NFD foi identificada e determinada cromatograficamente por um sistema CLAE isocrtico equipado com coluna C18, pr coluna (C18), loop de 50 L, detector ultravioleta e integrador 88

eletrnico. A fase mvel foi composta de gua:acetonitrila:metanol na proporo 50:25:25. O comprimento de onda de deteco foi fixado em 235 nm, correspondente ao mx encontrado por espectrofotometria de varredura na regio do UV, o fluxo foi fixado em 1,0 mL / min. As amostras provenientes dos ensaios de liberao e dos ensaios de penetrao e/ou permeao cutneas foram analisadas por CLAE. As amostras de soluo receptora coletadas com auxlio de seringa de 30 mL, bem como as amostras extradas da epiderme e da derme suna, foram filtradas por unidade filtrante descartvel com poro de 0,45 m, recolhidas em eppendorf mbar e analisadas por CLAE.

4.2.5.2.1 Parmetros da validao da metodologia analtica para a NFD nas amostras por CLAE

Conforme exposto no item 4.2.3.6, a validao de uma metodologia de anlise tem a finalidade de garantir que o mtodo atenda s exigncias das aplicaes analticas, assegurando a confiabilidade dos resultados, atravs de experimentos. (Brasil, 2003) A seletividade ou especificidade foi avaliada comparando-se uma matriz isenta de NFD (branco) e uma matriz adicionada com NFD (padro), a fim de se observar que nenhum interferente tenha sido eluido no tempo de reteno da NFD, de modo que esta tenha permanecido separada dos demais compostos presentes na amostra. A linearidade foi determinada avaliando-se a curva analtica por meio do coeficiente de determinao (r). O intervalo da curva foi determinado entre a concentrao superior e a inferior analisada, atendendo aos requisitos de preciso, 89

exatido e linearidade (RIBANI et al., 2004). O intervalo de concentrao entre 0,0625 g/mL e 0,5 g/mL foi obtido avaliando-se estes parmetros para os valores utilizados na construo da curva analtica obtida em cada experimento com padro de trabalho de NFD, cuja pureza foi estabelecida contra padro farmacopico USP, conforme descrito no item 4.2.2.2. A preciso foi avaliada pelo desvio padro (s), pelo desvio padro relativo (DPR) e pela repetitividade das anlises. A exatido do mtodo foi avaliada pelo ensaio de recuperao da quantidade de NFD extrada, adicionada a um branco da matriz em anlise. Os limites de deteco e quantificao foram calculados pelo mtodo baseado em parmetros da curva analtica, expressos como demonstrado em 4.2.3.6 5. Para a anlise estatstica dos dados foi realizada anlise de varincia (ANOVA um fator) com nvel de significncia () de 5%, com auxlio do programa Sigma Stat for Windows 1.0 (Jandel Corporation, 1994)

4.2.5.2.2 Validao da metodologia para extrao da NFD dos estratos cutneos: epiderme e derme suina

Inicialmente, segmentos de pele de 1 cm2 foram imersos em gua a 60oC por 60s (BHATIA; GAO; SINGH, 1997) para separao da epiderme da derme com auxlio de bisturi. Os dois estratos cutneos (epiderme e derme) foram transferidos para tubos de eppendorf mbar.

90

O procedimento foi realizado em 3 nveis de quantidade de NFD em cada um dos estratos cutneos, em triplicata para cada nvel de quantidade e para o branco (segmentos cutneos mais solventes). Aos estratos cutneos de derme e de epiderme resultantes foram adicionadas diferentes quantidades de NFD: 1,66g: 20 L de soluo de NFD a 83 g/mL em fase mvel 3,4g: 20 L de soluo de NFD a 170 g/mL em fase mvel. 5,0 g:20 L de soluo de NFD a 250 g/mL em fase mvel. Aps a evaporao total do solvente procedeu-se a extrao do frmaco. A preciso foi avaliada pelo desvio padro, pelo desvio padro relativo e pela repetitividade das anlises. A mdia do coeficiente de correlao (r) foi realizada para n=5 para a verificao da linearidade de resposta de CLAE dentro da faixa de concentrao entre 0,2 a 5,5 g/mL.

4.2.5.2.3 Metodologia para extrao da NFD da epiderme e derme suna

Cada um dos estratos cutneos, epiderme e derme foram transferidos para um tubo de eppendorf mbar e adicionados de 1mL de fase mvel, agitados em vortex por 30 segundos intercalados trs vezes. Este procedimento foi repetido por trs vezes. Aps a terceira agitao no vrtex, os eppendorfs foram centrifugados a 6400 rpm por 10 minutos em centrfuga. Os testes foram realizados em triplicata. Aps a centrifugao, o sobrenadante foi filtrado por unidade filtrante descartvel com poro de 0,45 m e analisadas por CLAE. 91

Todo o procedimento foi mantido ao abrigo da luz devido a fotossensibilidade da NFD. A figura 16 ilustra as etapas realizadas validao da metodologia para extrao da NFD dos estratos cutneos: epiderme e derme.

a)

b)

c)

d)

e)

f)

g)

h)

i)

j)

k)

l)

Figura 16: Etapas realizadas validao da metodologia para extrao da NFD dos estratos cutneos: epiderme e derme. Corte dos segmentos de pele (a) (b) e (c); separao dos extratos cutneos (d) (e) (f); adio de NDF (g); transferncia para eppendorf (h); adio de fase mvel extratora (i); agitao em vortex (j); centrifugao (k); filtrao para eppendorf mbar (l).

92

4.2.5.2.4 Estudo de Liberao in vitro

Foi empregado um sistema de difuso vertical composto por um compartimento doador e um compartimento receptor, como mostra a figura 17. Entre os compartimentos foi acoplada uma membrana. Para os ensaios de liberao utilizou-se membrana sinttica de acetato de celulose e para os ensaios de penetrao e/ou permeao utilizou-se membrana natural de pele suna. A rea de difuso foi de 1,54 cm2 e o volume utilizado do compartimento receptor foi de 40 mL.

Coleta de amostra manual

Membrana de acetato de celulose

Compartimento doador

Compartimento receptor

Figura 17 -: Sistema de difuso vertical montado com membrana artificial de acetato de celulose

93

4.2.5.2.5 Ensaio de liberao in vitro da NFD das formulaes semi-slidas

A soluo receptora empregada foi tampo fosfato pH 7,4 adicionado de 0,5% lauril sulfato de sdio. Este meio foi selecionado de acordo com a solubilidade da NFD, estabelecida no item 4.2.5.1, a fim de ser estabelecido um fluxo da NFD no sistema, sem, no entanto, promover a saturao do meio receptor. Procedeu-se hidratao das membranas de acetato de celulose com poro de 0,2 m em gua destilada a 100C durante cinco minutos, por trs vezes. As membranas de acetato de celulose hidratadas foram montadas no sistema de difuso, de modo a separar o compartimento doador do compartimento receptor. Os compartimentos receptores foram mantidos sob agitao constante na velocidade de 900 rpm, por meio de uma barra magntica. Teve-se o cuidado de monitorar a presena de bolhas de ar abaixo da membrana. A fim de se estabelecer o equilbrio entre a membrana e a soluo receptora, o sistema foi mantido por 30 minutos antes da aplicao da amostra no compartimento doador. Passados os 30 minutos guardados para o equilbrio do sistema, foram aplicados 500 g de amostra no compartimento doador, com o auxlio de uma pipeta para semislidos (figura 18).

94

Figura 18 - Aplicao da amostra de formulao no compartimento doador do sistema de difuso.

Em intervalos de tempo pr-estabelecidos, alquotas de 3 mL foram retiradas para anlise, havendo reposio do volume com a soluo receptora. A presena de NFD na soluo receptora foi determinada a cada 30 minutos por 3 horas, e uma coleta foi realizada aps 24 horas de experimento. As amostras resultantes do ensaio de liberao foram analisadas por CLAE, conforme descrito no item 4.2.5.1. Foi possvel expressar o transporte atravs do fluxo de equilbrio, o qual foi definido como a quantidade de NFD liberada por unidade de rea por tempo. Os resultados foram expressos como a mdia erro padro da mdia (EPM) de seis experimentos. Para a anlise estatstica dos dados foi realizada anlise de varincia (ANOVA um fator) com nvel de significncia () de 5%, com auxlio do programa Sigma Stat for Windows 1.0 (Jandel Corporation, 1994).

95

4.2.6 Ensaio de penetrao e/ou permeao da NFD das formulaes semi-slidas atravs de membrana natural de pele suina

Os estudos de penetrao ou reteno cutnea e de permeao percutnea da NFD foram realizados no sistema de difuso vertical exposto no item 4.2.5.

4.2.6.1 Preparo da pele suna

As peles utilizadas neste trabalho foram obtidas de orelhas de sunos sadios abatidos com aproximadamente quatro meses de idade, provenientes do abatedouro de suinocultura da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ). Aps o abate dos animais, as orelhas foram retiradas e transportadas, sob refrigerao, para o laboratrio em um tempo no superior a 2 horas. As orelhas foram lavadas com gua corrente para remoo de manchas de sangue. A pele da parte posterior da orelha foi excisada com auxlio de bisturi e pina e, com auxlio de tesoura e pina, excesso de tecido adiposo e vasos sanguneos foram retirados da parte inferior da pele. Os pelos superficiais foram cuidadosamente cortados com auxlio de uma tesoura. A seguir, pedaos de pele circulares de aproximadamente 11,0 cm2 foram acondicionados em filme de cloreto de polivinila (PVC) com remoo de ar e devidamente etiquetados e armazenados a -20oC por no mximo quatro semanas antes do uso.

96

4.2.6.2 Montagem do sistema de difuso

A pele suna total excisada foi colocada horizontalmente com o EC voltado para dentro do compartimento doador e fixada com auxlio de um elstico, de modo que a face interna da pele permaneceu livre para o contato com a soluo receptora. O compartimento receptor foi preenchido com 40 mL da soluo receptora (tampo fosfato pH 7,4 adicionado de 0,5% de lauril sulfato de sdio). Ao longo do experimento, a soluo receptora permaneceu sob agitao contnua com auxlio de uma barra magntica, a fim de conservar a homogeneidade. O sistema de difuso foi mantido a 35C 0,5 com auxlio de um banho de gua termostatizado. Os sistemas de difuso permaneceram funcionando por um perodo de 1 hora com os segmentos de pele em contato com a soluo receptora, com a finalidade de se estabelecer um equilbrio no ambiente. Os experimentos foram conduzidos com uma amostra de aproximadamente 500 g aplicadas por dentro do compartimento doador, sobre o EC, com auxlio de uma pipeta automtica para semi-slidos. Uma clula era sempre utilizada como branco, isto , sem o produto. A cada 2 horas uma alquota de 3 mL de soluo receptora foi coletada, por um perodo de 8 horas. Uma coleta foi feita aps 24 horas e o sistema foi desmontado. A cada alquota retirada o volume foi completado com nova soluo receptora. As amostras da soluo receptora foram coletadas com auxlio de seringa de 30 mL, filtradas por unidade filtrante descartvel com poro de 0,45 m, recolhidas em microtubos mbar e analisadas por CLAE.

97

Os resultados foram expressos como a mdia erro padro da mdia (EPM) de cinco experimentos. Para a anlise estatstica dos dados foi realizada anlise de varincia (ANOVA um fator) com nvel de significncia () de 5%, com auxlio do programa Sigma Stat for Windows 1.0 (Jandel Corporation, 1994). Ao final das 24 horas de experimento, o sistema foi desmontado, o segmento de pele foi retirado, a formulao foi removida com auxlio de algodo e limpo com algodo umedecido em gua por trs vezes e, por fim, foi seco com algodo. A epiderme foi separada da derme com auxlio de bisturi, os estratos cutneos foram submetidos ao processo de extrao da NFD, como descrito no item 4.2.5.2.3.

4.2.6.3 Caracterizao Histolgica dos Estratos Cutneos

A anlise histolgica foi realizada com o objetivo de avaliar o procedimento de separao dos estratos cutneos, i.e., a separao da epiderme da derme com auxlio de bisturi. Para esta anlise utilizou-se 2 segmentos de pele, com dimenses aproximadas de 5 cm x 2 cm. Um segmento de pele foi imerso em gua a 60C por 30 segundos e o outro mantido fora da gua com auxlio de uma pina. A seguir, a epiderme da metade do segmento submetido ao aquecimento foi removida com auxlio de um bisturi. Com o objetivo de verificar se o procedimento de separao dos segmentos cutneos realmente produziu a separao da epiderme da derme, realizou-se o estudo histolgico microscopia de luz de um segmento submetido ao processo preconizado de separao. 98

4.2.6.4 Mtodo em Microscopia de Luz

Segmentos cutneos, epiderme e derme, separados com auxlio de bisturi foram e processados seguindo-se a tcnica histolgica para incluso em parafina. O material foi fixado em formol neutro tamponado (por 1 semana) e/ou lquido de Bouin (por 18 horas). Aps o perodo de fixao para cada fixador, os fragmentos foram lavados e mantidos em lcool 70%. A seguir, os fragmentos foram desidratados utilizando-se concentraes crescentes de lcool etlico (70%, 80%, 90% e 100% - um banho de 20 min. em cada lcool). Aps a desidratao, o material foi clarificado em dois banhos sucessivos de xilol (15 minutos cada), posteriormente impregnado, utilizando-se dois banhos de parafina (15 minutos cada) em seguida o fragmento foi emblocado em parafina. Cortes histolgicos de 5 m de espessura foram obtidos com o auxlio de um micrtomo American Optical modelo Spencer 45, sendo coletados em lminas histolgicas e guardados em estufa a 37C durante 24 h para secagem. A anlise morfolgica foi realizada, utilizando-se a colorao pela hematoxilinaeosina (Lillie e Fullmer, 1976): os cortes foram desparafinizados em trs banhos de xilol, hidratados em uma srie de concentraes decrescentes de lcool etlico (100%, 90%, 80% e 70%) e lavados em gua destilada. Procedeu-se colorao pela hematoxilina de Harris, por 10 segundos, que foi seguida de lavagem em gua corrente por 5 minutos. Posteriormente, os cortes foram submetidos colorao pela eosina, durante 15 segundos. Aps rpida lavagem em gua destilada, os cortes foram desidratados em lcool etlico (70%, 80%, 90% e 100%), clarificados em trs banhos de

99

xilol e montados com lamnulas, usando-se entelan (Entellan new, Merck). Neste mtodo, as estruturas basfilas, como o ncleo, coram-se em azul e as estruturas acidfilas, como citoplasma, coram-se em rseo.

100

5 RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Anlise da Matria-prima Nifedipina (NFD)

A Tabela 2 apresenta os resultados dos testes de perda por dessecao e ponto de fuso da NFD de acordo com a F. Brs IV (1996).

Tabela 2: Resultados dos testes de perda por dessecao e ponto de fuso da NFD de acordo com a F. Brs IV (1996). Testes Realizados Perda por Dessecao Ponto de Fuso Resultados 0,67 x 10 -3 % 171,3 171,9 C Especificao mximo 0,5% Entre 171 175 C

Os resultados encontrados esto de acordo com a especificao. Na Tabela 3 encontram-se os resultados da anlise quantitativa (doseamento) da matria prima por espectrofotometria de absoro de acordo com a F. Brs IV (1996).

Tabela 3: Anlise quantitativa (doseamento) da matria prima por espectrofotometria de absoro de acordo com a F. Brs IV (1996).
Dia 1 n=5 % 101,03 101,46 100,37 101,56 101,39 98,58 98,95 97,85 99,14 99,10 Mdia dp DPR %

101,16 0,486

0,48

2 n=5

98,72 0,537

0,54

Geral n = 10

99,94 1,373

1,37

101

A matria-prima foi aprovada pelos testes aos quais foi submetida. A Figura 19 mostra o espectro de absorbncia obtido durante o doseamento da NFD pelo mtodo de espectrofotometria de absoro ultravioleta (UV).

Abs

Comprimento de onda (nm)

Figura 19: Espectro de absorbncia obtido durante o doseamento da NFD pelo mtodo de espectrofotometria de absoro ultravioleta (UV).

A Figura 20 mostra a resoluo do cromatograma da matria prima NFD em anlise, nas condies definidas pela USP 30 (2007): fase mvel H2O:AcN:MeOH (50:25:25), fluxo 1 mL/min, coluna C18 (15 cm) e concentrao da amostra 100 g/mL

Figura 20: Resoluo do cromatograma da matria prima NFD empregando as seguintes condies : fase mvel H2O:AcN:MeOH (50:25:25), fluxo 1 mL/min, coluna C18 (15 cm) e concentrao da amostra 100 g/mL.

102

A Figura 21 mostra o espectro de absoro no UV Visvel (UV-Vis) realizado em cromatgrafo provido de detector com arranjo de foto diodos (UV-PDA), a fim de selecionar o comprimento de onda de 230 nm, e verificar a pureza do sinal, sem a existncia de interferentes, modificando de intensidade nos tempos entre 3,20 e 3,70 minutos.

Figura 21: Anlise do cromatograma da NFD por arranjo de foto diodos, mostrando a pureza do sinal, modificando de intensidade nos tempos entre 3,20 e 3,70 minutos.

Tendo em vista os resultados satisfatrios na anlise da matria prima de NFD, esta foi aplicada como padro de trabalho neste estudo, com pureza determinada de 99,94%.

5.2 Caracterizao das Formulaes

5.2.1 Validao do Mtodo para a Anlise Quantitativa da NFD nas Formulaes por Espectrofotometria de Absoro no UV-Vis Reao Colorimtrica

103

5.2.1.1 Especificidade

A Figura 22 mostra os espectros obtidos com o solvente (a), com os exicientes das formulaes (b), com a NFD padro de trabalho em solvente (c), e com as formulaes contendo NFD (d).

Figura 22 - Espectros de varredura no UV-vis de 200 a 1000 nm das amostras: Branco (solvente), Padro (NFD+solvente), Placebo (excipintes) e Amostra (formulao contendo NFD)

Pela anlise dos espectros foi possvel observar que no existe absoro de interferentes em 830 nm na mesma intensidade da absoro da NFD, por este motivo o mtodo foi considerado especfico.

104

5.2.1.2 Linearidade

A Tabela 4 apresenta os valores obtidos para as cinco concentraes de NFD, preparadas em duplicata em cada dia de anlise, com seus desvios-padro (DP) e desvios-padro relativos (DPR). Esto contidos na tabela os resultados da anlise da regresso linear e os parmetros da curva analtica: intercepto, inclinao, coeficiente de determinao e coeficiente de correlao.

Tabela

4:

Anlise estatstica espectrofotometria

da

regresso

linear

das

curvas

padro

obtida

por

Concentrao (mg/mL) 0,005 0,015 0,025 0,035 0,045 Intercepto Inclinao valor P - intercepto Coef de determinao (r2) Coef de correlao (r) a n=6

Dia 1 0,110 0,112 0,320 0,319 0,502 0,498 0,732 0,716 0,913 0,892 24,42 0,0574 0,2010 0,9994 0,9995

Dia 2 0,113 0,110 0,336 0,321 0,319 0,501 0,720 0,693 0,904 0,871 25,10 0,0339 0,1422 0,9996 0,9994

Dia 3 0,109 0,112 0,321 0,321 0,318 0,502 0,694 0,714 0,906 0,918 20,33 0,0213 0,0500 0,9994 0,9995

Mdiaa 0,111 0,32 0,470 0,71 0,91

DPa 0,002 0,001 0,008 0,013 0,017

DPR%a 1,4 0,38 1,67 1,81 1,89

A Figura 23 mostra as solues obtidas para a curva analtica realizada pelo mtodo de UV-vis para o doseamento da NFD

105

Figura 23: Solues obtidas para a curva analtica realizada pelo mtodo de UV-vis para o doseamento da NFD.

De acordo com a RE 899/2003 (ANVISA, 2003) a linearidade definida como a capacidade de uma metodologia analtica de demonstrar que os resultados obtidos so diretamente proporcionais concentrao do analito em estudo na amostra estudada, dentro de um intervalo especificado. A norma recomenda que a linearidade seja determinada pele anlise de cinco concentraes diferentes, e que o critrio mnimo aceitvel para o coeficiente de correlao (r) deve ser igual a 0,99. Como apresentado na Tabela 4, observa-se adequao dos coeficientes de correlao, o que demonstra boa linearidade para o mtodo para a faixa de concentrao entre 0,005 e 0,045 mg/mL de NFD. Pela anlise da regresso linear foi possvel observar que o intercepto mostrouse estatisticamente no diferente de zero, para os trs ensaios, com significncia de 5% (valor de P do intercepto maior do que 0,05). A linearidade foi comprovada pelo valor no significativo da anlise estatstica do intercepto e o coeficiente de correlao superior a 0,999 mostrou baixa disperso dos dados.

106

4.2.1.3 Preciso

A preciso de um mtodo definida como a avaliao da proximidade dos resultados obtidos em uma srie de medidas e pode ser expressa como o desvio padro ou como o desvio padro relativo, de acordo com a RE 899/2003 (ANVISA, 2003). Foi possvel observar, atravs da avaliao dos 5 nveis da curva analtica, que os valores de DPR obtidos foram satisfatrios (< 5%), demonstrando que o mtodo preciso. O limite de deteco (LD), definido como a menor quantidade do analito presente na amostra capaz de ser detectado, mas no necessariamente quantificado e o limite de quantificao (LQ), definido como a menor quantidade do analito que pode der determinada com preciso e exatido (ANVISA, 2003), foram calculados como descrito no item 4.2.3.6.5. O valor obtido para LD foi igual a 0,0018 mg/mL e para LQ o valor obtido foi igual a 0,0049 mg/mL.

5.2.1.4 Exatido

A determinao da exatido foi realizada como descrito em 4.2.3.6.3, pelo mtodo de adio padro. As Tabela 5, 6 e 7 apresentam os valores obtidos para os ensaios.

107

Tabela 5: Resultados do teste de exatido para PLO base+ TC

PLO base+TC Quantidade recuperada de NFD Recuperao Recuperao % % 98,33 98,51 99,23 97,97 99,24 98,96 98,96 98,67 99,74 99,09 99,38 98,18

Quantidade adicionada de NFD (mg) 0,020

0,025

0,03
a

Massa (mg) 0,01967 0,01985 0,01959 0,02481 0,02474 0,02467 0,02992 0,02981 0,02945

DPR %a 0,66

0,29

0,82

n=6

Tabela 6: Resultados do teste de exatido para PLO base

PLO base Quantidade recuperada de NFD Recuperao Recuperao % % 98,15 89,37 99,23 97,79 99,10 98,76 98,81 98,38 99,74 99,00 99,26 98,06

Quantidade adicionada de NFD (mg) 0,020

0,025

0,03
a

Massa (mg) 0,01963 0,01985 0,01956 0,02478 0,02470 0,02460 0,02992 0,02978 0,02942

DPR %a 0,76

0,36

0,87

n=6

Tabela 7: Resultados do teste de exatido para EMUL base

EMUL base Quantidade recuperada de NFD Recuperao Recuperao % % 98,51 98,68 99,41 98,15 99,39 99,10 99,10 98,81 99,86 99,21 99,50 98,30

Quantidade adicionada de NFD (mg) 0,020

0,025

0,03
a

Massa (mg) 0,01970 0,01988 0,01963 0,02485 0,02478 0,02470 0,02996 0,02985 0,02949

DPR %a 0,65

0,29

0,81

n=6

108

A exatido definida como a proximidade dos resultados obtidos pelo mtodo em estudo em relao ao valor verdadeiro pela RE 899/2003 (ANVISA, 2003). De acordo com os resultados observados nas tabela 5, 6 e 7, a metodologia apresentou exatido para todas as formulaes, uma vez que em todos os casos a recuperao encontra-se dentro da faixa preconizada de 98% a 102% (BRITO et.al.2003)

4.2.1.5 Determinao do Teor de NFD nas Formulaes

A Tabela 8 mostra os resultados das analises de teor de NFD nas trs formulaes em estudo, armazenadas temperatura ambiente e ao abrigo da luz por at 9 meses.

Tabela 8: Resultados das analises de teor de NFD nas trs formulaes em estudo, armazenadas temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Tempo (meses) Formulaes Teor mdio %a DPR %a PLO+NFD PLO+NFD+ TC EMUL 0 99,81 0,72 100,18 0,49 99,63 0,58 9 98,72 ,67 98,59 0,83 98,41 ,92 Valor P 0,0036 0,0051 0,0039 IC 92,20 a 106,31 89,28 a 109,49 91,27 a 106,77 a n=3 IC = Intervalo de confiana de 95%

A anlise dos resultados apresentados na Tabela 8 permite observar que houve decrscimo significativo do teor de NFD nas trs formulaes ao longo dos 9 meses transcorridos, entretanto em todos os casos o decrscimo representa menos de 2% em relao ao teor inicial.

109

5.2.2 Determinao do pH

A Tabela 9 apresenta os valores de pH para as formulaes em estudo.

Tabela 9: Valores de pH apresentados pelas formulaes em estudo

Formulao PLO base PLO+NFD PLO+NFD+ TC EMUL base EMUL

pH 5,0 5,5 5,5 4,0 4,5

Observou-se que as formulaes em presena de NFD apresentaram um valor de pH discretamente menos cido do que as bases na ausncia do frmaco, isto provavelmente se deve s caractersticas da NFD.

5.2.3 Determinao da Reologia

Embora a forma de representao da viscosidade mais apropriada de um material pseudoplstico seja o grfico completo da curva de consistncia, possvel se calcular a viscosidade aparente a partir da inclinao da tangente curva, em um ponto especfico (SINKO,2008). A tabela 10 mostra os valores da viscosidade aparente, a uma taxa de cisalhamento de 500 (s-1):
Tabela 10 - Valores da viscosidade aparente a uma taxa de cisalhamento de 500 (s-1), para as formulaes em estudo:

Formulao PLO base PLO+NFD PLO+NFD+ TC EMUL

Viscosidade aparente (Pas) 500 (s-1) 0,068 0,090 0,038 0,280 110

Apenas nas formulaes contendo PLO existe a presena do polmero de polaxamer, o que pode explicar a menor viscosidade aparente dessas formulaes a uma taxa de cisalhamento de 500 (s-1), em comparao com a formulao EMUL. Para os sistemas que contm polmeros com molculas longas e lineares observa-se um alinhamento dessas molculas no sentido longitudinal na direo do fluxo, com o aumento da tenso de cisalhamento. Essa orientao reduz a resistncia interna no material, permitindo uma maior velocidade de cisalhamento para cada tenso de cisalhamento sucessiva. Adicionalmente, pode haver a liberao de parte do solvente associado s molculas de polmero, o que contribui para um abaixamento efetivo da concentrao e do tamanho das molculas dispersas, o que, igualmente conduzir a um abaixamento da viscosidade aparente (SINKO,2008). As viscosidades das amostras PLObase, PLO+NFD e EMUL no apresentaram diferenas estatisticamente representativas entre si, com P>0,05 (para =5%), enquanto que PLO+NFD+ TC apresentou um valor de viscosidade estatisticamente diferente de PLObase e EMUL, com P<0,005 (para =5%). Em relao PLO+NFD, PLO+NFD+ TC apresentou viscosidade sensivelmente diferente (menor), com P<0,001, (para =5%). De acordo com Brthlemy e cols.(1995) o TC apresenta miscibilidade com solventes polares e apolares, e um potente agente solubilizador para vrios frmacos. Mura e cols. (2000) observaram que o TC aumentou a solubilidade do clonazepan em uma matriz de gel de carbopol em cerca de 100 vezes. Os resultados encontrados sugerem que a presena do TC alterou a viscosidade do PLO na presena de NFD, provavelmente, por ter promovido a solubilidade do frmaco na matriz do PLO. 111

A figura 24 mostra os grficos da recuperao isotrmica da consistncia aps a determinao da viscosidade para as amostras em estudo:
PLO base Viscosidade (Pa.s)
Viscosidade (Pa.s)

PLO+NFD 100 1 0,01 0,1 0,01 Taxa (s-1) PLO+NFD PLO+NFD 1 10 100 1000

10000 100 1 0,01 0,01 1 100 Taxa (s-1) PLO base PLO base 10000

a
PLO+NF+Trc
Viscosidade (Pa.s)

b
EMUL

Viscosidade (Pa.s)

10000 100 1 0,01 0,1 0,01 1 10 Taxa (s-1) PLO+NFD+Trc 100 1000

10000 100 1 0,01 0,1 0,01

Taxa (s-1)

10

100

1000

PLO+NFD+Trc

EMUL

EMUL replica

Figura 24 - Grficos da recuperao isotrmica da consistncia aps a determinao da curva de consistncia para as amostras em estudo (com rplicas dos ensaios): (a) PLO base, (b) PLO+NFD, (c) PLO+NFD+ TC e (d) EMUL.

A anlise estatstica dos dados mostra que existe diferena estatisticamente representativa da tixotropia apenas entre o comportamento das formulaes PLO+NFD e PLO+NFD+ TC, com P<0,001 (para =5%). Os grficos apresentados na Figura 24 permitem verificar que, quanto ao fluxo, todas as amostras apresentam um comportamento pseudoplstico, caracterstico de sistemas contendo polmeros em disperso e sistemas emulsionados semi-slidos (BENTEY et.al., 1999; SINKO,2008), uma vez que a viscosidade diminui com o aumento da taxa de cisalhamento, em todas as amostras. 112

A recuperao isotrmica e relativamente lenta da consistncia perdida pelo cisalhamento em um material deixado em repouso conhecida como Tixotropia (SINKO,2008). Os grficos apresentados na figura 24 mostram que as curvas ascendentes da viscosidade esto deslocadas abaixo das curvas descendentes, indicando que o material possui uma consistncia menor para qualquer taxa de cisalhamento sobre a curva ascendente, em relao curva descendente. Isso denota uma quebra da estrutura que no se restaura de imediato aps a remoo ou diminuio da tenso de cisalhamento. Os sistemas que apresentam tixotropia, geralmente contm partculas

assimtricas que originam retculos tridimensionais frouxos que permeiam a amostra, devido presena de numerosos pontos de contato. Essa estrutura confere um certo grau de rigidez ao sistema, quando este est em repouso, o que o torna parecido com um gel. Ao se aplicar um cisalhamento e iniciando-se o fluxo, a estrutura se desintegra medida que os pontos de contato so desfeitos e as partculas se alinham, umas em relao s outras. Isto faz com que o sistema sofra uma mudana de gel para sol. A estrutura inicia sua reestruturao ao cessar a tenso de cisalhamento, entretanto, este um processo progressivo de restaurao da consistncia, medida que as partculas assimtricas entram em contato, umas com as outras, por efeito do movimento browniano aleatrio (SINKO,2008). O comportamento da amostra PLO+NFD pode ser classificado como pouco tixotrpico. Isto talvez possa ser explicado pela presena de muitos cristais slidos de NFD suspensos na matriz semi-slida, oferecendo resistncia ao fluxo, uma vez que no temos a presena do promotor de solubilidade (Transcutol) nesta formulao. Esta 113

hiptese est em consonncia com o dado de viscosidade aparente desta formulao a um cisalhamento de 500 (S-1), que maior em relao s outras formulaes que envolvem o PLO. Observa-se que a presena do Transcutol na formulao restabeleceu a tixotropia. As formulaes semi-slidas apresentam-se como no newtonianas quanto ao fluxo e apresentam, simultaneamente, as propriedades de viscosidade de um lquido e da elasticidade de um slido. A esta caracterstica denomina-se viscoelasticidade. A anlise de materiais viscoelsticos desenhada para preservar a estrutura, a fim de que as medies possam proporcionar informaes sobre as foras intermoleculares e intraparticulares existentes no material (SINKO,2008). A fase interna das formulaes de PLO (gel de polaxamer) apresenta-se como um gel muito viscoso temperatura ambiente, mas torna-se lquida temperatura de refrigerador (5 C), apresentando gelificao termorreversvel e pode ser aquecido e resfriado muitas vezes sem alterar suas propriedades (SCHMOLKA, 1972). As formulaes a base PLO envolvidas neste estudo contm um gel de polaxamer 407 constituindo a fase interna da microemulso. Os gis de polaxamer 407 so materiais viscoelsticos, que apresentam um mdulo elstico (G`) caracterstico de um slido, e um mdulo viscoso (G``) caracterstico de um lquido. Alm de viscoelsticos, os gis de polaxamer 407 so pseudoplsticos, o que significa que sofrem deformao com o cisalhamento e a sua viscosidade diminui (FREITAS, 2006). Os experimentos realizados neste estudo envolveram o comportamento do mdulo elstico (G`) e do mdulo viscoso (G``) das formulaes em funo da temperatura, a uma taxa de cisalhamento constante, para a determinao da temperatura de transio sol-gel (EDSMAN et. al., 1998, RICCI et.al., 2002). 114

A figura 25 mostra os grficos obtidos no estudo da temperatura de transio solgel das amostras de PLO base (a), PLO+NFD (b) e PLO+NFD+ TC (c):
PLO base

100000 (Pa) 10000 1000 100 -20 0 20 40 60

Tem peratura (C) G` G``

a
PLO+NFD 10000 (Pa)

1000

100 -20 0 20 Temperatura (C) G` G`` Repl. G` Repl. G`` 40 60

b
PLO+NFD+Trc 100000 (Pa) 10000 1000 100 -20 0 20 Tem peratuta (C) G` G`` 40 60

c Figura 25 - Grficos obtidos no estudo da temperatura de transio sol-gel das amostras (com rplicas dos ensaios) de PLO base (a), PLO+NFD (b) e PLO+NFD+ TC (c), medindo-se a viscosidade em funo da temperatura a uma taxa de cisalhamento constante.

115

Observa-se que as trs formulaes apresentam comportamento viscoelstico, pois apresentam componentes elsticos (G`) e componentes viscosos (G``) diferentes entre si, e diferentes de zero. Os grficos na figura 25 mostram como as caractersticas reolgicas das formulaes mudam com o aumento da temperatura. Pode-se notar que em todas as formulaes testadas neste ensaio existe o fenmeno de transformao sol-gel, pelas variaes sofridas por G` e G``. Isso mostra que houve alterao da estrutura nas formulaes pela presena da NFD e tambm pela adio do transcutol. Com o aumento da temperatura possvel observar, a certo ponto, uma diminuio considervel de G` e G``, provavelmente devido fase interna das formulaes apresentarem-se no estado de liquido viscoso. Em seguida possvel observar um ponto a partir do qual G` e G`` aumentam. Este ponto deve ser considerado como o ponto de gelificao da fase interna da formulao. Os valores crescentes de G`e G`` a partir da podem representar a estabilizao do mdulo eslstico e do mdulo viscoso acima da temperatura de transio sol-gel, respectivamente. Na Tabela 11 encontram-se os valores de G`e G`` comparados entre as formulaes PLO base (sem frmaco e sem transcutol) e PLO+NDF+Trc.

Tabela 11 - Valores de G`e G`` comparados entre as formulaes PLO base (sem frmaco e sem transcutol) e PLO+NDF+Trc. Temp Trans (T C) G` G`` PLO base 10,05 11,05 PLO+NFD+Trc 9,72 12,72

116

Os dados apresentados na tabela 11 permitem observar que houve alterao da temperatura de transio sol-gel entre as formulaes PLObase e PLO+NFD+Trc. Isto significa que a presena da NFD e do Transcutol resultou em alterao das caractersticas reolgicas e da estrutura das formulaes de PLO, provavelmente por alterar as propriedades da fase interna (gel de polaxamer), corroborando os resultados dos estudos realizados por Veyries cols. (1999) e Bentley e cols. (1999). A Tabela 12 mostra a faixa de temperatura que compreende a transformao solgel, bem como o valor mdio, na formulao PLO+NFD:

Tabela 12 - Faixa de temperatura que compreende a transformao sol-gel, bem como o valor mdio, na formulao PLO+NFD Intervalo Temp Transio (T C) G` G`` 4,055 3,70 PLO+NFD 9,38 15,38 T C Trans Mdia 6,72 9,54

Observou-se que a presena da NFD na ausncia do transcutol resultou em alterao da estrutura das formulaes de PLO de maneira ainda mais acentuada, provavelmente por alterar as propriedades da fase interna (gel de polaxamer), novamente em consonncia com os resultados dos estudos realizados por Veyries cols. (1999) e Bentley e cols. (1999). De acordo com Fong-Spaven e Hollenbeck (1986), as descontinuidades observadas na faixa de temperatura de transio apresentadas pela formulao PLO+NFD podem ser atribudas a possveis deslocamentos dentro das estruturas de cristal lquido. O comportamento diferenciado desta formulao em relao s outras pode ser devido presena de numerosos cristais de NFD suspensos na formulao,

117

provocando resistncia ao fluxo e acentuando os deslocamentos na estrutura de cristal lquido. No PLO base a NFD est ausente e no PLO+NFD+Trc temos um promotor de solubilidade da NFD, o que provavelmente reduziu a resistncia e a interferncia dos cristais do frmaco. A presena da NDF em ausncia de transcutol provocou alterao significativa no mdulo elstico G` (caracterstico de slidos), que apresentou valores baixos a baixas temperaturas, mas aumentou drasticamente com o aumento da temperatura, como resultado do processo de formao do gel. Ao final da transio sol-gel, G` tornou-se independente da temperatura. A propriedade de viscoelasticidade tambm foi preservada. Uma explicao para este comportamento pode estar no fato de que alguns polaxmeros apresentam uma transio sol-gel medida que a temperatura se eleva, tornando-se no newtonianos no seu carter reolgico (SINKO,2008). Isso ocorre porque a solubilidade dos polaxameros em gua diminui com o aumento da temperatura, e a hidratao do polmero reduzida pela quebra das ligaes de hidrognio a temperaturas elevadas. A dessolvatao resultante, somada ao entrelaado das cadeias polimricas, provavelmente o responsvel pela gelificao dos polaxameros (CABANA et.al.,1997; MOORE et.al. 2000; FREITAS et.al.,2006). O gel de polalxamer que constitui a fase interna das formulaes de PLO apresenta caractersticas reolgicas incomuns como a gelificao termorreversvel, e temperatura de transio sol-gel (FREITAS, 2006), que influenciam nas caractersticas finais das formulaes de PLO. A presena de aditivos como frmacos (VEYRIES et. al.,1999) e promotores qumicos da penetrao cutnea (BENTLEY et. al., 1999), como o transcutol 118

(empregado neste estudo como co-solvente para a NFD no PLO) podem mudar algumas caractersticas reolgicas dos gis de polaxamer e, por conseguinte, das formulaes de PLO. A anlise estatstica dos dados mostra que as trs formulaes apresentam comportamentos de transio sol-gel em funo da temperatura distintos entre si, com p<0,001 (para =5%).

5.2.4 Estudo do Aspecto Morfolgico por Microscopia ptica (MO)

A microscopia ptica (MO) tem sido utilizada como mtodo preliminar de observao da microestrutura (MAITI, 2003, KOO, KIM, CHUNG, 2003, CARASTRAN, 2007). Embora a resoluo do equipamento seja em torno de 1 m, este mtodo til pra se observar a existncia de partculas grandes de cristais, bem como a disperso das partculas. Uma anlise visual das microestruturas das amostras pde ser feita atravs de microscopia ptica. A figura 26 mostra as microestruturas observadas por MO de imerso simples e a figura 27 mostra as microestruturas observadas por MO de imerso com luz polarizada:

119

a) PLO base MO simples aumento de 100X

b) PLO+NFD MO simples aumento de 100X

c) PLO+NFD+ TC MO simples aumento de d) EMUL MO simples aumento de 100X 100X Figura 26 - Mostra as microestruturas das formulaes observadas por MO simples no aumento de 100X. PLO base (a), PLO+NFD (b), PLO+NFD+ TC (c) e EMUL (d).

possvel observar que existe uma similaridade na morfologia entre as formulaes base de PLO (uma base microemulsionada), diferindo sensivelmente da formulao EMUL (no microemulsionada). possvel, ainda, evidenciar a presena de cristais de NFD nas formulaes PLO+NFD e PLO+NFD+ TC, mostrando que em ambos os casos existem cristais do frmaco suspensos na formulao. Embora o transcutol tenha sido aplicado com a funo de melhorar a solubilidade da NFD na formulao, isto no aconteceu 120

completamente, pois ainda permaneceram cristais do frmaco suspensos na base galnica. Uma possvel evidncia de que o transcutol tenha aumentado a solubilidade da NFD at certo ponto, observada pela menor viscosidade aparente a 500 (s^-1) da formulao PLO+NFD+ TC (0,038 Pa.s.) em relao da formulao PLO+NFD (0,090 Pa.s). Isto pode estar relacionado a uma maior resistncia ao cisalhamento na formulao PLO+NFD pela presena de maior nmero de cristais do frmaco em suspenso. De acordo com Sinko (2008) possvel utilizar um microscpio convencional para medir o tamanho de partcula na faixa de 0,2 at 100 m, aproximadamente. Com o auxlio de um programa gerenciador de imagens acoplado ao microscpio ptico de luz polarizada, foi possvel realizar medidas aleatrias dos tamanhos das micelas nas formulaes. A figura 27 mostra as fotomicrografias das formulaes contendo as medidas aleatrias.

121

a) PLO base

b) PLO+NFD

d) EMUL d) PLO+NFD+ TC Figura 27 - Fotomicrografias das formulaes observadas por MO de imerso com luz polarizada no aumento de 100X. PLO base (a), PLO+NFD (b), PLO+NFD+ TC (c) e EMUL (d).contendo as medidas aleatrias: relativa homogeneidade no tamanho das micelas nas formules contendo PLO, na ordem de 0,8 m. Na formulao EMUL foi possvel observar uma maior heterogeneidade e um tamanho mdio maior das micelas, na ordem de 2,4 m, onde as maiores chegaram a 10,4 m, neste campo de observao.

Embora as medidas tenham sido realizadas aleatoriamente, foi possvel observar nas formulaes envolvendo PLO, uma relativa homogeneidade no tamanho das micelas na ordem de 0,8 m. Na formulao EMUL foi possvel observar uma maior heterogeneidade e um tamanho mdio maior das micelas, na ordem de 2,4 m, onde as maiores chegaram a 10,4 m, neste campo de observao. Estes dados permitem

122

verificar

que

metodologia

de

extruso

utilizando

seringas

possibilitou

microemulsionamento uniforme das formulaes de PLO. Estes resultados so compatveis com os de Bentley e cols. (1999), que aplicaram a microscopia ptica para evidenciar a formao de estruturas micelares no gel de polaxamer pela adio de lecitina. Os autores observaram que a adio de lecitina ao sistema permitiu a formao de micelas menores e mais uniformes.

5.2.5 Liberao in vitro Atravs de Membrana Sinttica

As formulaes de uso tpico consistem em sistemas complexos, de modo que a liberao do frmaco a partir de um veculo tem sido bastante investigado. (FREITAS, 2005) A liberao in vitro de frmacos presentes em formulaes de uso tpico pode ser determinada aplicando-se uma metodologia que preconiza um modelo

bicompartimental, conhecido como clula de difuso vertical, e membrana sinttica (HAIGH; SMITH, 1994), por no oferecerem resistncia passagem do frmaco do compartimento doador para o compartimento recepto. Assim, permite a quantificao do frmaco em funo da partio entre veculo e a soluo receptora. Neste trabalho optou-se por uma membrana de acetato de celulose.

123

5.2.5.1 Estudo da Solubilidade da NFD para a Escolha da Soluo Receptora para os Ensaios de Liberao e Permeao / Penetrao Cutnea

Quando frmacos com baixa solubilidade em gua so aplicados na produo de medicamentos de uso tpico pode ser necessria a aplicao de solues receptoras contendo surfactantes ou solventes orgnicos para garantir a solubilidade adequada do frmaco, a fim de manter a condio sink nos estudos da avaliao da liberao in vitro (BEMVINDO, 2006). Segundo o CDER / U.S. FDA (GUIDANCE FOR INDUSTRY, 1997) o meio receptor pode consistir de tampo aquoso, meio hidroalcolico ou qualquer outro tipo, com a justificativa apropriada. De acordo com FIP / AAPS (SIEWERT et.al. 2003), dependendo da solubilidade do frmaco, o meio receptor pode necessitar conter surfactantes. A Tabela 13 mostra os valores obtidos para a solubilidade da NFD nas solues testadas:

Tabela 13: Valores obtidos para a solubilidade da NFD nas solues testadas: Soluo (a) soluo de gua e etanol (1:1) (b) soluo de gua e etanol (1:1) adicionada de 0,5% lauril sulfato de sdio (c) gua adicionada de 0,5% lauril sulfato de sdio (d) tampo fosfato pH 7,4 adicionado de 0,5% lauril sulfato de sdio 33,04 36,30 Solubilidade determinada (g/mL) 181,62 174,45

124

Embora a NFD tenha apresentado valores de solubilidade muito bons nas solues hidroalcolicas, optou-se pela soluo contendo tampo pH 7,4 com lauril sulfato de sdio por ser mais apropriada para os testes de permeao / penetrao empregando membrana natural de pele suna. Ali e cols (1989) verificaram uma solubilidade de 5,6 g/mL para a NFD em soluo tampo aquosa de pH = 7,4. A solubilidade de 36,3 g/mL, apresentada pela soluo selecionada, representa um valor mais de 6 vezes maior, provavelmente pela adio do surfactante. Para a manuteno da condio sink, a concentrao no meio receptor no deve exceder 12,1 g/mL (o que representa 1/3 de 36,3 g/mL). Considerando-se que a maior quantidade encontrada na soluo receptora foi da ordem de 0,733 g/mL, admite-se que a condio sink foi obedecida, no ocasionando aumento aprecivel da concentrao de modo a ocasionar reduo do fluxo de difuso da NFD do compartimento doador ao receptor.

5.2.5.2 Condies Analticas para a Anlise da NFD nas Amostras por CLAE

A definio das condies analticas teve por objetivo adotar o mtodo adequado s propostas do presente trabalho, para a quantificao da NFD nas matrizes de trabalho. O processo de validao no foi exaustivo, por no estar contemplado como objeto do projeto.

125

As condies analticas aplicadas seguiram condies definidas pela USP 30 (2007): fase mvel H2O:AcN:MeOH (50:25:25), fluxo 1 mL/min, volume de injeo de 25 L, detector de UV em 235 nm. Utilizou-se coluna C18 (25 cm). A Figura 28 apresenta a eluio de solues padro de NFD em trs concentraes diferentes, preparadas como descrito em 4.2.5.2.3, onde se pode observar uma boa simetria dos sinais de NFD.

a)

b)

c)

Figura 28: Eluio de solues padro de NFD em trs concentraes: a) 0,063 g/mL, b) 0,15 g/mL, c) 0,5 g/mL. O tempo de reteno foi de 9,6 minutos.

5.2.5.2.1 Curva Analtica

A Tabela 14 apresenta os resultados das respostas obtidas para as cinco concentraes de NFD, preparadas em triplicata, em cada dia de anlise e seus desvios padro (DP) e desvios padro relativos (DPR). Realizou-se anlise de regresso linear dos parmetros da curva padro: intercepto, inclinao, coeficiente de determinao e correlao, tambm apresentados na tabela.

126

Tabela 14 - Apresenta os resultados das respostas obtidas para as cinco concentraes de NFD, preparadas em triplicata, em cada dia de anlise, seus desvios padro (DP), desvios padro relativos (DPR)e parmetros da curva. rea Ensaio 2 6603 6549 6793 18694 19021 18475 34103 33996 33897 47601 48024 47902 67804 67767 68075 140718 1918,2 0,0026 0,9994 0,9997

Conc(g/mL)

0,063

0,150 0,250 0,350 0,500 Intercepto Inclinao Valor P - intercepto Coef. Determinap(r2) Coef. Correlao(r) a n= 9

Ensaio 1 6485 6676 6501 18796 18683 18549 33789 34790 33587 47305 48487 46978 67579 68024 67793 140567 1964 0,0003 0,9994 0,9998

Ensaio 3 6498 6702 6601 18504 18659 17985 33798 34076 33958 46969 47396 46923 66987 67209 67932 139553 1952,9 0,0023 0,9993 0,9996

Mdiaa

DPa

DPR %
a

6601

106

1,6

18596 33999 47509 67686

283 337 543 368

1,5 1,0 1,1 0,5

De acordo com a ANVISA (2003), a linearidade dita como a capacidade de uma metodologia analtica em demonstrar que os resultados obtidos em um ensaio so diretamente proporcionais concentrao do analito na amostra. A legislao em vigor recomenda a determinao da linearidade pela anlise de cinco concentraes diferentes, no mnimo, e que o coeficiente de correlao (r) mnimo aceitvel deve ser de 0,99. Os coeficientes de correlao apresentados na tabela 12 mostraram-se adequados, demonstrando que o mtodo apresenta linearidade para faixa de concentrao de trabalho. Foi possvel comprovar a linearidade, apesar da anlise 127

estatstica do intercepto ter resultado em valor significativo, uma vez que este representa menos de 0,7% da concentrao de trabalho.

Seqncia1

80000 70000 60000 rea 50000 40000 30000 20000 10000 0 0,000 0,100
Seqncia2 Seqncia3

y = 140567x - 1964 r = 0,99978 y = 140718x - 1918,2 r = 0,99967 y = 139553x - 1952,9 r = 0,9993

0,200

0,300

0,400

0,500

Concentrao (g/mL)

Figura 29: Representao grfica das curvas padro, obtidas por CLAE, em trs experimentos diferentes.

A preciso foi avaliada pela proximidade dos resultados obtidos nos experimentos repetidos, expressa pelos desvios padro e desvios padro relativos (ANVISA, 2003). Observou-se que todos os valores de DPR obtidos foram satisfatrios (< 5%) para os cinco nveis de concentrao da curva padro (Figura 29).

5.2.5.3 Resultados dos Ensaios de Liberao in vitro Atravs de Membrana Sinttica de Acetato de Celulose

Na

determinao

da

liberao

in

vitro

da

NFD,

uma

amostra

de

aproximadamente 0,5 g de cada formulao (PLO+NFD, PLO+NFD+ TC e EMUL) foi 128

aplicada no compartimento doador e por conseguinte, a difuso ocorreu sob condio de quantidade infinita de frmaco. Aps um pequeno lag time inicial, observou-se um perfil sempre linear com tempo, permitindo o clculo do fluxo no estado estacionrio (Jss) (Tabela 15). Os fluxos foram calculados para cada clula, por regresso linear, a partir do tempo 60 minutos, considerando-se que a partir deste ponto o equilbrio j estaria alcanado.

Tabela 15: Fluxo no estado estacionrio (Jss) para cada uma das formulaes estudadas Formulao Fluxo (Jss) durante 3 h (g/cm2/h)* PLO+NDF PLO+NFD+ TC EMUL * Corresponde a mdia E.P.M. de seis unidades de ensaio. 6,26 0,288 4,03 0,081 6,39 0,254

Os resultados plotados na figura 30 representam a mdia e.p.m de seis unidades de ensaio. Os dados mostram que PLO+NFD+ TC apresentou fluxo menor em relao s outras duas formulaes, embora a diferena entre o fluxo das trs formulaes no tenha mostrado diferena estatisticamente significativa (P = 0,0683 para = 5%). A presena do transcutol alterou discretamente a atividade termodinmica da NFD na base PLO. O transcutol apresenta miscibilidade com solventes polares e apolares e timas propriedades como solubilizante para um grande nmero de frmacos (BARTHLMY et.al.1995; MURA et.al.2000). Entretanto, por ser um lquido higroscpico (RISCHEL et.al.,1991), pode provocar mudanas na composio do compartimento doador e

129

assim influenciar a solubilidade e a atividade termodinmica do frmaco (DE CARVALHO, 1995).

35 30 Nifedipina liberada ( g/mc 2) 25 20 15 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Tem po (m inutos) EMUL PLO+NFD PLO+NFD+TC

Figura 30 - Quantidade de NFD liberada por rea. Erro de barras indica erro padro da mdia (E.P.M.).

De acordo com Davis e Khanderia (1972), a atividade termodinmica e a viscosidade tm um efeito dominante sobre a liberao da substncia ativa do veculo. O transporte de massa de um frmaco atravs da membrana diretamente dependente da atividade termodinmica do permeante no veculo. Para composies de veculo onde o frmaco est completamente solubilizado e bem abaixo da saturao, o permeante tende a ter alta afinidade pelo veculo e no particiona em direo membrana. Entretanto, se a composio do veculo alterada para aumentar a solubilidade do permeante, o fluxo diminui linearmente (FLYNN e SMITH, 1972 apud LALOR et. al. 1994). Aumentando-se a solubilidade da NFD na base PLO pela adio do transcutol, reduz-se seu coeficiente de partio, Kp, em relao ao compartimento 130

receptor. (FLORENCE e ATTWOOD, 2003). Isto pode explicar o comportamento da formulao PLO+NFD+ TC sobre a liberao da NFD. Este comportamento compatvel com estudos realizados por outros autores. Um estudo realizado por Turakka e Ala-Fossi (1987) mostrou que a velocidade de liberao de hidrocortizona e acetato de hidrocortizona diminuiu a medida em que houve um aumento da solubilidade dos frmacos na matriz da formulao. Freitas (2006) observou que a adio de propilenoglicol s formulaes estudadas alterou a atividade termodinmica do CTZ provocando uma menor liberao do frmaco. Observou-se que PLO+NFD+ TC apresentou a menor viscosidade relativa a um cisalhamento de 500
s-1

. A adio de TC restabeleceu a tixotropia, muito diminuda pela

adio da NFD ao PLO. Este fatos, provavelmente, esto relacionados alterao da solubilidade da NFD na base PLO. Para as formulaes de uso tpico desejvel que a viscosidade diminua com o cisalhamento a fim de facilitar a espalhabilidade sobre a pele. Por outro lado, a tixotropia tambm desejvel para que a formulao no escorra da pele.

5.2.6 Permeao / Penetrao Atravs de Membrana Natural de Pele Suna

O uso da pele de orelha suna em pesquisas de produtos dermatolgicos para uso humano extensivamente discutida para testes com sistemas transdrmicos, ou de permeabilidade cutnea. Neste contexto as camadas da pele de maior importncia so a epiderme e a derme (BHATTI, SCOTT, DYER,.1989, MEYER , ZSCHEMISCH, 2002).

131

5.2.6.1 Observao Histolgica dos Segmentos Cutneos de Pele Suna Separao da Epiderme e Derme A anlise histolgica confirmou que o processo proposto foi eficiente na separao da derme e epiderme. possvel observar, na extremidade superior direita da Figura 31, a presena da epiderme formada por suas camadas caractersticas, incluindo o extrato crneo. Na extremidade superior esquerda nota-se a derme, constituda por tecido conjuntivo, exposta aps a remoo completa da epiderme.

Figura 31: Fotomicrografia em microscopia de luz da amostra pele suna submetida ao processo de separao de epiderme e derme. Colorao: hematoxilina-eosina; Barra = 20m.

132

5.2.6.2 Validao da Metodologia para a Extrao da NFD de Epiderme e Derme Suna 5.2.6.2.1 Caracterizao da Seletividade, da Recuperao e Preciso da Extrao da NFD da Epiderme e Derme Suna. A avaliao da recuperao de NFD adicionada aos segmentos cutneos de epiderme e derme sunas foi feita por meio da comparao das respostas obtidas nas amostras e nas spiked solutions correspondentes a cada nvel de massa de NFD total adicionada. Os resultados obtidos na validao para o procedimento de extrao da NFD dos segmentos cutneos de epiderme e derme suna esto apresentados na tabela 16.

Tabela 16: Recuperao mdia de NFD dos tecidos para trs nveis do frmaco e seus DPR. Recuperao DPRa Quantidade adicionada de NFD Epiderme (g) 5,04 3,40 1,66
a

Epiderme % 96,70 1,38 96,23 1,79 96,68 1,42

Derme (g) 4,88 2,28 3,27 1,17 1,63 3,29

Derme % 96,89 2,28 96,12 1,17 97,98 3,29

(g) 4,87 1,37 3,28 1,79 1,60 1,42

n=3

Os resultados foram satisfatrios no que se refere s curvas padro preparadas no perodo. A mdia do coeficiente de correlao (r) encontrado foi de 0,9991 0,02 para n = 3, indicando que a resposta de CLAE foi linear para as condies de anlise dentro da faixa de concentrao entre 0,34 e 5,04 g/mL. O LD para a anlise neste perodo foi de 0,1134 g/mL e o LQ foi de 0,3436 g/mL.

133

Os desvios padro entre os experimentos realizados para cada nvel tambm foram considerados aceitveis para o mtodo bioanaltico (<15%, SHAH et. al., 1992; ANVISA, 2003), o que caracteriza preciso adequada para os objetivos deste trabalho. A figura 32 mostra as curvas analticas obtidas para este experimento

1200000 1000000 800000 rea 600000 400000 200000 0 0,00

Seqncia1 Seqncia2 Seqncia3

y = 186937x - 6887,4 r = 0,999303 y = 186590x - 8917,8 r = 0,998948 y = 186377x - 8876,5 r = 0,999135

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

Concentrao (g/mL)

Figura 32: Curvas analticas de NFD 0,34 a 5,04 g/mL

Na figura 33 esto apresentados os cromatogramas obtidos para a soluo extratora da epiderme e da derme na ausncia de NFD e para as solues extratoras na presena de NFD. Pode-se observar, na figura 34, que existe boa resoluo entre o sinal da NFD e dos interferentes.

134

a) Soluo Padro 1,66 g/mL

b) Epiderme Branco

c) Epiderme+NFD

d) Derme Branco

e) Derme+NFD

Figura 33 - Cromatogramas obtidos no experimento de extrao da NFD da pele suna empregando solvente gua:acetonitrila:metanol (50:25:25), para a avaliao da especificidade do mtodo. A) soluo padro de NFD, b) branco da epiderme, c) epiderme na presena de NFD, d) branco da derme, e) derme na presena de NFD. Tempo de reteno da NFD = 16 min.

Pela anlise dos resultados apresentados, o mtodo de extrao proposto para a extrao da NFD das camadas de pele suna mostrou-se seletivo, preciso e exato, assim, adequado para o emprego nos estudos de penetrao cutnea neste trabalho.

5.2.6.3 Resultados da Penetrao / Permeao in vitro das Formulaes contendo NFD Ao final dos experimentos de permeao, a presena de NFD nos extratos cutneos foi determinada aps separao dos mesmos, de acordo com o procedimento descrito no item 4.2.5.2.3

135

As massas absolutas de NFD extradas da epiderme e derme suna aps 24 horas de experimento em que a formulao permaneceu em contato com a pele, em uma rea de 1,54 cm2 esto apresentadas na tabela 17.

Tabela 17: Massas de NFD obtidas da derme e da epiderme suna em uma rea de 1,54 cm2, aps 24 horas de contato com a formulao.
24 horas Quantidade de NFD Epiderme (g) n 1 2 3 4 5 6 Mdia DP PLO+NFD 420,37 412,97 429,54 405,19 429,76 418,16 419,33 9,5 PLO+NFD+ TC 101,47 94,67 94,42 94,80 88,38 98,69 95,41 4,4 EMUL 214,20 224,31 220,45 214,04 223,65 224,52 220,20 4,9 Quantidade de NFD Derme (g) PLO+NFD 158,38 168,32 164,36 167,07 159,89 166,83 164,14 4,1 PLO+NFD+ TC 57,89 54,58 64,65 59,69 58,52 56,64 58,66 3,4 EMUL 117,67 115,34 122,31 120,93 114,12 115,77 117,69 3,3

A figura 34 mostra a representao grfica dos resultados apresentados na tabela 17.

500,00 450,00 400,00 Nifedipina (g) 350,00 300,00 250,00 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 PLO PLO + TRANS Formulaes EMULSO Epiderme Derme

Figura 34 - Massas absolutas de NFD extradas da epiderme e derme aps 24 horas de contato das formulaes com a pele, em uma rea de 1,54 cm2.

136

Uma analise da figura 34 permite concluir que, para as trs formulaes, a quantidade de NFD detectada foi maior na epiderme do que na derme, mostrando assim, que a quantidade de NFD diminuiu com a profundidade. A diferena na quantidade de NFD retida na epiderme e derme entre as trs formulaes mostraram-se estatisticamente diferentes (p< 0,001 para = 5%). Bem como a diferena da quantidade de NFD retida nos diferentes estratos cutneos para uma mesma formulao tambm se mostraram estatisticamente distintas em todos os casos (p< 0,001 para = 5%). Ayub (2002), Freitas (2005) e Bemvindo (2006), em seus estudos, tambm verificaram quantidade decrescente de frmaco nos extratos cutneos. Um estudo realizado por Wodjac (1997) avaliou o efeito da lecitina de ovo como surfactante na biodisponibilidade da NFD administrada intragastricamente em ratos. Os resultados do estudo mostraram que houve um aumento da biodisponibilidade do frmaco em presena da lecitina. Bonina e Montenegro (1994), estudaram o efeito de alguns promotores de penetrao cutnea, incluindo o transcutol e a lecitina de soja, na absoro da heparina sdica atravs de pele humana. Neste estudo observou-se que todos os promotores, inclusive a lecitina de soja foram capazes de promover a penetrao da heparina, com exceo do transcutol. Medindo o fluxo da heparina a partir das formulaes contendo os promotores mostrou-se que a lecitina de soja foi capaz de promover a penetrao da heparina, enquanto o transcutol no foi capaz. Segundo os autores os resultados indicam que a lecitina pode atuar aumentando o coeficiente de difuso da heparina.

137

Estes estudos podem explicar a maior quantidade de NFD encontrada nos estratos cutneos expostos formulao PLO+NFD, onde a lecitina alterou o coeficiente de difuso da NFD, aumentando a sua concentrao nos estratos cutneos. Por outro lado, de acordo com Ganem-Quintanar e cols. (1997) o transcutol passa atravs da pele alcanando o compartimento receptor a uma taxa constante, limitado pelo extrato crneo. Em conseqncia da higroscopicidade do transcutol, um fluxo oposto de gua estabelecido do compartimento receptor para o doador, que atrai gua da pele. Como resultado dos fluxos opostos, a taxa de permeao afetada, modificando o particionamento do frmaco e a sua atividade termodinmica no compartimento doador. Isto pode explicar a quantidade de NFD encontrada nos estratos cutneos expostos PLO+NFD+ TC. Na avaliao da possvel permeao cutnea de NFD, observou-se que aps 24 horas de experimento foi possvel detectar a presena do frmaco no meio receptor apenas para as formulaes PLO+NFD e EMUL. As quantidades de NFD detectadas so apresentadas na tabela 18
Tabela 18: Quantidade de NFD (g/mL) encontrada no meio receptor aps24h de ensaio.

Formulao PLO+NFD PLO + TC EMUL a n = 6 DP

NFD (g/mL)* 19,04 2,27 -3,09 2,77

*Quantidade de NFD (g/mL) no meio receptor aps 24h de ensaio.

Sabendo-se que a solubilidade da NFD na soluo receptora 36,3 g/mL, conclui-se que a condio sink foi respeitada considerando-se as concentraes de NFD obtidas ao final das 24 horas.

138

O maior valor encontrado foi de 19,04 g/cm2 em um volume de 40 mL de soluo receptora, o que representa uma concentrao de 0,476 g/mL, mostrando que a condio sink (12,1 g/mL) foi respeitada. Godwim, Kim e Felton (2002) estudaram a influencia da concentrao de transcutol em formulaes anti-solares na permeao e reteno cutnea de filtros solares. De acordo com os autores a incluso do transcutol nas formulaes aumentou a reteno cutnea sem, no entanto promover a permeao. Este fato, somado ao fenmeno de modificao do particionamento do frmaco e a sua atividade termodinmica no compartimento doador descrito por Ganem-Quintanar e cols. (1997) pode explicar a ausncia de permeao da NFD, mesmo aps 24h. A opo pela terapia com NFD por via tpica pressupe que a ao do frmaco se desenvolva nas camadas superiores da pele e no se deseja a penetrao profunda, capaz de atingir a circulao sistmica. Por este motivo o estudo de permeao cutnea capaz de fornecer dados importantes. A quantidade de NFD quantificada na soluo receptora aps 24 horas indica que o frmaco apresentou dificuldade em alcanar a soluo receptora. Uma hiptese para explicar estas quantidades, pode estar relacionada s propriedades moleculares da NFD, como a baixa capacidade de partio do frmaco para a soluo receptora aquosa. Alm disso, uma vez que a derme possui caractersticas hidroflicas maiores do que a epiderme, ela tambm pode representar uma barreira passagem de substncias, sobretudo quelas que possuem alto coeficiente de partio e baixa solubilidade em gua (KOU et.al., 1993). Desta maneira, substncias muito lipoflicas

139

tm uma tendncia ao acmulo no estrato crneo e na epiderme, seja pela afinidade com esses tecidos ou pela dificuldade em atravessar a derme.

140

CONCLUSES

Com base nos resultados obtidos no presente trabalho, foi possvel concluir que:

Foi possvel desenvolver formulaes contendo NFD em base PLO pelo mtodo de extruso. O mtodo utilizado para a anlise da NFD de trabalho mostrou-se satisfatrio, seu teor foi determinado em 99,94% e a matria-prima foi aplicada como padro secundrio. O mtodo analtico proposto para a determinao do teor de NFD nas formulaes por UV-vis demonstrou linearidade, sensibilidade e preciso adequadas. O meio aceptor escolhido para os ensaios de liberao e permeao / penetrao permitiu que a condio sink fosse obedecida, assim mostrando-se adequado para a aplicao nos experimentos desenvolvidos neste estudo. O estudo de caracterizao histolgica dos fragmentos de pele suna permitiu confirmar que o processo proposto para a separao da epiderme e derme foi eficiente e garante correta separao dos estratos cutneos nos experimentos de permeao / penetrao cutnea. O mtodo analtico aplicado para a determinao da NFD por CLAE nas amostras provenientes dos ensaios de liberao e permeao / penetrao demonstrou linearidade, sensibilidade e preciso adequadas aos objetivos deste estudo. A avaliao das propriedades fsico-qumicas das formulaes permitiu observar que: A presena da NFD alterou discretamente o pH das formulaes; 141

Todas as formulaes apresentaram decrscimo na viscosidade aparente com o aumento da taxa de cisalhamento apresentando um comportamento

pseudoplstico quanto ao fluxo, caracterstico de sistemas contendo polmeros em disperso e sistemas emulsionados semi-slidos; As viscosidades das amostras PLObase, PLO+NFD e EMUL no apresentaram diferenas estatisticamente significativas entre si, com P>0,05 (para =5%), enquanto que PLO+NFD+TC apresentou um valor de viscosidade

estatisticamente diferente de PLObase e EMUL, com P<0,005 (para =5%). Em relao PLO+NFD, PLO+NFD+TC apresentou diminuio sensvel da viscosidade, com P<0,001 (para =5%). Revelando que a presena do transcutol proporcionou alterao da viscosidade. Todas as formulaes apresentaram tixotropia. PLO+NFD mostrou-se pouco tixotrpica devido presena de cristais insolveis de NFD, entretanto, a adio de transcutol restabeleceu o comportamento tixotrpico. PLObase, PLO+NFD e PLO+NFD+ TC apresentam comportamento viscoelstico, com componentes elsticos (G`) maiores que os componentes viscosos (G``). A anlise por microscopia ptica permitiu evidenciar que o processo de extruso produziu formulaes de PLO microemulsionadas, em contraste com a formulao EMUL (no microemulsionada). Os estudos de liberao in vitro em sistema de difuso vertical equipado com membrana sinttica permitiram identificar o perfil de liberao da NFD a partir das formulaes em estudo.

142

Nos ensaios de liberao a formulao PLO+NFD+ TC apresentou fluxo de NFD menor em relao s outras duas formulaes, embora a diferena entre o fluxo das trs formulaes no tenha demonstrado diferena estatisticamente significativa (P = 0,0683 para = 5%). A presena do transcutol alterou discretamente a atividade termodinmica da NFD na base PLO. Os estudos empregando clulas de difuso vertical com membrana natural de pele suna mostraram que para as trs formulaes, a quantidade de NFD detectada foi maior na epiderme do que na derme, evidenciando assim, que a quantidade de NFD diminuiu com a profundidade no tecido estudado. Observou-se que lecitina alterou o coeficiente de difuso da NFD, aumentando a sua concentrao nos estratos cutneos. Os resultados indicam que o transcutol afetou a permeao, provavelmente modificando o particionamento do frmaco e a sua atividade termodinmica no compartimento doador. Na avaliao da possvel permeao cutnea da NFD, observou-se que aps 24 horas de experimento foi possvel quantificar a presena do frmaco no meio receptor, apenas nas formulaes PLO+NFD e EMUL. A opo pela terapia com NFD por via tpica pressupe que a ao do frmaco se desenvolva nas camadas superiores da pele e no se deseja a penetrao profunda, capaz de atingir a circulao sistmica. Provavelmente, dentre as formulaes estudadas, a que se mostrou mais apropriada para o tratamento tpico de leses cutneas de difcil cicatrizao por deficincia de revascularizao foi PLO contendo 8% de nifedipina e 10% de transcutol, pois: constituda de excipientes que possuem alta compatibilidade com a pele; 143

Os excipientes possuem caracterstica de promover a reteno do ativo nos segmentos cutneos, epiderme e derme;

Apresentou a menor viscosidade relativa quando submetida ao cisalhamento, o que est relacionado com uma melhor espalhabilidade.

Embora tenha apresentado um fluxo de liberao menor que o das outras formulaes estudadas, esta diferena no foi considerada representativa.

A adio de TC restabeleceu a tixotropia, muito diminuda pela adio da NFD ao PLO. Para as formulaes de uso tpico desejvel que a viscosidade diminua com o

cisalhamento a fim de facilitar a espalhabilidade sobre a pele. Por outro lado, a tixotropia tambm desejvel para que a formulao no escorra da pele.

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