Dissertação Irismara PDF

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM PLANTAS MEDICINAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
IRISMARA SOUSA SILVA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DO EXTRATO

AQUOSO E DA FRAÇÃO POLISSACARÍDICA DA Thuja occidentalis Linn.
(Cupressaceae) EM CAMUNDONGOS.
TERESINA
2016

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Farmacologia do Núcleo de Pesquisas
em Plantas Medicinais NPPM/CCS da Universidade
Federal do Piauí como requisito parcial para a
obtenção do Título de Mestre em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. JAND VENES ROLIM MEDEIROS
TERESINA
2016

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia do

Núcleo de Pesquisas em Plantas Medicinais NPPM/CCS da Universidade
Federal do Piauí como requisito parcial para a obtenção do Título de Mestre em
Farmacologia.
Aprovada em: ____/____/_________
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________
Prof. Dr. Jand-Venes Rolim Medeiros
(Orientador)
Universidade Federal do Piauí (UFPI)
______________________________________________
Prof. Dr. Joilson Ramos de Jesus
(Examinador Externo)
Universidade Federal da Bahia (UFBA)
______________________________________________
Profª. Drª. Rosimeire Ferreira dos Santos
(Examinador Interno)
Universidade Federal do Piauí (UFPI)
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ
REITOR
Prof. Dr. José Arimatéia Dantas Lopes
VICE-REITORA
Profª. Drª Nadir d Nascimento Nogueira
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

Prof. Dr. Helder Nunes da Cunha
DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Profª. Drª. Regina Ferraz Mendes
VICE-DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Profª. Drª. Lina Gomes Santos
COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

FARMACOLOGIA
Profª. Drª. Fernanda Regina de Castro Almeida
“Seu trabalho vai preencher uma parte grande
da sua vida, e a única maneira de ficar
realmente satisfeito é fazer o que você acredita
ser um ótimo trabalho. E a única maneira de
fazer um excelente trabalho é amar o que você
faz.”
(Steve Jobs)
AGRADECIMENTOS
À Deus pela minha vida, saúde, por me ensinar a ser um ser humano
melhor e me mostrar sempre o caminho certo a trilhar, sem ele eu nada seria.
À minha família, em especial a meus pais Sandra e Cícero, por
constituírem minha base em amor e caráter, às minhas irmãs Caroline e
Patrícia pelo amor incondicional, à minha querida vó Maria Diva por tanto
cuidado, aos meus tios Roque Fernando e Marcia Silva, vocês foram vitais para
meu crescimento pessoal e profissional, cada conselho e ensinamento
ajudaram a construir a pessoa que me tornei hoje.
Aos meus amigos, em especial à Camila Brito pela amizade
incomparável que construímos em meio a momentos de alegria e dificuldades,
por ter iniciado este trabalho junto comigo, e mesmo estando longe sempre que
preciso está à disposição, te amo minha amiga. À Beatriz Melo pela linda
amizade ao longo desses anos, por ter me recebido em sua casa nesses
últimos meses, pela paciência, colaboração, por indagar junto comigo na busca
de novos conhecimentos, por ter cuidado de mim no pós-operatório com tanto
carinho, amo você amiga, serei sempre grata por tanto apoio. À Nathália
Carvalho, pela parceria ao longo dessa trajetória de LAFFEX e mestrado,
obrigada pela amizade linda que temos, sei que sempre estaremos unidas. Ao
Antônio Carlos pela amizade, carinho e cuidado, você é um dos meus maiores
exemplos de confiança, sei que sempre posso contar com você. Ao Rafael
Almendra por sempre se mostrar disposto a me ajudar não importa a hora,
nossa amizade é algo que pretendo cuidar com muito amor pelo resto dos
meus dias. Ao Matheus Sombra, que nos últimos meses se tornou a minha
melhor companhia, serei sempre grata pelas infinitas vezes que contribuiu com
esse trabalho e com a seleção de doutorado, sua contribuição foi crucial para
essa conquista, cada momento, cada sorriso será guardado como algo
imensamente precioso no meu coração, obrigada por tudo. À Fabiana,
obrigada por ter me recebido em sua casa com tanto carinho, sua amizade é
especial. Ao Gustavo Pereira, pelo amor, cuidado, carinho e pela preocupação
com meu bem estar, sempre será imensamente especial na minha vida. Aos
demais: Andressa Barbosa, Viviane Dias, José Junior, Larissa, agradeço pelos
momentos de descontração, cada palavra, cada gesto de generosidade, e de
alegria ajudaram a me manter forte para seguir os passos que me trouxeram
até aqui, amo todos vocês.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Jand Venes Rolim Medeiros, pela
oportunidade concedida, pelos conhecimentos, conselhos e por acreditar no
meu potencial, seu apoio e confiança foram essenciais para que eu chegasse
até aqui, tudo que aprendi com você hoje me abre muitas portas pra buscar um
futuro melhor.
Aos membros do Laboratório de Fisio-Farmacologia Experimental
(LAFFEX), em especial àqueles que no iníco me receberam com amor e tanto
me ensinaram, que hoje embora alguns estejam distantes buscando seus
sonhos sei que posso contar sempre: Beatriz Melo, Nathalia Carvalho, Camila
Brito, Samara Damasceno, Renan Oliveira, Valdelania Gomes e Lucas Nicolau.
Aos demais membros pela ajuda nos experimentos, pela troca de
conhecimentos, amizade e momentos de alegria: Simone de Araújo, Ana
Patrícia de Oliveira, Maisa Santos, José Júnior, Bruno Iles, Gabriella Pacheco,
Matheus Sombra, Caroline Brandão, Elenice Monte, Fabiana Moura, Kerolayne
Nogueira, Dvison Pacífico, Monique Campos, Ana Leódido, Vanessa Meneses,
Douglas Costa, Thiago Lopes, Nayara Alves e Luan Kelves.
Aos meus amigos de turma de mestrado do Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia: Larissa, Gele, Oscar, Breno, Michel, Geovanni e João Victor em
especial ao Antonio, Nathália, Rafael e Jalles, sem vocês eu claramente não
teria conseguido pagar 10 disciplinas ao mesmo tempo e fazer incontaveis
seminários, os momentos que vivemos juntos, a companhia, amizade e apoio
nas horas difíceis e de desespero fazem de vocês tão especiais, amo muito
cada um de vocês.
À Universidade Federal do Piauí, pela enorme contribuição na minha
vida acadêmica, profissional e científica.
Ao Núcleo de Pesquisas em Plantas Medicinais e ao corpo
docente do programa de pós-graduação em Farmacologia – UFPI: Aldeídia
Pereira, Fernanda Regina Almeida, Rita de Cássia Meneses, Rosimeire
Ferreira, Salete Brito, Fernando Aécio Amorim, Francisco Oliveira, Jand Venes
Rolim Medeiros, Leonardo Torres, Moisés Tolentino e Rozeverter Moreno por
todo conhecimento e aprendizado durante o curso do mestrado, todos
contribuiram de uma forma única para meu crescimento profissional.
À Prof.ª Drª Fernanda Regina de Castro Almeida pelos
conhecimetos durante a tragetória da disciplina de práticas deensio, e pelo
apoio e auxílio na burocracia referente ao meu ingresso no doutorado.
Aos membros da banca, à Profª. Drª. Rosimeire Ferreira dos Santos,

pela imensa contribuição aos meus conhecimentos durante as disciplinas, sua
garra, determinação e brilho nos olhos ao ministrar as aulas me inspiraram a
buscar um futuro profissional semelhante ao seu, além disso, agradeço por
aceitar colaborar com o meu trabalho final de dissertação. Ao Prof. Dr. Joilson
Ramos, por aceitar com tanta alegria o convite para participar da banca
examinadora, disponibilizando seu tempo para avaliar meu trabalho.
Ao Laboratório de Farmacologia da Inflamação e do Câncer (LAFICA) da

Universidade Federal do Ceará pela colaboração.
À CAPES/CNPq pelo consentimento da bolsa.
Enfim, agradeço a todos que fizeram parte deste caminho de

crescimento pessoal e profissional.
MUITO OBRIGADA!
RESUMO
A indução da inflamação aguda representa o principal mecanismo pelo qual o sistema

imune inato lida com infecções e lesões teciduais. No entanto, a inflamação pode
tornar-se prejudicial quando o processo é desregulado e exacerbado. Os fármacos
comumente utilizados no tratamento de condições inflamatórias estão associados ao
aparecimento de efeitos adversos graves como úlceras gastrointestinais, hemorragias
e distúrbios renais. Nesse contexto, as plantas medicinais constituem uma fonte
importante para estudos que visam à descoberta de novas substâncias com atividade
farmacológica que tenham maior segurança, melhor eficácia e menos efeitos
adversos. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar a atividade anti-inflamatória do
extrato aquoso (EA) e da fração polissacarídica (PLS) da T. occidentalis Linn. em
camundongos. A atividade anti-inflamatória do AE e PLS da T. occidentalis L foi
avaliada pela medição de edema de pata induzido por diferentes agentes
inflamatórios, análise histopatológica e imuno-histoquímica. No modelo de peritonite,
foi analisada a contagem total e diferencial de leucócitos, a atividade da
mieloperoxidase (MPO), os níveis de citocinas (TNF-α e IL-6), a concentração de
nitrito, os níveis da glutationa (GSH) e as concentrações de malondialdeído (MDA).
Em adição, também foram avaliadas a permeabilidade vascular e a toxicidade
gástrica. Todos estes testes foram realizados em camundongos Swiss. Como
resultados, o pré-tratamento com AE e PLS (3, 10 e 30 mg/kg, i. p.) reduziu
significativamente (P < 0,05) o edema da pata induzido pela carragenina, sulfato de
dextrana (DEX), composto 48/80, serotonina (5-HT ), histamina (HIST), bradicinina
(BK), e prostaglandina E2 (PGE2). Além disso, também inibiu o recrutamento de
leucócitos e neutrófilos; reduziu a atividade da enzima MPO, os níveis do fator de
necrose tumoral-alfa (TNF-α) e os níveis de interleucina-6 (IL-6), a permeabilidade
vascular, as concentrações de nitrito, as concentrações de MDA e manteve os níveis
de GSH no exsudado peritoneal. AE e PLS também reduziram a infiltração de
polimorfonucleares, bem como o número de células marcadas para a COX-2 e iNOS
no tecido da pata quatro horas após a administração de carragenina. Em adição, o
tratamento com uma dose de cem vezes maior de AE e PLS (300 mg/kg) que a usada
como melhor dose nos testes descritos anteriormente, não promoveu toxicidade
gástrica. Em conclusão, estes dados mostram que AE e PLS reduzem a resposta
inflamatória através da inibição de eventos vasculares e celulares, por modular a
migração de neutrófilos, pela inibição da produção de citocinas pró-inflamatórias, e
reduzir o estresse oxidativo.
Palavras-chave: Cupressaceae; polissacarídeos; inflamação; citocinas, estresse

oxidativo.
ABSTRACT
Acute inflammation induction is the major mechanism by which innate immune system
deals with infections and tissue injuries. However, inflammation can be prejudicial
when the process is deregulated and exacerbated. The drugs frequently used to treat
inflammatory conditions are associated with severe adverse effects such as,
gastrointestinal ulceration, bleeding and renal disorders. In this context, medicinal
plants are an important source for studies that aim to discover new substances
endowed with pharmacological activity with greater safety, efficacy and less adverse
effects. Thus, the objective of this study was to investigate the anti-inflammatory
activity of aqueous extract (AE) and the polysaccharide fraction (PLS) of T. occidentalis
L. in mice. The anti-inflammatory activity of aqueous extract (AE) and polysaccharide
fraction (PLS) of T. occidentalis L. were assessed by measuring paw edema induced
by different inflammatory agents, histopathological and Immunohistochemistry analysis.
In peritonitis model, it was evaluated the number total and differential leucocyte,
myeloperoxidase (MPO) activity, cytokine levels, concentration of nitrite, glutathione
(GSH) levels and malondialdehyde (MDA) concentration. In addition, were also
evaluated vascular permeability and gastric toxicity in mice. In the results, pretreatment
of mice with AE and PLS (3,10 and 30 mg/kg, i.p.) significantly reduced (p˂0.05)
induced paw edema by carrageenan, dextran sulfate (DEX), compound 48/80,
serotonin (5-HT), bradykinin (BK), histamine (HIST) and prostaglandin E2 (PGE2).
Furthermore, also inhibited the recruitment of total leukocytes and neutrophils;
decreased MPO activity, tumor necrosis factor-a (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) levels,
vascular permeability, concentration of nitrite, MDA concentration and maintained the
GSH levels in the peritoneal exudate. AE and PLS also reduced neutrophil infiltration
and immunostaining for COX-2 and iNOS in paw tissue four hours after carrageenan
administration. In addition, treatment with a dose one hundred times higher of AE and
PLS (300 mg/kg) did not promote gastric toxicity. In conclusion, the data show that AE
and PLS reduces inflammatory response by inhibiting vascular and cellular events,
modulating neutrophil migration, inhibiting proinflammatory cytokine production, and
reducing oxidative stress. Furthermore, did not promoted gastric toxicity at high doses.
Keywords: Cupressaceae, polysaccharide, inflammation, cytokines, oxidative stress

LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Representação esquemática da integração do sistema imunológico

humano. ........................................................................................................... 17
FIGURA 2: Representação esquemática das principais vias de sinalização que
levam à ativação do fator de transcrição NF-КB. ............................................. 19
FIGURA 3: Representação esquemática das etapas clássicas da cascata da
diapedese. ........................................................................................................ 22
FIGURA 4: Representação esquemática do mecanismo de ação dos
glicocorticoides. ................................................................................................ 31
FIGURA 5: Representação esquemática do mecanismo de ação dos AINEs. 32
FIGURA 6: Thuja occidentalis Linn. ................................................................. 36
FIGURA 7: Representação esquemática do delineamento experimental
realizado. .......................................................................................................... 44
FIGURA 8: Efeito do EA e PLS no edema de pata induzido por carragenina. . 52
FIGURA 9: Análise histológica. ........................................................................ 53
FIGURA 10: Efeito do EA e PLS na análise imuno-histoquímica para COX-2. 55
FIGURA 11: Efeito do EA e PLS na análise imuno-histoquímica para iNOS ... 56
FIGURA 12: Efeito do EA e PLS no edema de pata induzido por diferentes
agentes. ........................................................................................................... 58
FIGURA 13: Efeito do EA e PLS sobre a migração de leucócitos para a
cavidade peritoneal. ......................................................................................... 59
FIGURA 14: Efeito do EA e PLS sobre os níveis da enzima mielopexidase
(MPO). .............................................................................................................. 60
FIGURA 15: Efeito do EA e PLS sobre os níveis das citocinas TNF-alfa e IL-6
......................................................................................................................... 61
FIGURA 16: Efeito do EA e PLS sobre as concentrações de glutationa (GSH) e
nos níveis de malondialdeído (MDA). ............................................................... 62
FIGURA 17: Efeito do EA e PLS sobre as concentrações de nitrito (NO2-) ..... 63
FIGURA 18: Efeito do do EA e PLS na permeabilidade vascular. ................... 64
FIGURA 19: Análise da toxicidade gástrica do EA e PLS e níveis da MPO em
camundongos. .................................................................................................. 65
FIGURA 20: Diagrama esquemático representativo do efeito do EA e PLS na
resposta inflamatória ........................................................................................ 73
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
5-HT – Serotonina
AINE’s – Anti-inflamatórios Não Esteroides
ANOVA – Análise de Variância
AP1 – Fator de transcrição AP-1 (factivator protein-1)
BK – Bradicinina
BKB1 – Receptor de bracicinina B1
BKB2 – Receptor de bracicinina B2
CCL2 – Quimiocina CCL2
Cg – Carragenina
COX – Ciclooxigenase
CXCL8 – Quimiocina CXCL8
DAMPs – Damage-associated molecular patterns
DEX – Sulfato de Dextran
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
DTNB – Ácido Ditio-Nitrobenzóico
EA – Extrato aquoso
EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
ELISA – Ensaio de Imunoabsorbância Ligado a Enzima
EP1 – Receptor EP1 de prostaglandina E2
EROS – Espécies Reativas do Oxigênio
FADD – Fas-Associated protein with Death Domain
GC – Glicocorticóides
G-CSF – Granulocyte-colony stimulating factor
GM-CSF – Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
GRE – Glucocorticoid responsive elements
GSH – Glutationa
H & E – Hematoxilina e Eosina
HIST – Histamina
HSP – Heat shock protein
HTAB – Hexa-Decil-Trimetil-Amônio
i.p. – Intraperitoneal
ICAM 1 e 2 – Intercellular Adhesion Molecule 1 and 2
IFN – Interferon
IgG – Imunoglobulina G
IL-10 – Interleucina 10
IL-1β – Interleucina- 1beta
INDO – Indometacina
iNOS – Óxido Nítrico Sintase Induzida
JAK-STAT – Janus kinase/signal transducers
LPS – Lipopolissacarídeo
LTB4 – Leucotrieno B4
M-CSF – Macrophage colony-stimulating factor
MDA – Malondialdeído
MPO – Mieloperoxidase
NF-kB – Factor nuclear kappa B
NK – Natural Killer Cell
NLR – NOD-like receptors
O2•– – Ânion Superóxido
ONOO- – Peroxinitrito
PAF – Fator de ativação de plaquetas
PAMPs – Pathogen-associated molecular pattern
PBS – Tampão Fosfato salino
PG – Prostaglandinas
PGE2 – Prostaglandina E2
PGI2 – Prostaciclina
PKA – Proteína Kinase A
PLS – Polissacarídeo
PMN – Polimorfonucleados
PRRs – Pattern recognition receptors
RMN – Ressonância magnética nuclear
s.c. – Subcutânea
Sal – Salina/ Soro Fisiológico
TCA – Ácido Tricloroacético
TLRs – Toll-like receptors
TNF-RI – Receptor do fator de necrose tumoral 1
TNFRII – Receptor do fator de necrose tumoral 2
TNF-α – Fator de Necrose Tumoral Alfa
TNF-β – Fator de necrose tumoral beta
TXB2 – Tromboxano B2
v.o – Via Oral
VCAM 1 – Vascular cell adhesion molecule 1
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 15
1.1 A INFLAMAÇÃO ........................................................................................ 15
1.1.1 Eventos vasculares da resposta inflamatória .......................................... 20
1.1.2 Eventos celulares da resposta inflamatória ............................................. 21
1.1.3 Papel dos neutrófilos na inflamação aguda ............................................. 24
1.1.4 Mediadores envolvidos nos processos inflamatórios .............................. 25
Aminas Vasoativas ........................................................................................... 25
Bradicinina........................................................................................................ 26
Citocinas........................................................................................................... 27
Óxido Nítrico..................................................................................................... 28
Metabólitos do Ácido Araquidônico (AA) .......................................................... 29
1.2 FÁRMACOS ANTI-INFLAMATÓRIOS ...................................................... 30
1.3 PLANTAS MEDICINAIS ............................................................................ 32
1.4 O GÊNERO THUJA ................................................................................... 35
1.4.1 T. occidentalis L. composição fitoquímica e atividades farmacológicas .. 36
2. OBJETIVOS ................................................................................................. 39
2.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................... 39
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................... 39
3. METODOLOGIA .......................................................................................... 41
3.1 OBTENÇÃO DO EXTRATO E DA FRAÇÃO POLISSACARÍDICA DE T.

occidentalis L.................................................................................................... 41
3.2 DROGAS E REAGENTES ......................................................................... 42

3.3 ANIMAIS..................................................................................................... 42
3.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL .......................................................... 43
3.5 EFEITO DO EA E PLS SOBRE O EDEMA DA PATA INDUZIDO POR

CARRAGENINA ............................................................................................... 45
3.6 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA...................................................................... 45
3.7 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA PARA COX-2 E iNOS ........................ 45
3.8 EFEITO DE EA E PLS SOBRE EDEMA DA PATA INDUZIDO POR

DIFERENTES AGENTES INFLAMATÓRIOS .................................................. 46
3.9 PERITONITE INDUZIDA POR CARRAGENINA ........................................ 47
3.10 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA MIELOPEROXIDASE (MPO) 47
3.11 ANÁLISE DAS CONCENTRAÇÕES DE TNF-α E IL-6 ............................ 48
3.12 ANÁLISE DAS CONCENTRAÇÕES DE GLUTATIONA (GSH) ............... 48
3.13 ANÁLISE DOS NÍVEIS DE MALONDIALDEÍDO (MDA)........................... 49
3.14 ANÁLISE DAS CONCENTRAÇÕES DE NITRITO (NO2-) ........................ 50
3.15 AVALIAÇÃO DA PERMEABILIDADE VASCULAR .................................. 50
3.16 ANÁLISE DO EFEITO DO EA E PLS SOBRE A TOXICIDADE GÁSTRICA

EM CAMUNDONGOS ...................................................................................... 50
3.17 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................... 51
4. RESULTADOS ............................................................................................. 51
4.1 EFEITO DO EA E PLS NO EDEMA DE PATA INDUZIDO POR

CARRAGENINA ............................................................................................... 51
4.2 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA...................................................................... 52
4.3 EFEITO DO EA E PLS NA ANÁLISE IMUNOHI-STOQUÍMICA PARA iNOS

E COX-2 ........................................................................................................... 54

DIFERENTES ESTIMULOS INFLAMATÓRIOS ............................................... 57
4.5 EFEITO DO EA E PLS NA PERITONITE INDUZIDA POR CARRAGENINA

......................................................................................................................... 59
4.6 EFEITO DO EA E PLS NA ATIVIDADE DA MPO ...................................... 60

4.7 EFEITO DE EA E PLS NOS NÍVEIS DE TNF-α E IL-6 .............................. 61
4.8 EFEITO DO EA E PLS NAS CONCENTRAÇÕES DE GLUTATIONA (GSH)

......................................................................................................................... 62
4.9 EFEITO DO EA E PLS NOS NÍVEIS DE MALONDIALDEÍDO (MDA) ....... 62
4.10 EA E PLS INIBE A PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (NO) NA

CAVIDADE PERITONEAL ............................................................................... 63
4.11 EFEITO DO EA E PLS NA PERMEABILIDADE VASCULAR................... 64
4.12 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE GÁSTRICA ............................................. 65
5. DISCUSSÃO ................................................................................................ 66
6. CONCLUSÃO .............................................................................................. 73
7. PERSPECTIVAS FUTURAS........................................................................ 73
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 75
ANEXO ............................................................................................................ 89
APÊNDICES .................................................................................................... 90
15
1. INTRODUÇÃO
A resposta inflamatória constitui uma reação de proteção da

microcirculação, que ocorre em resposta a estímulos nocivos, infecção, trauma
ou lesão. Tem por objetivo eliminar o estímulo nocivo, promover reparação
tecidual e cicatrização e, em casos de infecções, estabelecer memória imune
de modo que o hospedeiro monte uma resposta mais rápida e específica para
futuras infecções (FULLERTON; GILROY, 2016; LALRINZUALI et al., 2016).
Este processo é caracterizado pela produção de mediadores solúveis (incluindo
aminas vasoativas, bradicinina, citocinas, quimiocinas e eicosanoides, tais
como prostaglandinas), aumento da permeabilidade vascular e recrutamento
de leucócitos (DAMASCENO et al., 2014). Entretanto, a inflamação pode
tornar-se prejudicial quando o processo é desregulado e exacerbado,
resultando em efeitos indesejados como consequência do estresse oxidativo
que leva à produção de moléculas, tais como peróxido de hidrogénio, o ânion
superóxido e peroxinitrito ARRUMAR ESSA COLOCAÇÃO (SILVA et al., 2013;
LALRINZUALI et al., 2016). Nesse contexto, a inflamação está subjacente a
diversas patologias, incluindo doenças cardiovasculares, artrite, asma, diabetes
mellitus tipo 2 e está muitas vezes ligada ao desenvolvimento de câncer
(ALLIJN et al., 2016).
Os fármacos comumente utilizados no tratamento de condições
inflamatórias, como drogas anti-inflamatórias não esteroides (AINES) atuam
interferindo com a síntese das prostaglandinas através da inibição da síntese
de COX-1 e/ou COX-2 (VAN ESCH et al., 2013). Contudo, estas drogas estão
associadas ao aparecimento de efeitos adversos graves bem documentados,
como úlceras gastrointestinais, hemorragias e distúrbios renais (SILVA et al.,
2015). Esses efeitos adversos representam uma importante limitação ao uso
contínuo destes fármacos. Assim, são necessárias pesquisas que busquem por
alternativas mais eficazes no tratamento da inflamação. Nesse contexto, as
plantas medicinais constituem uma fonte importante para estudos que visam a
descoberta de novas substâncias com atividade farmacológica que tenham
maior segurança, melhor eficácia e menos efeitos adversos (DAMASCENO et
al., 2014; DUTRA et al., 2016).
16
Dentre as plantas com uso medicinal destaca-se a Thuja occidentalis L.,

oriunda da família Cupressaceae, popularmente conhecida como ―cedro
branco‖ ou ―árvore da vida‖, é originária da parte oriental da América do Norte e
tanto no Brasil quanto na Europa ela é cultivada como um arbusto ornamental
(STANGERLIN et al., 2008; ALVES et al., 2014). Sua composição fitoquímica
inclui compostos como flavonoides, diterpenos, saponinas, fenóis, taninos,
aminas, mucilagens, compostos lactônicos, carotenóides, cumarinas (p-
cumárico e ácido umbeliferona), tânico, polissacarídeos, proteínas e sais
minerais (NASER et al., 2005; ALVES et al, 2014; FIGUEIRÊDO et al., 2014).
Estudos anteriores mostraram que T. occidentalis L. possui diferentes
propriedades farmacológicas incluindo: atividade antioxidante e gastroprotetora
(DAS et al., 2013; DUBEY et al., 2009), antidiarreica (LOKESH et al., 2007)
antibacteriana, anti-proliferativa (DAS et al., 2013), além de atividades anti-
aterosclerótica e anti-diabética, (BRIJESH et al., 2012), hepatoprotetora e ação
antitumoral (SUNILA et al., 2005; BISWAS et al., 2011; SUNILA et al., 2011;
ALVES et al., 2014). Entretanto, não existem estudos sobre os efeitos
antiinflamatórios de T. occidentalis. Estes fatos fornecem evidências para a
realização deste trabalho, que objetiva investigar a atividade anti-inflamatória
do extrato aquoso (EA) e da fracção polissacáridica (PLS) da T. occidentalis L.,
em camundongos.
1.1 A INFLAMAÇÃO
O sistema imunológico é constituído por uma intrincada rede de órgãos,

células e moléculas, e tem por finalidade manter a homeostase do organismo,
combatendo as agressões em geral (Figura 1). Atua por meio de sua
capacidade de reconhecer especificamente determinadas estruturas
moleculares ou antígenos e desenvolver uma resposta efetora adequada diante
destes estímulos (DE SOUZA et al., 2010).
A resposta imunológica tem sido conceitualmente dividida em imunidade
inata e imunidade adaptativa. A imunidade inata representa uma resposta
rápida e estereotipada a um grande número, mas limitado, de estímulos
(MEDZHITOV; JANEWAY, 2000). É representada por barreiras físicas,
químicas e biológicas, células especializadas e moléculas solúveis, presentes
17
em todos os indivíduos, independentemente de contato prévio com

imunógenos ou agentes agressores, e não se altera qualitativa ou
quantitativamente após o contato (CRUVINEL et al., 2010). As principais
células efetoras da imunidade inata são: células fagocíticas (neutrófilos,
monócitos e macrófagos), células que liberam mediadores inflamatórios
(basófilos, mastócitos, eosinófilos) e células natural killer (NK). Os
componentes moleculares incluem sistema complemento, proteínas de fase
aguda, citocinas e quimiocinas (DELVES; ROITT, 2000).
Figura 1: Representação esquemática da integração do sistema imunológico

humano.
A figura ilustra os principais componentes do sistema imunológico humano, constituído pelas

barreiras anatômicas e fisiológicas, o sistema imunológico inato e adaptativo. Fonte: Adaptado
e modificado de Stuart; Turvey; Broide, (2010).
A imunidade adaptativa difere da resposta imune inata, pois depende da

ativação de células especializadas como as células efetoras da resposta
imunitária celular, os linfócitos T, que amadurecem no timo, e as células
produtoras de anticorpos, os linfócitos B, que surgem na medula óssea, e as
células apresentadoras de antígenos (APCs) (DELVES; ROITT, 2000;
BONILLA; OETTGEN, 2010; LUCKHEERAM et al., 2012). As principais
características desta resposta são: especificidade e diversidade de
reconhecimento, memória, especialização de resposta, autolimitação e
18
tolerância a componentes do próprio organismo (CRUVINEL et al., 2010;

DUNKELBERGER; SONG, 2010). Nesse contexto, a inflamação pode ser
conceituada como uma resposta biológica defensiva, acionada toda vez que
um agente agressor, ultrapassa uma barreira primária de defesa do corpo
humano (PUNCHARD; WHELAN; ADCOCK, 2004).
Também denominada de flogose, o termo inflamação provém do grego
phlogosis e do latim flamma, que significa fogo, área em chamas e foi descrita
há mais de 2.000 anos atrás por Cornelius Celsius, que descreveu os quatro
sinais cardinais da inflamação: dor, rubor (hiperemia), calor (aumento da
temperatura local) e tumor (edema). A estes sinais, Galeno, acrescentou a
perda de função da área afetada como o quinto sinal cardinal (ROCK; KONO,
2008).
A indução da inflamação aguda representa o principal mecanismo pelo
qual o sistema imune inato lida com infecções e lesões teciduais, e embora
estas respostas sejam muito semelhantes e levem a manifestações vasculares
e celulares similares, dependendo, do gatilho incitante, os eventos primários
desse processo podem ser muito distintos (MEDZHITOV, 2010). O
reconhecimento do agente agressor por componentes celulares são de crucial
importância para ativação da resposta imunoinflamatória. Nesse aspecto os
receptores de reconhecimento padrão (PRRs), dentre eles os receptores Toll-
Like (TLRs) e receptores do tipo NOD (DIZER O NOME NOD E BOTAR NAS
ABREVIATURAS) (NLR), são responsáveis pela identificação tanto de padrões
moleculares associados a patógenos (PAMPs) como ácidos nucléicos, LPS,
ácido lipoteicóico etc, oriundos de agentes infeciosos tais como, bactérias,
vírus e fungos, quanto de padrões moleculares associados a danos (DAMPs),
que são fatores endógenos liberados em condições de injúria tecidual, como
proteínas do choque térmico (HSP), espécies reativas de oxigênio, etc. (ROCK;
KONO, 2008; RAKOFF-NAHOUM; MEDZHITOV, 2008; FANG et al., 2015).
O reconhecimento do estímulo inflamatório por componentes do sistema
imune aciona diferentes vias de sinalização subsequentes, dentre elas a via do
fator nuclear (NF-КB) (Figura 2). Esse fator de transcrição NF-КB tem atividade
pró-inflamatória e a sua ativação está envolvida com a expressão da iNOS,
COX-2 e de diversas citocinas dentre elas o TNF-α (AHN e AGGARWAL,
2005;. AHN et al, 2007). Os produtos destes genes são componentes
19
essenciais da resposta inflamatória e estão implicados na patogênese de várias

doenças com caráter inflamatório (BARNES; KARIN, 1997).
Figura 2: Representação esquemática das principais vias de sinalização que

levam à ativação do fator de transcrição NF-kB.
A figura ilustra que a ativação do fator de transcrição NF-κB pode ser mediada pela ativação
de diferentes receptores imunológicos como receptores tipo Toll-Like (TLRs), receptores para
citocinas (IL-1 e TNF-α), receptores para células B, células T e CD40. A ativação destas vias
leva a transcrição de genes que codificam proteínas pró-inflamatórios. Ag (Antígeno); IKK* (
IKKα + IKKβ + IKKγ); 1 (Migração do NF-κB para o núcleo); 2 (Efeitos do NFκB no núcleo).
Fonte: autoria própria.
Quanto ao tempo de duração, a resposta imune inflamatória pode ser

dividida em fase aguda e crônica, sendo a primeira caracterizada por uma
resposta imediata e inicial a um agente agressor (KOPF et al.,1994), onde as
principais características desta fase são: vasodilatação com aumento da
permeabilidade vascular e exsudação de líquidos e proteínas plasmáticas
(eventos vasculares), migração de leucócitos, predominantemente de
neutrófilos para o foco inflamatório (eventos celulares) e alterações sistêmicas
tais como dor, febre e elevação nos níveis de uma série de proteínas,
20
caracterizadas como proteínas de fase aguda (fibrinogênio, componentes C3 e

C5 do complemento, proteína C reativa, entre outras) (KOPF et al.,1994), A
persistência do estímulo agressor por um período indeterminado poderá
cronificar o processo inflamatório. A fase crônica caracteriza-se por ser de
longa duração, não apresentar um padrão tão estereotipado, variando de
acordo com os tipos de mediadores celulares e humorais envolvidos (HAUSER;
OKSENBERG, 2006) estar associada à presença de linfócitos e macrófagos, e
à proliferação de novos vasos sanguíneos (angiogênese) e de tecido
conjuntivo. Portanto, apesar de ser um mecanismo de defesa essencial e
inicialmente benéfico para o hospedeiro, uma resposta inflamatória
desenvolvida inadequadamente está associada ao desenvolvimento de efeitos
deletérios (PERRETI, 1997; MEDZHITOV, 2008).
1.1.1 Eventos vasculares da resposta inflamatória
A resposta inflamatória aguda evolui a partir de uma fase vascular

iniciada pelas células residentes no tecido imediatamente após o dano. O
reconhecimento do estímulo inflamatório desencadeia uma resposta imediata,
mediada por células sentinelas, como macrófagos residentes do tecido e
mastócitos (MOGENSEN, 2009). As células residentes produzem uma
variedade de mediadores inflamatórios, incluindo quimiocinas (CXCL8 e CCL2),
citocinas pró-inflamatórias (IL-1 e TNF-α), aminas vasoativas (histamina e
serotonina), eicosanoides (PGE2 e PGI2) e produtos de cascatas proteolíticas.
Estes por sua vez, atuam sobre o endotélio vascular nas vénulas pós-capilares,
induzindo vasodilatação, expressão de moléculas de adesão (P-selectina e E-
selectina), aumento do fluxo sanguíneo e da permeabilidade vascular seguida
de exsudação de líquidos (CRUVINEL et al., 2010). Este exsudato inflamatório
contém componentes do sistema complemento (C3a; C5a; C5b-C9), proteínas
de fase aguda, sistema de coagulação, sistema fibrinolítico e sistema de
cininas (bradicinina) (CRUVINEL et al., 2010).
A vasodilatação é uma das primeiras mudanças físicas que ocorre em
resposta ao estímulo inflamatório (RYAN; MAJNO, 1977). Em situações
fisiológicas, as células endoteliais funcionam como uma barreira
semipermeável, restringindo as proteínas plasmáticas ao espaço intravascular
21
(RYAN; MAJNO, 1977). A mudança conformacional do endotélio, em

decorrência do estímulo inflamatório, desencadeia dois eventos importantes: o
aumento do leito dos capilares, promovendo maior aporte sanguíneo e levando
à vermelhidão e ao calor local; e aumento da permeabilidade vascular, que
ocorre por contração das células endoteliais pós-capilares e pela abertura de
canais intracelulares nas próprias células (KHAN; KHAN, 2010).
O aumento da permeabilidade vascular pode ocorrer por diferentes
mecanismos, incluindo a ação de aminas vasoativas (histamina e serotonina),
bradicinina, substância P, fator de ativação plaquetária (PAF) e ativação de
componentes do sistema complemento (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY,
2004). Essas alterações promovem extravasamento de fluídos rico em
proteínas plasmáticas para o tecido, seguido de infiltração celular para o sítio
inflamatório (NAGY et al, 2008). Assim, a vasodilatação, o aumento na
permeabilidade vascular e o extravasamento do exsudato para o interstício
caracterizam os eventos vasculares da inflamação aguda, e juntos são
responsáveis pelo o aparecimento dos sinais cardinais da inflamação como,
calor, eritema e edema (MULLER, 2O13).
1.1.2 Eventos celulares da resposta inflamatória
A reposta inflamatória celular representa um dos principais mecanismos

pelos quais o organismo se defende contra agentes lesivos e repara o tecido
danificado (WARRINGTON et al, 2011). Os leucócitos são as principais células
sanguíneas envolvidas na resposta inflamatória, embora plaquetas e eritrócitos
também participem. Dentre os leucócitos, os neutrófilos, são as primeiras
células a alcançarem o local da inflamação seguido pela migração dos
monócitos que posteriormente se diferenciam em macrófagos. Os mastócitos
residentes também exercem papel importante principalmente pela liberação de
mediadores como citocinas, histamina e serotonina (COLGAN, 2015).
Estes eventos celulares são marcados pelo recrutamento de leucócitos
da corrente sanguínea para o tecido perivascular (diapedese) e este
mecanismo ocorre através de eventos coordenados caracterizados pelo
rolamento dos leucócitos sobre a parede endotelial, adesão firme às células
22
endoteliais e, finalmente, a transmigração para o sítio de injúria (Figura 3)

(MANTOVANI; BONECCHI; LOCATI, 2006; HEADLAND; NORLING, 2015).
Figura 3: Representação esquemática das etapas clássicas da cascata da

diapedese.
A figura ilustra o rolamento de leucócitos mediado por selectinas, ativação, mediada por
quimiocinas, e a adesão mediada por integrinas. A figura também mostra as principais
moléculas envolvidas em cada uma das fases mostradas. ICAM-1 = molécula de adesão
intercelular-1; JAM = molécula de adesão juncional; LFA-1 = antígeno associados à função
linfocitária-1; Mac-1 = antígeno de macrófago; PSGL-1 = ligante da glicoproteína P-selectina-1;
PECAM-1 = molécula de adesão celular endotélio-plaqueta-1; VCAM-1 = molécula de adesão
celular vascular-1; VLA-4 = Antígeno muito tardio-4. Fonte: Adaptado e modificado de Ley et
al., (2007).
Mediadores como citocinas e quimiocinas liberados pelas células

residentes em resposta a estimulação por PAMPs ou DAMPs atuam sobre às
células endoteliais que revestem as vênulas do local da agressão e aumentam
a expressão de moléculas de adesão em sua superfície (E-selectina e P-
selectina) (LEY et al, 2007). Normalmente, em situações fisiológicas os
leucócitos circulam no centro do vaso, no entanto, nos locais de inflamação
alterações na hemodinâmica como a vasodilatação, redução do fluxo
sanguíneo e a presença de ligantes de selectinas nos leucócitos, permitem que
estes se liguem à superfície do endotélio, no entanto essa interação é de baixa
afinidade e é rapidamente rompida pela força de cisalhamento do fluxo
23
sanguíneo, consequentemente os leucócitos desprendem-se rapidamente e

ligam-se novamente, caracterizando assim o rolamento destas células sobre a
superfície do endotélio vascular (DELVES; ROITT, 2000; LANGER;
CHAVAKIS, 2009; MULLER, 2013).
Em adição, a ação de quimiocinas (CXCL8) e citocinas (TNF-α e IL-1β)

sobre a superfície do endotélio induz a expressão de integrinas ICAM 1 e 2
(moléculas de adesão intercelular 1 e 2 ) e VCAM-1 (molécula de adesão
vascular 1) que por sua vez interagem com maior afinidade com seus
respectivos ligantes presentes nos leucócitos, essa interação resulta na firme
fixação e apreensão dessas células ao endotélio (SALLUSTO; BAGGIOLINI,
2008; LANGER; CHAVAKIS, 2009). Por conseguinte, os leucócitos iniciam os
eventos de transmigração paracelular, processo que exige a ruptura transitória
e reversível das proteínas envolvidas nas junções de adesão (JAM), mantendo
unidas entre si as células endoteliais (COUSSENS; WERB, 2002; LUSTER;
ALON; ANDRIAN, 2005; LEY et al., 2007).
O tipo celular a migrar para o tecido varia dependendo da natureza e do
tempo decorrido a partir do início da lesão ou estímulo inflamatório.
Geralmente, na maioria das respostas inflamatórias agudas, os neutrófilos são
o tipo leucocitário predominante nas primeiras horas (LUSTER; ALON;
ANDRIAN, 2005). A ativação destas células leva á síntese e liberação de vários
mediadores pró-inflamatórios como citocinas (IL-1, IL-6 e TNF-α), eicosanóides
(LTB4, PGE2, TXB2), fatores hematopoiéticos (GM-CSF; G-CSF; M-CSF),
além de moléculas efetoras microbicidas (H2O2, NO) (WALLACE et al, 2015;
NAKAMURA et al., 2003). Além disso, fagocitam agentes agressores,
impedindo o crescimento de um eventual microrganismo patogênico, remove
dedritos celulares da área afetada e degrada o tecido necrótico iniciando assim
a reparação tecidual (SERHAN; CHIANG; DALLI, 2015).
Nesse contexto a reparação tecidual é uma etapa crucial para resolução
da inflamação, e estes são processos fortemente regulados por uma série de
mediadores como citocinas, quimiocinas e seus receptores (PERRETTI, 2015).
Além destes, mediadores pró-resolução como as lipoxinas são sintetizadas e,
então, desempenham sua ação anti-inflamatória, assim como atuam impedindo
o recrutamento de mais neutrófilos e macrófagos, que são os principais
24
componentes da resolução e reparo, pela fagocitose dos restos celulares.

Outros eicosanóides como protectinas e resolvinas também têm demonstrado
seu papel na resolução (HEADLAND; NORLING, 2015; GILROY; MAEYER,
2015; COLGAN, 2015).
1.1.3 Papel dos neutrófilos na inflamação aguda
Os neutrófilos são produzidos na medula óssea, pelas células-tronco

pluripotentes, as quais dão origem ás demais células sanguíneas, sua
diferenciação, proliferação e maturação são regulados principalmente por três
fatores de crescimento hematopoiético: GM-CSF (Fator de estimulação de
crescimento de granulócitos e monócitos), G-CSF (Fator de estimulação de
crescimento de granulócitos) e IL-3 (Interleucina 3) (HAMPTON et al, 1998;
OSTUNI, 2016).
Na corrente sanguínea, os neutrófilos constituem cerca de 50 a 70% do
total de leucócitos circulantes, e são recrutados por sinais quimiotáticos de
quimiocinas, citocinas, metaloproteinases da matriz extracelular, produtos dos
microrganismos invasores, entre outros (KOBAYASHI; VOYICH; DELEO,
2003). Ao receber o sinal, estas células circulam na direção do gradiente
quimioatraente que se forma em direção ao sítio inflamatório, onde ativam
sinais que irão desencadear a remoção do gente incitante (DE OLIVEIRA;
ROSOWSKI; HUTTENLOCHER, 2016).
A fagocitose desempenhada pelos neutrófilos é estimulada pela ligação
de seus receptores para opsoninas, Fc de IgG e C3b. O material fagocitado
(microorganismos, células mortas e restos celulares) é destruído por meio da
produção de radicais livres de oxigênio e nitrogênio, e pela atividade de
enzimas lisossomais presentes nestas células (BRINKMANN et al., 2004).
Estas funções desempenhadas pelos neutrófilos requerem a mobilização dos
grânulos dentre eles os grânulos azurofílicos que possuem como principal
constituinte a enzima mieloperoxidase (MPO), a qual é uma proteína catiônica
que pode ser utilizada como indicador da migração de neutrófilos (WALLACE,
2000).
Alem disso, os neutrófilos possuem um sistema enzimático oxidativo,
acoplado a membrana plasmática, conhecido como nicotinamida adenina
25
dinucleótideo fosfato oxidase (NADPH), responsável pelo aumento do

metabolismo oxidativo, também conhecido como explosão respiratória. Neste
sistema, ocorre uma transferência de elétrons do NADPH intracelular para o
oxigênio, reduzindo-o a ânion superóxido (O2-), o qual pode ser rapidamente
convertido a peróxido de hidrogênio e este a radicais hidroxilas, denominados
genericamente de espécies reativas do oxigênio (EROS), estes mecanismos
são importantes para sua ação fagocitica e microbicida, no entanto estes
eventos quando exacerbados estão associados com o dano celular (DALE;
BOXER; LILES, 2008; SILVA et al, 2014).
1.1.4 Mediadores envolvidos nos processos inflamatórios
Mediadores inflamatórios são substâncias oriundas do plasma ou

secretadas por células ativadas, liberadas, concomitantemente ou
sequencialmente no local da lesão. Os de origem plasmática são formados a
partir da ativação de quatro cascatas enzimáticas: sistema de coagulação,
sistema fibrinolítico, sistema das cininas (bradicinina) e sistema complemento
(C3a; C5a; C5b-C9); já os de origem celular, como histamina e serotonina
(mastócitos e plaquetas), prostaglandinas, fator ativador de plaquetas
(leucócitos e mastócitos), leucotrienos e citocinas (macrófagos e linfócitos
ativados) são produzidos da ativação de tais células (MEDZHITOV, 2008;
DAMASCENO et al, 2014). Dentre eles podemos destacar:
Aminas Vasoativas
As aminas vasoativas, histamina e serotonina, são encontradas nos

mastócitos, basófilos e plaquetas, sendo liberadas em resposta a estímulos.
Durante a inflamação, a histamina é liberada a partir da degranulação dos
mastócitos e basófilos e atua nas células do músculo liso vascular e células
endoteliais conduzindo a vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular
(; DIJKSTRA et al 2007; THURMOND; GELFAND; DUNFORD, 2008). Exerce
seus efeitos mediante interação com quatro diferentes receptores da célula-
alvo, H1, H2, H3 e H4. O receptor H1 quando ativado promove a contração da
musculatura lisa de vários órgãos e o aumento da permeabilidade dos capilares
venosos; H2 aumenta a secreção de ácido gástrico e promove relaxamento da
26
musculatura lisa; H3 está envolvido no feedback negativo da síntese de

histamina e H4 medeia quimiotaxia de mastócitos (THURMOND; GELFAND;
DUNFORD, 2008; COURA et al., 2015).
Na microcirculação, a histamina liga-se a seu receptor H1 promovendo
vasodilatação das arteríolas e o aumento da permeabilidade vascular, fator
este que ocorre por meio da contração das células endoteliais e em seguida
pela formação de abertura das junções celulares endoteliais, favorecendo o
extravasamento plasmático. Além disso, também promove a síntese de
prostaciclina (PGI2) e induz a liberação de óxido nítrico (NO) pelo endotélio,
ambos possuem potente atividade vasodilatadora (DE TONI et al, 2015;
KIMURA et al, 2015).
A serotonina ou 5-hidroxitriptamina (5-HT) é o segundo mediador
vasoativo pré-formado, possuindo ações semelhantes às da histamina. Está
presente nas plaquetas, mastócitos e células endoteliais, bem como em
terminais serotoninérgicos centrais, assim como de outros neurotransmissores
é liberada em resposta ao dano tecidual e inflamação (SHAJIB; KHAN, 2015).
Atua na vasoconstrição inicial e juntamente com outros mediadores atua na
vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular (DE TONI et al, 2015).
Bradicinina
As cininas (bradicinina) modulam muitos eventos inflamatórios, incluindo

a vasodilatação, o aumento da permeabilidade vascular, o extravasamento de
plasma, a migração celular, dor e hiperalgesia (CAMPOS; CALIXTO, 1995;
CAMPOS; HENRIQUES; CALIXTO,1997). Além disso, a bradicinina está
associada com a produção secundária de outros mediadores, incluindo
prostanóides (PGE2), citocinas, produtos derivados de mastócitos e óxido
nítrico (NO). Suas ações biológicas se dão mediante ativação de dois
receptores distintos, denominado receptor de bradicinina B1 e B2 (BKB1 e
BKB2). Acredita-se geralmente que BKB2 está envolvido na fase aguda da
resposta inflamatória e dor, ao passo que BKB1 participa na fase crônica da
resposta (YIMAM et al, 2016).
27
Citocinas
As citocinas são pequenos peptídeos ou glicoproteínas que variam de 8

a 30 kDa, produzidas por uma variedade de tipos celulares, e atuam
desempenhando funções efetoras sobre processos imunoinflamatórios, bem
como sobre a regulação das respostas imunológicas, sendo, portanto, vitais
para a defesa do hospedeiro. Além disso, também exercem papel na
manutenção de processos fisiológicos e metabólicos normais como
diferenciação, sobrevivência, crescimento e metabolismo celular (COMMINS,
BORISH, STEINKE, 2010; DE OLIVEIRA et al. 2011). As citocinas não são
armazenadas como moléculas pré-formadas, e podem atuar sobre as células
que as produzem (efeito autócrino) de forma parácrina (em células vizinhas)
ou, em alguns casos, em células distantes (ação endócrina) (ZHANG; AN,
2007; DE OLIVEIRA et al. 2011).
As citocinas podem ser classificadas em interleucinas (IL), fatores de
necrose tumoral (TNF), interferons (IFN), fator estimulador de colónias, fator de
crescimento transformador e quimiocinas, mas também podem ser
classificadas conforme sua atividade biológica, a exemplo de exercerem
atividade pró-inflamatória (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α e TNF-β) e/ou anti-
inflamatória (IL-4, IL-10, IL-13) (OPAL; DEPALO, 2000; DINARELLO, 2007).
Estas moléculas podem exercer seus efeitos através de duas vias de
sinalização principais, pela ativação de receptores tirosina quinase que ativam
a via janus quinase (JAK-STAT) ou pela ativação da via de sinalização do fator
de transcrição NF-kB (LEONARD; LIN, 2000).
Dentre as citocinas mediadoras da inflamação aguda, duas ocupam
papel de destaque, a IL-1 (α e β) e o TNF-α, por desempenharem potentes
ações pró-inflamatórias e coordenar a atividade de muitas outras células
(SCHETT, 2013; WYNN, 2015). A interleucina-1 α e β são citocinas pró-
inflamatórias que exercem efeitos pleiotrópicos sobre uma variedade de células
e desempenham um papel chave em distúrbios autoimunes e desordens
inflamatórias agudas e crônicas, ambas atuam nos mesmos receptores e
desempenham ações biológica similares, no entanto a IL-1β é a principal forma
ativa biologicamente secretada (WYNN, 2015).
28
A transcrição de IL-1β é induzida pelas vias sinalização TLR e NOD que

ativam o fator de transcrição NF-kB. Suas ações são mediadas via receptor de
IL-1 tipo I expresso em muitos tipos celulares, incluindo leucócitos, células
endoteliais e células epiteliais. Uma das mais importantes atividades biológicas
da IL-1 é a sua capacidade para ativar linfócitos T através do aumento da
produção de IL-2 e a expressão de receptores de IL-2, além disso, IL-1 também
estimula a adesão celular endotelial de leucócitos através da regulação da
expressão de ICAM-1, VCAM-1 e E-selectina (CHURCH; COOK;
MCDERMOTT, 2008; DINARELLO; SIMON; VAN DER MEER, 2012).
O TNF-α é produzido por diferentes tipos de células, incluindo
macrófagos, monócitos, células T, células musculares lisas, adipócitos, e
fibroblastos, suas respostas biológicas são mediadas através de dois
receptores estruturalmente distintos: receptor do fator de necrose tumoral tipo I
(TNF-RI) e tipo II (TNF-RII), que estão presentes na membrana de todos os
tipos celulares exceto eritrócitos (POPA et al, 2007). A ativação destes
receptores pode recrutar proteínas adaptadoras que por sua vez promovem a
ativação das vias NF-κB e JNK e consequentemente a sobrevivência da célula
(WAJANT; PFIZENMAIER; SCHEURICH, 2003; POPA et al, 2007).
Alternativamente, pode recrutar outras proteínas adaptadoras (FADD) e
procaspase-8, que é posteriormente ativada para iniciar a apoptose.
(AGGARWAL, 2003; LIU, 2005; BRENNER; BLASER; MAK; 2015).
Óxido Nítrico
O óxido nítrico (NO) é uma importante molécula mediadora de

sinalização intracelular envolvida na regulação de diversos mecanismos
fisiológicos e fisiopatológicos em sistemas cardiovascular, nervoso e
imunológico (AKTAN, 2004). Em condições de injúria o NO é formato a partir
da L-arginina pela ação da enzima NO sintase induzível (iNOS), de forma
independe de Ca2+, a expressão desta enzima é mediada pela ativação de
macrófagos ou por ação de citocinas como o TNF-α, que resulta na ativação
das vias de sinalização do fator de transcrição NF-kB e JAK-STAT. Nessas
circunstâncias a indução de iNOS resulta na capacidade para formar
quantidades muito maiores de NO quando comparada a atividade das NOS
29
constitutiva, e esta quantidade aumentada pode resultar em efeitos

fisiopatológicos (WALLACE, 2005).
Em concentrações fisiológicas o NO inibe a agregação de plaquetas pró-
inflamatórias, a adesão de leucócitos mediada pelas integrinas, expressão de
genes pró-inflamatórios, fatores que controlam a inflamação vascular e lesão
oxidativa. Entretanto, em altas concentrações o NO possui atividade de radical
.
livre, devido à produção de metabólitos oxidantes (ONOO-, peroxinitrito, NO ) e
outros compostos oxidantes reativos na presença de radicais superóxido ou

peroxidases, tornando deletérios os efeitos protetores do NO
(BLOODSWORTH; O'DONNELL; FREEMAN, 2000). Estes radicais livres
formados são altamente reativos e podem interagir com as proteínas, lípidios,
carboidratos, e com o DNA podendo conduzir a danos oxidativos nestes
tecidos (AKTAN, 2004). Além disso, os metabólitos oxidantes do NO também
podem inibir a atividade de enzimas antioxidantes, como a glutationa
peroxidase exacerbando ainda mais o dano celular (HAN et al, 2001).
Metabólitos do Ácido Araquidônico (AA)
Os eicosanoides são metabólitos lipídicos derivados do ácido

araquidônico (AA) e ácidos graxos polinsaturados, que atuam regulando muitos
processos homeostáticos e inflamatórios ligados a várias doenças. O ácido
araquidônico (AA) é um ácido graxo insaturado de 20 carbonos contendo
quatro ligações duplas em estrutura química, sendo liberado a partir dos
fosfolipídios de membrana por meio de uma reação catalisada pela enzima
fosfolipase A2 (PLA2). O ácido araquidônico (AA) livre pode ser metabolizado
por duas vias enzimáticas distintas como as cicloxigenases, gerando os
prostanóides (prostaglandinas, prostaciclinas e tromboxanas), as lipoxigenase,
gerando os leucotrienos e as lipoxinas (DENNIS; NORRIS, 2015; CREAN;
GODSON, 2015).
As isoformas da enzima cicloxigenase (COX): COX-1 e COX-2, são
encontradas nas membranas do retículo endoplasmático e na membrana
nuclear, sendo que a COX-1 está presente na maioria das células e sua
expressão é constitutiva, sendo responsável pela síntese fisiológica de
prostanóides, já a COX-2 tem sua expressão induzida por estímulos
30
inflamatórios e apresenta cerca de 60% de homologia com a COX-1, sendo

expressa constitutivamente apenas no sistema nervoso central e nos
glomérulos renais (WILLIAMS; MANN; DUBOIS, 1999; BOTTING, 2006
RICCIOTTI; FITZGERALD, 2011).
Dentre os eicosanóides, as PGs têm funções importantes como
manutenção da integridade do epitélio das mucosas, e das funções
cardiovascular e renal. Sua expressão pode ser induzida por citocinas como a
IL-1. Dentre as PGs, a PGE2 ocupa papel importante nas respostas
inflamatórias, esta atua sobre quatro tipos do receptor de PGE, EP1, EP2, EP3
e EP4, todos os quais são acoplados com a sinalização da proteína G e assim
desempenha um papel crucial em vários eventos biológicos, tais como febre,
proteção da mucosa gástrica, hipersensibilidade a dor, função renal e resposta
anti-alérgica via EP3. Como mediadores da inflamação atuam promovendo a
vasodilatação local, na atração e ativação de neutrófilos, macrófagos, e
mastócitos em estágios iniciais de inflamação (PARK; PILLINGER;
ABRAMSON, 2006; RICCIOTTI; FITZGERALD, 2011).
1.2 FÁRMACOS ANTI-INFLAMATÓRIOS
Existem duas grandes classes de fármacos que no geral são os mais

prescritos para o tratamento de desordens inflamatórias: os glicocorticoides e
os anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs). Os glicocorticoides são
amplamente utilizados para a supressão de eventos pró-inflamatórios
envolvidos na fisiopatologia de doenças inflamatórias, tais como asma, artrite,
doença inflamatória intestinal e doenças auto-imunes, todos os quais estão
associados com um aumento da expressão de genes inflamatórios (BARNES,
1998).
31
Figura 4: Representação esquemática do mecanismo de ação dos

glicocorticoides.
A figura ilustra o mecanismo de ação dos glicocorticoides. Fonte: autoria própria
O mecanismo molecular de ação dos glicocorticoides envolve sua ligação

a receptores de glicocorticoides presentes no citoplasma, que, em seguida,
dimerizam e migram para o núcleo, onde se ligam a elementos de resposta a
glicocorticoide (GRE) no DNA, resultando em aumento da transcrição de genes
responsivos a glicocorticoides, podendo assim, aumentar a transcrição de
genes que codificam proteínas anti-inflamatórias, incluindo a lipocortina-1 e a
IL-10, e inibição dos fatores de transcrição NF-kB e AP-1 (Figura 4) (ZHOU;
CIDLOWSKI, 2005; COUTINHO; CHAPMAN, 2011). No entanto, o uso a longo
prazo de glicocorticoides está associado ao desenvolvimento de efeitos
secundários graves, incluindo osteoporose, doenças metabólicas e risco
aumentado de doenças cardiovasculares (SCHÄCKE; DÖCKE; ASADULLA,
2002; HENGGE et al, 2006).
Os anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) são amplamente prescritos
para desordens inflamatórias, devido suas ações analgésicas e anti-
inflamatórias. Estes medicamentos atuam interferindo com a síntese das
32
prostaglandinas através da inibição da síntese de COX-1 e/ou COX-2 (Figura

5) (SILVA et al 2015; VAN ESCH, 2013).
Figura 5: Representação esquemática do mecanismo de ação dos AINEs.
A figura ilustra o mecanismo de ação dos anti-inflamatórios não esteroides (AINEs), que atuam
por meio da inibição das enzimas ciclooxigenases (COX1 e/ou 2) interferindo com a biossíntese
das prostaglandinas. A figura ainda mostra a ação dos glicocorticoides sobre a fosfolipase A2
inibindo a cascata do ácido araquidônico (AA).
O uso destes fármacos também pode levar ao aparecimento de efeitos

adversos importantes, principalmente no trato gastrintestinal, ocasionando
hemorragias e distúrbios renais (VAN ESCH, 2013; SILVA et al 2015). Estes
efeitos adversos em sua maioria estão associados com a depleção de
prostaglandinas derivados de COX-1 (SOSTRES, 2010; VONKEMAN; VAN DE
LAAR, 2010).
1.3 PLANTAS MEDICINAIS
Ao longo dos séculos os seres humanos têm contado com a natureza

para atender a suas necessidades básicas. Produtos naturais e seus derivados
têm sido historicamente uma fonte inestimável de agentes terapêuticos para o
tratamento de um amplo espectro de doenças (CRAGG; NEWMAN, 2013). Os
primeiros registros sobre o uso plantas medicinais são datados de cerca de
2.600 a.c e foram escritos em tábuas de argila em escrita cuneiforme na
33
Mesopotâmia. O documento trata sobre o uso de aproximadamente mil

substâncias derivadas de plantas. Dentre elas, estão os óleos de espécies de
Cedrus (cedro) e Cupressus sempervirens (cipreste), Glycyrrhiza glabra
(alcaçuz), espécies de Commiphora (mirra) e Papaver somniferum (sumo de
papoula), os quais ainda hoje são usados para o tratamento de doenças que
vão de tosses e resfriados a infecções parasitárias e inflamação (GURIB-
FAKIM, 2006; CRAGG; NEWMAN, 2013).
A Medicina egípcia data de cerca de 2.900 a. c, mas o registro mais
conhecido é o "Papiro de Ebers" que data de 1.500 a. c, documentando mais
de 700 drogas, principalmente de origem vegetal. A Medicina chinesa tem sido
documentada ao longo dos séculos, sendo o primeiro registro datado de cerca
de 1.100 a. c, e ao longo da história vários estudos documentaram centenas de
substâncias ativas derivadas de plantas (CRAGG e NEWMAN, 2013).
Atualmente estima-se que cerca de 30% dos medicamentos terapêuticos
disponíveis são derivados a partir de fontes naturais. (KOEHN; CARTER, 2005;
MISHRA; TIWARI, 2011; CRAGG; NEWMAN, 2013; DUTRA et al.,2016).
O Brasil tem a maior biodiversidade no mundo, que compreende mais de
45.000 espécies de plantas superiores (20-22% do total existente no planeta)
(DUTRA et al, 2016). A população brasileira tem uma longa tradição no uso de
plantas medicinais para o tratamento de diferentes doenças agudas e crônicas,
influenciada pela cultura indígena, africana e europeia. (DUTRA et al, 2016).
Dessa forma, as notáveis diversidades químicas dos produtos naturais os
tornam moléculas favoráveis para a descoberta de novos medicamentos
(KOEHN; CARTER, 2005; EKSTEIN; SCHACHTER, 2010; SCOTTI et al,
2010).
Através de estudos com produtos naturais, os cientistas puderam
compreender fenômenos complexos relacionados à biologia celular e molecular
e à eletrofisiologia, permitindo que enzimas, receptores, canais iônicos e outras
estruturas biológicas fossem identificados, isolados e clonados. Isso
possibilitou à indústria farmacêutica desenhar drogas dotadas de maior
seletividade e também mais eficazes contra várias patologias de maior
complexidade. Além disso, os produtos naturais são usados como matéria-
prima na síntese de moléculas complexas de interesse farmacológico, assim as
34
maiores indústrias farmacêuticas mundiais possuem programas de pesquisa na

área de produtos naturais (SHU, 1998; CALIXTO, 2003).
Em 2015, as doenças inflamatórias crônicas principais (doenças
cardiovasculares, câncer, doenças respiratórias crônicas, doenças autoimunes
e diabetes) causaram 300 milhões de mortes em todo o mundo (Organização
Mundial de Saúde - OMS, 2015) (DUTRA et al., 2016). Produtos naturais e
seus derivados são, portanto, muito utilizados para o tratamento de diversas
patologias, dentre elas para o alívio da dor e inflamação. Desde os tempos
antigos, muitas pessoas que sofriam de disfunções inflamatórias eram tratadas
com fitoquímicos, o que levou ao descobrimento do primeiro fármaco anti-
inflamatório e analgésico denominado Aspirina®. Sua descoberta foi baseada
no conhecimento das propriedades analgésicas e antipiréticas das cascas de
espécies de salgueiro (Salix spp) há 400 a.c pelos gregos e romanos. Assim,
em 1899, o ácido acetilsalicílico (aspirina) foi introduzido como o primeiro
fármaco potente para tratar doenças reumáticas (VANE, 1971; JÚNIOR;
BOLZANI, 2006).
Existem, todavia, problemas que dificultam o aproveitamento da
biodiversidade para o desenvolvimento de novos medicamentos. O que inclui:
falta de leis específicas para o acesso a biodiversidade; grande complexidade
das moléculas isoladas a partir de produtos naturais, que às vezes dificulta sua
síntese; o tempo necessário para o descobrimento de moléculas líderes às
vezes é longo; a descoberta pode ser dispendiosa; poucas bibliotecas de
compostos naturais estão disponíveis; existem poucas informações com
relação à estrutura-atividade desses compostos; frequentemente, moléculas já
conhecidas com pouco interesse, são isoladas de produtos naturais; os
químicos sintéticos muitas vezes são relutantes em trabalhar com produtos
naturais (STROHL, 2000; CALIXTO; 2003; HARVEY; EDRADA-EBEL; QUINN,
2015).
Apesar dos problemas relatados e do grande desenvolvimento de
métodos para a síntese de produtos farmacêuticos, as plantas medicinais ainda
representam importantes fontes de novas identidades moleculares,
principalmente devido ao fato de que as plantas podem sintetizar e produzir
constituintes que são difíceis de obter, através de síntese química. Os
compostos obtidos a partir de fontes naturais também podem servir como
35
protótipos para a síntese de novos medicamentos com atividades biológicas e

terapêuticas semelhantes, ou ser ligeiramente modificado de modo a torná-los
mais eficazes ou menos tóxicos (HARVEY, 2000; NEWMAN; CRAGG, 2012).
Dessa forma, as plantas medicinais têm propiciado avanços importantes
para a terapêutica de várias doenças como também tem fornecido ferramentas
extremamente úteis para o estudo teórico da fisiologia e da farmacologia,
tornando-se alvo das indústrias farmacêuticas e institutos de pesquisas na
busca de novas drogas e compostos com atividade terapêutica mais eficaz e
com menos efeitos adversos. (SILVA et al, 2015; CALIXTO, 2005).
1.4 O GÊNERO Thuja
O gênero Thuja pertence à família Cupressaceae e abrange cinco

espécies: Thuja koraiensis, Thuja plicata, Thuja standishii, Thuja sutchuenensis
e Thuja occidentalis. Esta última é vulgarmente conhecida como árvore da vida
ou cedro branco. A Thuja occidentalis é endêmica no leste da América do Norte
e, tanto no Brasil quanto na Europa é cultivada como um arbusto ornamental
(STANGERLIN et al, 2008; ALVES et al, 2014).
A planta foi identificada pela primeira vez como um remédio por índios
nativos no Canadá durante uma expedição do século XVI. As árvores são
caracteristicamente coníferas e monóicas, medindo entre 12 e 21 metros de
altura, tem uma cúpula em formato piramidal com ramificações monopodial
para o tronco, que é ereto e com um córtex marrom-avermelhado e galhos
ramificados e relativamente grandes. Os ramos são achatados, curtos e
horizontais. Além disso, há uma extremidade ascendente e coberta com folhas
pequenas e rígidas, que se sobrepõem uma a outra (Figura 6). As folhas são
em forma oval, persistentes, verdes, com escalas cruzando lados opostos e
extremidades afiladas no sentido de uma superfície dorsal convexa (ALVES et
al, 2014).
36
Figura 6: Thuja occidentalis Linn.
Fonte: Tree Seed Online Ltd, 2016.
1.4.1 T. occidentalis L. composição fitoquímica e atividades

farmacológicas
Na medicina popular, T. occidentalis L., é utilizada para tratar bronquite,

enurese, cistite, psoríase, carcinomas uterinos, amenorreia e reumatismo
(CHANG et al, 2000). O extrato desta planta também tem mostrado atividade
antioxidante e antidiarreica (NAM, KANG, 2005; (LOKESH et al., 2007; DUBEY;
BATRA 2009, DAS; RANI, 2013). Outros estudos sobre T. occidentalis L.
revelaram que o extrato etanólico da planta possui atividade antibacteriana e
anti-proliferativa (DAS; RANI, 2013), além de atividades anti-aterosclerótica,
anti-diabética, hepatoprotetora, inseticida e radioprotetora (ALFARO et al,
1981; HWANG et al., 1985; DUBEY; BATRA, 2009; JAHAN et al., 2010;
SUNILA; HAMSA, 2011; BISWAS et al, 2011; BRIJESH et al, 2012). As
atividades farmacológicas de T. occidentalis L. devem-se a presença de uma
37
série de componentes químicos na planta, muitos deles ainda não

identificados.
Dentre os estudos que citam a composição fitoquímica geral da T.
occidentalis L., AKKOL et al (2015) identificaram 25 compostos no óleo da
planta. Dentre esses, os constituintes principais foram: α e β-tujona, terpineno-
4-ol, sabineno, mirceno, limoneno, bem como os diterpenos beyereno e
rimueno. Além disso, outros estudos evidenciaram a presença de saponinas,
fenóis, taninos, aminas, mucilagens, compostos lactônicos, carotenóides,
cumarinas (p-cumárico e ácido umbeliferona), tânico, proteínas e sais minerais.
Somado a isso, os flavonoides também se encontram presentes, sendo
descritos dentre os compostos a (+/-)-catequina, (-)-galocatequina,
mearnsitrina, miricetina, quercetina, quercitrina, canferol e canferol-3-O-α-
ramnosídeo, além dos biflavonóides bilobetina e amentoflavona, revisado por
Naser et al., (2005).
De acordo com a literatura, o monoterpeno tujona, extraído do óleo
essencial da planta, é o maior constituinte químico encontrado nas espécies de
Thuja (CHANG et al, 2000; TSIRI et al, 2009; SULEA et al, 2009). Neste
sentido, foi demonstrado recentemente que este composto apresenta efeito
promissor no tratamento da síndrome do ovário policístico, sem induzir a
osteoporose (AKKOL et al, 2015).
Além disso, outros estudos fitoquímicos demonstraram que a T.
occidentalis L. contêm terpenóides, esteroides e polissacarídeos (LOKESH et
al., 2007; DUBEY; BATRA, 2009), sendo que estes compostos apresentam
benefícios para o tratamento de doenças ginecológicas exercendo efeitos
contra distúrbios da menstruação, bem como é capaz de prevenir a dor
abdominal, cãibras, náuseas e a fadiga associada com períodos menstruais.
Eles também ajudam a regular o ciclo menstrual e mantêm os órgãos
reprodutivos femininos saudáveis, promovendo o equilíbrio hormonal com a
secreção de certos hormônios, como o estrogênio e a progesterona (LOKESH
et al., 2007; DHIMAN et al, 2012).
Quanto à presença de triterpenos e esteróis, FIGUEIREDO et al. (2014)
identificaram o componente β-sitosterol na espécie de T. occidentalis L. A
presença deste metabólito nas espécies da planta foi anteriormente descrita
por CASTELLON et al, 2000, que analisou tinturas mãe comercializadas em
38
Cuba. Estudos mostram que o β-sitosterol tem propriedades anti-inflamatórias

(VALERIO et al, 2011; LEE et al, 2012), e que esses efeitos anti-inflamatórios
podem ser devido a interrupção da sinalização de NF-kB (LEE et al, 2012; SHI
et al, 2015).
Também foi demonstrado que uma fração de cloreto de metileno da
espécie de T. occidentalis L. inibe potencialmente os biomarcadores
relacionados com a inflamação in vitro e in vivo, podendo ser um candidato
potencial para o tratamento de doenças inflamatórias (KIM et al, 2011). Estudos
também mostram que a espécie T. occidentalis L. pode aumentar a proliferação
de células do baço, bem como promover o aumento de TNF-α, IL-6 e IL-1,
apresentando também atividade protetora contra a toxicidade induzida por
radiação (BELAL, et al, 2005).
Nesta perspectiva, alguns pesquisadores têm mostrado a associação
entre a atividade imunoestimulante e a ação antitumoral das partes aéreas de
T. occidentalis L. (SUNILA et al, 2011). Além disso, uma fração do
polissacarídeo de T. occidentalis L. induziu a proliferação de linfócitos T CD4+
no sangue periférico humano (OFFERGELD et al, 1992), como também
demonstrou evidências para a atividade antiviral (NASER et al, 2005). Assim,
esses estudos geram expectativas de o extrato aquoso e a fração
polissacarídica extraídos da espécie T. occidentalis L. possa apresentar
atividade anti-inflamatória.
39
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
• Investigar a atividade anti-inflamatória do extrato aquoso (EA) e da

fração polissacarídica (PLS) da Thuja occidentalis Linn. (Cupressaceae) em
modelos experimentais de inflamação.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Determinar a atividade anti-inflamatória do extrato aquoso e da fração

polissacarídica da T. occidentalis L. em modelo de edema de pata em
camundongos induzido por carragenina;
• Avaliar o efeito do extrato aquoso e da fração polissacarídica da T.

occidentalis L. sobre as alterações histológicas e imuno-histoquímica no edema
de pata induzido por carragenina.
• Avaliar o efeito do extrato aquoso e da fração polissacarídica da T.

occidentalis L. em modelo de edema de pata em camundongos induzido por
diferentes mediadores inflamatórios (Sulfato de dextrana, Bradicinina,
Histamina, Serotonina, Composto 48/80 e PGE2);
• Averiguar a ação do extrato aquoso e da fração polissacarídica da T.

occidentalis L. sobre a migração de neutrófilos para o peritônio induzida por
carragenina em camundongos;
• Investigar o potencial do extrato aquoso e da fração polissacarídica da T.

occidentalis L. sobre a atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) do líquido
peritoneal;
• Determinar o potencial do extrato aquoso e da fração polissacarídica da

T. occidentalis L. sobre os níveis das citocinas TNF-α e IL-6.
40
• Determinar o potencial do extrato aquoso e da fração polissacarídica da

T. occidentalis L. sobre os níveis de glutationa (GSH) e malondialdeído (MDA)
no líquido peritoneal.
• Investigar o potencial do extrato aquoso e da fração polissacarídica da T.

occidentalis L. sobre as concentrações de nitrito no líquido peritoneal.
• Averiguar a ação do extrato aquoso e da fração polissacarídica da T.

occidentalis L. sobre a permeabilidade vascular em camundongos;
• Avaliar o potencial do extrato aquoso e da fração polissacarídica da T.

occidentalis L. sobre a toxicidade gástrica em camundongos.
41
3. METODOLOGIA
3.1 OBTENÇÃO DO EXTRATO E DA FRAÇÃO POLISSACARÍDICA DE T.

occidentalis L.
Partes aéreas de T. occidentalis L. foram coletadas de mudas cultivadas

no município do Cabo de Santo Augustinho - PE (8º29’86,07‖S e
35º06’45,29‖W). A identificação da espécie foi realizada pela pesquisadora Dra.
Rita de Cássia Araújo Pereira e a exsicata depositada no Herbário Instituto
Agronômico de Pernambuco (IPA), sob o nº 87.752. O material vegetal
coletado foi lavado com água purificada e aspergido com álcool a 60-80 %
(v/v). Em seguida, foi seco em estufa de ar circulante por 80-90 h à
temperatura de 30-50 ºC. Após secagem, o material foi pulverizado em moinho
de facas, acondicionado em recipiente de vidro vedado e mantido em ausência
de luz.
A solução extrativa de T. occidentalis L. foi obtida através de extração
aquosa sob aquecimento, em banho-maria a 85-95°C, empregando-se uma
proporção de 2,0-5,0 g de droga vegetal para cada 20-40 mL de água
destilada, durante 2-5 h. Em seguida, a solução extrativa foi resfriada à
temperatura ambiente e filtrada em algodão. A obtenção do extrato seco
realizou-se através da secagem da solução extrativa, anteriormente descrita,
que foi congelada em ultrafreezer a 85-95°C por 12-36 h, e posteriormente
liofilizada sob pressão de 20-30 µmm de Hg; vácuo 215-225 Vca. por 90-100 h.
O produto obtido foi acondicionado em frascos-ampola hermeticamente
fechado e armazenados em dessecador de vidro sob vácuo.
A fração polissacarídica de T. occidentalis L. foi obtida a partir da
solução extrativa anteriormente descrita, empregando-se o método de
precipitação com etanol, conforme o seguinte procedimento: transferiu-se uma
alíquota de 1-3 mL da solução extrativa para tubos de ensaio contendo 0,20-
0,30 mL de ácido tricloroacético (TCA) 10% (v/v). As amostras foram
centrifugadas a 3000-5000 rpm, durante 3-6 min para remoção de interferentes
proteicos por precipitação, e posterior tratamento do sobrenadante com etanol
absoluto, na proporção 1:3, para precipitação dos polissacarídeos. Estes foram
obtidos após centrifugação a 3000-5000 rpm, durante 10-20 min.
42
Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e a fração de polissacarídeos

ressuspendida em 5-15 mL de água destilada para ser transferida ao
congelamento em ultrafreezer a -85-95°C por 12-36 h, e posteriormente
liofilizada sob pressão de 20-30 µmm de Hg; vácuo 215-225 Vca. por 90-100 h.
O produto foi acondicionado em frasco-ampola hermeticamente fechados e
armazenados em dessecador de vidro sob vácuo.
3.2 DROGAS E REAGENTES
λ-carragenina, indometacina, bradicinina, serotonina, composto 48/80,

sulfato de dextran, histamina, prostaglandina E2 (PGE2), e captopril, foram
adquiridos da Sigma Chemical (St. Louis, MO, EUA). Heparina foi fornecida
pela Merck, São Paulo, Brasil. Todos os fármacos foram dissolvidos em 0,9%
(w/v) de NaCl (salina). Todos os outros produtos químicos eram de grau
analítico e foram obtidos a partir de fornecedores comerciais padrão.
3.3 ANIMAIS
Camundongos Swiss machos e/ou fêmeas foram obtidos da

Universidade Federal do Piauí- UFPI, pesando entre 26 a 30 g. Os animais
foram alojados em gaiolas, em ambiente com temperatura controlada (12 h de
luz/12 h no escuro) com livre acesso à água e dieta padrão. Após os
procedimentos experimentais, os animais foram eutanasiados com sobredose
de tiopental sódico (100 mg/kg, i.p.). Tratamentos, procedimentos cirúrgicos e
protocolos experimentais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do
Instituto Nacional de Saúde, (Bethesda, MD, EUA) e foram aprovados pelo
Comitê de Ética da Universidade Federal do Piauí, Brasil (protocolo nº 068/14)
(ver anexo 1). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos
animais.
43
3.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
A atividade anti-inflamatória de EA e PLS foi analisada em modelos de

inflamação aguda, incluindo edema de para induzido por carragenina, neste
modelo amostras da pata foram recolhidas para anásise histológica e imuno-
histoquímica. Também foi modulado edema por diferentes agentes com ação
pró-inflamatória como o composto 48/80, sulfato de dextrana, histamina,
serotonina, bradicinina e a prostaglandina E2. Em outros experimentos, no
modelo de peritonite induzida por carragenina foi analisada a cotagem total e
diferencial de leucócitos, a dosagem dos níveis enzima MPO, os níveis de
citocinas TNF-α e IL-6, as concentrações de MDA, GSH e nitrito no exsudato
peritoneal. Além disso, a permeabilidade vascular também foi avaliada por
meio da análise do extravasamento do corante azul de Evans para a cavidade
peritoneal. Por fim, foi analisada a toxicidade de EA e PLS em altas doses
sobre o epitélio gástrico, o esquema está ilustrado na figura 7.
Figura 7: Representação esquemática do delineamento experimental realizado.
44
45
3.5 EFEITO DO EA E PLS SOBRE O EDEMA DA PATA INDUZIDO POR

CARRAGENINA
Inicialmente, os camundongos foram pré-tratados com EA e PLS nas

doses de (3, 10 e 30 mg/kg i.p) ou indometacina (10 mg/kg i.p). Após 30
minutos, o edema foi induzido pela administração de 50 μl de uma suspensão
de carragenina (500 μg/pata) na pata traseira direita, a qual foi diluída em
solução salina estéril a 0,9%. O grupo controle não tratado recebeu apenas 50
μl de salina estéril (0,9 %). O volume da pata foi medido antes (V0), e após 1,
2, 3 e 4 horas do tratamento com carragenina (Vt), usando um pletismômetro
(Panlab, Barcelona, Espanha) como descrito por CHAVES et al (2013). Na 4ª
hora, amostras da pata foram removidas e fixadas em formalina a 10% para
posterior análise histopatológica. Além disso, o edema foi mensurado 24, 48,
72 e 96 horas após a administração de carragenina (500 μg/pata) (POSADAS
et al., 2004). Os dados foram expressos como média ± S.E.M de 5-6 animais
por grupo. As doses selecionadas de EA e PLS para esta pesquisa foram
baseadas em estudos prévios realizado pelo grupo de pesquisa do Laboratório
de Fisiofarmacologia Experimental da UFPI (LAFFEX) da UFPI.
3.6 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA
Para avaliação histológica, as amostras da pata foram fixadas em

solução de formalina 10% e mantidas durante 24 horas. Após a fixação, as
amostras foram transferidas para uma solução de álcool 70%. O material foi,
em seguida, embebido em parafina e seccionado. Secções de 4 mm de
espessura foram desparafinizadas, corados com hematoxilina e eosina (H & E)
e, em seguida analisada sob um microscópio de luz por um patologista
experiente, sem conhecimento dos tratamentos previamente descritos.
3.7 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA PARA COX-2 E iNOS
Para os ensaios de imuno-histoquímica, o método de estreptavidina-

biotina-peroxidase foi utilizado (Hsu e Raine, 1981). Três camundongos de
cada grupo foram tratados com 0,9% de solução salina estéril, AE e PLS na
46
dose de (3 mg/kg, ip) ou indometacina (10 mg/kg) e, 60 minutos mais tarde,

com uma injecção intraplantar de carragenina (protocolo previamente descrito).
Quando necessário, um grupo sem tratamento foi incluído (controle normal, ou
seja, a pata contralateral). Três horas mais tarde, os animais foram
eutanasiados e secções da região plantar de 5 mm da pata traseira foram
imersos em 10% de formol tamponado durante 48 h, seguido pela imersão em
uma solução de álcool a 70%. As secções foram então desparafinados,
hidratado em xilol e etanol, e imersos em tampão citrato 0,1 M (pH 6) com
menos de 18 min de aquecimento micro-ondas, para a recuperação de
antígeno. Após arrefecimento à temperatura ambiente, durante 20 min, as
secções foram lavadas com uma solução tamponada com fosfato, seguida de
15 minutos de bloqueio da peroxidase endógena, com uma solução de H 2O2 a
3%. As secções foram incubadas durante a noite (4°C) com os anticorpos
primários (anti-iNOS e anti-COX-2) diluída em PBS, de acordo com as
instruções dos fabricantes. No dia seguinte, as secções foram lavadas em PBS
e incubadas durante 30 min com o anticorpo secundário de coelho biotinilado
(anti-IgG), igualmente diluído em PBS (diluição a 1:200). Após lavagem em
PBS, as secções foram incubadas durante 30 minutos com o complexo
peroxidase de estreptoavidina conjugada (complexo ABC Vectastain®, Vector
Laboratories, Burlingame, CA, EUA). Depois de mais uma lavagem com PBS,
as secções foram coradas com 3,3'diaminobenzidine-peróxido (DAB)
cromophore, contra-coradas com hematoxilina Mayer, desidratadas e
montadas em lâminas de microscópio para análise, e os dados foram
quantificados semi (como a densidade óptica relativa) com o programa Image J
(NIH, EUA).
3.8 EFEITO DE EA E PLS SOBRE EDEMA DA PATA INDUZIDO POR

DIFERENTES AGENTES INFLAMATÓRIOS
Para induzir edema, os animais foram administrados com injeções de 50

μl de composto 48/80 (12 μg/pata), sulfato de dextran (DEX; 500 μg/pata),
serotonina (5-HT; 1% p/v), histamina (HIST; 100 μg/pata) bradicinina (BK; 6.0
nmol/pata), ou prostaglandina E2 e (PGE2; 3.0 nmol/pata) na pata traseira
direita (SILVA et al, 2015). A pata contralateral recebeu 50 μl de solução salina
47
estéril (0,9%) que serviu como controle sem tratamento. No experimento com
bradicinina, os animais foram pré-tratados com captopril (5 mg/kg, i.p.) 1 hora
antes da indução de bradicinina para evitar sua degradação (SILVA et al,
2015). EA e PLS na dose de (3.0 mg/kg) e indometacina na dose de (10 mg/kg,
droga de referência) foram administradas intraperitonealmente 30 minutos
antes da injeção intraplantar destes agentes inflamatórios. O volume da pata
direita foi medida antes (V0; tempo zero) a 30, 60, 90 e 120 min após estímulos
(Vt). Os dados foram expressos como média ± S.E.M de 5-6 animais por grupo.
3.9 PERITONITE INDUZIDA POR CARRAGENINA
Para a determinação da migração de neutrófilos para a cavidade

peritoneal, foi administrado intraperitonealmente salina (0,9% i.p), indometacina
(10 mg/kg i.p) ou EA e PLS na dose de (3.0 mg/kg, i.p.). Trinta minutos depois,
os animais foram tratados com carragenina (250 ul; 500 ug/cavidade). Os
animais foram eutanasiados 4 horas mais tarde e a cavidade peritoneal foi
lavada com 1,5 ml de fosfato heparinizado de salina tamponada (PBS) para a
colheita peritoneal de células. Os volumes recuperados foram semelhantes em
todos os grupos experimentais e eram equivalentes a 95% do volume injetado.
As Contagens de células totais foram realizadas em uma câmara de Neubauer,
e as contagens de células diferenciais (100 células total) foram realizadas em
lâminas citocentrífuga coradas com hematoxilina e eosina (H & E). Os
resultados foram apresentados como o número de neutrófilos por mililitro de
exsudato peritoneal. Alíquotas de exsudatos peritoneais foram colhidas para
análise da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO), dos níveis de citocinas
TNF-α e IL-6, dos níveis de glutationa (GSH), malondialdeído (MDA) e as
concentraçõe de nitrito (NO2-). Os dados foram expressos como média ± S.E.M
de 5-6 animais por grupo.
3.10 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA MIELOPEROXIDASE (MPO)
O ensaio da atividade da enzima MPO foi baseado no método de

BRADLEY et al., (1982). Foram centrifugados 400 μl de exsudato peritoneal a
40000 x g durante 7 minutos a 4°C. Depois, 10 µl do sobrenadante foram
48
recolhidos e a atividade da MPO determinada por medição da alteração na

absorbância a 450 nm, utilizando o-edihydrochloride dianisidin e 1% peróxido
de hidrogénio (H2O2). Os resultados foram expressos em unidades/ml. Uma
unidade de atividade de MPO foi definida como a conversão de 1 μmol de
peróxido de hidrogénio a água em 1 min a 22 ° C.
3.11 ANÁLISE DAS CONCENTRAÇÕES DE TNF-α E IL-6
Os níveis de TNF-α e IL-6 foram determinados utilizando ensaio de

imunoabsorbância ligado a enzima (ELISA). Uma placa de microtitulação foi
incubada a 4° C durante toda a noite com um anticorpo policlonal para TNF-α
ou IL-6 (4 µg/ml) DuoSet ELISA Development kit R&D Systems. Os locais de
ligação adicionais na superfície da placa foram bloqueados por incubação dos
poços com PBS contendo albumina de soro bovino (BSA) a 2% durante 90 min
a 37°C. Em seguida, as amostras de teste e cada amostra padrão foram
adicionadas em várias diluições, postas em duplicata e incubadas a 4°C
durante 24 h. Em seguida, as placas foram lavadas três vezes com tampão
(0,01 M de fosfato, 0,05 M de NaCl, 0,1% de Tween 20, pH 7,2). Após a
lavagem das placas, foi adicionado 50 µL de biotinilado policlonal de ovelha
anti-TNF-α, ou anti-IL-6 (diluição de 1:1000 em tampão de ensaio contendo 1%
de BSA. Foi feita entao outra incubação à temperatura ambiente durante 1 h.
Logo depois as placas foram lavadas e 50 µl de peroxidase adivinda de
conjugado de rábano silvestre na proporção de 1: 5000 foi adicionado a todos
os poços, após 15 min. as placas foram lavadas e o reagente de cor o-fenileno-
diamina (40 µg/poço) foi adicionado. Depois de 15 min em um ambiente escuro
com temperatura de 37°C, a reação da enzima foi interrompida com H2SO4 (1
M) e a absorbância foi lida a 490 nm. Os resultados de ELISA foram expressos
como pictogramas de cada citocina por mililitro de exsudato peritoneal (pg/ml).
3.12 ANÁLISE DAS CONCENTRAÇÕES DE GLUTATIONA (GSH)
Inicialmente, 400 µl de cada sobrenadante de exsudado peritoneal foram

misturadas a 320 μL de água destilada e a 80 μL de acido tricloroacético (TCA)
a 50% para precipitação de proteínas. Os tubos foram centrifugados por 15
49
minutos a 3.000 rpm a 4°C. Um total de 400 μL do sobrenadante foi adicionado

a 800μL de tampão Tris 0,4 M (pH 8.9) e 20 μL de ácido ditio-nitrobenzoico
DTNB (reagente de Ellman) 0,01M. A mistura foi então agitada por 3 minutos e
a absorbância lida a 412 nm em espectrofotômetro (SILVA et al, 2015). As
concentrações de GSH foram expressas em μg/ml de exsudato.
3.13 ANÁLISE DOS NÍVEIS DE MALONDIALDEÍDO (MDA)
As concentrações de MDA no exsudato peritoneal a partir de cada um

dos grupos foi medida de acordo com SILVA et al (2013). Resumidamente,
alíquotas (500 µL) do exsudato peritoneal foram centrifugados a 3000 g durante
15 min a 4 °C, em seguida, 250 µL de cada sobrenadante foi adicionado a 1,5
mL de ácido fosfórico a 1% (H3PO4) e 0,5 mL de ácido tiobarbitúrico 0,6%
(solução aquosa). Em seguida, esta mistura foi agitada e aquecida em banho-
maria durante 45 min. Posteriormente, as amostras foram levadas
imediatamente a um recipiente com água gelada seguido pela adição de 4 ml
de n-butanol. As amostras foram agitadas, e a camada de butanol foi separada
por centrifugação a 1200 g durante 15 min e a absorbância foi lida em 520 e
535 nm no espectrofotômetro. As concentrações de MDA foram expressas
como mmol/ml de exsudato.
50
3.14 ANÁLISE DAS CONCENTRAÇÕES DE NITRITO (NO2-)
As concentrações de nitrito (NO2-) no exsudado peritoneal foi

determinada pela reação de Griess como indicador da produção de óxido
nítrico como modificado previamente por Mizokami et al (2016).
Resumidamente, 50 μL da amostra e 50 μL do reagente de Griess
(sulfanilamida mistura de 2% em ácido fosfórico a 5% e 0,2% de N- (1-naftil)
etilendiamina hidrocloridrico-NEED) foram misturados em 96 poços de placas
de ELISA. A absorvância foi medida a 550 nm, e os níveis de NO 2- foram
determinadas utilizando uma curva padrão de NaNO2. Os resultados são μM de
NO2- por cavidade.
3.15 AVALIAÇÃO DA PERMEABILIDADE VASCULAR
A permeabilidade vascular foi analisada em camundongos através da

mensuração do extravasamento de Azul de Evans, substâncias com elevada
capacidade de ligação à albumina sérica. Após administração de 50 uL de Azul
de Evans (50 mg/kg em PBS 10x) via plexo ocular, foram administrados EA e
PLS (3 mg/kg, ip) após 30 minutos foi administrado via intraperitoneal salina ou
estímulo inflamatório (Cg, ip, 500 µg/200 µL por 20 g de peso do camundongo).
Os animais foram eutanasiados 4 horas após a injeção de carragenina e a
lavagem peritoneal foi realizada com 3 ml de PBS mais EDTA, e a quantidade
de extravasamento de azul de Evans foi medida com o auxílio de um
espectrofotómetro a 620 nm após a realização de curva padrão. O veículo
(solução salina estéril a 0,9% (p/v) foi utilizado como controle (THURSTON et
al., 2000).
3.16 ANÁLISE DO EFEITO DO EA E PLS SOBRE A TOXICIDADE

GÁSTRICA EM CAMUNDONGOS
Após jejum de 18 horas os animais receberam EA e PLS (300 mg/kg v.o)

por gavagem, indometacina (20 mg/kg v.o.) ou 0,9% de solução salina estéril.
Após 7 horas, os animais foram eutanasiados; o estômago localizado,
51
removido e aberto ao longo da curvatura maior. O dano gástrico macroscópico

foi medido utilizando paquímetro digital (Mitutoyoα) e calculado como a soma
dos comprimentos de todas as erosões lineares. Em adição, foram colhidas
amostras de tecido gástrico para ensaio de atividade da enzima
mieloperoxidase (MPO) como descrito anteriormente (SILVA et al, 2015).
3.17 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os valores obtidos foram expressos em média ± S.E.M (erro padrão da

média). Para comparação entre as médias, foi utilizada a análise de variância
(ANOVA) e a significância entre os grupos estabelecida pelos testes de Student
Newman-Keuls. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente
significativos.
4. RESULTADOS

CARRAGENINA
A figura 8 mostra que a administração de carragenina na pata traseira

direita promoveu intensa formação de edema, atingindo um valor máximo na 3ª
hora (0,128 ± 0,005 ml), 24ª hora (0,122 ± 0,008 ml) e 72ª hora (0,112 ± 0,005
ml), com um declínio ocorrendo nas 96ª hora (0,10 ± 0,01 ml). O pré-tratamento
com EA e PLS (3, 10, e 30 mg/kg) reduziu marcadamente a resposta
edematogênica induzida pela administração de carragenina. O efeito máximo
foi observado na dose de 3 mg/kg para ambos, EA e PLS, (Figuras 8A e 8B),
respectivamente, os quais significativamente (p <0,05) reduziram o edema em
todos os pontos de tempo avaliados, incluindo o pico da 3ª hora (60,9% de
redução e 76,5%, respectivamente), 24 horas (60,6% e 61,4%, de redução,
respectivamente) e 72 h (53,5% e 55,3% de redução, respectivamente). Uma
vez que a dose de 3 mg/kg proporcionou proteção máxima contra edema da
pata induzido por carragenina, esta dose foi selecionada para dar continuidade
aos estudos posteriores.
52
Figura 8: Efeito do EA e PLS no edema de pata induzido por carragenina.
EA e PLS reduzem edema de pata induzido por carragenina. Os camundongos foram pré-
tratados com EA ou PLS (3, 10, e 30 mg/kg, i.p.). Após 30 min foi administrado carragenina
(500 µg/pata). Cada linha representa a média ± S. E. M de 5-6 animais por grupo. *P <0,05 em
relação ao grupo carragenina, testes de one-way ANOVA e Newman–Keuls.
4.2 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA
A figura 9 mostra que 4 horas após a administração de carragenina, o

tecido da pata apresentou um intenso infiltrado inflamatório de células,
caracterizado principalmente pela presença de neutrófilos e acompanhada por
edema intenso (painel A e B) quando comparado ao grupo tratado apenas com
salina (painel E). Os nossos dados mostram que o pré-tratamento com EA e
PLS (3 mg/kg) reduziram significativamente a infiltração de neutrófilos (Painel C
e D, respectivamente) de modo semelhante ao grupo controle de referência
pré-tratado com indometacina (painel F).
Figura 9: Análise histológica.
Fotomicrografias da pata de camundongos coradas com hematoxilina e eosina, (Painéis B. C, D, E e F: ampliação de 40x; Painel A:
ampliação de 10x). Painel E: grupo salina que exibe características histológicas normais, com a pata intacta e sem evidência de
inflamação; O painel A e B: grupo carragenina, mostra uma resposta inflamatória pronunciada com intensa presença células
polimorfonucleares e edema; Painel C: EA + carragenina, Painel D: PLS + carragenina, mostrando que o pré-tratamento com EA e PLS
reduziu a migração celular. Painel F: indo + carragenina.
53
54
4.3 EFEITO DO EA E PLS NA ANÁLISE IMUNOHI-STOQUÍMICA PARA

iNOS E COX-2
A análise imuno-histoquímica de tecido conjuntivo e epitelial das patas

inflamadas de camundongos tratados com carragenina (500 µg/pata), na quarta
hora mostrou imunomarcação para as enzimas relacionadas com a inflamação,
tais como iNOS e COX-2. O tratamento com EA e PLS (3 mg/kg) ou
indometacina (10 mg/kg) foi capaz de reduzir a expressão de todas as
marcações como mostrado nas figuras 10 e 11. Quanto ao número de células
marcadas, os resultados do painel (10-F e11-F) indicam que a imunomarcação
para COX2 e iNOS em células de tecido conjuntivo e epitelial das patas são
estatisticamente diferentes entre os grupos tratados com carragenina e solução
salina (COX2: 67,20 ± 7,5 vesus 8,2 ± 1,6; iNOS: 90,4 ± 11,9 versus 13,0 ± 6,7,
respectivamente). Quando se analisa o número de células marcadas nos
grupos tratados com EA e PLS observa-se que houve uma redução
significativa (p <0,05) no número de células marcadas (COX2: 34,4 ± 4,0 e 37,2
± 4,9; iNOS: 51,6 ± 4,5 e 39,4 ± 9,6, respectivamente).
Figura 10: Efeito do EA e PLS na análise imuno-histoquímica para COX-2
(Painel A) animal tratado apenas com solução salina, (painel B) animais pré-tratados com solução salina + carragenina, (painel C)
animais pré-tratados com EA + carragenina (painel D), animais pré-tratados com PLS + carragenina, (painel E) animais pré-tratados
INDO + carragenina. A Figura 11 mostra que a carragenina aumentou significativamente a expressão de COX2 e o número de células
marcadas em comparação com o grupo tratado apenas com solução salina. O pré-tratamento com EA ou PLS reduziu significativamente
a imunomarcação para COX2 em células de tecido conjuntivo e epitelial da pata. Cada linha representa a média ± S. E. M de 5-6
animais por grupo. *P <0,05 contra o estímulo inflamatório. Uma análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Newman-Keuls.
55
Figura 11: Efeito do EA e PLS na análise imuno-histoquímica para iNOS
(Painel A) animal tratado apenas com solução salina, (painel B) animais pré-tratados com solução salina + carragenina, (painel C)
animais pré-tratados com EA + carragenina (painel D), animais pré-tratados com PLS + carragenina, (painel E) animais pré-tratados
INDO + carragenina. A Figura 12 mostra que a carragenina aumentou significativamente a expressão de iNOS e o número de células
marcadas em comparação com o grupo tratado apenas com solução salina. O pré-tratamento com EA ou PLS reduziu
significativamente a imunomarcação para iNOS em células de tecido conjuntivo e epitelial da pata. Cada linha representa a média ± S.
E. M de 5-6 animais por grupo. *P <0,05 contra o estímulo inflamatório. Uma análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de
Newman-Keuls.
56
57

DIFERENTES ESTIMULOS INFLAMATÓRIOS
A figura 12 mostra o edema da pata induzida por composto 48/80 (Fig.

12A: 0,066 ± 0,006 ml), sulfato de dextran (Fig. 12B: 0,044 ± 0,005 ml),
histamina (Fig. 12C: 0,06 ± 0,004 ml), serotonina (Fig. 12D: 0,054 ± 0,006 ml),
bradicinina (Fig. 12E: 0,016 ± 0,002 ml) e PGE2 (Fig. 12F: 0,09 ± 0,009 ml). O
pré-tratamento com EA e PLS na dose de (3 mg/kg) reduziu eficazmente (p
<0,05) a formação do edema de pata induzido por composto 48/80 (69,6% e
54,5% de inibição, respectivamente; Fig. 12A), sulfato de dextran (63,6% e
77,27% de inibição, respectivamente; Fig. 12B), histamina (83,3% e 73,3% de
inibição, respectivamente; Fig. 12C), serotonina (81,4% e 66,6% de inibição,
respectivamente; Fig. 12D), bradicinina (87,5% e 62,5 % de inibição,
respectivamente; Fig. 12E) e PGE2 (55,5% e 71,11% de inibição,
respectivamente; Fig. 12F). O fármaco de referência, indometacina (10 mg/kg),
também inibiu significativamente o edema de pata induzido por todos estes
mediadores inflamatórios (Figura 12).
58
Figura 12: Efeito do EA e PLS no edema de pata induzido por diferentes

agentes.
A B
C D
E F
Legenda: EA e PLS reduzem edema de pata induzido por vários estímulos. Os camundongos
foram pré-tratados com EA e PLS (3 mg/kg, i.p.). Após 30 min foi induzido edema de pata pelo
composto 48/80 (12 μg/pata; A), sulfato de dextran (DEX; 500 μg/pata; B), serotonina (5-HT;
1% w/v; C), histamina (HIST; 100 μg/pata; D) bradicinina (BK; 6.0 nmol/pata; E), e
prostaglandina E2 e (PGE2; 3.0 nmol/pata; F). Cada linha representa a média ± S. E. M de 5-6
animais por grupo. *P <0,05 contra o estímulo inflamatório testes de one-way ANOVA e
Newman–Keuls.
59
4.5 EFEITO DO EA E PLS NA PERITONITE INDUZIDA POR CARRAGENINA
No presente estudo, a administração de carragenina promoveu intensa

migração de leucócitos (7,65 ± 0,8 × 106 células/ml; Figura 13A) e neutrófilos
(6,06 ± 0,6 × 106 células/ml; Figura 13B) para a cavidade peritoneal 4 h após
sua administração (p< 0.001) em comparação as contagens correspondentes
ao grupo controle salina (2,4 ± 0,3 × 106 células/ml e 0,8 ± 0,1 × 106 células/ml,
respectivamente). O pré-tratamento com EA e PLS (3 mg/kg) reduziu
consideravelmente a contagem total (4,9 ± 0,5 × 106 células/ml e 2,9 ± 0,1 ×
106 células/ml, respectivamente) e diferencial (5,2 ± 0,6 × 106 células/ml e 1,6 ±
0,1 × 106 células/ml, respectivamente). Similarmente, o pré-tratamento com
indometacina produziu uma redução de (5,0 ± 0,3 × 10 6 células/ml) na
contagem total de leucócitos e uma redução de (2,3 ± 0,2 × 10 6 células/ml) na
migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal.
Figura 13: Efeito do EA e PLS sobre a migração de leucócitos para a cavidade

peritoneal.
A B
EA e PLS reduzem a migração celular na peritonite induzida por carragenina. Os camundongos

foram pré-tratados com EA e PLS (3 mg/kg, i.p.). Após 30 min carragenina (500 μg/cavidade)
foi administrada. A migração celular foi avaliada 4 h mais tarde. (A) contagem total deeucócitos
e (B). contagem diferencial de neutrófilos. Cada coluna representa a média ± S. E. M de 5-6
#
animais por grupo. P <0,05 comparado ao grupo salina; *P <0,05 em relação ao grupo
carragenina, testes de one-way ANOVA e Newman–Keuls.
60
4.6 EFEITO DO EA E PLS NA ATIVIDADE DA MPO
A administração de carragenina (15,6 ± 0,5 U/ml de exsudato peritoneal)

produziu um aumento significativo (p <0,001) na atividade da MPO no exsudato
peritoneal (Figura 14), esta enzima é um importante marcador de infiltração
neutrofílica, em comparação com as contagens correspondentes do grupo
controle salina (4,3 ± 1,3 U/ml de exsudato peritoneal). No entanto, o pré-
tratamento com EA e PLS (3 mg/kg) reduziu significativamente (p <0,001) os
níveis de MPO (6,9 ± 0,4 U/ml e 7,8 ± 0,7 U/ml de exsudato peritoneal,
respectivamente) para valores semelhantes aos do grupo de controle de
referência indometacina (4,6 ± 1,0 U/ml de exsudato peritoneal).
Figura 14: Efeito do EA e PLS sobre os níveis da enzima mielopexidase

(MPO).
EA e PLS reduzem os níveis da atividade da mieloperoxidase (MPO) na peritonite induzida por

carragenina. Os camundongos foram pré-tratados com EA e PLS (3 mg/kg, i.p.). Após 30 min
carragenina (500 μg/cavidade) foi administrada, e a análise realizada após 4 h. Cada coluna
#
representa a média ± S. E. M de 5-6 animais por grupo. P <0,05 comparado ao grupo salina;
*P <0,05 em relação ao grupo carragenina, testes de one-way ANOVA e Newman–Keuls.
61
4.7 EFEITO DE EA E PLS NOS NÍVEIS DE TNF-α E IL-6
A figura 15 mostra que a administração de carragenina aumentou os

níveis de TNF-α (478,3 ± 68,55 pg/ml; Fig 15A.) e IL-6 (24542 ± 7586 pg/ml;
Fig. 15B), no exsudato peritoneal, em comparação com os níveis
correspondentes no grupo controle (100,5 ± 42,63 pg/ml e 3128 ± 3018 pg/ml,
respectivamente). O pré-tratamento com EA ou PLS (3 mg/kg) reduziu de
forma significativa (p <0,05) os níveis de TNF-α (220,0 ± 58,83 e 173,8 ± 45,08
pg/ml, respectivamente) e IL-6 (7680 ± 2458 e 7780 ± 1620 pg/ml,
respectivamente).
Figura 15: Efeito do EA e PLS sobre os níveis das citocinas TNF-α e IL-6
A B
EA e PLS reduzem os níveis das citocinas TNF-α e IL-6 na peritonite induzida por carragenina.
Os camundongos foram pré-tratados com EA e PLS (3 mg/kg, i.p.). Após 30 min carragenina
(500 μg/cavidade) foi administrada, e a análise realizada após 4 h. Cada coluna representa a
#
média ± S. E. M de 5-6 animais por grupo. P <0,05 comparado ao grupo salina; *P <0,05 em
relação ao grupo carragenina, testes de one-way ANOVA e Newman–Keuls.
62
4.8 EFEITO DO EA E PLS NAS CONCENTRAÇÕES DE GLUTATIONA (GSH)
Como mostrado na figura 16A a administração de carragenina (59,82 ±

6.4 µg/ml) reduziu os níveis de GSH, em comparação com o grupo controle
salina (127,2 ± 8,77 µg/ml). O pré-tratamento com EA e PLS (3 mg/kg)
manteve de forma significativa (p <0,05) os níveis de GSH a valores
semelhante ao grupo controle salina (118,6 ± 1,12 µg/mL e 127,1 ± 2,19 ug/mL,
respectivamente).
4.9 EFEITO DO EA E PLS NOS NÍVEIS DE MALONDIALDEÍDO (MDA)
A figura 16B mostra que a administração de carragenina (15,4 ± 0,4

nmol/ml) promoveu aumento significativo nos níveis de MDA, em comparação
com o grupo controle tratado apenas com solução salina (3,2 ± 0,3 nmol/ml). O
pré-tratamento com EA e PLS (3 mg/kg) reduziu de forma significativa (p <0,05)
os níveis de MDA (4,6 ± 0,5 µg/mL e 3,6 ± 0,4 nmol/ml, respectivamente).
Figura 16: Efeito do EA e PLS sobre as concentrações de glutationa (GSH) e

nos níveis de malondialdeído (MDA).
A B
EA e PLS reduzem os níveis de GSH e MDA na peritonite induzida por carragenina. Os

camundongos foram pré-tratados com EA e PLS (3 mg/kg, i.p.). Após 30 min carragenina (500
μg/cavidade) foi administrada, e os parâmetros bioquímicos analisados 4 h após a injeção de
carragenina. (A) os níveis de GSH e em (B) os níveis de MDA. Cada coluna representa a média
#
± S. E. M de 5-6 animais por grupo. P <0,05 comparado ao grupo salina; *P <0,05 em relação
ao grupo carragenina, testes de one-way ANOVA e Newman–Keuls.
63
4.10 EA E PLS INIBE A PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (NO) NA

CAVIDADE PERITONEAL
A figura 17 mostra que a administração de carragenina aumentou os

níveis de nitrito (0,8380 ± 0,01615), um indicador da produção de óxido nítrico,
no exsudado peritoneal, em comparação com os do grupo de controle tratado
apenas com solução salina (0,4669 ± 0,02795). O pré-tratamento com EA e
PLS (3 mg/kg) reduziu de forma significativa (p <0,05) as concentrações de
nitrito (0,2700 ± 0,02566 e 0,2533 ± 0,03963, respectivamente) no exsudato
peritoneal quando comparado ao grupo tratado com carragenina.
Figura 17: Efeito do EA e PLS sobre as concentrações de nitrito (NO2-)
-
EA e PLS reduzem as concentrações de nitrito (NO2 ) na peritonite induzida por carragenina.
Os camundongos foram pré-tratados com EA e PLS (3 mg/kg, i.p.). Após 30 min carragenina
(500 μg/cavidade) foi administrada, e os parâmetros bioquímicos analisados 4 h após a injeção
#
de carragenina. Cada coluna representa a média ± S. E. M de 5-6 animais por grupo. P <0,05
comparado ao grupo salina; *P <0,05 em relação ao grupo carragenina, testes de one-way
ANOVA e Newman–Keuls.
64
4.11 EFEITO DO EA E PLS NA PERMEABILIDADE VASCULAR
A figura 18 mostra que a administração de carragenina (68,7 ± 5,7 µg/ml

de exsudato) produziu um significativo (p <0,001) aumento na permeabilidade
vascular, em comparação com o grupo salina (10,4 ± 3,5 µg/ml de exsudato). O
pré-tratamento com EA (3 mg/kg) reduziu significativamente (p <0,001) a
permeabilidade vascular (24,4 ± 5,4 µg/ml de exsudato). No entanto, o pré-
tratamento com PLS (3 mg/kg) não reduziu de forma significativa a
permeabilidade vascular (61,9 ± 2,0 µg/ml de exsudato). Indometacina (10
mg/kg), também reduziu de forma significativa (p <0,001) a permeabilidade
vascular (36,8 ± 4,2 µg/ml de exsudato).
Figura 18: Efeito do EA e PLS na permeabilidade vascular.
EA e PLS reduzem a permeabilidade vascular, teste de azul de Evans. Os camundongos

receberam azul de Evans (50 mg/kg em PBS 10x) via plexo ocular em seguida foram pré-
tratados com EA e PLS (3 mg/kg, i.p.) ou INDO (10 mg/kg). Após 30 min carragenina (500
μg/cavidade) foi administrada, e os parâmetros bioquímicos analisados 4 h após a injeção de
#
carragenina. Cada coluna representa a média ± S. E. M de 5-6 animais por grupo. P <0,05
comparado ao grupo salina; *P <0,05 em relação ao grupo carragenina, testes de one-way
ANOVA e Newman–Keuls.
65
4.12 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE GÁSTRICA
Este protocolo experimental foi realizado para avaliar a toxicidade do EA

e PLS sobre a mucosa gástrica comparado com a indometacina na dose de (20
mg/kg) uma droga de referência. A figura 19 mostra que a administração de
indometacina promoveu lesão gástrica (2,1 ± 0.05 milímetros, Fig. 19A) e
aumento da atividade da MPO (2,21 ± 0,09 UMPO/mg de tecido gástrico, Fig.
19B) de forma significativa (p <0,05), quando comparado com o grupo tratado
apenas com salina (Fig. 19A, 0,1 ± 0,04 milímetros e 0,1 ± 0,03 UMPO/mg de
tecido, respectivamente, Fig. 19B). No entanto, o pré-tratamento com EA e
PLS na dose de (300 mg/kg) não promoveu dano gástrico (0,2 ± 0,04 e 0,1 ±
0,02 milímetros, respectivamente, Fig. 19A) ou alteração na atividade da MPO
(0,09 ± 0,04 e 0,07 ± 0,05 UMPO/mg de tecido, respectivamente, Fig. 19B).
Figura 19: Análise da toxicidade gástrica de EA e PLS e níveis da MPO em

camundongos.
A B
Legenda: EA e PLS não apresentaram toxicidade sobre a mucosa gástrica e reduziu os níveis
de MPO. Painel A: avaliação da toxicidade gástrica; Painel B: ensaio da atividade da MPO. Os
camundongos receberam salina, EA e PLS (300 mg/kg, v.o.) ou indometacina(20 mg/kg. v. o.),
os parâmetros foram avaliados 7 h após a administração de cada tratamento. Cada coluna
representa a média ± S. E. M de 5-6 animais por grupo. *P <0,05 em relação ao grupo salina,
testes de one-way ANOVA e Newman–Keuls.
66
5. DISCUSSÃO
As opções terapêuticas anti-inflamatórias disponíveis, em sua maioria

estão associadas a efeitos secundários graves que impedem o seu uso
contínuo (AKRAM et al., 2016). Plantas medicinais são comumente usadas
para o tratamento de diversas doenças inflamatórias e são consideradas uma
importante fonte de moléculas com potencial eficácia terapêutica (SILVA et al.,
2015; AKRAM et al., 2016). Neste estudo, mostramos que EA e PLS obtidos a
partir de T. occidentalis L, reduziu a resposta inflamatória em modelos
experimentais clássicos de inflamação; o mecanismo subjacente envolve a
redução de edema induzida por diferentes agentes, a inibição da migração de
neutrófilos para o local de inflamação, acompanhado pela redução da
permeabilidade vascular, dos níveis de citocinas pró-inflamatórias e pela
redução do estresse oxidativo.
Inicialmente, no modelo de edema de pata induzido por carragenina, os
nossos resultados mostraram que EA e PLS inibiram a formação do edema em
todos os pontos de tempo avaliados. A inflamação induzida por carragenina é
um processo bifásico, a fase inicial é determinada por uma vasodilatação inicial
mediada pela libertação de mediadores tais como a histamina, 5-HT e
bradicinina, seguida de intensa infiltração de células polimorfonucleares (PMN),
com o pico ocorrendo entre a 3ª e 4ª hora após a administração de
carragenina, a fase posterior se desenvolve predominantemente após 24
horas, com um efeito máximo visto entre 48 e 72 horas, esta fase é
caracterizada pela libertação de TNF-α, e migração de macrófagos, eosinófilos,
e linfócitos (CHAVES et al., 2013; SILVA et al., 2015; DE OLIVEIRA et al.,
2016).
No presente estudo, confirmamos o aumento gradual do volume da pata
no grupo tratado com carragenina, com pico ocorrendo em 3, 4, 24 e 72 horas.
O pré-tratamento com EA e PLS foram igualmente eficientes em ambas as
fases do edema de pata induzido por carragenina, promovendo uma redução
significativa no volume da pata. Assim, sugerimos que seus efeitos anti-
inflamatórios podem estar associados com a inibição da liberação de
mediadores pró-inflamatórios, tais como histamina, serotonina e bradicinina,
67
inibição da migração de células ou por meio da inibição de citocinas pró-

inflamatórias.
A primeira fase do edema induzido pela carragenina envolve a rápida
produção e liberação de vários mediadores inflamatórios (MALING et al., 1974;
POSADAS et al., 2004). Para provar este mecanismo, foi induzido edema da
pata por meio de diferentes agentes inflamatórios. O sulfato de dextrana e o
composto 48/80 são conhecidos por promoverem um edema osmótico
caracterizado por um aumento da permeabilidade vascular, pela ativação de
cininas (bradicinina), e induzir a libertação de aminas vasoativas (histamina e
5-HT) derivadas da degranulação de mastócitos (PATON, 1951; CUNHA et al.,
2016; DE OLIVEIRA, et al., 2016). Nossos dados demonstram que o EA e PLS
inibiram marcadamente o edema de pata induzido pelo composto 48/80 e
sulfato de dextrana, sugerindo que estes compostos podem estar auxiliando na
estabilização da membrana dos mastócitos e assim na prevenção da
degranulação ou inibindo a ação das aminas vasoativas, em seus respectivos
locais de ação. Isto foi confirmado pelo fato do EA e PLS também inibirem o
edema da pata induzido por histamina e 5-HT. A histamina é responsável pelo
aumento da permeabilidade vascular e vasodilatação através de sua ação
sobre os receptores-H1 de células endoteliais (DE TONI et al., 2015). 5-HT é
um agente pró-inflamatório com ação periférica, seus efeitos são mediados por
diferentes receptores, incluindo 5HT1 presentes nos vasos sanguíneos
periféricos, quando ativado estes receptores promovem a vasodilatação e
aumento da permeabilidade, o que facilita o desenvolvimento do edema (DE
TONI et al., 2015; SHAJIB; KHAN, 2015).
Em outros experimentos, EA e PLS também reduziram o edema de pata
induzido por bradicinina e PGE2. A bradicinina é uma quinina de ação local
derivada do sangue, é o mediador inflamatório mais importante implicado nos
principais sinais da inflamação, atuando na produção e libertação de
mediadores pró-inflamatórios derivados da via do ácido araquidônico, incluindo
PGE2, assim como citocinas, produtos derivados dos mastócitos e óxido nítrico
(NO) (GOLIAS et al., 2007; YIMAM et al., 2016). Assim, está envolvida na
maioria dos eventos observados durante os processos inflamatórios, incluindo
vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular, o extravasamento de
plasma, a migração celular, dor e hiperalgesia (SOUZA et al., 2004). A PGE2 é
68
considerada um mediador inflamatório lipídico vital na patogênese da

inflamação. COX-2 é a enzima chave que atua sintetizando PGE2 a partir do
ácido araquidônico. Atua como um potente vasodilatador, induzindo a produção
de vários agentes quimioatáticos, tais como leucócitos e citocinas pró-
inflamatórias, incluindo a IL-1β e TNF-α (RICCIOTTI; FITZGERALD, 2011;
ZHANG et al., 2016). Nesse contexto, estes resultados sugerem que os efeitos
antiedematogênicos do EA e PLS podem estar relacionados com eventos que
envolvem a inibição da libertação ou atividade destes mediadores inflamatórios.
Estes dados estão de acordo com estudos realizados por Kim et al., (2013) que
demonstrou que um diterpeno derivado da Thuja orientalis L. (Cupressacea)
uma planta pertencente a mesma família da Thuja ocidentalis L. possui ação
inibitória sobre a produção de mediadores pró-inflamatórios como PGE2 e
citocinas TNF-α, IL-1β e IL-6 em cultura de macrófagos desafiados com LPS.
Alteração na permeabilidade vascular pode ser induzida por vários
fatores, incluindo a ação de aminas vasoativas (histamina e 5-HT), bradicinina,
leucotrienos, substância P, fator de ativação de plaquetas (PAF) e ativação do
sistema complemento. A função deste evento é permitir o fornecimento de
fatores solúveis, tais como anticorpos e proteínas de fase aguda para o local da
lesão (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY et al., 2004; SILVA et al., 2014). Para
investigar esta alteração, analisamos o extravasamento vascular utilizando o
corante azul de Evans, que forma um complexo estável com proteínas
plasmáticas (albumina). Nossos resultados demonstram que o tratamento
prévio com EA reduziu o aumento da permeabilidade vascular induzido pela
carragenina semelhante ao grupo tratado com indometacina, no entanto, o pré-
tratamento com PLS não alterou significativamente este efeito. Portanto, estes
dados sugerem que a ação de EA e PLS na permeabilidade vascular pode
ocorrer através da inibição de mediadores inflamatórios, como demonstrado
nos dados expostos anteriormente.
A migração de leucócitos para os tecidos infectados ou lesados é crucial
para a resposta de defesa do hospedeiro (CANO et al., 2016). Os neutrófilos
são leucócitos que compreendem uma das primeiras linhas de defesa contra os
agentes patogénicos do corpo, e a sua infiltração nos tecidos inflamados é uma
das principais características da resposta inflamatória aguda inata (GOMIDES
et al., 2014). Neste estudo, por meio da análise histológica, foi demonstrado
69
que o recrutamento de células no tecido da pata 4 h após a administração de

carragenina foi marcadamente reduzido nos grupos pré-tratados com EA e
PLS. Posteriormente, analisamos a migração de leucócitos no modelo de
peritonite induzida por carragenina, nestes experimentos observamos que o
pré-tratamento com AE e PLS também reduziu significativamente o número de
leucócitos, bem como de neutrófilos que migraram para a cavidade peritoneal.
Para confirmar estes resultados, também foram avaliados os níveis da enzima
mieloperoxidase (MPO) no exsudato peritoneal. A MPO é uma enzima
encontrada principalmente nos grânulos azurófilos dos neutrófilos, lançada em
locais inflamatórios, e sua ação pode provocar danos aos tecidos adjacentes e,
assim, contribuir para a patogênese da inflamação, assim, é utilizada como um
marcador da infiltração de neutrófilos (LORIA et al., 2008; MIZOKAMI et al.,
2016) Nossos resultados mostraram que o pré-tratamento com EA e PLS
reduziu significativamente os níveis da MPO, sugerindo que a atividade anti-
inflamatória de AE e PLS envolve a diminuição da migração de neutrófilos para
os locais de inflamação.
O papel das citocinas no contexto da inflamação é bem estabelecido
(Warren, 1990). TNF-α e IL-6 são citocinas sintetizadas e libertadas pela
ativação de neutrófilos, macrófagos entre outros leucócitos o qual podem
posteriormente ativar mais leucócitos, além disso, podem ativar as células
endoteliais que conduzem a interação de neutrófilos culminando nos eventos
sequenciais de rolamento, adesão e transmigração para o sítio inflamatório
(FUJISHIMA et al, 1993; SCHELLER et al, 2011). A produção excessiva, ou
produção inapropriada de citocinas pró-inflamatórias pode resultar em
condições patológicas como a artrite reumatoide, que envolve a destruição de
tecidos e exacerbação da inflamação, assim, a supressão destes mediadores
acredita-se ser uma estratégia eficaz para o tratamento de diversas condições
patológicas de cunho inflamatório (MCINNES et al., 2007; STROBER at al.,
2011). Estudos anteriores mostraram que a administração de carragenina
induziu um aumento nos níveis de TNF-α e IL-6 no exsudato peritoneal
(CHAVES et al, 2013; SILVA et al, 2015). No nosso estudo, o pré-tratamento
com EA e PLS promoveu uma redução dos níveis das citocinas TNF-α e IL- 6
para níveis semelhantes aos observados no grupo de controle, sugerindo que
70
as ações de EA e PLS sobre a migração de células polimorfonucleares,

provavelmente seja devido sua ação inibitória sobre os níveis de TNF-α e IL-6.
A enzima COX2 é induzível em resposta a estímulos pró-inflamatório,
resultando na superprodução de PGs, assim, em vista o seu papel na
patogênese da inflamação, sendo ela o principal alvo dos AINEs (VANE, 1971).
O óxido nítrico (NO) é sintetizado a partir do aminoácido L-arginina pela NO-
sintase (NOS), podendo ser libertado por neurônios, células endoteliais,
plaquetas e neutrófilos em resposta a estímulos homeostáticos e patológicos
(BLANTZ E MUNGER, 2002; SHARMA et al., 2007). Em processos
inflamatórios são produzidas grandes quantidades de NO, gerado
principalmente pela ação da iNOS exercendo ação pró-inflamatória
(WALLACE, 2005). A isoforma induzível da NOS (iNOS) é expressa após
ativação de macrófagos e outros leucócitos (GUZIK, 2003). Para verificar a
ação de EA e PLS sobre a inibição da expressão das enzimas COX-2 e iNOS,
foi realizada a análise por imuno-histoquímica 4 horas após a injeção de
carragenina, além da expressão destas enzimas no tecido da pata. Os nossos
dados mostram que a administração de carragenina aumentou
significativamente a imunoexpressão de COX-2 e o número de células
marcadas no tecido da pata. Em contraste, o pré-tratamento com EA ou PLS
reduziu significativamente a imunomarcação para COX-2 em células de tecido
conjuntivo e epitelial das patas. Deste modo, estes dados sugerem um possível
efeito inibidor destes compostos sobre a enzima COX-2. Adicionalmente,
também foi observado um aumento da imunoexpressão de iNOS e do número
de células marcadas no grupo tratado com carragenina, enquanto que o pré-
tratamento com EA ou PLS reduziu significativamente a expressão de iNOS.
Estes dados corroboram com os resultados obtidos a partir das dosagens de
nitrito, que constitui um indicador da produção de NO. Em nosso estudo,
confirmamos que a carragenina aumenta as concentrações de nitrito no
exsudato peritoneal, no entanto, o pré-tratamento com EA e PLS reduziu
significativamente as concentrações de nitrito para níveis semelhantes aos do
grupo controle. Portanto, estes resultados sugerem um possível papel da EA e
PLS alterando produção de NO via iNOS, em adição, estes dados também
encontram-se em concordância com o trabalho de Jung et al., (2013), em que o
mesmo demonstrou que o extrato da Thuja orientalis L. possui ação inibitória
71
sobre a produção de NO e expressão de iNOS e COX-2 em células BV-2 da

micróglia estimuladas com LPS, em modelo de isquemia cerebral focal e
transiente.
Os AINEs são a classe de fármacos mais prescritos para o tratamento
de desordens inflamatórias. Atuam promovendo inibição das enzimas
cicloxigenases (COX1 e/ou COX2), prevenindo a biossíntese das
prostaglandinas a partir do ácido araquidônico (SILVA et al, 2015; SYLVIA-
LUCAS; 2016). No entanto, estes fármacos estão associados com efeitos
secundários importantes atribuídos a fatores que incluem a deficiência de
prostaglandinas endógenas (PGs), ativação de neutrófilos, e o aumento da
produção de radicais livres, o que contribui para a produção de efeitos
adversos como lesões na mucosa gástrica. Para avaliar a toxicidade de EA e
PLS no epitélio gástrico, indometacina um AINE de referência foi utilizado na
dose de 20 mg/kg. Em nossos experimentos confirmamos que o tratamento
com indometacina pode levar ao aparecimento de lesões gástricas e aumento
na atividade da enzima MPO em tecido gástrico. Em contrapartida, o
tratamento com uma dose cem vezes maior (300 mg/kg) de EA e PLS do que a
dose utilizada como melhor dose nas análises anteriores, não promoveu lesão
gástrica e nem aumento nos níveis de MPO. Dessa forma, um mecanismo
proposto na literatura para a atividade protetora gástrica de polissacáridos
derivados de plantas é, devido à sua natureza aniônica e sua elevada
capacidade de ligação a resíduos de mucina e aminoácidos, carregados
positivamente, funcionando assim como uma camada de revestimento protetor
da mucosa (SRIKANTA et al., 2007; SILVA et al., 2011; CARVALHO et al.,
2015). Nossos dados corroboram com o estudo de Das e Rani (2013) que
demonstrou as propriedades antioxidantes e gastroprotetoras do extrato
metanólico de frutos da T. occidentalis L. em modelo de úlcera gástrica
induzido por aspirina. Assim, AE e PLS apresentam-se como um candidato
potencial para uma droga anti-inflamatória, uma vez que foi demonstrado
proporcionar uma vantagem importante em comparação com os AINEs de
referência, apresentando ação anti-inflamatória em modelos de inflamação
aguda, no entanto, mostrou-se desprovido de efeitos tóxicos sobre o epitélio
gástrico, mesmo em doses elevadas.
72
Existe um “crosstalk‖ entre a inflamação e o estresse oxidativo em

muitas doenças e condições não homeostáticas como a artrite, doença
inflamatória do intestino (doença de Crohn), pancreatite crônica, doenças
autoimunes, asma, etc (REUTER et al., 2010). Estas doenças estão
associadas com o excesso na produção de espécies reativas de oxigénio
(EROS) que levam ao estresse oxidativo, resultando na peroxidação lipídica e
danos a biomoléculas importantes, tais como proteínas ou DNA, e desse modo,
produz dano tecidual (HAKIM, 1993; MITTAL et al, 2014). O malondialdeído
(MDA) é o principal produto final da peroxidação lipídica e suas concentrações
refletem um desequilíbrio entre os sistemas oxidantes e antioxidantes (GAWEŁ
et al., 2004; SILVA et al., 2015). Por outro lado, a glutationa (GSH) é o principal
antioxidante endógeno produzida por organismos vivos e protege as células
contra as espécies reativas de oxigénio geradas durante as lesões patológicas
(SANTIAGO et al., 2015). Com base no exposto, avaliamos o potencial
antioxidante do EA e PLS através da análise das concentrações de MDA e dos
níveis de GSH. Nossos resultados confirmam que a administração de
carragenina promove aumento nos níveis de MDA e mantem as concentrações
de GSH no exsudato peritoneal no modelo de peritonite. Assim, estes dados
confirmam que a resposta inflamatória produz metabólitos reativos que
agravam e intensificam ainda mais este processo e dessa forma esses
compostos com ação antioxidantes podem apresentar efeito anti-inflamatório
potencial. Com base nestes dados sugerimos que EA e PLS podem promover
proteção contra ação de EROS por aumentar as concentrações de
antioxidantes endógenos, e assim atenuar o processo inflamatório.
Em síntese, estes resultados indicam que EA e PLS possuem ação anti-
inflamatória por promoverem inibição da formação de edema induzido por
diferentes agentes com ação pró-inflamatória, a permeabilidade vascular, a
migração de leucócitos como neutrófilos, a imunoexpressão de enzimas
relacionadas à inflamação como a COX-2 e iNOS, bem como também reduziu
os níveis das citocinas TNF-α e IL-6. Além disso, mostrou-se eficiente em
atenuar a peroxidação lipídica e os danos oxidativos, bem como não
apresentou toxicidade sobre a mucosa gástrica quando administrados em uma
dose elevada.
73
6. CONCLUSÃO
Os resultados apresentados neste estudo suportam evidências que o

extrato aquoso (EA) e a fração polissacarídica (PLS) obtidos da T. occidentalis
L, demonstram ação anti-inflamatória observada pela inibição de parâmetros
inflamatórios clássicos como a formação de edema induzido por carragenina e
mediadores tais como histamina, serotonina, bradicinina e PGE2, redução da
permeabilidade vascular, redução da migração de neutrófilos e dos níveis da
enzima mieloperoxidade. Além disso, EA e PLS reduziu a produção de
citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-6), a imunomarcação para COX-2 e
iNOS, e o stress oxidativo. Além disso, não apresentou ação lesiva sobre a
mucosa gástrica, uma característica incomum a maioria das classes de
fármacos com ação anti-inflamatória. Em conclusão, os resultados desta
pesquisa sugerem que EA e PLS são alvos importantes para futuras
abordagens terapêuticas no tratamento de doenças inflamatórias.
Figura 20: Diagrama esquemático representativo do efeito do EA e PLS na

resposta inflamatória
74
7. PERSPECTIVAS FUTURAS
 Realizar experimentos para elucidar a composição química e

propriedades funcionais da fração polissacarídica da T. occidentalis L. por meio
de espectroscopia de infravermelho e RMN para verificar a estrutura química
do polissacarídeo;
 Avaliar o efeito do extrato aquoso e da fração polissacarídica da T.

occidentalis L. sobre a expressão do fator nuclear NF-kB no edema de pata
induzido por carragenina;
 Verificar efeito do extrato aquoso e da fração polissacarídica da T.

occidentalis L. sobre os níveis de citocinas (IL1- β, IL-10 e IL-8);
 Analisar a ação do extrato aquoso e da fração polissacarídica da T.

occidentalis L. sobre a migração de leucócitos por meio da microscopia
intravital;
 Estudar a ação do extrato aquoso e da fração polissacarídica da T.
occidentalis L. sobre os receptores H1 da histamina e 5HT1 da serotonina.
75
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AHN, K.S.; AGGARWAL, B.B. Transcription factor NF-kappaB: a sensor for

smoke and stress signals. Annals of the New York. Ann N Y Acad Sci, v. 1056,
p. 218–233, 2005.
AHN, K.S.; SETHI, G.; AGGARWAL, B.B. Nuclear factor-kappa B: from clone to
clinic. Curr. Mol. Med, v. 7, n. 7, p. 619–637, 2007.
AKKOL, E.K. et al. Thuja occidentalis L. and its active compound, α-thujone:
Promising effects in the treatment of polycystic ovary syndrome without
inducing osteoporosis. J Ethnopharmacol, v. 168, p. 25–30, 2015.
AKRAM, M. et al. Potent Anti-inflammatory and Analgesic Actions of the

Chloroform Extract of Dendropanax morbifera Mediated by the Nrf2/HO-1
Pathway. Biol. Pharm. Bull, v. 39, p. 728–736, 2016
AKTAN, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sci, v.
75, n. 6, p. 639–53, 2004.
ALFARO, R.I. et al. Insect feeding and oviposition deterrents from western red
cedar foliage. J Chem Ecol, v. 7, p.39–48. 1981.
ALLIJN, I. E. et al. Head-to-Head Comparison of Anti-Inflammatory

Performance of Known Natural Products In Vitro. PLoS One, v. 11, n. 5, p.
e0155325, 2016.
ALVES, L.D.S. et al. Thuja occidentalis L. (Cupressaceae): review of botanical,

phytochemical, pharmacological and toxicological aspects. Int J Pharm Sci
Res, v. 5, p. 1163–1177, 2014.
BARNES, P. J.; KARIN, M. Nuclear factor-kappaB: a pivotal transcription factor

in chronic inflammatory diseases. N Engl J Med, v. 336, n. 15, p. 1066-71,
1997.
BARNES, P.J. Anti-inflammatory actions of glucocorticoids: molecular

mechanisms. Clin Sci, v. 94, n. 6, p. 557-572, 1998.
BAUHMAN, H.; GAULDIE, J. The acute phase response. Immunol Today,

v.15, n. 2, p. 74-80, 1994.
BELAL, N. et al. Thuja occidentalis (Arbor vitae): A Review of its

Pharmaceutical, Pharmacological and Clinical Properties. Adv Aces Publicat,
p. 69-78, 2005.
BISWAS, R. et al. Thujone-rich fraction of Thuja occidentalis demonstrates

major anti- cancer potentials: evidences from in vitro studies on A375 cells.
Evid-based Complement AlternMed, p. 1–16, 2011.
76
BLANTZ, R. C.; MUNGER, K. Role of nitric oxide in inflammatory conditions.

Nephron, v. 90, p. 373-378, 2002.
BLOODSWORTH, A.; O'DONNELL, V. B.; FREEMAN, B. A. Nitric oxide

regulation of free radical- and enzyme-mediated lipid and lipoprotein oxidation.
Arterioscler Thromb Vasc Biol, v. 20, n. 7, p. 1707-15, 2000.
BONILLA, F.A.; OETTGEN, H.C. Adaptive immunity. J Allergy Clin

Immunol, v. 125, n. 2, p.33-40, 2010.
BOTTING R.M. Review Cyclooxygenase: Past, present and future. A tribute to

John R. Vane(1927–2004). J Therm Biol, v. 31, n. 1-2, p. 208-219, 2006.
BRADLEY, P.P. et al. Measurement of cutaneous inflammation: estimation of

neutrophil content with an enzyme marker, J Invest Dermatol, v. 78, p. 206–
209, 1982.
BRENNER, D.; BLASER, H.; MAK, T.W. Regulation of tumour necrosis factor
signalling: live or let die. Nat Rev Immunol, v. 15, n. 6, p. 362-74, 2015.
BRIJESH, K. et al. Phytoconstituents and Therapeutic potential of Thuja

occidentalis. Biol Chem Sci, v. 3, n. 2, p. 354–362, 2012.
BRINKMANN, V. et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science, v.

303, n.5663, p. 1532-1535, 2004.
CALIXTO, J.B. Biodiversidade como fonte de medicamentos. Cienc. Cult, v.

55, n. 3, p. 37-39, 2003.
CALIXTO, J.B. Twenty-five years of research on medicinal plants in Latin

America: a personal view. J Ethnopharmacol, v. 100, n. 1-2, p. 131-134, 2005.
CAMPOS, M. M.; CALIXTO, J. B. Involvement of B1 and B2 receptors in

bradykinin-induced rat paw oedema. Br J Pharmacol, v. 114, n. 5, p. 1005-
1013, 1995.
CAMPOS, M. M.; HENRIQUES, M. G.; CALIXTO, J. B. The role of B1 and B2

kinin receptors in oedema formation after long-term treatment with
Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG). Br J Pharmacol, v. 120,
n. 3, p. 502-8, 1997
CANO, P. M.; VARGAS, A.; LAVOIE, J. P. A real-time assay for neutrophil

chemotaxis. Biotechniques, v, 60, p. 245-251, 2016.
CARVALHO, N.S. et al. Gastroprotective properties of cashew gum, a complex

heteropolysaccharide of Anacardium occidentale, in naproxen-induced
gastrointestinal damage in rats. Drug Dev Res, v. 76, p. 143-51, 2015.
CASTELLÓN, M.A. et al. Obtenção e controle de qualidade da tintura-mãe de

Thuja occidentalis. Pesquisa homeopática, v. 15, n. 1, p.67-75. 2000.
77
CHANG, L.C. et al. Bioactive constituents of Thuja occidentalis. J Nat Prod, v.

63, p.1235-1238. 2000.
CHAVES, L.S. et al. Antiinflammatory and antinociceptive effects in mice of a

sulfated polysaccharide fraction extracted from the marine red algae Gracilaria
caudata. Immunopharmacol Immunotoxicol, v.35, n. 1, p. 93–100, 2013.
CHURCH, L.D.; COOK, G.P.; MCDERMOTT, M.F. Primer: inflammasomes and

interleukin 1beta in inflammatory disorders. Nat Clin Pract Rheumatol, v. 4, n.
1, p. 34-42, 2008.
COLGAN, S. P. Neutrophils and inflammatory resolution in the mucosa. Semin

Immunol, v. 27, n. 3, p. 177-83, 2015.
COLGAN, S. P.; CAMPBELL, E. L.; KOMINSKY, D. J. Hypoxia and Mucosal

Inflammation. Annu Rev Pathol, v. 11, p. 77-100, 2016.
COMMINS, S.P.; BORISH, L.; STEINKE, J.W. Immunologic messenger

molecules: cytokines, interferons, and chemokines. J Allergy Clin Immunol, v.
125, n. 2, p. 53-72, 2010.
COURA, C. O. et al. Mechanisms involved in the anti-inflammatory action of a

polysulfated fraction from Gracilaria cornea in rats. PLoS One, v. 10, n. 3, p.
e0119319, 2015.
COUSSENS, L. M.; WERB, Z. Inflammation and cancer. Nature, v. 420, n.

6917, p. 860-867, 2002.
COUTINHO, A. E.; CHAPMAN, K. E. The anti-inflammatory and

immunosuppressive effects of glucocorticoids, recent developments and
mechanistic insights. Mol Cell Endocrinol, v. 335, n. 1, p. 2-13, 2011.
CRAGG, G. M.; NEWMAN, D.J. Natural products: a continuing source of novel

drug leads. Biochim Biophys Acta, v. 1830, n. 6, p. 3670-3695, 2013.
CREAN, D.; GODSON, C. Specialised lipid mediators and their targets. Semin
Immunol, v. 27, n. 3, p. 169-76, 2015.
CRUVINEL, W.M. et al. Immune system: Part I. Fundamentals of innate

immunity with emphasis on molecular and cellular mechanisms of inflammatory
response. Rev Bras Reumatol, v. 50, n. 4, p. 434-447, 2010.
CUNHA, F. Q. et al. Blockade by fenspiride of endotoxin-induced neutrophil

migration in the rat. Eur J Pharmacol, v. 238, n. 1, p. 47-52, 1993.
CUNHA, V.R. et al. Delivery system for mefenamic acid based on the
nanocarrier layered double hydroxide: Physicochemical characterization and
evaluation of anti-inflammatory and antinociceptive potential. Mater. Sci. Eng.
C. Mater. Biol., v. 58, 629–638, 2016.
78
CURFS, J. H.; MEIS, J. F.; HOOGKAMP-KORSTANJE, J. A. A primer on

cytokines: sources, receptors, effects, and inducers. Clin Microbiol Rev, v. 10,
n. 4, p. 742-80, 1997.
DALE, D.C.; BOXER, L.; LILES, W.C. The phagocytes: neutrophils and
monocytes. Blood, v. 112, n. 4, p. 935-945, 2008.
DAMASCENO, S.R. et al. Carvacryl acetate,a derivative of carvacrol, reduces

nociceptive and inflammatory response in mice. Life Sci, v. 94, n. 1, p. 58–66,
2014.
DAS, S. et al. Biosynthesized silver nanoparticles by ethanolic extracts of

Phytolacca decandra, Gelsemium sempervirens, Hydrastis canadensis and
Thuja occidentalis induce differential cytotoxicity through G2/M arrest in A375
cells. Colloids Surf BBiointerfaces, v. 101, p. 325-36, 2013.
DAS, S.; RANI, R. Antioxidant and gastroprotective properties of the fruits of

Thuja occidentalis. Linn. Asian J Biochem Pharm Res, v. 3, p. 80–87, 2013.
DE OLIVEIRA, C. M. et al. Cytokines and pain. Rev Bras Anestesiol, v. 61, n.

2, p. 255-259, 2011.
DE OLIVEIRA, S. et al. ATP Modulates Acute Inflammation In Vivo through

Dual Oxidase 1–Derived H2O2 Production and NF-κB Activation. J. Immunol.,
v.192, p. 5710-5719, 2014.
DE OLIVEIRA, S.; ROSOWSKI, E.E.; HUTTENLOCHER, A. Neutrophil

migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nat Rev
Immunol, v. 16, n. 6p. 378-391, 2016.
DE TONI, L. G. et al. Inflammatory mediators involved in the paw edema and

hyperalgesia induced by Batroxase, a metalloproteinase isolated from Bothrops
atrox snake venom. Int Immunopharmacol, v. 28, n. 1, p. 199-207, 2015.
DELVES, P.J.; ROITT, I.M. The immune system. Second of two parts. N Engl J
Med, v. 343, n. 1, p. 108-17, 2000.
DENNIS, E. A.; NORRIS, P. C. Eicosanoid storm in infection and inflammation.

Nat Rev Immunol, v. 15, n. 8, p. 511-23, 2015.
DHIMAN, A. et al. An appraisal on pharmacognosy, phytochemistry and

bioactivity of Thuja occidentalis Linn. (Cupressaceae). J.Pharm.Sci.Innov, v.1,
n.1. 2012.
DIJKSTRA, D. et al. Histamine downregulates monocyte CCL2 production

through the histamine H4 receptor. J Allergy Clin Immunol, v. 120, n. 2, p.
300-7, 2007a.
DIJKSTRA, D. et al. Histamine downregulates monocyte CCL2 production

through the histamine H4 receptor. J Allergy Clin Immunol, v. 120, n. 2, p.
300-7, 2007b.
79
DINARELLO, C.A. Historical Review of Cytokines. Eur J Immunol, v. 37, n. 1,

p. 34-45, 2007.
DUBEY, S.K.; BATRA, A. Anti-diabetic activity of Thuja occidentalis Linn. RJPT,

v. 1, n. 4, p. 362-365, 2008.
DUBEY, S.K.; BATRA, A. Hepatoprotective Activity from ethanol fraction of

Thuja occidentalis Linn. AJRC, v. 1, n.1, p. 32-35, 2008.
DUBEY, S.K.; BATRA, A. Role of Phenolics in Anti-Atherosclerotic Property of

Thuja occidentalis Linn. Ethnobot Leaflets, v. 13, p. 791-800, 2009.
DUNKELBERGER, J.R.; SONG, W.C. Complement and its role in innate and
adaptive immune responses. Cell Res,v. 20, n. 1, p. 34-50, 2010.
DUTRA, R. C. et al. Medicinal plants in Brazil: Pharmacological studies, drug

discovery, challenges and perspectives. Pharmacol Res, 2016.
EKSTEIN, D.; SCHACHTER, S.C. Natural Products in Epilepsy—the Present

Situation and Perspectives for the Future. Pharmaceuticals, v. 3, n. 5, p.
1426–1445, 2010.
FANG, H. et al. Balancing Innate Immunity and Inflammatory State via

Modulation of Neutrophil Function: A Novel Strategy to Fight Sepsis. J
Immunol Res, v. 2015, p. 1 - 8, 2015.
FIGUEIRÊDO, C.B.M. et al. Physical-chemical characterization, anatomical and

seasonal evaluation of Thuja occidentalis L. (Cupressaceae).Int J Pharm Sci
Res, v. 5, p. 1721-1731, 2014.
FUJISHIMA, S. et al. Regulation of neutrophil interleukin 8 gene expression and

protein secretion by LPS, TNF-alpha, and IL1 beta. J. Cell. Physiol., v.154, p.
478-85, 1993.
FULLERTON, J. N.; GILROY, D. W. Resolution of inflammation: a new

therapeutic frontier. Nat Rev Drug Discov, 2016. Disponível em:
http://www.nature.com/nrd/journal/vaop/ncurrent/pdf/nrd.2016.39.pdf.
Acesso em 10 de abril de 2016.
GAWEL, S. et al. Malondialdehyde (MDA) as a lipid peroxidation marker. Wiad.

Lek, v. 57, p. 453-5, 2004.
GILROY, D.; DE MAEYER, R. New insights into the resolution of inflammation.

Semin Immunol, v. 27, n. 3, p. 161-168, 2015.
GOLIAS, C. et al. The kinin system-bradykinin: biological effects and clinical

implications. Multiple role of the kinin system-bradykinin. Hippokratia, v.11, p.
124-128,2007.
80
GOMIDES, L.F. et al. Blockade of proteinase-activated receptor 4 inhibits

neutrophil recruitment in experimental inflammation in mice. Inflamm Res, v.
63, n. 11, p. 935-41, 2014.
GURIB-FAKIM, A. Medicinal plants: traditions of yesterday and drugs of

tomorrow. Mol Aspects Med, v. 27, n. 1, p. 1-93, 2006.
GUZIK, T.J., KORBUT, R., ADAMEK-GUZIK, T. Nitric oxide and superoxide in

inflammation and immune regulation. J. Physiol. Pharmacol., v. 54, p. 469-
487, 2003.
HAKIM, J. Reactive oxygen species and inflammation. Seances. Soc. Biol.

Fil., v. 187, p. 286-95, 1993.
HAMPTON, M. B.; KETTLE, A. J.; WINTERBOURN, C. C. Inside the neutrophil

phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood, v. 92, n. 9,
p.3007-3017, 1998.
HAN, Y.J. et al. Antioxidant enzymes suppress nitric oxide production through
the inhibition of NF-kappa B activation: role of H(2)O(2) and nitric oxide in
inducible nitric oxide synthase expression in macrophages. Nitric Oxide, v. 5,
n. 5, p. 504-513, 2001.
HARVEY, A. L.; EDRADA-EBEL, R.; QUINN, R. J. The re-emergence of natural

products for drug discovery in the genomics era. Nat Rev Drug Discov, v. 14,
n. 2, p. 111-29, 2015.
HAUSER, S. L.; OKSENBERG, J. R. The neurobiology of multiple sclerosis:

genes, inflammation, and neurodegeneration. Neuron, v. 52, n. 1, p. 61-76,
2006.
HEADLAND, S. E.; NORLING, L. V. The resolution of inflammation: Principles

and challenges. Semin Immunol, v. 27, n. 3, p. 149-60, 2015
.
HENGGE, U. R. et al. Adverse effects of topical glucocorticosteroids. J Am
Acad Dermatol, v. 54, n. 1, p. 1-15, 2006.
HWANG, Y.S. et al. Isolation and identification of mosquito repellents in

Artemisia vulgaris. J Chem Ecol, v.11, p. 1297–1306, 1985.
ISLAM, M. A. et al. Natural Products Towards the Discovery of Potential Future

Antithrombotic Drugs. Curr Pharm Des, v. 22, n. 20, p. 2926-2946, 2016.
JAHAN, N. et al. Antimicrobial screening of some medicinal plants of Pakistan.

Pak J Bot, v. 42, n.6, p.4281–4284, 2010.
JUNG, H.W. et al. Effect ofthe semen extract of Thujaorientalis on inflammatory

responses in transient cerebral ischemia rat model and LPS-stimulated BV-2
microglia. Am J Chin Med., v.1, n. 41, p. 99-117, 2013.
81
JÚNIOR, C. V.; BOLZANI, V. S.; BARREIRO, E.J. The natural products and the
modern medicinal chemistry. Quim. Nova, v. 29, n. 2, p. 326-337, 2006.
KHAN, F.A.; KHAN, M.F. Inflammation and acute phase response. Int J Appl
Biol Pharm, v. 1, n. 2, p. 312-321, 2010.
KIM, J.Y. et al. Methylene chloride fraction of the leaves of Thuja orientalis
inhibits in vitro inflammatory biomarkers by blocking NF-κB and p38 MAPK
signaling and protects mice from lethal endotoxemia. J Ethnopharmacol,
v.133, n. 2, p.687–695, 2011.
KIM, T.H. et al. A new labdane diterpenoid with anti-inflammatory activity from
Thuja orientalis. J Ethnopharmacol, v.3, n. 146, p.760-767, 2013.
KIMURA, L. F. et al. Mast cells and histamine play an important role in edema
and leukocyte recruitment induced by Potamotrygon motoro stingray venom in
mice. Toxicon, v. 103, p. 65-73, 2015.
KOBAYASHI, S. D.; VOYICH, J. M.; DELEO, F. R. Regulation of the neutrophil-

mediated inflammatory response to infection. Microbes Infect, v. 5, n. 14, p.
1337-44, 2003.
KOEHN, F. E.; CARTER, G. T. The evolving role of natural products in drug

discovery. Nat Rev Drug Discov, v. 4, n. 3, p. 206-20, 2005.
KOPF, M. et al. Impaired immune and acute-phase responses in interleukin-6-

deficient mice. Nature, v. 368, n. 6469, p. 339-42, 1994.
LALRINZUALI, K.; VABEIRYUREILAI, M.; JAGETIA, G. C. Investigation of the

Anti-Inflammatory and Analgesic Activities of Ethanol Extract of Stem Bark of
Sonapatha Oroxylum indicum In Vivo. Int J Inflam, p.1-8, 2016
LANGER, H. F.; CHAVAKIS, T. Leukocyte-endothelial interactions in

inflammation. J Cell Mol Med, v. 13, n. 7, p. 1211-20, 2009.
LEE, I.A.; KIM, E.J.; KIM, D.H. Inhibitory effect of B-sitosterol on TNBS- induced
colitis in mice. Planta Med, v.78, p. 896–898, 2012.
LEONARD, W. J.; LIN, J. X. Cytokine receptor signaling pathways. J Allergy

Clin Immunol, v. 105, n. 5, p. 877-888, 2000.
LEY, K. et al. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion

cascade updated. Nat Rev Immunol, v. 7, n. 9, p. 678-689, 2007.
LIU, Z. G. Molecular mechanism of TNF signaling and beyond. Cell Res, v. 15,
n. 1, p. 24-27, 2005.
LOKESH, D.A et al. ntidiarrhoeal activity of Thuja occidentalis Linn. Ethanol

extract on experimental animal. Indian Drugs, v.44, n. 4, p. 319-321, 2007.
82
LORIA, V. et al. Myeloperoxidase: a new biomarker of inflammation in ischemic

heart disease and acute coronary syndromes. Mediators Inflamm., v. 2008, p.
1-4, 2008.
LUCKHEERAM, R.V. et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin

Dev Immunol, v. 2012, p.1-12, 2012.
LUSTER, A.D.; ALON, R.; VON ANDRIAN, U. H. Immune cell migration in

inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology, v.6,
p.1182-1190, 2005.
MALING, H.M. et al. Inflammation induced by histamine, serotonin, bradykinin

and compound 48/80 in the rat: antagonists and mechanisms of action. J.
Pharmacol. Exp. Med., v. 191, p. 300–310, 1974.
MANTOVANI, A.; BONECCHI, R.; LOCATI, M. Tuning inflammation and

immunity by chemokine sequestration: decoys and more. Nat Rev Immunol, v.
6, n. 12, p. 907-918, 2006.
MARCEAU, F.; BACHVAROV, D.R. Kinin receptors. Clin Rev Allergy

Immunol, v. 16, n. 4, p. 385-401, 1988.
MCINNES, I.B.; SCHETT, G. Cytokines in the pathogenesis of rheumatoid

arthritis. Nat. Rev. Immunol., v.7, p. 429-442, 2007.
MEDZHITOV R.; JANEWAY. C.JR. Innate immunity. N Engl J Med, v. 343, n.5,
p. 338-344, 2000.
MEDZHITOV, R. Inflammation 2010: new adventures of an old flame. Cell, v.

140, n. 6, p. 771-776, 2010.
MEDZHITOV, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature, v. 454,

n. 24, p. 428-435, 2008.
MESQUITA JÚNIOR, D. et al. Immune system-part II: basis of the

immunological response mediated by T and B lymphocytes. Rev Bras
Reumatol, v. 50, n. 5, p. 552-580, 2010.
MISHRA, B. B.; TIWARI, V. K. Natural products: an evolving role in future drug

discovery. Eur J Med Chem, v. 46, n. 10, p. 4769-807, 2011.
MITTAL, M. et al. Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury.

Antioxid. Redox. Signal., v.20, p.1126-1167, 2014.
MIZOKAMI, S, S. et al. Pimaradienoic Acid Inhibits Carrageenan-Induced

Inflammatory Leukocyte Recruitment and Edema in Mice: Inhibition of Oxidative
Stress, Nitric Oxide and Cytokine Production. PLoS One. v.2, n. 11, 2016.
MOGENSEN, T. H.Pathogen recognition and inflammatory signaling in innate

immune defenses.Clin Microbiol Rev, v. 2, n. 22, p.240-73, 2009.
83
MULLER, W. A. Getting leukocytes to the site of inflammation. Vet Pathol, v.

50, n. 1, p. 7-22, 2013.
NAGY, J, A. et al. Vascular permeability, vascular hyperpermeability and

angiogenesis. Angiogenesis, v. 11, n. 2, p. 109-119, 2008.
NAKAMURA, K. et al. Involvement of CD4 D3–D4 membrane proximal

extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-
induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation. Mol
immunol, v. 39, n. 15, p. 909-921, 2003.
NAM, S.H.; KANG, M.Y. Antioxidant activity of Medicinal Plants. Pharma

Biotechnol, v. 42, p.409. 2005.
NASER, B. et al. Thuja occidentalis L. (Arbor vitae): A review of its

pharmaceutical, pharmacological and clinical properties. Evid Based
Complement Alternat Med, v. 2, p.69-78. 2005.
NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. M. Natural products as sources of new drugs over

the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod, v. 75, n. 3, p. 311-35, 2012.
OFFERGELD, R. et al. Mitogenic activity of high molecular polysaccharide

fractions isolated from the cuppressaceae Thuja occidentalis L. enhanced
cytokine-production by thyapolysaccharide, g-fraction (TPSg). Leukemia, v. 3,
p. 189S-191S, 1992
OFFERGELD, R. et al. Mitogenic activity of high molecular polysaccharide

fractions isolated from the cuppressaceae Thuja occidentalis L. enhanced
cytokine-production by thyapolysaccharide, g-fraction (TPSg). Leukemia, v. 3,
p. 189S-191S, 1992
OPAL, S.M.,DEPALO, V.A. Anti-inflammatory cytokines. Chest, v. 117, n. 4, p.

1162-72, 2000.
OSTUNI, R. et al. Epigenetic regulation of neutrophil development and

function. Semin Immunol, v. 28, n. 2, p. 83-93, 2016.
PARK, J.Y.; PILLINGER, M.H.; ABRAMSON, S.B. Prostaglandin E2 synthesis

and secretion: the role of PGE2 synthases. Clin Immunol, v.119, n. 3, p. 229-
240, 2006.
PATON, W.D. Compound 48/80: a potent histamine liberator. Br. J.

Pharmacol, v.6, p.499-508, 1951.
PEARSON, M. J.; LIPOWSKY, H. H. Effect of fibrinogen on leukocyte

margination and adhesion in postcapillary venules. Microcirculation, v. 11, n.
3, p. 295-306, 2004.
PERRETTI, M. et al. Resolution Pharmacology: Opportunities for Therapeutic

Innovation in Inflammation. Trends Pharmacol Sci, v. 36, n. 11, p. 737-55,
2015.
84
PERRETTI, M. Endogenous mediators that inhibit the leukocyte-endothelium

interaction.Trends Pharmacol Sci ,v. 11, n. 18, p. 418-425, 1997.
PERRETTI, M. The resolution of inflammation: New mechanisms in patho-

physiology open opportunities for pharmacology. Semin Immunol, v. 27, n. 3,
p. 145-148, 2015.
POSADAS, I. et al. Carrageenan-induced mouse paw o edema is biphasic, age-

weight dependent and displays differential nitric oxide cyclooxygenase-2
expression, Br. J. Pharmacol,v. 142, p.331-338, 2004.
PUNCHARD, N.A.; WHELAN, C.J.; ADCOCK, I. The journal of inflammation. J

Inflamm, v.1, n.1, p.1, 2004.
RAKOFF-NAHOUM, S.; MEDZHITOV, R. Innate immune recognition of the

indigenous microbial flora. Mucosal immunol, v. 1, p. S10-S14, 2008.
REIS, F.S. et al. Biomolecule profiles in inedible wild mushrooms with

antioxidant value. Molecules, v. 16, n. 6, p. 4328-4338, 2011.
REN, K.; TORRES, R. Role of interleukin-1beta during pain and inflammation.

Brain Res Rev, v.60, n. 1, p. 57-64, 2009.
REUTER, S. et al. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they
linked? Free. Radic. Biol. Med., v.49, p.1603-1616, 2010.
RICCIOTTI, E.; FITZGERALD, G. A. Prostaglandins and inflammation.

Arterioscler Thromb Vasc Biol, v. 31, n. 5, p. 986-1000, 2011.
ROCK, K. L.; KONO, H.The inflammatory response to cell death. Annu Rev
Pathol, v. 3, p. 99-126, 2008.
RYAN, G.B.; MAJNO, G. Acute inflammation. A review. Am J Pathol, v. 86, n.

1, p. 183, 1977.
SALLUSTO, F.; BAGGIOLINI, M. Chemokines and leukocyte traffic. Nat

Immunol, v. 9, n. 9, p. 949-52, 2008.
SANTIAGO, R.F. et al., Riparin B, a Synthetic Compound Analogue of Riparin,

Inhibits the Systemic Inflammatory Response and Oxidative Stress in Mice.
Inflammation, v. 38, n. 6, p. 2203-2215, 2015
SCHÄCKE, H.; DÖCKE, W. D.; ASADULLAH, K. Mechanisms involved in the

side effects of glucocorticoids. Pharmacol Ther, v. 96, n. 1, p. 23-43, 2002.
SCHELLER, J. et al. The pro- and anti-inflammatory properties of the cytokine

interleukin-6. Biochim. Biophys. Acta., v.1813, p.878-888, 2011.
SCHETT, G. et al. How cytokine networks fuel inflammation: Toward a cytokine-

based disease taxonomy. Nat Med, v. 19, n. 7, p. 822-824, 2013.
85
SCOTTI, L et al. Chemometric studies on natural products as potential inhibitors

of the NADH. Molecules, v. 15, n. 10, p. 7363-7377, 2010.
SERHAN, C.N.; CHIANG, N.; DALLI, J. The resolution code of acute

inflammation: novel pro-resolving lipid mediators in resolution. Semin Immunol,
v.27, n. 3, p. 200-215, 2015.
SHAJIB, M.S., KHAN, W.I. The role of serotonin and its receptors in activation
of immune responses and inflammation. Acta. Physiol. (Oxf)., v.213, p.561-
574, 2015.
SHARMA, J.N., AL-OMRAN, A., PARVATHY, S.S. Role of nitric oxide in

inflammatory diseases. Inflammopharmacology, v. 2, n. 15, p. 252-259, 2007.
SHERWOOD, E.R.; TOLIVER-KINSKY, T. Mechanisms of the inflammation
response. Best Pract Res Clin Anaesthesiol, v.18, n.3, p. 385-405, 2004.
SHI, C. et al. Incorporation of B-sitosterol into the membrane prevents tumor

necrosis factor-a-induced nuclear factor-kB activation and gonadotropin
releasing hormone decline. Steroids, v.96, p.1–6. 2015.
SHU, Y. Z. Recent natural products based drug development: a pharmaceutical

industry perspective. J Nat Prod, v. 61, n. 8, p. 1053-1071, 1998.
SILVA, R. O. et al. Phytol, a diterpene alcohol, inhibits the inflammatory

response by reducing cytokine production and oxidative stress. Fundam Clin
Pharmacol, v. 28, n. 4, p. 455-64, 2014.
SILVA, R. O. et al. Sulfated-polysaccharide fraction from red algae Gracilaria

caudata protects mice gut against ethanol-induced damage. Mar Drugs, v. 9, n.
11, p. 2188-200, 2011.
SILVA, R. O. et al. Riparin A, a compound from Aniba riparia, attenuate the

inflammatory response by modulation of neutrophil migration. Chem Biol
Interact, v. 229, p. 55-63, 2015.
SILVA, R.O. et al. Evaluation of the anti‐inflammatory and antinociceptive

effects of myrtenol, a plant‐derived monoterpene alcohol, in mice. Flavour
Frag. J, v. 29, p. 184-192, 2014.
SILVA, R.O. et al. Polysaccharide fraction isolated from Passiflora edulis

inhibits the inflammatory response and the oxidative stress in mice. J Pharm
Pharmacol, v. 67, n. 7, p. 1017-1027, 2015.
SILVA, V. G.; et al. Anti-inflammatory and antinociceptive activity of

epiisopiloturine, an imidazole alkaloid isolated from Pilocarpus microphyllus. J
Nat Prod, v. 76, n. 6, p. 1071-1077, 2013.
86
SOSTRES, C. et al. Adverse effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs

(NSAIDs, aspirin and coxibs) on upper gastrointestinal tract. Best Pract Res
Clin Gastroenterol, v. 24, n. 2, p. 7-22, 2010.
SOUZA, A.W. S. et al. Immune system: part III. The delicate balance of the
immune system between tolerance and autoimmunity.Rev Bras Reumatol, v.
50, n. 6, p. 665-679, 2010.
SOUZA, D.G. et al. Role of bradykinin B2 and B1 receptors in the local, remote,
and systemic inflammatory responses that follow intestinal ischemia and
reperfusion injury. J Immunol, v.172, p. 2542-2548, 2004.
SRIKANTA, B.; SIDDARAJU, M.; DHARMESH, S. A novel phenol-bound pectic

polysaccharide from Decalepis hamiltonii with multi-step ulcer preventive
activity. World J Gastroenterol, v.13, p. 5196-5207, 2007.
STROBER, W., FUSS, I.J. Proinflammatory cytokines in the pathogenesis of

inflammatory bowel diseases. Gastroenterol, v.140, p.1756-1767, 2011.
STROHL, W. R. The role of natural products in a modern drug discovery

program. Drug Discov Today, v. 5, n. 2, p. 39-41, 2000.
STUART, E.; TURVEY, S.E.; BROIDE, D.H. Innate immunity. J Allergy Clin
Immunol, v. 125, n. 2, p.24-32, 2010.
SULEA, D.; LECA, M. Collagen-Thuja tincture biomaterials for wound treatment.

Rev Roum Chim, v.54, p.1097-1101, 2009.
SUNILA, E.S.,KUTTAN, G. Protective effect of Thuja occidentalis against

radiation- induced toxicity in mice. Integr. Cancer Ther, v. 4, n.4, p. 322–328,
2005.
SUNILA, E.S.; HAMSA, T.P.; KUTTAN, G. Effect of Thuja occidentalis and its
polysaccharide on cell-mediated immune responses and cytokine levels of
metastatic tumor-bearing animals. Pharma Biology, v.49, p.1065– 1073, 2011.
SYLVIA LUCAS, M.D. The Pharmacology of Indomethacin. Headache, v. 56, n.

2, p. 436-446, 2016.
THURMOND, R.L.; GELFAND, E.W.; DUNFORD, P.J. The role of histamine H1

and H4 receptors in allergic inflammation: the search for new antihistamines.
Nat Rev Drug Discov, v. 7, n. 1, p. 41-53, 2008.
THURSTON, G. et al. Angiopoietin-1 protects the adult vasculature against

plasma leakage. Nature Medicine, v. 6, p. 460-463, 2000.
TSIRI, D. et al. Chemosystematic value of the essential oil composition of Thuja

species cultivated in Poland-antimicrobial activity. Molecules, v.14, p.4707-
4715, 2009.
87
VALERIO, M.; AWAD, A.B. B-Sitosterol down-regulates some pro-inflammatory

signal transduction pathways by increasing the activity of tyrosine phosphatase
SHP-1 in J774A.1 murine macrophages. Int Immunopharmacol, v.11, p.1012–
7, 2011.
VAN AS, S. NSAIDs can have adverse effects on bone healing. Med
Hypotheses, v. 81, n. 2, p. 343-6, 2013.
VAN ESCH, R.W.; KOOL, M.M.; VAN AS, S. NSAIDs can have adverse effects
on bone healing. Med Hypotheses, v.81, n. 2, p. 343-3346, 2013.
VAN ESCH, R. W.; KOOL, M. M.; VANE, J. R. Inhibition of prostaglandin

synthesis as a mechanism of action for aspirin-like drugs. Nat New Biol, v. 231,
n. 25, p. 232-5, 1971.
VONKEMAN, H.E.; VAN DE LAAR, M.A. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs:

adverse effects and their prevention. Semin Arthritis Rheum, v. 39, n. 4, p.
294-312, 2010.
WAJANT, H.; PFIZENMAIER, K.; SCHEURICH, P. Tumor necrosis factor

signaling. Cell Death Differ, v. 10, n. 1, p. 45-65, 2003.
WALLACE, J. L. et al. NSAID-induced gastric damage in rats: requirement for

inhibition of both cyclooxygenase 1 and 2. Gastroenterology, v. 119, n. 3, p.
706-14, 2000.
WALLACE, J. L. Nitric oxide as a regulator of inflammatory processes. Mem

Inst Oswaldo Cruz, v. 100, p. 5-9, 2005.
WALLACE, J. L. et al. Gaseous mediators in resolution of inflammation. Semin

Immunol, v.27, n. 3, p. 227-233, 2015.
WARRINGTON, R. et al. An introduction to immunology and immunopathology.

Allergy Asthma Clin Immunol, v. 7, n. 1, p. 1, 2011.
WILLIAMS, C. S.; MANN, M.; DUBOIS, R. N. The role of cyclooxygenases in

inflammation, cancer, and development. Oncogene, v. 18, n. 55, p. 7908-16,
1999.
WYNN, T.A. Type 2 cytokines: mechanisms and therapeutic strategies. Nat

Rev Immunol, v. 15, n. 5, p. 271-282, 2015.
XU, H. et al. Genetic consequences of fragmentation in "arbor vitae," eastern

white cedar (Thuja occidentalis L.), toward the northern limit of its distribution
range. Ecol Evol, v. 2, n. 10, p. 2506-2520, 2012.
YIMAM, M. et al. Analgesic and anti-inflammatory effects of UP1304, a

botanical composite containing standardized extracts of Curcuma longa and
Morus alba. J Integr Med, v. 14, n. 1, p. 60-8, 2016.
88
ZHANG, J. M.; AN, J. Cytokines, inflammation, and pain. Int Anesthesiol Clin,
v. 45, n. 2, p. 27-37, 2007.
ZHOU, J.; CIDLOWSKI, J. A. The human glucocorticoid receptor: one gene,

multiple proteins and diverse responses. Steroids, v. 70, n. 5-7, p. 407-17,
2005.
89
ANEXO
90
APÊNDICES
91
92
93
94
95
96

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ

IRISMARA SOUSA SILVA

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DO EXTRATO

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DO EXTRATO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Orientador: Prof. Dr. JAND VENES ROLIM MEDEIROS

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-INFLAMATÓRIO DO EXTRATO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia do

Aprovada em: ____/____/_________

PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

VICE-DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

Aos membros da banca, à Profª. Drª. Rosimeire Ferreira dos Santos,

Ao Laboratório de Farmacologia da Inflamação e do Câncer (LAFICA) da

À CAPES/CNPq pelo consentimento da bolsa.

Enfim, agradeço a todos que fizeram parte deste caminho de

A indução da inflamação aguda representa o principal mecanismo pelo qual o sistema

Palavras-chave: Cupressaceae; polissacarídeos; inflamação; citocinas, estresse

Keywords: Cupressaceae, polysaccharide, inflammation, cytokines, oxidative stress

FIGURA 1: Representação esquemática da integração do sistema imunológico

1.1 A INFLAMAÇÃO ........................................................................................ 15

1.1.1 Eventos vasculares da resposta inflamatória .......................................... 20

1.1.2 Eventos celulares da resposta inflamatória ............................................. 21

1.1.3 Papel dos neutrófilos na inflamação aguda ............................................. 24

1.1.4 Mediadores envolvidos nos processos inflamatórios .............................. 25

Aminas Vasoativas ........................................................................................... 25

Metabólitos do Ácido Araquidônico (AA) .......................................................... 29

1.2 FÁRMACOS ANTI-INFLAMATÓRIOS ...................................................... 30

1.3 PLANTAS MEDICINAIS ............................................................................ 32

1.4 O GÊNERO THUJA ................................................................................... 35

1.4.1 T. occidentalis L. composição fitoquímica e atividades farmacológicas .. 36

2.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................... 39

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................... 39

3.1 OBTENÇÃO DO EXTRATO E DA FRAÇÃO POLISSACARÍDICA DE T.

3.2 DROGAS E REAGENTES ......................................................................... 42

3.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL .......................................................... 43

3.5 EFEITO DO EA E PLS SOBRE O EDEMA DA PATA INDUZIDO POR

3.6 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA...................................................................... 45

3.7 ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA PARA COX-2 E iNOS ........................ 45

3.8 EFEITO DE EA E PLS SOBRE EDEMA DA PATA INDUZIDO POR

3.9 PERITONITE INDUZIDA POR CARRAGENINA ........................................ 47

3.10 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA MIELOPEROXIDASE (MPO) 47

3.11 ANÁLISE DAS CONCENTRAÇÕES DE TNF-α E IL-6 ............................ 48

3.12 ANÁLISE DAS CONCENTRAÇÕES DE GLUTATIONA (GSH) ............... 48

3.13 ANÁLISE DOS NÍVEIS DE MALONDIALDEÍDO (MDA)........................... 49

3.14 ANÁLISE DAS CONCENTRAÇÕES DE NITRITO (NO2-) ........................ 50

3.15 AVALIAÇÃO DA PERMEABILIDADE VASCULAR .................................. 50

3.16 ANÁLISE DO EFEITO DO EA E PLS SOBRE A TOXICIDADE GÁSTRICA

3.17 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................... 51

4.1 EFEITO DO EA E PLS NO EDEMA DE PATA INDUZIDO POR

4.2 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA...................................................................... 52

4.3 EFEITO DO EA E PLS NA ANÁLISE IMUNOHI-STOQUÍMICA PARA iNOS

4.4 EFEITO DO EA E PLS NO EDEMA DE PATA INDUZIDO POR

4.5 EFEITO DO EA E PLS NA PERITONITE INDUZIDA POR CARRAGENINA

4.6 EFEITO DO EA E PLS NA ATIVIDADE DA MPO ...................................... 60

4.8 EFEITO DO EA E PLS NAS CONCENTRAÇÕES DE GLUTATIONA (GSH)

4.9 EFEITO DO EA E PLS NOS NÍVEIS DE MALONDIALDEÍDO (MDA) ....... 62

4.10 EA E PLS INIBE A PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (NO) NA

4.11 EFEITO DO EA E PLS NA PERMEABILIDADE VASCULAR................... 64

4.12 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE GÁSTRICA ............................................. 65

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 75

Aprovada em: //_____