2019 Tese Mysdfernandes

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
MARA YONE SOARES DIAS FERNANDES
α-BISABOLOL PROTEGE DA LESÃO CEREBRAL ISQUÊMICA, POR UM

MECANISMO QUE ENVOLVE INIBIÇÃO DA INFLAMAÇÃO E DO
ESTRESSE OXIDATIVO.
FORTALEZA
2019

MECANISMO QUE ENVOLVE INIBIÇÃO DA APOPTOSE, INFLAMAÇÃO E
DO ESTRESSE OXIDATIVO
Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Farmacologia da
Universidade Federal do Ceará, como
requisito parcial à obtenção do título de
Doutor em Farmacologia. Área de
concentração: Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Geanne Matos de

Andrade
FORTALEZA
2019

MECANISMO QUE ENVOLVE INIBIÇÃO DA APOPTOSE, INFLAMAÇÃO E
DO ESTRESSE OXIDATIVO
Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Farmacologia da
Universidade Federal do Ceará, como
requisito parcial à obtenção do título de
Doutor em Farmacologia. Área de
concentração: Farmacologia.
Aprovada em: 30/08/2019.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________
Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________
Profa. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana
_________________________________________
Profa. Dra. Carolina Melo de Souza
Centro Universitário Christus (UNICHRISTUS)
_________________________________________
Profa. Dra. Silvânia Maria Mendes de Vasconcelos
______________________________________
Prof. Dr. Christopher Kushmerick
Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)
À Deus.
À minha família.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por ter abençoado a minha trajetória. A fé que

tenho em ti alimentou meu foco, minha força e minha disciplina. Sou grata pelas
bênçãos que recaíram não só sobre mim, mas também sobre todos os amigos e
familiares. A ele, toda a honra e toda a gloria.
Aos meus pais, Zeca e Daluz, pelo amor incondicional, incentivo e a educação
que deles recebi que mais uma vez me acompanharam durante esta etapa da minha vida,
e por não medirem esforços para que os meus sonhos fossem realizados. Meu
sentimento é de gratidão eterna.
As minhas irmãs, Amarita e Aya agradeço pela amizade, pelo carinho, pela
cumplicidade, companheirismo, por estarem sempre presentes (mesmo a distância) e por
torcerem por mim. Vocês são muito importantes para mim! Amo demais!
Aos meus tios Sena e Zelita, que sempre deram total apoio às minhas decisões,
sempre se fazendo tão presente, que vibram com todas as minhas conquistas e que
sempre demonstraram muito orgulho por tudo o que eu faço.
À minha orientadora, Professora Geanne Matos de Andrade, por ter me aceitado

como aluna desde o mestrado, pela dedicação e competência na execução deste
trabalho, por ter contribuído para a minha formação científica e pela oportunidade dos
ensinamentos que serão importantes para a construção da minha trajetória profissional.
O meu sentimento é admiração sincera como pessoa e como pesquisadora.
A todos os meus colegas do Laboratório de Neurociência e Comportamento,

com quem eu tenho a honra e o prazer de trabalhar, especialmente a Jéssica Rabelo e a
Tyciane Nascimento, pela dedicação, profissionalismo, por se mostrarem sempre
disponíveis, e por toda a colaboração dada à realização deste trabalho. Ao Arnaldo
Viana, Marta Regina, Amanda Aragão, Priscila Caracas, Albert Layo, Erlânia Alves,
Juliete Tavares, Jéssica Pessoa, Alfaete Vieira, Maiara Maia, Isabelle Albuquerque, por
compartilharem comigo boa parte do tempo, pelos conhecimentos, por estarem sempre
disponíveis a prestarem uma ajuda e por tornarem o ambiente de trabalho um lugar
agradável e harmônico.
!
A Ana Thais, pelo carinho, amizade, disponibilidade sempre demonstrada, pela
colaboração dada à realização deste trabalho, e por ser minha companheira de viagem.
O carinho que tenho por você é o mesmo que tem por mim. Obrigado por você existir!
A Analu, por todos os ensinamentos e exemplos.
Agradeço à Aline Marinho, uma das minhas amigas mais queridas e chegadas há
mais de uma década, por partilharmos tantos momentos juntos. Para mim é maravilhoso
poder ter uma espécie de irmã no Brasil. A sua garra e força de vontade inspiram-me.
Ao Adriano, pelo carinho, e pelo empenho e dedicação em ajudar na execução

do projeto.
A Universidade Federal do Ceará, pela oportunidade dе fazer о curso. Pelo sеu

corpo docente, direção е administração quе oportunizaram а janela quе hoje vislumbro
υm horizonte superior, eivado pеlа acendrada confiança nо mérito е ética aqui
presentes.
Aos Professores do Curso de Pós-Graduação, por terem transmitido com muita
dignidade seus conhecimentos, os quais adquiriram com muito esforço e dedicação.
Ao Professor Doutor Ricardo Lima, por ter me ensinado os primeiros conceitos
da eletrofisiologia, e por ter aberto as portas do laboratório de eletrofigiologia.
À equipe do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, especialmente o
coordenador do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Prof. Dr. Pedro Jorge
Caldas Magalhães, Profª. Drª. Flávia Almeida Santos, Célia Carvalho, Laura Alves,
Maria Cristielia.
A Profa. Dra. Ana Paula Fontenele Menezes, Prof. Dr. Orleâncio
Gomes Ripardo de Azevedo, Prof. Dr. Ricardo de Freitas Lima por aceitarem participar
da minha banca de Exame de Qualificação.
A Profa. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana, Profa. Dra. Silvânia Maria Mendes
de Vasconcelos, Profa. Dra. Carolina Melo de Souza, Prof. Dr. Christopher Kushmerick
por aceitarem participar da minha banca de Defesa de Doutorado e por ajudarem a
melhorar a qualidade deste trabalho com todas as sugestões.
À Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra e ao Centro de
Neurociências e Biologia Celular, por terem me recebido para a realização do meu
estágio sanduíche em Portugal. Agradeço em especial o Professor Doutor Rodrigo
Cunha, líder do grupo de Purinas, por me ter aberto as portas do seu laboratório e por
!
me ter dado o privilégio de o ouvir e de aprender consigo ao longo das reuniões de
grupo. Obrigado pelos ensinamentos, por toda a compreensão, pelos desafios que me foi
colocando, pelo estímulo, pela exigência que me foi imposta, e por ter contribuído
muito para a minha formação científica.
Ao Professor Doutor Ângelo Tomé, por se mostrar sempre disponível em ajudar

e a resolver todos os problemas com maior vontade. Obrigada pela amizade, pelo apoio,
pelas suas palavras de incentivo e por toda a confiança em mim depositada.
Ao Henrique Silva, por me ter ensinado as bases dos registros eletrofisiológicos

extracelulares. Por me ter ajudado e acompanhado na eletrofisiologia. Obrigado por
todo o carinho, e pelo apoio constante.
A Minha conterrânea Samira, uma pessoa admirável, e que me orgulho de ter
presente em minha vida e que faço toda a questão de manter perto de mim. Obrigada
pela amizade, pelos conselhos e ensinamentos. Para mim você é uma inspiração e um
grande exemplo de vida.
À Margarida Almeida, pelas horas e noites no laboratório, por termos partilhado
juntas os primeiros passos na eletrofisiologia, e por seres uma estudante brilhante que
sempre me estimulou a querer ser mais e melhor. Obrigada por tanto carinho, e amizade
que jamais se apagarão da minha memória.
A Marlene Pereira, agradeço de coração pela amizade, pelos ensinamentos, e

espero sinceramente que continues a fazer parte da minha vida, estejamos onde
estivermos. Te adoro.
A Sara Reis, pelos ensinamentos, pelo tempo que partilhou comigo no
laboratório, pela sua amizade e por ter mostrado sempre disponível.
As Doutoras Paula Canas e Paula Agostinho, pela paciência, pelo apoio e por
terem disponibilizado recursos para a realização deste trabalho.
A todos os meus colegas no grupo das Purinas do CNC, nomeadamente, Ana

Patrícia, João Pedro, Francisco Queiroz, pelo profissionalismo e por terem se mostrado
sempre disponíveis para tirar duvidas sobre os registros. A Inês Amaral, Anna
Pliássova, Catia Lopes, Daniela Madeira, Liliana Dias, pela simpatia e pela companhia
no laboratório.
!
A Neusa dos Santos, a sua ajuda e o seu apoio foram muito importantes, nunca
vou esquecer tudo que você fez por mim. Com todo o carinho e de coração eu agradeço,
e para sempre minha gratidão será sua. Muito obrigada!
Ao Daniel Moreira e a Angela França, pela companhia, pelo carinho, e por ter
tornando minha estadia em Coimbra ainda mais agradável.
A Doutora Ana Ledo do laboratório de Biologia Redox do CNC, por suas

valiosas contribuições, sugestões e por abrirem as portas seus laboratórios, para que
pesquisas essenciais no desenvolvimento desta tese fossem realizadas.
Agradeço também ao Órgão Financiador FUNCAP, a CAPES pelas bolsas

concedidas ao longo do curso.
Chego assim ao fim esta etapa tão marcante. Mais uma vez, obrigada a todas as
pessoas que fizeram parte deste percurso e me ajudaram a subir, a ver para lá do limite
que eu achava que tinha.
!
Nas grandes batalhas da vida,
o primeiro passo para a vitória é o desejo de vencer.
Mahatma Gandhi
!
RESUMO

MECANISMO QUE ENVOLVE INIBIÇÃO DA APOPTOSE, INFLAMAÇÃO E DO
ESTRESSE OXIDATIVO
A fisiopatologia do AVC envolve a redução do suprimento sanguíneo, uma condição
de hipóxia e privação de glicose, que acarreta excitotoxicidade, estresse oxidativo,
apoptose e danos teciduais na região afetada. O AVC é a segunda principal causa de
morte no mundo e uma das principais causas de incapacidade física em adultos. O α-
bisabolol (α-bis) é um álcool sesquiterpeno, monocíclico, que têm demonstrado
atividade antioxidante, anti-inflamatória e anti-apoptótica. O objetivo do presente
trabalho foi avaliar os efeitos da α-bis sobre o dano neuronal (TTC e déficit motor),
déficits de memória, apoptose, resposta inflamatória, estresse oxidativo e plasticidade
sináptica de camundongos submetidos à isquemia cerebral. A oclusão permanente da
artéria cerebral média (pMCAO) foi o in vivo utilizado para a indução da isquemia. O α-
bis foi administrado via oral 3 h após a pMCAO e/ou uma vez ao dia até 3 dias a
depender do desenho experimental. O dano isquêmico foi avaliado 24 horas após a
cirurgia através da coloração com TTC e da avaliação neurológica. O α-bisabolol
diminuiu significativamente a área de infarto e o desempenho sensório-motor dos
animais submetidos à pMCAO. A atividade locomotora e a coordenação motora foram
avaliadas 72 horas após a pMCAO através do teste de campo aberto, e do teste do
rotarod, e foram observadas uma redução na capacidade de exploração horizontal e
vertical, e na coordenação motora nos animais isquemiados em comparação com o
grupo FO, e o tratamento com o α-bis, protegeu contra esses deficits, no teste de campo
aberto. Os déficits de memória foram avaliados pelos testes do Y-maze, e da esquiva
passiva e observamos que os animais isquemiados apresentaram déficits na memória de
trabalho e na aversiva, e o tratamento com o α-bis preveniu esses déficits de memória. A
vias da apoptose foram avaliadas, por meio da densidade proteica relativa do citocromo
c, das pró-caspases-3, -9, e das caspases -3,-9, PARP total e clivada. Para explorar o
provável mecanismo subjacente do efeito neuroprotetor do α-bis, fatias hipocampais
foram submetidas à privação de oxigênio e glicose (OGD) durante 7 min para mimetizar
lesão isquêmica in vitro. Os nossos resultados mostraram que em situações fisiológicas,
o α-bisabolol não alterou: a transmissão sináptica basal, a plasticidade de curta (PPF) e
de longa duração (LTP e despotenciação). Na presença da OGD, o α-bisabolol preveniu
!
contra a depressão irrevensivel do fEPSP (potencial pós-sináptico excitatório), em
comparação com o grupo controle. A taxa de consumo de oxigénio foi avaliada
utilizando o equipamento ororboros, e observamos que os animais submetidos a OGD, e
tratados com o veículo (etanol 0,01%), apresentaram um burst na respiração (aumento
da taxa de consumo de oxigénio) nos primeiros minutos, que com o passar do tempo foi
diminuindo, e o tratamento com o α-bis preveniu contra o aparecimento desse burst na
respiração. A neuroinflamação foi avaliada através da imunomarcaçãao para a IL-1β,
TNF- α, densidade proteica relativa do NF-κB, e teste bioquímico para MPO. O
tratamemto com o α-bis reduziu significativamente esses marcadores inflamatórios.
Além disso, também foram avaliados o estresse oxidativo, por meio da densidade
relativa da proteína SOD-2, e dos testes bioquímicos para Nitrato/nitrito e TBARS. Os
nossos resultados mostraram aumento da densidade relativa da proteína SOD-2 nos
grupos tratados com o α-bis; concluímos que o α-bisabolol apresentou atividade
neuroprotetora provavelmente devido a sua ação anti-inflamatória, antioxidantes e
antiapoptoticas nos fornecendo evidências experimentais acerca de sua utilização como
adjuvante no tratamento da isquemia cerebral.
Palavras-chave: Isquemia Cerebral; α-Bisabolol; Estresse Oxidativo;

Neuroinflamação; LTP.
!
ABSTRACT
α-BISABOLOL PROTECTS FROM ISCHEMICAL BRAIN INJURY BY A

MECHANISM INVOLVING INHIBITION OF APOPTOSIS, INFLAMMATION
AND OXIDATIVE STRESS.
The pathophysiology of stroke involves the reduction blood supply, a condition of

hypoxia and glucose deprivation, which causes excitotoxicity, oxidative stress,
apoptosis and tissue damage in the affected region. Stroke is the second leading cause of
death worldwide and one of the leading causes of physical disability in adults. Α-
Bisabolol (α-bis) is a monocyclic sesquiterpene alcohol that has shown antioxidant,
anti-inflammatory and anti-apoptotic activity. The objective of the present study was to
evaluate the effects of α-bis on neuronal damage (TTC and motor deficit), memory
deficits, apoptosis, inflammatory response, oxidative stress and synaptic plasticity of
mice submitted to cerebral ischemia. Permanent occlusion of the middle cerebral artery
(pMCAO) was the in vivo used to induce ischemia. Α-bis was administered orally 3 h
after pMCAO and / or once daily for up to 3 days depending on the experimental
design. Ischemic damage was assessed 24 hours after surgery by TTC staining and
neurological assessment. Α-Bisabolol significantly decreased infarct area and
sensorimotor performance of animals submitted to pMCAO. Locomotor activity and
motor coordination were assessed 72 hours after pMCAO through the open field test
and the rotarod test, and a reduction in horizontal and vertical exploration capacity and
motor coordination was observed in ischemic animals compared with The FO group,
and α-bis treatment, protected against these deficits in the open field test. Memory
deficits were evaluated by Y-maze and passive avoidance tests and we observed that
ischemic animals had working and aversive memory deficits, and treatment with α-bis
prevented these memory deficits. Apoptosis pathways were evaluated by the relative
density of cytochrome c, pro-caspases-3, -9, and caspases -3, -9, total and cleaved
PARP. To explore the likely underlying mechanism of the α-bis neuroprotective effect,
hippocampal slices were subjected to oxygen and glucose deprivation (OGD) for 7 min
to mimic ischemic injury in vitro. Our results showed that in physiological situations, α-
bisabolol did not change: basal synaptic transmission, short (PPF) and long duration
(LTP and depotentiation) plasticity. In the presence of OGD, α-bisabolol prevented
irreversible depression of fEPSP (excitatory postsynaptic potential) compared with the
control group. The oxygen uptake rate was assessed using the orbital equipment, and we
!
observed that animals subjected to OGD and vehicle treated (0.01% ethanol) had a burst
in respiration (increased oxygen uptake rate) in the first minutes, which over time
decreased, and treatment with α-bis prevented the onset of this burst in breathing.
Neuroinflammation was assessed by immunostaining for IL-1β, TNF-α, relative density
of NF-κB, and biochemical test for MPO. Treatment with α-bis significantly reduced
these inflammatory markers. In addition, oxidative stress was also evaluated by the
relative density of SOD-2 protein and by biochemical tests for nitrate / nitrite and
TBARS. Our results showed increased relative density of SOD-2 protein in the α-bis
treated groups; We concluded that α-bisabolol showed neuroprotective activity probably
due to its anti-inflammatory, antioxidant and antiapoptotic action providing us with
experimental evidence about its use as an adjuvant in the treatment of cerebral ischemia.
Keywords: Cerebral ischemia; α-Bisabolol; Oxidative stress; Neuroinflammation; LTP.
!
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Taxas de mortalidade por AVC ajustadas por idade e sexo. As taxas 29
são mais altas na Europa Oriental, norte da Ásia, África central e no
sul do Pacífico......................................................................................
Figura 2: Imagens de tomografia do crânio: AVC hemorrágico (esquerda) e 31
AVC isqûemico (direita)......................................................................
Figura 3: Esquema demonstrativo das artérias cerebrais anteriores e posteriores, 36

artérias comunicantes anteriores e posteriores e carótida interna que
formam o polígono de Willis..................................................................
Figura 4: Perfusão colateral no cérebro após isquemia cerebral focal.................. 40
Figura 5: Mecanismos potenciais de dano neuronal após isquemia..................... 42
Figura 6: Resumo geral dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos na 47

isquemia e reperfusão cerebral...............................................................
Figura 7: Vias extrínseca e intrínseca de apoptose e respectiva associação com 49
as caspases..............................................................................................
Figura 8: Mecanismo molecular da LTP................................................................ 53
Figura 9: A potenciação de longa duração (LTP) pode ser detectada em diversas 54
regiões do SNC, especialmente no hipocampo......................................
Figura 10: Mecanismo molecular da LTD............................................................... 55
Figura 11: Registro de um potencial de membrana do terminal axônico................ 57
Figura 12: Tipos e subtipos de memória e suas regiões de processamento............. 58
Figura 13: Estrutura química dos quatro diastereoisômeros do alfa-bisabolol. O α 62
-(-) - bisabolol é a forma mais comum...................................................
Figura 14: Desenho experimental dos experimentos in vivo................................... 69
Figura 15: Diagrama estrutural da microcirurgia da MCAO. Imagem da foto da 70
caixa quadrada direita foi capturada durante o procedimento................
Figura 16: Arena do Campo Aberto......................................................................... 73
Figura 17: Aparelho de Rotarod............................................................................ 74
!
Figura 18: Labirinto em Y..................................................................................... 75
Figura 19: Aparelho de Esquiva Passiva. (Insight LTDA) ................................... 76
Figura 20: O α-bisabolol melhora os déficits sensório-motores em camundongos 82

submetidos à pMCAO...................................................
Figura 21: Fotografia das fatias cerebrais dos animais submetidos a pMCAO e 83
tratados com o α-Bis (coloração com TTC 1%)..................................
Figura 22: O α-bisabolol diminui a área de infarto isquêmico em camundongos 84
submetidos à pMCAO.........................................................................
Figura 23: O α-bisabolol protege submetidos a pMCAO contra a diminuição da 85
atividade locomotora...........................................................................
Figura 24: O α-bisabolol não melhora a coordenação motora dos camundongos 86
submetidos à pMCAO.........................................................................
Figura 25: O α-bisabolol protege os camundongos contra os déficits de memória 87
de trabalho induzidos pela pMCAO....................................
Figura 26: O α-bisabolol protege os camundongos contra os déficits de memória 88
recentes induzidos pela pMCAO..........................................
Figura 27: O α-bisabolol não diminui a densidade relativa de Citocromo C no 90
córtex de camundongos 96 horas após a cirurgia.................................
Figura 28: O α-bisabolol não diminui a densidade relativa da Pró-Caspase 3 no 91
córtex de camundongos após a pMCAO..............................................
Figura 29: A pMCAO não modifica a densidade proteica relativa da Caspase 3 92

clivada no córtex estriado e hipocampo de camundongos....................
Figura 30: O α-bisabolol reduziu a relação entre a densidade proteica relativa da 94

Caspase 3 clivada/ Pró-Caspase 3 no estriado e no hipocampo de
camundongos após a pMCAO, porém não no córtex..........................
Figura 31: O α-bisabolol aumenta a densidade relativa da Pró-Caspase 9 no 95

córtex de camundongos 96 horas após a pMCAO, porém não no
estriado e no hipocampo.......................................................................
Figura 32: A pMCAO não modifica a densidade proteica relativa da Caspase 9 96
!
clivada em camundongos.....................................................................
Figura 33: O α-bisabolol reduz a relação entre a densidade proteica relativa da 98

Caspase 9 clivada/ Pró-Caspase 9 no cortex de camundongos 96 horas
após a pMCAO.......................................................................................
Figura 34: A pMCAO não modifica a densidade proteica relativa da PARP total 99
em camundongos..................................................................................
Figura 35: A pMCAO não modifica a densidade proteica relativa da PARP 100
clivada no córtex de camundongos......................................................
Figura 36: A pMCAO não modifica a relação entre a densidade proteica relativa 102
da PARP clivada/PARP total em camundongos.....................
Figura 37: A pMCAO modifica a densidade proteica relativa de NF-кB 104

(citoplasmático) no estriado de camundongos.....................................
Figura 38: O α-bisabolol reduz a densidade proteica relativa de NF-кB (nuclear) 107
no córtex de camundongos 96 horas após a pMCAO............................
Figura 39: O α-bisabolol não reduz o aumento dos níveis de MPO no córtex 106
temporal de camundongos 24h após a pMCAO.....................................
Figura 40: Fotomicrografia representativa da imunomarção para TNF-α em 109

secções coronais do córtex e estriado 96 horas após a cirurgia............
Figura 41: O α-bisabolol diminuiu a densidade relativa de TNF-α no córtex (A) e 110
estriado (B) de camundongos pMCAO..................................................
Figura 42: Fotomicrografia representativa da imunomarção para TNF-α em 111

secções coronais do hipocampo 96 horas após a cirurgia....................
Figura 43: O α-bisabolol diminui a densidade relativa de TNF-α no hipocampo 112

(CA1, CA3 e GD) de camundongos 96 horas após a pMCAO............
Figura 44: Fotomicrografia representativa da imunomarção para IL-1β no córtex 113

e no estriado 96 horas após a cirurgia....................................................
!
Figura 45: O α-bisabolol diminui a densidade relativa de IL-1β no córtex e 114
estriado de camundongos 96 horas após a pMCAO.............................
Figura 46: Fotomicrografia representativa da imunomarção para de IL-1β no 115

hipocampo (CA1, CA3 e GD) 96 horas após a cirurgia.......................
Figura 47: O α-bisabolol diminui a densidade relativa de IL-1β no hipocampo 116

(CA1 e CA3) de camundongos 96 horas após a pMCAO....................
Figura 48: O α-bisabolol aumenta a densidade proteica relativa da SOD-2 no 118

cortex de camundongos 96 horas após a pMCAO...............................
Figura 49: A pMCAO não modifica os níveis de nitrito/nitrato (NO2/NO3) no 120
córtex de camundongos........................................................................
Figura 50: A pMCAO modifica os níveis de peroxidação lipídica (TBARS) no 122

córtex, estriado e no hipocampo de camundongos...............................
Figura 51: A pMCAO não modifica a densidade proteica relativa da 124

sinaptofisina no córtex camundongos..................................................
Figura 52: Esquema de amostragem de um hipocampo de roedores ilustrado no 130

topo.......................................................................................................
Figura 53: Diagrama mostrando como os registros eletrofisiológicos foram 131

obtidos....................................................................................................
Figura 54: Desenho experimental utilizado em registros eletrofisiológicos 134

extracelulares.........................................................................................
Figura 55: O α-bisabolol não altera a transmissão sináptica basal em fatias 138
hipocampais...........................................................................................
Figura 56: O α-bisabolol não altera acurva I/O em nenhuma das concentrações 139
testadas...................................................................................................
Figura 57: O α-bisabolol não altera a plasticidade sináptica de curta 141
!
duração...................................................................................................
Figura 58: O α-bisabolol protege contra a depressão irreversível da 143

neurotransmissão induzida por um insulto de privação de oxigenio e
glicose (OGD) de 7 minutos..................................................................
Figura 59: O α-bisabolol não altera a neurotransmissão basal em fatias 145

hipocampais...........................................................................................
Figura 60: O α-bisabolol não altera a transmissão sináptica basal.......................... 146
Figura 61: O Etanol 0,01% e o α-bisabolol 3µM não altera a plasticidade 148
sináptica de curta duração, nos intervalos de 50 e 25ms.......................
Figura 62: O α-bisabolol 3µM não aumenta a amplitude da LTP........................... 150
Figura 63: O α-bisabolol 3µM não altera a amplitude da Despotenciação............. 151
Figura 64: O α-bisabolol protege contra a depressão irreversível da 153

neurotransmissão induzida por um insulto de OGD de 7 minutos.......
Figura 65: O α-bisabolol aumenta a excitabilidade basal após OGD de 7 min...... 154
Figura 66: O α-bisabolol aumenta a amplitude da LTP.......................................... 156
Figura 67: O α-bisabolol 3µM aumenta a amplitude da Despotenciação............... 157
Figura 68: α-bisabolol 3µM inibe o burst respiratorio após a OGD....................... 159
Figura 69: Modelo hipotético proposto para sítio de ação do α-bisabolol no 185
modelo de isquemia cerebral focal permanente.....................................
!
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Resumo dos sintomas e respetivos prognósticos associados a um 32

AVC......................................................................................................
Tabela 2: Resumo de alguns compostos que falharam na avaliação clínica para 34

o tratamento de AVC isquêmico agudo. ...........................................
Tabela 3: Grupos de tratamento............................................................................ 69
Tabela4: Avaliação neurológica........................................................................... 71

Tabela 5: Resumo dos efeitos do α-bisabolol nos diferentes testes realizados 186
nesse estudo......................................................................................
!
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACM Artéria cerebral média

aCSF Líquido cefalorraquidiano artificial
AMPA Ácido amino-3-hidroxi-5-metil-isoxasole-propiônico
APAF1 Protease Apoptótica Ativadora de Fator 1
ATP Trifosfato de Adenosina
ATPase Adenosinatrifosfatases
AVC Acidente Vascular Cerebral
BDNF Fator neurotrófico derivado do cérebro
2+
Ca Cálcio Íonizado
CaMKII Cálcio / calmodulina quinase
COX 2 Cicloxigenase 2
DNA Ácido Dexorribonucléico
DP Despotenciação
DTC Doppler transcraniano
EC Córtex Entorrinal
eNOS Óxido nitrico sintase endotelial
EPM Erro Padrão da Média
ERK Quinases reguladas por sinal extracelular
FADD Proteína associada ao FAS com o domínio da morte
FDA Food and Drug Administration
FO Falso-operado
FSC Fluxo sanguíneo cerebral
GABA Ácido γ-amino butírico
GD Giro denteado
GFAP Proteína ácida fibrilar glial
GluR1 Receptor de glutamato 1
HTAB Brometo de cetil trimetil amônio
ICAM-1 Molécula de adesão intercelular-1
IGF-1 Fator de crescimento tipo insulina
iNOS óxido nitrico sintase induzida
IP3 Inositol trisfosfato
!
LFS Estimulação em baixa frequência
LTP Potenciação de longa duração
NF-κB Factor nuclear kappa B
NMDA N-Metil-D-Aspartato
NO Óxido nítrico
SC Schaffer colateral
RPM Rotações por minuto
SOD superóxido dismutase
TNF-α Fator de necrose tumoral-α
!
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
1.1 Perspectivas históricas
1.2! Definição e classificação
1.3 Epidemiologia
1.4 Sintomatologias e diagnóstico
1.5 Fatores de Risco
1.6 Tratamento
1.7 Modelos experimentais de Isquemia Cerebral
1.7.1 Modelos in vivo:
1.7.2 Modelos in vitro:
1.8 Mecanismos de dano neuronal induzidos por isquemia
1.8.1 Depleção de ATP e despolarização da membrana
1.8.2 Cálcio e excitotoxicidade
1.8.3 Isquemia e estresse oxidativo
1.8.4 Inflamação
1.8.5 Apoptose
1.9 Plasticidade sináptica hipocampal e cognição
1.9.1 Anatomia e circuito hipocampal
1.9.2 Plasticidade sináptica na sub-região do hipocampo CA1
1.9.3 Registros eletrofisiológicos
1.9.4 Isquemia cerebral e déficits de memória
1.10 Terpenos e neuroprotecção

1.10.1. α-Bisabolol
2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
!
3.2 Objetivos Específicos
4. METODOLOGIA
4.1. Desenho experimental
4.2. Animais
4.3. Drogas
4.4. Protocolo experimental
4.5. Isquemia cerebral focal por oclusão da artéria cerebral média

(pMCAO) (Tamura et al., 1981).
4.6. Avaliação Neurológica.
4.7. Quantificação do dano isquêmico cerebral através da coloração pelo

Cloreto de 2,3,5-Trifeniltetrazol (TTC).
4.8. Avaliaçao comportamental
4.8.1. Avaliação da atividade locomotora (Teste de campo aberto).
4.8.2. Avaliação da coordenação motora - Teste de rotarod.
4.9. Avaliação da memória
4.9.1. Avaliação da memória de trabalho - Teste do labirinto em Y.
4.9.2. Avaliação da memória aversiva – Teste da Esquiva Passiva.
4.10. Avaliação do Estresse Oxidativo
4.10.1. Determinação da peroxidação lipídica.
4.10.2. Determinação da concentração de nitrito/nitrato.
4.11. Ensaio para Mieloperoxidase (MPO).
4.12. Avaliação da imunoreatividade para (TNF-α e IL-1β).
4.13. Quantificação da densidade da proteina citocromo C, Caspase-3

e 9 (total e clivada), PARP total e clivada, sinaptofisina, SOD-2, NF-kB
( no núcleo e no citoplasma) pela técnica de Western-blot
4.14. Análise estatística
5. RESULTADOS
5.1. Avaliação neurológica de camundongos submetidos a isquemia
!
focal permanente por oclusão da artéria cerebral média (pMCAO), e
tratados com o α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg).
5.2. Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre o dano isquêmico
de camundongos submetidos à pMCAO.
5.3. Avaliação comportamental
5.3.1. Efeito do α-bisabolol 50, 100, 200mg/kg sobre a atividade

locomotora de camundongos submetidos à pMCAO.
5.3.2. Efeito do α-bisabolol 50, 100, 200mg/kg sobre a coordenação
motora de camundongos submetidos à pMCAO.
5.4. Avaliação de memória
5.4.1. Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memória de

trabalho de camundongos submetidos à pMCAO.
5.4.2. Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memória
aversiva de camundongos submetidos a pMCAO.
5.5. Avaliação da apoptose
5.5.1. Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade proteica

relativa de Citocromo C no córtex, estriado e hipocampo de
camundongos submetidos a pMCAO.
5.5.2 Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade proteica
relativa da Pró-Caspase 3 no córtex, estriado e hipocampo de
5.5.3 Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade relativa da
Caspase 3 clivada no córtex, estriado e hipocampo de camundongos
submetidos a pMCAO
5.5.4 Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a relação entre a
densidade proteica relativa da Caspase 3 clivada/ Pró-Caspase 3 no
córtex, estriado e hipocampo de camundongos submetidos a pMCAO.
5.5.5 Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade proteica
relativa da Pró-Caspase 9 no córtex, estriado e hipocampo de
Caspase 9 clivada no córtex, estriado e hipocampo de camundongos
submetidos a pMCAO.
!
densidade relativa da Caspase 9 clivada/ Pró-Caspase 9 no córtex,
estriado e hipocampo de camundongos submetidos a pMCAO.
PARP total no córtex, estriado e hipocampo de camundongos
submetidos a pMCAO.
densidade relativa da PARP clivada no córtex, estriado e hipocampo
de camundongos submetidos a pMCAO.
densidade proteica relativa da PARP total/PARP clivada no córtex,
5.6. Avaliação da inflamação
5.6.1. Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade proteica relativa
de NF-кB (citoplasmático) no córtex, estriado e no hipocampo de
5.6.2. Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade relativa de NF-
кB (nuclear) no córtex, estriado e hipocampo de camundongos
submetidos a pMCAO.
5.6.3. Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a atividade da
mieloperoxidase (MPO) no córtex temporal, corpo estriado e hipocampo
de camundongos submetidos a pMCAO.
5.6.4. Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a expressão de TNF-α no
córtex, estriado e hipocampo de camundongos submetidos à pMCAO.
5.6.5 Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a expressão de IL-1β no
córtex, estriado e hipocampo de camundongos submetidos à pMCAO.
5.7. Avaliação do estress oxidativo
5.7.1. Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade relativa de

SOD-2 no córtex, estriado e hipocampo de camundongos submetidos a
pMCAO.
5.7.2. Efeitos do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a dosagem de
nitrito/nitrato (NO2/NO3) no córtex temporal, corpo estriado e
hipocampo de camundongos submetidos a pMCAO.
!
5.7.3. Efeitos do α-bisabolol sobre a peroxidação lipídica (TBARS) em
tecidos cerebrais de camundongos submetidos à oclusão permanente da
artéria cerebral média.
5.8. Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade relativa de
sinaptofisina no córtex e estriado de camundongos submetidos a
pMCAO.
6. JUSTIFICATIVA
7.1 OBJETIVOS
7.2 Objetivos Gerais
7.3. Objetivos Específicos
8. Eletrofisiologia
8.1. Animais
8.2. Registros eletrofisiológicos extracelulares
8.3. Protocolos utilizados:
8.4. Curvas de estímulo-resposta:
8.5. Facilitação de pulso emparelhado (PPF):
8.6. Privação de oxigênio e glicose durante 7 minutos (OGD):
8.7. Potenciação de longa duração (LTP):
8.8. Despotenciação:
8.9. Respirometria de alta resolução
9 RESULTADOS
9.1. Efeito do α-bisabolol 3, 10 e 50µM, sobre a transmissão sináptica

basal em fatias hipocampais.
9.2. Efeito do α-bisabolol 3, 10 e 50µM, sobre a plasticidade sináptica
de curta duração (PPF) em fatias hipocampais.
9.3. Efeito do α-bisabolol 3, 10 e 50 µM, sobre a depressão irreversível
do fEPSP em fatias do hipocampo submetidas ao modelo de isquemia
cerebral in vitro (OGD).
!
9.4. Efeito do α-bisabolol 3µM, sobre a transmissão sináptica basal em
fatias hipocampais.
9.5. Efeito do α-bisabolol 3µM sobre a plasticidade sináptica de curta
duração (PPF) em fatias hipocampais.
9.6. Efeito do α-bisabolol 3µM sobre a plasticidade sináptica de longa
duração em fatias hipocampais.
9.8. Efeito do α-bisabolol 3µM, sobre a depressão fEPSP irreversível
em fatias hipocampais submetidas ao modelo de isquemia cerebral in
vitro (OGD).
9.9. Efeito do α-bisabolol 3µM, sobre a curva I/O em fatias
hipocampais submetidas ao insulto da OGD.
9.10. Efeito do α-bisabolol 3µM, sobre a curva I/O em fatias
duração em fatias hipocampais, após a OGD de 7 min.
9.12. Efeito do α-bisabolol 3µM, na taxa de consumo de oxigénio, em
fatias hipocampais submetidas ao modelo de isquemia cerebral in vitro
(OGD).
10. DISCUSSÃO
REFERÊNCIAS
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27!
!
1. INTRODUÇÃO
1.1 Perspectivas históricas
O acidente vascular cerebral (AVC) foi descrito, pela primeira vez, há cerca de
2.400 anos, no século IV a.C., por Hipócrates, após analisar diversos casos de pacientes
com um quadro clínico de convulsões e paralisias súbitas decorrentes de uma lesão
cerebral. Hipócrates observou que, do lado contralateral ao da lesão, frequentemente
ocorria paralisia total (hemiplegia) ou parcial (hemiparesia), envolvendo parte ou
mesmo toda a metade do corpo; além disso, quando havia o comprometimento do braço
direito, os pacientes apresentavam desordem de fala. Esse foi o primeiro relato de afasia
na literatura. Os sintomas ocorriam, primacialmente, de forma súbita e intensa, e assim,
Hipócrates designou-os de apoplexia que, em grego, significa: "atingiu violência"
(THOMPSON, 1996; NINDS, 2004; WARLOW et al., 2007).
Ao longo de muitos anos, a medicina não obteve grande êxito na redução das
sequelas causadas pelo AVC. Os avanços nessa área só tiveram inicio no século XVII,
quando o patologista e farmacologista Johann Jacob Wepfer forneceu as bases para a
classificação atual do AVC. Ele identificou sinais de derrames cerebrais em autópsias
de pacientes, cuja morte foi causada pela apoplexia (NINDS, 2004). Essa descoberta
culminou com a identificação das maiores artérias irrigadoras do cérebro e com as
principais causas dos derrames anteriormente observados. Segundo Johann Wepfer, a
apoplexia, provocada pela ruptura das artérias cerebrais, também poderia ser ocasionada
pelo bloqueio dessas mesmas artérias. À luz dos recentes conhecimentos, a apoplexia
ocasionada pela ruptura ou bloqueio das artérias cerebrais passou a ser designada de
doença cerebrovascular (NINDS, 2004; WARLOW et al., 2007).
1.2!Definição e classificação
O acidente vascular cerebral é descrito, atualmente, como uma emergência

médica caracterizada por um início agudo, gerando déficits neurológicos que podem
persistir por pelo menos 24 horas e, em casos mais graves, levar até a morte. A
fisiopatologia do AVC envolve a redução do suprimento sanguíneo, uma condição de
!
28!
!
hipóxia e privação de glicose, que acarreta danos teciduais na região afetada

(MASSARO, 2006; PEDATA et al., 2016).
O tecido cerebral tem um consumo de oxigênio e de glicose relativamente
elevado, o qual depende, quase exclusivamente, da via metabólica da fosforilação
oxidativa para a produção de energia (VERWEIJ et al., 2007). Isso torna as células
cerebrais, em particular, mais suscetíveis a deficiências energéticas induzidas pela
isquemia e, portanto, incapazes de manter os gradientes iônicos necessários para a
função celular normal e para a homeostase (HANSEN; NEDERGAARD, 1988;
PUNDIK et al., 2012; SONG; YU, 2013).
O AVC pode manifestar-se de duas formas: a primeira, mais comum (cerca de
80% dos casos), representa o AVC isquêmico ou tromboembólico que ocorre pela
interrupção do suprimento sanguíneo resultante de processos ateroscleróticos ou
embólicos; e a segunda forma, é o AVC hemorrágico, decorrente do sangramento dentro
ou em volta das estruturas do sistema nervoso central, mais precisamente no
parênquima cerebral, ou no espaço subaracnóideo (BROUNS; DE DEYN, 2009;
AKOUDAD et al., 2016).
1.3 Epidemiologia
Apesar das taxas de acidente vascular cerebral no mundo estar em declínio nos
últimos anos, com uma redução de 21% de 2005 a 2015, o AVC continua sendo a
segunda maior causa de mortes no mundo e a primeira causa de incapacitação em
adultos, acometendo, aproximadamente, 15 milhões de pessoas por ano, particularmente
nos países em desenvolvimento (GBD, 2015), e destas, 6,7 milhões chegam ao óbito
(GBD, 2015; BROUNS, 2009; HOU et al., 2017) (Figura 1).
O termo DALY (Disability-Adjusted Life Year - Anos de vida ajustados por
incapacidade) sublima o conceito de sobrevivência, enquanto penaliza os anos de vida
após a doença de acordo com os déficits por ela causados. O AVC é responsável por
5,7% dos anos vividos com deficiências em pessoas a partir dos 70 anos de idade.
(GDB, 2016). Além disso, aproximadamente 90% dos sobreviventes do acidente
vascular cerebral têm sequelas funcionais (CARVALHO et al., 2016), e apenas 5% a
20% dos pacientes alcançam recuperação funcional completa, Considera-se que, em
2030, a incapacidade secundária a eventos cerebrovasculares em sociedades ocidentais
será a quarta causa mais importante de perda de DALYs (CARVALHO et al., 2016).
!
29!
!
Figura 1: Taxas de mortalidade por AVC ajustadas por idade e sexo. As taxas são mais
altas na Europa Oriental, norte da Ásia, África central e no sul do Pacífico.
Fonte: JOHNSTON et al., 2009.
No Brasil, o AVC é a principal causa de morte, com taxas de mortalidade

maiores que em outros países da América do Sul, sobretudo nas regiões do país menos
favorecidas economicamente, constituindo um importante problema de saúde pública
(DE PADUA et al., 2003; LAVADOS et al., 2007).
Em Fortaleza, no período de 2008 a 2017, foi observado um aumento gradual no
número de internações por AVC, com maior incidência para o gênero masculino, em
idosos de raça parda. A taxa de mortalidade, por sua vez, diminuiu gradativamente
nestes dez últimos anos, sendo maior entre as mulheres. De acordo com a Pesquisa
Nacional de Saúde realizada em 2013, não existem diferenças estatísticas significativas
entre as regiões brasileiras. A incidência nacional é de 1,5%, ou seja, existem,
aproximadamente, 2,2 milhões de pessoas diagnosticadas com AVC. Por sua vez, o
Nordeste foi a região que apresentou a maior incidência para AVC (1,7%), seguidos
pelas regiões Norte (1,6 %), Sul (1,5%), Centro-Oeste (1,5%) e Sudeste (1,4%)
(ALMEIDA, 2018).
!
30!
!
Com o aumento da expectativa de vida e o crescimento populacional nos últimos

anos, mais pessoas atingem idades nas quais os distúrbios neurológicos são mais
prevalentes (GBD, 2015). Um estudo de base populacional, realizado no Reino Unido,
apontou que a redução nas taxas de incidência do AVC deve-se, principalmente, aos
programas de prevenção realizados ao nível da atenção primária à saúde (APS)
(GLOBAL BURDEN OF DISEASE, 2015; AZIZET et al., 2016). O mesmo deve
acontecer com o acompanhamento e com os processos de reabilitação para que haja
redução da prevalência de sequelas após o AVC (CARVALHO, 2016). As diretrizes de
prática clínica sugerem uma avaliação rápida e abrangente, domínio ativo na avaliação,
planejamento precoce das intervenções para a reabilitação, e planos de treinamento de
profissionais e instrução constante das equipes multiprofissionais de assistência ao
AVC, para o progresso nos planos de reabilitação após a alta hospitalar (CARVALHO-
PINTO; FARIA, 2016; FOUNTOUKI; THEOFANIDIS, 2017). Neste consenso, vários
países já aderiram às unidades de cuidados ao AVC, com o objetivo de aperfeiçoar o
cuidado do evento agudo e das sequelas pós-evento AVC (FOUNTOUKI;
THEOFANIDIS, 2017; MAN et al., 2017).
1.4 Sintomatologias e diagnóstico
Durante muitos anos, o diagnóstico do AVC foi baseado inteiramente em sinais,

sintomas e na localização das lesões cerebrais em autópsias (KARENBERG, 2004;
THOMPSON, 1996).
A confirmação da origem vascular é fundamental para o diagnóstico do AVC, já
que, por vezes, existem doenças como tumores, enxaquecas e traumatismos que podem
assemelhar-se a alguns dos referidos sintomas. Deste modo, o diagnóstico realizado a
partir da história clínica do paciente, de um exame neurológico, isto é, da observação da
presença de sinais clínicos característicos como déficits motores, alterações na marcha e
na fala, e de um estudo imaginológico é primordial e torna-se muito útil no desfecho do
tratamento na fase aguda, assim como, no estabelecimento de um prognóstico e de um
plano de cuidado secundário adequado (DAVENPORT; DENNIS, 2000; SILVERMAN
et al., 2011).
Novos métodos de imagem baseados em tecnologia de perfusão e difusão estão
sendo frequentemente testados, mas os dois métodos mais aceitos para o diagnóstico
incluem a tomografia computadorizada (TC) e a ressonância magnética (RM).
!
31!
!
Atualmente, a TC e a RM são usados para diferenciar o AVC hemorrágico do AVC

isquêmico. A TC é uma técnica amplamente utilizada e permite essencialmente, numa
fase precoce, eliminar a possibilidade de os sintomas apresentados serem originados por
outras patologias cujas manifestações assemelham-se ao AVCs. Após o evento, fica
visível a isquemia ou a hemorragia sempre que essas existam (Figura 2).
(DAVENPORT; DENNIS, 2000; RINGLEB et al., 2011; WARLOW et al., 2003;
PERSSON, 2014).
Figura 2: Imagens de tomografia do crânio: AVC hemorrágico (esquerda) e AVC

isqûemico (direita).
Fonte: WARLOW et al., 2001.
O Doppler transcraniano é um método relativamente novo, não invasivo, que

configura uma ferramenta auxiliar no diagnóstico do AVC, mostrando sensibilidade e
especificidade elevadas quando são seguidos critérios rigorosos. Esse método utiliza a
técnica de ultrassom para medir indiretamente o fluxo nas porções proximais das
principais artérias intracranianas (pertencentes ao polígono de Willis), oferecendo
informações dinâmicas da circulação cerebral (CALDAS et al., 2017; MAZZUCCO et
al., 2017; CHANG et al., 2016; SHARMA et al., 2016; GARAMI; ALEXANDROV,
2009).
O AVC provoca um conjunto de sintomas característicos e limitantes que
conduzem o paciente à necessidade de buscar cuidados médicos. Além disso, os
sintomas e a gravidade poderão variar mediante a área cerebral atingida (Tabela 1).
!
32!
!
Tabela 1 – Resumo dos sintomas e respectivos prognósticos associados a um AVC.
Fonte: SILVERMAN et al., 2011
1.5 Fatores de Risco
Vários fatores de risco estão relacionados ao desfecho do AVC e podem ser

classificados como modificáveis e não modificáveis. Os fatores de risco não
modificáveis englobam idade (principalmente acima de 65 anos), hereditariedade, etnia
negra, sexo masculino e pessoas que já tiveram algum episódio anterior de AVC. Os
fatores de risco possivelmente modificáveis incluem a hipertensão arterial, o consumo
de tabaco, a presença de diabetes mellitus, a hipercolesterolemia, a inatividade física e a
obesidade (STROKE ASSOCIATION, 2014).
!
33!
!
A hipertensão é considerada o principal fator de risco modificável para o

desencadeamento do AVC e aproximadamente 85% dos pacientes com AVC são
hipertensos. Também o consumo excessivo de álcool conduz ao desenvolvimento do
AVC, pois aumenta os níveis da hipertensão arterial e das dislipidemias (GAGLIARDI,
2015; CHAVES, 2000).
O Diabetes Mellitus é outro fator de risco para o AVC, particularmente para
pessoas com idade inferior a 65 anos de idade (AMERICAN HEART ASSOCIATION,
2014). O uso contínuo de açúcares e a redução da ingestão de frutas e peixes, associados
à falta de atividades físicas regulares favorecem o aparecimento da obesidade e
modificações sanguíneas do colesterol (NICHOLS, 2012; AMERICAN HEART
ASSOCIATION, 2014).
O tabagista eleva o risco de ter sangramentos subaracnóideos, ocasionando
infartos cerebrais e aumentando o risco de desenvolver o AVC, em comparação aos não
fumantes; contudo, a relação tempo de tabaco e número de cigarros usados ainda
permanece inconclusiva (CHAVES, 2000).
Quanto à etnia, estudos feitos nos Estados Unidos e na Inglaterra mostraram
uma maior incidência do AVC na população negra, contudo, as diferenças
socioeconômicas nesses países podem ser um fator de justificativa relacionado à essa
incidência (CHAVES, 2000).
Alguns pesquisadores comprovaram que a gravidez pode ampliar o risco de
acidente vascular cerebral. Vários estudos forneceram novos dados sobre diferentes
padrões de comportamento de risco envolvidos no AVC de mulheres (LUNDBERG;
VOLGMAN, 2015; BEHROUZ; POWERS, 2015; SARNOWSKI et al., 2013).
Os anticoncepcionais orais são considerados fatores de risco tanto para o AVC
isquêmico como para o hemorrágico, todavia o risco para o hemorrágico com o uso de
anticoncepcionais tem menos relevância em comparação com o isquêmico (CHAVES,
2000; LUBIANCA, 2003; BRITO; CORRÊA, 2012).
!
34!
!
1.6 Tratamento
Em 1996, a agência do departamento de saúde do governo americano, a Food

and Drug Administration aprovou o ativador de plasminogênio tecidual (tPA) como
tratamento do acidente vascular isquêmico agudo e até o momento continua sendo o
único tratamento farmacológico aprovado para essa condição (GOLDSTEIN, 2007;
TSAI et al., 2015). O tPA possui uma janela terapêutica estreita e a sua eficácia está
relacionada com a sua utilização nas primeiras 4,5 horas após o início dos sintomas
(EMBERSON et al., 2014).
A literatura demostra que vários substancias neuroprotetores, já atingiram a fase
do ensaio clínico, mas teveram fracasso devido à falta de eficácia ou devido a
problemas de toxicidade. Um grande número de agentes terapêuticos já foi testado,
incluindo o antagonista do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA), bloqueadores dos
canais de cálcio e antioxidantes para o tratamento do AVC, mas nenhum deles forneceu
neuroproteção significativa em ensaios clínicos. Logo, a procura por outros
medicamentos potencialmente eficazes para o tratamento do AVC isquêmico torna-se
importante. Os agentes imunossupressores com sua ampla gama de mecanismos têm
potencial como neuroprotetores, os corticosteróides, ligantes de imunofilina,
micofenolato mofetil e minociclina exibiram efeito neuroprotetor através de suas ações
diretas atenuando os efeitos tóxicos dos mediadores da inflamação
(NIGHOGHOSSIAN et al., 2015; HAILER, 2008; TSIRKA et al., 1997; WANG et al.,
1998; ZHUO et al., 2000) (Tabela 2).
Tabela 2. Resumo de alguns compostos que falharam na avaliação clínica para o

tratamento de AVC isquêmico agudo.
Alguns compostos que falharam na avaliação clínica para o tratamento de AVC isquêmico
agudoa
Composto Mecanismo de ação Período Resultado Razãob
de (Fase)
Inclusão
(h)
Antagonista do 6
Selfotel receptor NMDA Negativo (III) Eventos
adversos
Aptiganel Antagonista do 6 Falta de

receptor NMDA Negativo (III) eficácia
!
35!
!
Gavestinel Antagonista do local Negativo (III) Falta de

de ligação da glicina eficácia
NMDA
6
Eliprodil Bloqueador de sítio de Negativo (II) Eventos
poliamida,NMDA adversos
Sulfato de magnésio Bloqueador de canal, 12 Negativo (III) Falta de
NMDA eficácia
Cervene Antagonista do 6 Negativo (III) Falta de

receptor opióide kappa eficácia
Lubrizol Inibidor da NOS e 8 Negativo (III) Falta de

bloqueador do canal eficácia
de Na+
Fosfenitoína Bloqueador dO canal 6 Negativo (III) Falta de
de sódio eficácia
BMS-204352 Bloqueador do canal 6 Negativo (III) Falta de

de K + eficácia
Antagonistas do cálcio Antagonistas do canal 6–24 Negativo Falta de

Ca2+ (Meta-análise) eficácia
Anticorpo anti-ICAM 6 Negativo (III)

Enlimomab Eventos
adversos,
e falta de
eficácia
Citicolina Estabilizador de 24 Negativo (III) Falta de

membrana celular eficácia
Clormetiazol Receptor mimético 12 Negativo (III) Falta de

GABAA eficácia
Tirilazad Inibidor da 4–24 Negativo (III) Falta de

peroxidação lipídica Ensaios 6 eficácia
Ebselen Inibidor da 12–48 Negativo (III) Falta de

peroxidação lipídica eficácia
Repinotan Antagonista do 6 Negativo (IIb) Falta de

receptor de 5-HT1A eficácia
receptor
Fonte: Adaptado de Green; Shuaib, 2006.

a
Abreviaturas: BMS-204352, [35] - [+] -[5-cloro-2-metoxifenil] -1,3-di-hidro-3-fluoro-6- [trifluorometil]-
2H-indol-2-ona; ICAM, molécula de adesão intercelular; NMDA, N-metil-D-aspartato; NOS, óxido
nítrico sintase.
b
Falta de eficácia significa que a eficácia não foi demonstrada.
!
36!
!
1.7 Modelos experimentais de Isquemia Cerebral
O sangue chega ao cérebro através das artérias vertebrais e das artérias carótidas
internas que se comunicam através do polígono de Willis (Figura 3), uma anastomose
arterial, que fornece o suprimento sanguíneo para os hemisférios cerebrais, sendo
formado pelas artérias cerebrais anteriores e posteriores, artérias comunicantes
anteriores e posteriores e pela carótida interna. Estas artérias possuem paredes muito
finas, o que as torna mais vulneráveis a hemorragias.
Figura 3: Esquema demonstrativo das artérias cerebrais anteriores e posteriores,

artérias comunicantes anteriores e posteriores e carótida interna que formam o polígono
de Willis.
Fonte: www.auladeanatomia.com. Acesso: 21 de Maio de 2019.
Vários modelos experimentais têm sido desenvolvidos para mimetizar a

isquemia cerebral que ocorre em humanos, servindo como uma ferramenta
!
37!
!
indispensável no campo de pesquisa dessa doença (JAMES et al., 2008; TAOUFIK;

PROBERT, 2008).
1.7.1 Modelos in vivo
Os modelos experimentais de isquemia in vivo podem ser classificados em

globais, quando afetam todo o cérebro, ou focais, quando afetam apenas uma pequena
região; permanentes, quando não têm recirculação sanguínea, ou transitórios quando
seguidos da recirculação (TARDINI et al., 2003; BRAEUNINGER; KLEINSCHNITZ,
2009).
Em modelos de isquemia focal, a artéria cerebral média (ACM) é ocluída,
permanentemente ou temporariamente, para permitir a reperfusão (KANEMITSU et al.,
2002). A ACM é a mais comumente acometida por AVC e irriga a região lateral do
hemisfério cerebral e estruturas subcorticais (LIPTON, 1999; DURUKAN;
TATLISUMAK, 2007; SICARD; FISHER, 2009).
Os modelos de oclusão da ACM podem ser divididos em modelos que não
necessitam de craniectomia, onde estão os modelos de embolismo, introdução de fio
intraluminal, fototrombose com corante Rosa de Bengala e modelo da endotelina-1;
modelos que necessitam de craniectomia, realizados através de técnicas cirúrgicas como
eletrocauterização, clampeamento e ligadura da artéria; modelos de oclusão da
circulação posterior, onde as artérias vertebrobasilares são ocluídas; e modelos de
trombose venosa cerebral, sendo os dois últimos menos utilizados (DURUKAN;
TATLISUMAK, 2007; SICARD; FISHER, 2009; LIU; MCCULLOUGH, 2011).
Diferentemente da isquemia cerebral focal, a isquemia cerebral global não
possui duas regiões distintas porque o fluxo sanguíneo é interrompido de forma geral e
abrupta, afetando uniformemente todas as áreas do cérebro (LIPTON, 1999). Os
modelos de isquemia cerebral global mimetizam a lesão cerebral resultante de distúrbios
circulatórios como o ataque cardíaco ou hipotensão severa, onde grandes vasos
extracranianos são interrompidos, reduzindo assim todo o fluxo cerebral
(PULSINELLI; BRIERLEY, 1979; MOZAFFARIAN et al., 2014).
O modelo experimental mais utilizado para reproduzir a isquemia cerebral
global é a oclusão dos 4 vasos onde ocorre a cauterização das artérias vertebrais seguida
de oclusão temporária das artérias carótidas comuns (SMITH et al., 1984; WELLONS
et al., 2000). Uma característica importante da isquemia cerebral global-reperfusão é a
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38!
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morte dos neurônios hipocampais, que geralmente ocorre dias após o evento e é mais
evidente na região CA1 (Cornu Ammonis) do hipocampo (BHUIYAN et al., 2015). O
dano neuronal também é observado de forma evidente, nas regiões CA3 do hipocampo,
estriado e em algumas camadas do córtex (CHO et al., 2007; KIRINO, 2000; WANG et
al., 2017). A subsequente desregulação nestas regiões é devida à perda neuronal, bem
como a disfunção das células da glia é resultado da interrupção do fornecimento de
sangue, de oxigênio e da glicose (WANG et al., 2017).
1.7.2 Modelos in vitro
Modelos experimentais in vitro são importantes ferramentas para a pesquisa por

constituírem modelos mais simples para estudos moleculares que os modelos in vivo, e
apresentam como vantagens a diminuição do número de animais utilizados por
experimentos, um aumento no controle dos parâmetros bioquímicos e/ou fisiológicos,
aumento da facilidade de avaliar os mecanismos de ação tanto ao nível celular como
molecular, constituindo claras correlações entre estrutura e função, bem como a
plasticidade de interações neurais em diferentes condições experimentais (HUMPEL,
2015; GEBHARDT, 2000; PRINGLE et al., 1997a).
Dentre os modelos in vitro, o modelo de cultivo de tecidos garante uma maior
sustentação da integridade das células e organização do tecido, ademais, estas
preparações proporcionam a probabilidade de uma fácil manipulação experimental.
A cultura organotípica foi desenvolvida em 1981 por Gähwiller e tem sido uma
alternativa de particular importância na pesquisa, principalmente para estudar a morte
neuronal induzida por excitotoxinas (ABDEL-HAMID; TYMIANSKI, 1997), hipóxia
(PRINGLE et al., 1997b), hipoglicemia (TASKER et al., 1992) e hipóxia/hipoglicemia
para simular a isquemia (BERNAUDIN et al., 1998; CIMAROSTI et al., 2001). Uma
das principais características da cultura organotípica é manter a organização do tecido in
vivo, na interface entre o ar e o meio de cultivo, podendo assim permanecer durante um
determinado período de tempo, como exemplo, a organização existente no hipocampo
(STOPPINI et al., 1991; GÄHWILER et al., 1997).
A cultura organotípica de células primárias ou o corte laminar (fatias) de
diferentes regiões cerebrais, como o hipocampo, o córtex ou o cerebelo (GOLDBERG;
CHOI, 1993; TAYLOR et al., 1999; BONDE et al., 2005; RAU et al., 2012;
LALONDE; MIELKE, 2014), podem ser submetidos a um modelo experimental in vitro
!
39!
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que simula as condições de isquemia in vivo, o qual chamamos de privação de oxigênio

e glicose (OGD). O OGD é considerado o modelo in vitro para isquemia global e
consiste na privação de oxigênio e glicose em uma atmosfera saturada de nitrogênio.
Essas condições simulam a falta de fluxo sangüíneo da isquemia (LAAKE et al., 1999;
BREDER et al., 2000). Nesse modelo, a composição iónica do meio de incubação, tal
como o líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF), assemelha-se ao liquido
cefalorraquidiano encontrado em cérebros normais. É evidente, no entanto, que os
modelos in vitro não reproduzem totalmente os eventos fisiopatológicos que ocorrem no
cérebro após a isquemia in vivo.
No presente trabalho foram utilizados modelos in vivo e in vitro. O modelo in
vivo utilizado foi a eletrocauterização da ACM, que leva a interrupção permanente do
fluxo sanguíneo cerebral. Este modelo foi descrito pela primeira vez por Tamura e
colaboradores (1981), conhecido como modelo de Tamura, tem sido amplamente
utilizado, pois permite o acesso a regiões mais proximais da ACM em comparação com
técnicas anteriores. O modelo de Tamura produz uma lesão isquêmica cerebral similar à
lesão causada pelo modelo de introdução do fio intraluminal, que envolve as regiões
cerebrais do córtex temporal e corpo estriado (LIPTON, 1999; TRAYSTMAN, 2003;
DURUKAN; TATLISUMAK, 2007). O modelo in vitro utilizado foi o OGD,
considerado o modelo in vitro para isquemia global.
1.8 Mecanismos de dano neuronal induzidos por isquemia
Experiências com pacientes que se recuperaram de um dano vascular mostraram

que este não é um fenômeno definitivo, “tudo ou nada”. Uma consideração sobre fluxo
sanguíneo cerebral é importante para se entender a evolução e as consequências do
ataque isquêmico focal.
Tanto na oclusão distal quanto proximal da artéria cerebral média, existem
regiões do core isquêmico, regiões primariamente irrigadas pela ACM, onde o fluxo
sanguíneo é reduzido para menos de 15% do normal e regiões de penumbra isquêmica,
zona de tecido adjacente à zona central (core) do infarto isquêmico, onde o fluxo é
reduzido em torno de 40%. Após um dano permanente ou suficientemente longo, tanto
o core quanto a penumbra se tornam regiões de infarto, enquanto a região fora da
penumbra apresenta somente morte de neurônios isolados, com densidade insuficiente
para causar infarto (LIPTON; ROSENBERG, 1994), (Figura 4).
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40!
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Figura 4: Perfusão colateral no cérebro após isquemia cerebral focal.
Fonte: Adaptado de Jackman; Iadecola, 2015.
1.8.1 Depleção de ATP e despolarização da membrana
A sinalização purinérgica é um termo científico utilizado para designar uma via

comum de comunicação célula-célula envolvida em vários mecanismos neuronais e não
neuronais e em eventos de curta e longa duração, incluindo respostas imunes,
inflamação, dor, agregação plaquetária, vasodilatação mediada pelo endotélio,
proliferação e morte celular (AGTERESCH et al., 1999; BURNSTOCK; KNIGHT,
2004; HOEBERTZ et al., 2003). Os receptores purinérgicos (receptores P1 e receptores
P2) estão entre os receptores mais abundantes nos organismos vivos e apareceram desde
o início da evolução, sugerindo que as purinas são um dos mensageiros químicos
presentes nos seres vivos mais primitivos e difundidos nos reinos animal e vegetal
(BURNSTOCK; VERKHRATSKY, 2009; BURNSTOCK, 1976).
O ATP, molécula sinalizadora do sistema purinérgico, é um nucleotídeo

trifosfatado presente em todas as células e está envolvido na regulação de vários
processos fisiopatológicos no meio extracelular. É considerada uma das moléculas
intracelulares mais abundantes e de sinalização pleiotrópica, agindo de uma célula para
outra (BURNSTOCK, 2006).
O ATP é armazenado em vesículas nas terminações sinápticas e, após
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41!
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despolarização neuronal, é liberado agindo em receptores específicos na membrana pós-

sináptica, designados purinoreceptores (BURNSTOCK, 1972; 1976; RALEVIC;
BURNSTOCK, 1998). Pode ser coliberado juntamente com vários neurotransmissores,
tais como acetilcolina, glutamato, noradrenalina, serotonina e ácido γ-amino butírico
(GABA) (BURNSTOCK, 2004; 2009; HOLTON, 1959; NAKANISHI; TAKEDA,
1973; PANKRATOV et al., 2009; ZIMMERMANN, 2008).
A liberação de ATP nos terminais pré e pós-sinápticos pode ocorrer como um

mecanismo fisiológico ou em resposta a danos celulares, como hipóxia e injúrias
(BURNSTOCK, 2008). A isquemia leva a uma depleção rápida de ATP (SIEGEL et al.,
1983). A interrupção focal do fluxo sanguíneo cerebral restringe a oferta de substratos
metabólicos, particularmente oxigênio e glicose, levando à depleção dos estoques de
energia requeridos para manutenção do gradiente iônico das células (MARTIN et
al.,1999).
O declínio de ATP intracelular inibe os processos celulares dependentes do
mesmo (ANDERSON et al., 1996; BIRK et al., 2013; LIU et al., 2014; PEGG, 1986) e
provoca falência das bombas transportadoras de íons dependentes de ATP,
principalmente da bomba sódio-potássio/ATPase, mas também da bomba cálcio-
hidrogênio/ATPase, com consequente aumento na concentração de Na+ e Ca2+
intracelular e de K+ no exterior da célula. Além disso, devido ao aumento de Na+
intracelular, o aporte de Na2+/Ca2+ é revertido, com maior acúmulo de Ca2+ no interior
da célula (SMITH, 2004; DURUKAN, TATLISUMAK, 2007; BROUNS; DEYN,
2009). Estudos relataram que, após um dano isquêmico, a concentração intracelular de
Na+ aumenta dentro do tecido do núcleo a uma taxa de 2% por hora em seres humanos
(THULBORN et al., 1999; TSANG et al., 2011; TSANG et al., 2009), 8% por hora em
macacos (LAVERDE et al., 2009), 12% por hora em coelhos (BARTHA et al., 2004) e
22-25% por hora nos ratos (JONES et al., 2006; WETTERLING et al., 2012;
YUSHMANOV et al., 2009). O tamanho da lesão do núcleo parece determinar a taxa de
aumento de Na+ com o decorrer do tempo (BOADA et al., 2012) (Figura 5).
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42!
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Figura 5: Mecanismos potenciais de dano neuronal após isquemia.
Fonte: SMITH, 2004
1.8.2 Cálcio e excitotoxicidade
O termo excitotoxicidade refere-se à toxicidade provocada pelo aumento da

concentração de glutamato durante a transmissão sináptica e consequente morte
neuronal. A ação neurotóxica do glutamato está completamente relacionada ao aumento
de íons Ca2+ (MATTSON, 2007; SMAILI et al., 2003; MATTSON, 2003).
O grande influxo de cálcio na célula neuronal leva à ocorrência de outros
mecanismos de dano neuronal como a ativação de calpaínas, proteases que afetam a
integridade estrutural da célula, ativação de fosfolipases que degradam a membrana
celular, além de induzir a expressão e ativação da enzima óxido nítrico sintase induzidas
(iNOS). Além disso, o cálcio promove a toxicidade direta para a mitocôndria; como
uma medida de sobrevivência da célula, a mitocôndria tenta sequestrar o cálcio
intracelular, mas promove, desse modo, dano à própria mitocôndria, gerando
despolarizações e edema mitocondrial. Nesta situação, os poros de transição
mitocondriais são abertos ocorrendo à liberação de íons e de citocromo C, que irá
promover a formação de radicais livres de oxigênio e morte neuronal por necrose e/ou
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43!
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apoptose (SMITH, 2004; DURUKAN; TATLISUMAK, 2007; HOSSMAN, 2009).

Os receptores NMDAs são permeáveis a íons Ca2+ permitindo que ocorra um
grande aumento das concentrações desse íon no interior da célula, portanto, sua
hiperativação tem sido considerada a principal responsável pela morte celular devido à
excitotoxicidade (STONE; ADDAE, 2002; MELDRUM, 2000).
O aparecimento de altas concentrações de glutamato no espaço extracelular é
indicativo de danos nos tecidos neuronais (SAYRE et al., 2014; BALTAN, 2014;
DING, 2014). O glutamato pode causar a morte neuronal isquêmica, atuando nos
receptores de NMDA (COLBOURNE et al., 1999), que desempenha um papel
fisiológico importante na potenciação em longo prazo e na formação da memória
(COLLINGRIDGE et al., 1983).
O glutamato no meio extracelular irá se ligar aos seus receptores ionotrópicos,
NMDAs, que são permeáveis ao cálcio, e em situações fisiológicas seu canal é
bloqueado pelo magnésio, e o AMPA/Cainato, que é permeável ao sódio, potássio e
zinco e eventualmente ao cálcio. A ativação destes receptores induz o aumento do
influxo de cálcio para dentro da célula (DIRNAGL et al., 1999; HOSSMAN, 2009;
WANG; MICHAELIS, 2010). Além dos receptores ionotrópicos, ele também irá se
ligar aos seus receptores metabotrópicos, acoplados a proteína G, induzindo a formação
de segundos mensageiros como o IP3, que ativa uma via de sinalização, promovendo
estresse ao retículo endoplasmático e ativando genes que levam a uma adaptação
genômica celular (HOSSMAN, 2009).
O glutamato, sendo liberado principalmente dos neurônios do core, irá exercer
sua ação nos neurônios da área de penumbra e em altas concentrações é capaz de
induzir a necrose direta pelo excesso de cálcio intracelular (SMITH, 2004; HOSSMAN,
2009).
Deste modo, a elevada concentração de receptores de NMDA excitatórios sobre
as árvores dendríticas de células piramidais de CA1 do hipocampo explica a
vulnerabilidade da área CA1 do hipocampo ao dano cerebral isquêmico (ESPOSITO et
al., 2002). Portanto, todas as drogas ou substâncias isoladas de plantas com capacidade
de diminuir os níveis de neurotransmissores excitatórios ou sua atividade no cérebro
podem ter um potencial terapêutico para melhorar as consequências das condições
isquêmicas (GOTTLIEB et al., 2003).
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44!
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1.8.3 Isquemia e estresse oxidativo

Na estrutura dos átomos e das moléculas, os elétrons associam-se normalmente
em pares. Definem-se espécies reativas ou radicais livres (RLs) espécies independentes
que contêm um ou mais elétrons não pareados (CLARK, 2002). As espécies reativas de
oxigênio são produzidas durante a fosforilação oxidativa mitocondrial como
bioprodutos do metabolismo aeróbico celular, sendo o oxigênio o principal fornecedor
de RLs. (GILKUN-SHERKI et al., 2002).
O estresse oxidativo é desencadeado quando a produção de radicais livres é
maior que a capacidade endógena das defesas antioxidantes celulares, ou seja, os níveis
de enzimas antioxidantes endógenas, como a superóxido dismutase (SOD), catalase e
glutationa, e as vitaminas antioxidantes, como α-tocoferol e ácido ascórbico, não são
suficientes para combater o excesso de radicais livres (MAKAR et al., 1994).
Os radicais livres são lesivos através de uma variedade de mecanismos: 1)
peroxidação dos ácidos graxos das membranas celulares; 2) oxidação de grupos
sulfidrila inativando uma variedade de enzimas; 3) alterações do DNA, promovendo
mutagênese; 4) inibição da síntese de ATP e consumo das reservas de dinucleotídeos
adenínicos da nicotinamida; 5) inativação direta do óxido nítrico (NO), comprometendo
os relaxamentos vasculares dependentes do endotélio; 6) reação com o NO, formando o
peroxinitrito, um ânion instável e tóxico; 7) ativação de citocinas como a interleucina-1;
8) ação inibitória na bomba de Na+/K+; 9) modulação da atividade de fatores de
transcrição como o factor nuclear kappa B (NF-κB) (GILKUN-SHERKI et al., 2002;
SCANDALIOS, 2005).
O NO é produzido no sistema nervoso central pelo óxido nítrico sintase
constitutiva (nNOS ou tipo 1), cálcio-calmodulina dependente, encontrada nos
neurônios e pela NOS induzida (iNOS ou tipo 2) encontrada na microglia. Se o NO é
neurotóxico ou neuroprotetor ainda é ponto de dúvidas. As diferenças observadas na
viabilidade celular, no que diz respeito ao efeito do NO, estão relacionadas, em parte,
com a presença ou ausência de espécies reativas de oxigênio (ROS). Este se combina ao
NO formando o ânion peroxinitrito (MORO et al., 2004).
Após uma injúria isquémica por tempos relativamente curtos (no máximo 30
minutos para neurônios), o tecido afetado pode ser recuperado pela reperfusão
sanguínea, reintroduzindo O2 e nutrientes. Contudo, a reintrodução de O2 acaba
produzindo injúrias mediadas por EROs. A NOS ativada pelo alto nível de Ca+2 resulta
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45!
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na formação de óxido nítrico e oxidantes dele derivados. A xantina oxidase, concebida

durante a hipóxia, oxida a hipoxantina acumulada produzindo radical O2•-, H2O2,
peroxinitrito (ONOO-) e ânion radical carbonato (CO3•-). A isquemia ainda pode levar à
liberação de metais de transição, promovendo a formação de HO• e o dano mitocondrial,
aumentando o "vazamento" de elétrons (MORO et al., 2004).
1.8.4 Inflamação
A isquemia focal leva, particularmente, a um aumento significante dos níveis de

citocinas, como fator de necrose tumoral (TNFα), interleucinas IL-1β e IL-6 e
quimiocinas, como a proteína quimiotática de monócito-1 (MCP-1) e a proteína
inflamatória de macrófagos (MIP-1α) (LIU et al., 1994; WANG et al., 1994; KIM et al.,
1995; WANG et al., 1995; KAPADIA et al., 2006). Todas essas moléculas induzem a
expressão de moléculas de adesão como a molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1),
P-selectina e E-selectina sobre as células endoteliais e células brancas do sangue
(ABBASSI et al., 1993; EPPIHIMER et al., 1996).
Em adição aos eventos excitotóxicos que ocorrem durante a isquemia, reações
inflamatórias agudas que se iniciam logo após o insulto isquêmico e persistem por dias,
também podem contribuir para a morte neuronal. Um dos principais eventos que levam
a inflamação no cérebro é a expressão de moléculas de adesão como a molécula de
adesão intercelular (ICAM-1) sobre as células endoteliais capilares que irão facilitar a
adesão e migração transendotelial de neutrófilos e macrófagos (BARONE;
FEUERSTEIN, 1999).
Após a oclusão transitória ou permanente da ACM em roedores, o acúmulo de
neutrófilos pode ser detectado muito cedo na área de infarto (BARONE et al., 1992;
GARCIA et al., 1994; YANAKA et al., 1997). Além disso, estudos demonstram que a
diminuição da circulação de neutrófilos pode reduzir o volume de infarto e o edema em
vários modelos de isquemia cerebral (SHIGA et al., 1991; MATSUO et al., 1994).
Enquanto nos capilares o acúmulo dos leucócitos prejudica o fluxo sanguíneo, quando
extravasados no parênquima cerebral, eles liberam uma grande quantidade de
substâncias neurotóxicas, incluindo citocinas e quimiocinas, algumas das quais induzem
os ligantes e receptores que medeiam o recrutamento e infiltração de leucócitos no
cérebro.
A mieloperoxidase (MPO) é uma enzima presente nos grânulos azurófilos de
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46!
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neutrófilos e de células da linhagem mielóide, especialmente nos monócitos e

macrófagos/micróglia. Após a sua liberação ela interage com o peróxido de hidrogênio
gerando ânion superóxido, peroxinitrito e outros radicais livres extremamente tóxicos
-
como o hipoclorito (OCL ). Na isquemia, a MPO está envolvida com a indução de
apoptose e nitritirosinação de proteínas. É uma molécula chave na inflamação e tem
sido descrita em diversos modelos animais de isquemia cerebral (WANG et al., 2015;
LIU et al., 2014; BRECKWOLDT et al, 2008).
A micróglia, macrófagos residentes no Sistema Nervoso Central (SNC), tem
importante papel como células imunológicas e fagocíticas, servindo como células de
limpeza na infecção, inflamação, trauma, isquemia e neurodegeneração. Em ratos
hipertensos isquémicos, submetidos a oclusão permanente da artéria cerebral média
(pMCAO), observou-se que o tratamento repetitivo com oxigênio hiperbárico reduziu o
volume de infarto pela inibição da ativação da micróglia (GUNTHER et al, 2005). Em
MCAO transitória a ativação microglial foi documentada no córtex cerebral do
hemisfério isquêmico (YU et al., 2005; ZHANG et al., 1997). A micróglia pode exercer
papel protetor na isquemia, através de moléculas neurotróficas como o fator
neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e o fator de crescimento tipo insulina (IGF-
1), e efeito deletério pela liberação de citocinas inflamatórias como TNF-α, Il-1β, além
de outras moléculas, como IL-6, NO, ROS e prostanóides (LAKHAN et al., 2009).
Os astrócitos, após um evento isquêmico, se tornam ativados resultando no
aumento da expressão de proteína ácida fibrilar glial (GFAP), também chamada de
gliose reativa, caracterizada por mudanças específicas na estrutura e função destas
células. Os astrócitos também participam da inflamação cerebral através da liberação de
mediadores inflamatórios como citocinas, quimiocinas e iNOS. Além disso, acredita-se
que os astrócitos também têm um papel na expressão de moléculas de adesão, liberação
de moléculas estimuladoras de resposta inflamatória TH2 e inibição da liberação de IL-
12 (LI et al, 2015; WANG; TANG, 2007).
O NF-κB é um fator de transcrição amplamente encontrado em células
eucariotas que desempenha papel primordial na resposta inflamatória, participando de
uma variedade de transcrições de genes relacionados à inflamação (RIDER;
SCHWANINGER, 2009). NF-κB é uma proteína dimérica que permanece em estado
inativo no citoplasma, associada à sua unidade inibitória I-κB. Estímulos inflamatórios
desencadeiam sua fosforilação e sua ubiquitinação, levando a sua dissociação e
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47!
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degradação de I-κB e posterior translocação do citoplasma para o núcleo. O prejuízo

causado por isquemia e reperfusão também pode ativar a expressão de TNF-α e
desencadear a fosforilação de NF-κB. A fosforilação dos inibidores de NF-κB
conduzem a translocação para o núcleo onde se ligam com regiões promotoras de genes
que medeiam a apoptose e a degradação do DNA (GHOLAMI et al., 2016; HARARI;
LIAO, 2010) (Figura 6).
Figura 6: Resumo geral dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos na isquemia e

reperfusão cerebral.
Fonte: Silva, 2014.
1.8.5 Apoptose
Encontram-se descritos diversos tipos de morte celular (KROEMER, et al.,

2009; OUYANG et al., 2012), sendo os três fundamentais, a apoptose (morte celular
tipo I), a autofagia (morte celular tipo II) e a necrose (morte celular tipo III)
(GODLEWSKI; KOBYLINSKA, 2016; SHAKERI et al., 2017).
A morte celular programada é um processo fisiológico essencial na manutenção
da homeostase humana, eliminando células senescentes ou defeituosas (PASPARAKIS;
VANDENABEELE, 2015). Durante muito tempo, a apoptose foi considerada como a
única forma de morte celular programada, enquanto a necrose era conotada como não
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programada; no entanto, pesquisas recentes sobre os mecanismos celulares de necrose

mostraram que, além da apoptose, existem vários tipos de morte celular que são também
reguladas por certas moléculas sinalizadoras como a piroptose, a ferroptose e a morte
celular autofágica (STOCKWELL et al., 2017; DEGTEREV et al., 2008). Essas
descobertas mudaram as ideias convencionais sobre a classificação de morte das células
e ofereceram uma base para uma terapia diferente e eficaz para doenças necróticas
(WALLACH et al., 2016).
A apoptose pode ser induzida por diversas situações e muitas delas prevalecem
durante a isquemia (ARUMUGAM et al., 2018; LIPTON, 1999). É caracterizada por
uma série de alterações morfologicas distintas como a condensação da cromatina e
intensa fragmentação do DNA em segmentos de tamanho proporcional, a perda de
volume celular, a formação de protuberâncias na membrana plasmática e a formação de
corpos apoptóticos que serão fagocitados por macrófagos (ONDROUSKOVA;
VOJTESEK, 2014; LOVE, 2003).
Dentre as moléculas sinalizadoras da apoptose destaca-se a participação das
caspases da família das cisteínas-proteases, as quais reconhecem e clivam substratos,
mediando por exemplo a externalização de lipídios de membrana chamados de resíduos
de fosfatidilserina, sinalizadores da fagocitose de células apoptóticas. São conhecidas 14
caspases humanas, sendo que seis delas (caspases-3, -6, -7, -8, -9, -10) participam da
apoptose (ULUKAYA et al., 2011).
Existem duas vias de sinalização distintas, mas interconectadas, que dão início
ao processo de apoptose: as vias intrínsecas (via mitocondrial) e as extrínsecas (ou via
dos receptores de morte). A via intrínseca de apoptose é desencadeada pela ação de
diferentes sinais de estresse intracelular, especificamente, a irradiação, agentes
quimioterápicos, vírus, bactérias, ausência de fatores de crescimento celular e hipóxia,
que vão provocar aumento da permeabilidade mitocondrial e liberação de substâncias
pró-apoptóticas no citoplasma da célula. A mitocôndria é o centro da via intrínseca da
apoptose, além disso, também pode amplificar e mediar a via extrínseca (HASSAN et
al., 2014; SCHMITT et al., 2002; SHARMA et al., 2000; MORAES et al., 2007;
JAATTELA; MATHIASEN, 2002; GALLUZZI et al., 2012). O citocromo C é liberado
da mitocôndria e conduz à ativação de caspase 3, a partir da ligação dessa molécula com
a proteína adaptadora, protease apoptótica ativadora de fator 1, e de pró-caspase 9
formando um complexo (apoptossomo) e levando à ativação da caspase 9, a qual, por
sua vez, ativará outras caspases, como as pró-caspase 3 e 7, resultando na apoptose via
!
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mitocondrial (LIU et al., 2017; HASSAN et al., 2014; GALLUZZI et al., 2012;
STEPHEN; GREEN, 2010) (Figura 7).
A família Bcl-2 atua na apoptose através da regulação da permeabilidade da membrana
mitocondrial. Pode ser subdividida em duas subfamílias: A subfamília pró-apoptótica,
Bax, Bcl-Xs, Bak, Bid e Bad que diminuem o potencial de membrana da mitocôndria
através do PTP facilitando a liberação do citocromo C, e a subfamília antiapoptóticas,
Bcl-2 e Bcl-Xl que conservam o potencial de membrana e bloqueiam a liberação de
citocromo C (SHAMAS-DIN et al., 2013; LOVE, 2003; SUGAWARA et al., 2004).
Figura 7: Vias extrínseca e intrínseca de apoptose e respectiva associação com as

caspases.
Fonte: Adaptado de WHITE et al., 2015.
A via extrínseca é ativada pela união de ligantes específicos dos receptores de

morte na superfície celular, por exemplo, o receptor do fator de necrose tumoral (rTNF)
e TRAIL (Ligante indutor de apoptose relacionado ao TNF). Os integrantes da família
rTNF têm um domínio extracelular rico em cisteína, o qual permite que eles
reconheçam seus ligantes (FULDA; DEBATIN, 2006). Quando os receptores de morte
reconhecem um ligante específico, seus domínios intracelulares interagem com a FADD
(proteína associada ao FAS com o domínio da morte), essa molécula tem a capacidade
!
50!
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de recrutar a pró-caspase-8 que, por sua vez, vai ativar as caspases efectoras 3, 6 e 7 que
vão levar à apoptose da célula (caspase inativa) (SOLA et al., 2013; KROEMER et al.,
1998; DEBATIN; KRAMMER, 2004).
Na região da penumbra isquêmica, a apoptose pode ocorrer após várias horas ou
dias, enquanto a necrose começa nas primeiras horas após o começo da isquemia no
núcleo isquémico (RADAK et al., 2016).
A necrose é um processo passivo, no qual a célula responde ao estresse externo
de uma forma aleatória e descoordenada. Hoje, é evidente que os mecanismos de morte
celular vão além da simples relação apoptose e necrose. Pesquisadores que estudarm a
morte celular relatam a existência de novos modos de regulação nesse processo que,
devido a sua complexidade, ainda não foram descritos (DEGTEREV; YUAN, 2008). A
administração do inibidor necrose/apoptose, o Nec-1, fornece proteção tecidual
significativa e melhoramentos de uma variedade de lesões agudas dos tecidos por meio
de mecanismos de inibição da apoptose em modelos de isquemia/reperfusão em ratos
com lesão (SMITH et al., 2007).
O excesso de ação da poli (ADP-ribosil), em resposta a danos no DNA, também
pode levar à morte celular numa série de situações como o acidente vascular cerebral,
lesão cerebral traumática e lesão de isquemia/reperfusão em vários órgãos (ANDRABI
et al., 2008). Assim, os inibidores da Poli (ADP-ribose) polimerase, a PARP-1, podem
fornecer proteção em ratos submetidos ao modelo de lesão de isquemia e reperfusão
(MARTIN et al., 2000).
A autofagia é um processo catabólico fundamental que degrada componentes
celulares dentro do lisossoma, onde as organelas celulares que já não se encontram
funcionais são abrangidos por uma membrana, sendo decompostos. A autofagia exerce
um indispensável papel no crescimento celular, desenvolvimento e homeostase,
ajudando a manter um equilíbrio entre síntese, degradação e subsequente reciclagem dos
produtos celulares (GALLUZZI et al., 2011).
1.9. Plasticidade sináptica hipocampal e cognição
1.9.1 Anatomia e circuito hipocampal
O hipocampo é uma região complexa e fascinante do cérebro que difere de todas

as outras em termos de estrutura morfológica e de organização dos circuitos neuronais.
Seu nome provém do seu formato curvado apresentado em secções coronais,
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51!
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assemelhando-se a um cavalo-marinho (Grego: hippos = cavalo, kampi = curva). É

encontrado em pares, localizado nos lados esquerdo e direito do cérebro (sistema
límbico), e tem um papel vital nos processos comportamentais, emocionais e de
memória (STRANGE et al., 2014; HEIJER et al., 2010; SMITH et al, 2006; KANDEL,
2001).
Anatomicamente o hipocampo é constituído por sub-regiões: o giro denteado
(GD) e o Corno Ammonis (CA), o qual se subdivide em CA1, CA2, CA3 e CA4, e o
subículo. Essas regiões são estruturadas em camadas e são regiões distintas, com
variedade de estrutura e tamanho celular, conectividade, propriedades eletrofisiológicas
e suscetibilidade a danos. A principal camada do GD é a camada granular e a principal
camada do CA é a camada piramidal (SCHULTZ; ENGELHARDT, 2014;
SCHARFMAN, 2007; ALTMAN; BAYER, 1990). Tanto as células granulares como as
células piramidais usam o glutamato como neurotransmissor. As regiões CA1 e CA2
contêm pequenas células piramidais; a região CA3 forma uma curva e é composta por
neurônios piramidais; e a região CA4, também chamada de região hilar, é composta por
células piramidais, ligeiramente estruturadas, que são circundadas pelo giro denteado
(SENDROWSKI, 2013). O GD subdivide-se na camada molecular ou dendrítica, no
estrato granuloso e na região hilar ou estrato polimorfo, caracterizados por neurônios
polimórficos, largamente dispersos, e está separado de CA1-CA3 pelo sulco do
hipocampo (DUVERNOY et al., 2013).
Funcionalmente o hipocampo de mamíferos pode ser subdividido em duas
regiões distintas: o hipocampo ventral e o hipocampo dorsal. A porção ventral está
envolvida especialmente no processamento emocional, enquanto a porção dorsal está
ligada principalmente à memória e ao aprendizado (BANNERMAN et al., 2004).
O estudo do hipocampo tem colaborado enormemente para a compreensão do
funcionamento dos circuitos cerebrais especialmente no armazenamento de traços de
memória de longo prazo (BURGESS et al., 2002). Devido a essas interações com
diversas estruturas cerebrais relacionadas às emoções (por exemplo, amígdala), o
hipocampo tem sido associado ao comportamento emocional (hipocampo ventral)
(SAHAY; HEN, 2008). Em relação à conectividade hipocampal, os hilus e
interneurônios hilares enviam projeções excitatórias e inibitórias, respectivamente, de
volta às células granulares. O fluxo intrínseco da informação do hipocampo ocorre de
maneira sequencial, em grande parte, unidirecional e glutamatérgica (excitatória) que,
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52!
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em última análise, faz parte de um circuito fechado chamado alça trissináptica

(SCHULTZ; ENGELHARDT, 2014).
De maneira sucinta e simples, o córtex entorrinal dá origem a projeções para
todos os constituintes do hipocampo, com suas projeções mais fortes ocorrendo através
da via perfurante para a região DG. Subsequentemente, o DG projeta-se para a região
CA3 através da via da fibra musgosa e depois projeta o CA3 para a região CA1 através
das células Schaffer Colaterals (SC). Finalmente, CA1 projeta de volta ao córtex
entorrinal, completando o ciclo (RAMÓN; CAJAL, 1911; AMARAL; WITTER, 1989;
NEVES et al., 2008; AGSTER et al., 2013; KNIERIM, 2015).
1.9.2 Plasticidade sináptica na sub-região do hipocampo CA1

A neurogênese varia muito entre as espécies e a sua existência na fase adulta
tem sido questionada em algumas espécies de mamíferos, principalmente, em seres
humanos (SORRELLS et al., 2018). O hipocampo, mais especificamente o GD, é uma
das poucas regiões cerebrais onde a neurogênese ocorre durante toda a fase da vida no
cérebro dos mamíferos saudáveis (MING; SONG, 2011). Novos neurônios surgem no
GD, onde amadurecem e se tornam axônios funcionais que, por sua vez, conectam-se a
outras subdivisões do hipocampo. Estudos recentes comprovaram a existência da
neurogênese em seres humanos adultos em quantidade funcionalmente relevante
(BOLDRINI et al., 2018; KEMPERMANN et al., 2018; MORENO-JIMENEZ et al.,
2019). Vários estudos já demostraram que a neurogênese desempenha um papel
fundamental no aprendizado, na memória e também na regulação do estado emocional
(STRANGE et al., 2014).
Os neurônios possuem uma capacidade singular de armazenar informações
através da modificação nas suas forças de interconexões. Uma das propriedades mais
encantadores e importantes do cérebro dos mamíferos é sua extraordinária habilidade de
ajustar a sua função com base no input recebido, de uma forma dependente da sua
atividade, força e eficácia na transmissão sináptica em sinapses pré-existentes - um
processo conhecido como plasticidade sináptica (BAYATI; VALIZADEH, 2012;
BAYATI et al., 2015; MADADI et al., 2017). A plasticidade sináptica é um processo
bidirecional que consiste no aumento da eficácia sináptica, da potenciação em longo
prazo (LTP) e no enfraquecimento da eficácia sináptica e da depressão em longo prazo
(LTD). Tanto ao nível celular como ao nível molecular, a plasticidade sináptica envolve
mudanças na estrutura das sinapses e no estado de fosforilação dos canais de membrana.
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O aumento do número e do tamanho das sinapses aumenta a área de superfície total que
conecta dois neurônios, enquanto que o aumento do número de receptores ou de
fosforilação aumenta o potencial de condutância dos neurônios (BEAR, 2003; CITRI;
MALENKA, 2008).
Estudos recentes mostraram que a LTP é o principal mecanismo celular pelo
qual os neurônios codificam informações complexas que nascem da experiência
(MILLER; MAYFORD, 1999; LANGILLE; BROWN, 2018). Em comparação, a LTD
parece ser indispensável para uma forma mais simples de aprendizagem e de habituação
(GLANZMAN, 2009). Os mecanismos moleculares subjacentes a ambas as formas de
modificações na função sináptica (LTD e LTD) são diferentes.
Segundo Donald Hebb (1949), para a indução da LTP, tanto os neurônios pré
como pós-sinápticos precisam estar ativados ao mesmo tempo porque o neurônio pós-
sináptico precisa ser despolarizado quando o glutamato é liberado do neurónio pré-
sináptico para cancelar completamente o bloqueio de Mg2+ dos NMDARs. Como
consequência da despolarização e da ligação do glutamato, ocorre um aumento no
influxo de cálcio através dos NMDARs, o que ativa as cascatas de sinalização
intracelular, envolvendo ativação de proteínas quinases dependentes de Ca2+/
calmodulina (CaMKII) que, em última instância, são responsáveis pela modificação na
eficácia sináptica. A LTP dependente dos NMDARs é crucial para a formação e
reestruturação dos circuitos neurais durante o processo de aprendizagem e de memória.
Esse processo ocorre abundantemente no cérebro, mas é mais estudado nas sinapses das
colaterais de Schaffer (CA3-CA1) no hipocampo (BLISS; COLLINGRIDGE, 1993;
HUGANIR; NICOLL, 2013; MORRIS, 2013) (Figura 8).
Figura 8: Mecanismo molecular da LTP.
Fonte: LENT, 2010.
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Vários estudos apontam que modificações morfológicas acompanham a LTP.

Essas modificações incluem crescimento de novos espinhos dendríticos, aumento de
espinhos pré-existentes e suas devidas densidades pós-sinápticas (PSDs) e a repartição
de um espinho em dois terminais pós-sinápticos funcionais (LAMPRECHET;
LEDOUX, 2004) (Figura 9).
Figura 9: A potenciação de longa duração (LTP) pode ser detectada em diversas

regiões do SNC, especialmente no hipocampo.
Fonte: LENT, 2010.

A. Representação dos circuitos básicos do hipocampo.
B. Mostra que o PPSE é maior após a estimulação tetânica do que antes dela.
C. Medindo o aumento do PPSE várias vezes na mesma preparação (pontos azuis em D), verificou-se que
o efeito se mantém durante horas. Quando os dendritos são cortados e separados do corpo celular, a LTP
decai em algumas horas (pontos verdes em D), e o mesmo acontece quando inibidores de RNA são
adicionados ao meio (barra amarela), e quando são adicionados inibidores de síntese proteica (barra
verde).
Por outro lado, a LTD pode ser induzida através da estimulação repetitiva do
neurônio pré-sináptico que em baixas frequências (LFS) (900 estímulos a 1Hz) leva a
uma diminuição da resposta pós-sináptica que pode durar horas. A força necessária para
a entrada do cálcio na célula é muito grande para um neurónio em repouso; o bloqueio
do NMDAR por Mg2+, mesmo no estado de repouso, é incompleto, o que permite a
entrada de Ca2+ dentro das células, em resposta a estimulação sináptica de baixa
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frequência (JAHR; STEVENS, 1993; SABATINI et al., 2002; BLOODGOOD;

SABATINI, 2007; BLOODGOOD et al., 2009). Presumivelmente, é repetida a
ocorrência deste fluxo de Ca2+. Assim como a LTP, diversas formas de LTD podem ser
encontradas no sistema nervoso. A forma mais bem estudada e prototípica é a LTD
dependente de receptores NMDAs (MULKEY et al., 1993; MULKEY et al., 1994).
Evidências sugerem que a indução da LTD envolve a ativação de proteínas fosfatases
dependentes das cascatas reguladas por Ca2+, principalmente calcineurina, proteína
fosfatase 1 e uma fosfoproteína chamada de inibidor 1. Consistentemente, foi
comprovado que a inibição dessas fosfatases reduz a LTD. A LTD também está
associada à desfosforilação de sítios de atuação de PKA e PKC, cinases envolvidas na
LTP. A desfosforilação da subunidade GluR1 no sítio de atuação da PKA está associada
a uma diminuição da probabilidade de abertura de canais AMPA, o que pode contribuir
para a indução de LTD (MORISHITA et al., 2001; LEE et al., 2000; BANKE et al.,
2000) (Figura10).
Figura 10: Mecanismo molecular da LTD.
Fonte: LENT, 2010.
Além destas formas de plasticidade sinápticas, as sinapses que recentemente

sofreram LTP podem ser despotencializadas por meio de um processo denominado
despotenciação (DP), o qual também é acionado pelo LFS. A DP e LTD são induzidos
por protocolos do tipo LFS semelhantes que resultam na redução da eficiência sináptica.
A DP é desregulada em doenças neurológicas, logo, a compreensão de suas
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características moleculares pode fornecer alvos farmacológicos pelo qual pode ser
modulada.
1.9.3 Registros eletrofisiológicos
O estudo do circuito hipocampal foi facilitado através dos registros

eletrofisiológicos das respostas neuronais em fatias do hipocampo. A associação entre
fatias do hipocampo e eletrofisiologia possibilitou uma melhor compreensão da
atividade neuronal, incluindo as atividades do potencial de ação dos neurônios. A
preparação de fatias do hipocampo apresenta várias vantagens como: a citoarquitetura e
os circuitos sinápticos do hipocampo são amplamente mantidos e o padrão de ligações
sinápticas dentro da fatia é praticamente inalterado em relação aos padrões in vivo. O
registro dos potenciais sinápticos extracelulares das células piramidais da região CA1
das fatias do hipocampo possibilita a leitura das atividades de diversas células locais,
tais como, a transmissão sináptica originada através de uma estimulação simultânea de
diversos neurônios (Schaffer collaterals).
É de fundamental importância identificar os diferentes tipos de substâncias que
estão em um potencial extracelular: 1- a salva pré-sináptica (PSV), que é uma deflexão
com duas fases logo após o artefato de estímulo e antes de um potencial sináptico de
campo. Tem origem na soma dos potenciais de ação das fibras de Schaffer estimuladas
(ANDERSEN et al., 1978); 2- o potencial sináptico de campo, que se origina da soma
dos potenciais inibitório e excitatório (ALGER; NICOLL, 1982). Este potencial é
composto por uma inclinação descendente que retrata os potenciais pós-sinápticos
excitatórios de campo (fEPSPs) da população neuronal estimulada e reproduz uma
despolarização temporária do potencial de membrana pós-sináptico concebida pelo
fluxo de íons carregados positivamente na célula pós-sináptica como resultado da
abertura dos canais iônicos regulados por ligantes (ANDERSEN et al., 1966). A
inclinação ascendente retrata a atividade inibitória (KAMPHUIS et al., 1988). Este tipo
de sinal é adquirido quando o eletrodo de registro é posicionado no CA1 do estrato de
camada radiada; 3- o pico populacional (PS), que é a modificação no potencial elétrico
como conseqüência do movimento de íons envolvidos na geração e propagação de
potenciais de ação. Representa a soma dos potenciais de ação produzidos de forma
simultânea pela população de corpos celulares na vizinhança do eletrodo de registro
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(ANDERSEN et al., 1971). Este tipo de sinal é alcançado quando o eletrodo de registro
é posicionado na camada piramidal do estrato CA1 (Figura 11).
Figura 11: Registro de um potencial de membrana do terminal axônico.
Fonte: LENT, 2010.
1.9.4 Isquemia cerebral e déficits de memória
A memória, a capacidade de deter informações e lembrá-las posteriormente, é

uma função fisiológica basilar e essencial para a sobrevivência. Além disso, as
memórias moldam as nossas identidades: somos quem somos por causa das nossas
memórias, que guiam os nossos pensamentos, nossas decisões e influenciam nossas
reações emocionais (KANDEL, 2001; DUDAI, 2004; LAMPRECHT, 2006;
ALBERINI, 2008; ALBERINI, 2009; DAVIS; SQUIRE, 1984).
Mcewen e Sapolsky (1995) caracterizaram a memória como sendo um processo
ativo e dependente de algumas variáveis como o meio e as experiências anteriores. O
estado emocional desempenha um papel de filtro na retenção da memória.
A memória pode ser classificada em diversas formas e depende de diversos
sistemas neurais. Com base na duração, as memórias podem ser classificadas em curto e
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longo prazo. A memória de curto prazo (STM) é a capacidade de preservar e recuperar

informações por um curto período de tempo, geralmente por alguns segundos, enquanto
as memórias de longo prazo (LTM) armazenam informações por períodos de longa
duração, às vezes por toda a vida. Os STMs e os LTMs também podem ser
diferenciados com base em seus mecanismos biológicos, enquanto os primeiros se
baseiam em redes existentes e modificações simples, estes últimos são acompanhados
por mudanças estruturais e funcionais de redes neurais que requerem uma nova
expressão gênica (KANDEL, 2001; DUDAI, 2004; LAMPRECHT, 2006; ALBERINI,
2008; ALBERINI, 2009; DAVIS; SQUIRE, 1984) (Figura12).
Figura 12: Tipos e subtipos de memória e suas regiões de processamento
Fonte: Adaptada de Helene; Xavier, 2003.
As memórias podem ser classificadas de acordo com as suas manifestações

comportamentais, o que reflete o uso de redes subjacentes distintas ou sistemas de
memória. Por exemplo, existe uma grande diferença entre as memórias explícitas
(declarativas) e as implícitas (não-declarativas ou processuais) (GRAF; SCHACTER,
1985; SQUIRE, 1996). Memórias declarativas são memórias que podem ser lembradas
conscientemente como aquelas relacionadas com fatos, pessoas e eventos, enquanto
memórias procedurais são aquelas que armazenam informações sobre habilidades, por
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exemplo, dirigir um carro, andar de bicicleta ou tocar piano. Embora se saiba que as
memórias declarativas envolvem criticamente o lobo temporal medial e,
particularmente, o hipocampo, as memórias procedurais recrutam criticamente o
cerebelo. Apesar dessas distinções, as lembranças costumam ser complexas e feitas a
partir de experiências que envolvem múltiplos sistemas de memória interagindo entre si
(DEW; CABEZA, 2011; SQUIRE; ZOLA, 1996).
Nas últimas duas décadas, um dos principais interesses dos neurocientistas tem
sido a identificação dos mecanismos biológicos subjacentes à formação e
armazenamento de memórias. Uma grande característica do processo de formação da
memória de longo prazo em seres vivos é que, inicialmente, uma memória recém-
codificada existe em um estado frágil e pode ser facilmente interrompida por vários
tipos de interferências, quer sejam farmacológicas, moleculares ou comportamentais.
Com o tempo, a memória se torna mais forte e resiliente à ruptura. Esse processo de
fortalecimento e estabilização é conhecido como consolidação da memória (DUDAI;
EISENBERG, 2004; ALBERINI, 2009; DAVIS, 1984; MCGAUGH, 2000). Uma vez
consolidada, portanto, insensível a interferências, acreditava-se que a memória era
armazenada “fixada”. Tanto a consolidação quanto a reconsolidação são fases durante
as quais as memórias são vulneráveis a interferências e um fortalecimento ou
enfraquecimento do rastreamento da memória pode ser alcançado. Este entendimento é
extremamente importante para potenciais aplicações clínicas; em princípio, de acordo
com os mecanismos de consolidação e reconsolidação, é possível fortalecer memórias
fracas ou memórias que são facilmente perdidas ou, inversamente, enfraquecer
memórias que são muito fortes e ligadas a psicopatologias, como aquelas associadas,
por exemplo, a transtorno de estresse pós-traumático, a ansiedade ou abuso de
substâncias (TRONSON; TAYLOR, 2007; PITMAN, 2011; HARTLEY; PHELPS
2010).
O dano neuronal resultante de isquemia cerebral pode levar a problemas de
cognição, como déficits de memória nos pacientes acometidos por AVC (AVIRAM et
al., 2000). Alguns trabalhos têm demonstrado déficits na aquisição e retenção da
memória após a oclusão da artéria cerebral média em animais (SARKAKI et al., 2015;
CARMO et al., 2014; FERNANDES et al., 2014), na memória operacional, acessada
através do teste de reconhecimentos de objetos e do recinto (MUMBY et al., 1996;
PLAMONDON et al., 2006) e na memória espacial que pode ser avaliada no teste do
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labirinto aquático (SANDSTROM; ROWAN, 2007). Esses déficits de memória estão

relacionados a danos neurais no córtex, corpo estriado e hipocampo (GU et al., 2010).
Portanto, reparação e regeneração neuronal nessas estruturas cerebrais, após dano
isquêmico, podem apresentar efeitos benéficos sobre a memória.
Um estudo recente (PENG, 2016), utilizando modelo de isquemia cerebral in
vivo, mostrou que os níveis de proteínas sinápticas, incluindo cálcio/proteína quinase
dependente de calmodulina II (CaMKII) e proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2)
e do receptor de glutamato 1 (GluR1), estão significativamente diminuídas na região
CA1 do hipocampo. Nesse mesmo estudo, foi observado déficit na potenciação de longa
duração (LTP) nesse grupo de animais (YAMAMOTO et al., 2008; WANG; PENG,
2016). Outro estudo mostrou que o evento isquêmico prejudica o LTP e acelera o
processo de morte neuronal (TANAKA et al., 2002).
Haghani e colaboradores (2016) mostraram que uma redução moderada da
perfusão cerebral sem lesão permanente pode aumentar dramaticamente a transmissão
sináptica basal. Este efeito pode estar associado com um aumento de
neurotransmissores nos neurônios pré-sinápticos.
1.10. Terpenos e neuroproteção
As plantas medicinais produzem diversos metabólitos secundários, dentre esses

metabólitos, o óleo essencial vem ganhando destaque por apresentar efeito
antibacteriano, antifúngico e antioxidante. Nos últimos anos, vem crescendo a atenção
para a produção e implementação dos óleos essenciais na medicina popular; são
compostos principalmente por terpenos e terpenóides com baixo peso molecular
(WASEEN; LOW, 2014).
Os terpenos são substâncias lipofílicas, ou seja, insolúveis em água e é essa
característica que indica a facilidade de uma molécula ser ou não transportada através
de uma membrana (MAZZATORTA et al., 2005). São classificados de acordo com sua
unidade de isopreno como monoterpeno, diterpeno, triterpeno e sesquiterpeno
(MURAKAMI et al., 2004).
Os terpenos, de ocorrência natural, representam uma fonte de matéria-prima
renovável, sendo muito importantes para as indústrias farmacêuticas, de perfumes, de
flavorizantes, agroquímicas, de cosméticos e de aromas, além de intermediários
sintéticos versáteis, podendo ser usados na síntese de produtos quirais (ERMAN, 1985;
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MONTEIRO; VELOSO, 2004). Essas substâncias vêm sendo muito utilizadas como
aditivos na indústria alimentícia e também na indústria de cosméticos (TSAO; COATS,
1995), por possuírem atividade antimicrobiana, inseticida, anticancerígena, anti-
inflamatória, dentre outras (MURAKAMI et al., 2004; HAN, 2005; GRODNITZKY;
COATS, 2002; GRIFFIN et al., 1999).
Ruberto e Baratta (2000) demostraram o efeito antioxidante de vários
sesquiterpenos presentes em diferentes óleos essenciais. Um estudo realizado com o
trans-farnesol mostrou a sua proteção contra o efeito do dano oxidativo causado por 1,2-
dimetil-hidrazina no cólon de ratos Wistar (KHAN; SULTANA, 2011) e por
substâncias tóxicas da fumaça do cigarro (QAMAR; SULTANA, 2008).
Estudos mostraram que vários terpenos apresentaram atividade neuroprotetora
frente à isquemia e à toxicidade induzida pela neurotoxina 6-OHDA, tanto in vitro como
in vivo. Exemplo de terpenos com essas atividades são: bilobalídeo e ginkgolídeo
(lactona sesquiterpeno), canabidiol e a tetra-hidrocanabinol (diterpeno), catalpol
(monoterpeno) e ácido seroféndico (diterpeno) (DEFEUDIS, 2002; LOGANI et al.,
2000; JACKSON et al., 2005; LASTRES-BECKER et al., 2005; LI et al., 2004;
OSAKADA et al., 2004; HSIAO et al., 2004; AHMAD et al., 2005).
Estudo realizado por Cionca e colaboradores (2013), demonstrou que o óleo
essencial extraído da Coriandrum sativum, popularmente conhecida como coentro, foi
capaz de melhorar a memória de animais expostos ao β-amilóide pela diminuição do
estresse oxidativo. Diversos estudos também demonstraram que alguns óleos essenciais
são capazes de proteger o cérebro da isquemia cerebral, como o realizado por Wang et
al. (2012), no qual concluiu-se que o óleo essencial da Lavandula angustifólia possui
efeito neuroprotetor frente à isquemia focal transitória em animais, o que pode ser
atribuído ao efeito antioxidante do óleo essencial. A pesquisa realizada por Chang e
colaboradores. (2013) observou que o β-cariofileno, um sesquiterpeno encontrado em
diversas plantas, apresenta atividade neuroprotetora em animais submetidos à isquemia
focal permanente, e essa proteção pode dever-se a seu efeito anti-inflamatório.
Outro estudo demonstrou que mesmo existindo vários terpenos com atividade
neuroprotetora, ainda é difícil encontrar estudos que comparem a atividade
neuroprotetora de diferentes terpenóides com a sua estrutura. As pesquisas sobre a
relação estrutura-atividade são ferramentas muito úteis para se investigar a relação entre
a estrutura química de um composto e a sua bioatividade (HERMENS, 1995; CHUN et
al., 2005).
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1.11. α-Bisabolol
O α-bisabolol (Figura 13), também conhecido como levomenol, é um álcool de

sesquiterpeno, natural, monocíclico, de caraterística lipofílica, de baixo peso molecular,
volátil, sendo, o constituinte majoritário do óleo essencial, retirado da Matricaria
chamomilla, popularmente conhecida como camomila, da Vanillosmopsis erythropappa
e da Peperônia, entretanto, dentre essas fontes de α-bisabolol, a mais utilizada para sua
extração é a camomila (REYNOLDS, 1996; VICHNEWSKI et al., 1989; LIRA et al.,
2009; OTTO et al., 2017).
Figura 13: Estrutura química dos quatro diastereoisômeros do alfa-bisabolol. O α -(-) -

bisabolol é a forma mais comum.
Fonte: Adaptado de KAMATOU; VILJOEN, 2010.
O α-bisabolol apresenta um peso molar de 222,37 g/mol, densidade de cerca de

0,93 g/mL e ponto de ebulição de 314,5 ° C a 1 atm. Este composto existe sob a forma
de quatro diastereoisómeros (figura 13). A forma mais comum é o alfa - (-) - bisabolol
ou levomenol, que é o principal responsável pela atividade biológica global do
composto, enquanto o isômero alfa - (+) - bisabolol é raro na natureza. O composto
sintético é geralmente uma mistura de alfa- (±) -bisabolol, contendo pelo menos 42,5%
de alfa - (-) - bisabolol (KAMATOU; VILJOEN, 2010; SCHILCHER et al., 2005;
CLARK et al., 2011).
Esse terpeno possui uma variedade de atividades biológicas, tais como:
despigmentação (KIM et al., 2008), anti-fúngica (VILA et al., 2010), atenuação
nociceptiva em ratos (LEITE et al., 2011), anti-tumoral (CAVALIERE et al., 2004;
CHEN et al., 2010; DA SILVA et al., 2010; PIOCHON et al., 2009), além de atividade
gastroprotetora (BEZERRA et al., 2009) e nefroprotetora (SAMPAIO et al., 2016). O α-
bisabolol foi utilizado como um dos componentes de perfumes e cosméticos, utilizado
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na produção de xampus, sabonetes e produtos de higiene e em outros produtos não-

cosméticos, tais como os detergentes (LEITE et al., 2011).
Um estudo demonstrou em modelo in vitro da barreira hematoencefálica, que o
α-bisabolol apresenta características físico-químicas compatíveis com a capacidade de
atravessá-la (PIOCHON et al., 2008). Em outro estudo, foi demonstrado que o α-
bisabolol possui um efeito gastroprotetor em modelo de úlcera induzida por etanol e
indometacina em ratos. Tal ação foi atribuída a uma atividade antioxidante (ROCHA et
al., 2010).
Ainda, algumas pesquisas vêm mostrando que o α-bisabolol atua na reação
inflamatória através da inibição da produção de NO e PGE2, que são mediadores pró-
inflamatórios nas celulas RAW264.7 Além disso, ele reduziu a expressão dos genes que
codificam iNOS e COX-2, inibindo a via de sinalização NF-κB e AP-1 (p38 e ERK).
(LEITE, 2011; SARSHAR et al., 2017; TAO et al., 2018). Estes achados sugerem que o
α-bisabolol pode ser usado tanto como um agente calmante, como no tratamento de
doenças inflamatórias.
Nossos resultados anteriores mostraram que o α-bisabolol possui efeito
neuroprotetor em modelo de isquemia cerebral focal (FERNANDES et al., 2018).
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2. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
O acidente ascular cerebral é considerado um dos maiores problemas de saúde

pública da atualidade, devido à alta incidência e prevalência, relevante morbidade e
elevados custos gerados. Compreender sua epidemiologia é fundamental para
desenvolver, implementar e avaliar políticas de prevenção e terapêutica eficazes.
Estima-se que até 2030, o AVC continuará sendo a segunda maior causa de
mortes no mundo, responsável por 12,2% dos óbitos previstos para o ano. Vinte e cinco
por cento (25%) dos pacientes com AVC morrem dentro de um mês após o início do
caso e, mesmo após a sobrevivência, relata-se que 60% dos pacientes sofrem de várias
deficiências, como paralisia, déficits cognitivos e distúrbios da fala, que os deixam
incapacitados de levar uma vida diária autónoma sem precisarem de ajuda.
Com o objetivo de diminuir esta morbidade neurológica, devemos procurar
entender os mecanismos envolvidos no dano e reparação neuronal, bem como, procurar
a terapia mais efetiva. O único fármaco que mostra eficácia significativa, porém só nos
casos de AVC trombótico, é o ativador tecidual de plasminogênio (tPA) e, somente, se
usado com eficiência, isto é, se administrado em curto período de tempo após o AVC.
Pelo exposto, fica evidente a importância de pesquisar novas drogas que tenham
ação de diminuir o dano isquêmico. Assim, este estudo procura esclarecer por quais
mecanismos o α-bisabolol previne o dano neuronal, os déficits de memória, como
também, avaliar a sua atividade após o episódio isquêmico, imitando uma janela
terapêutica que se aproxima do tempo médio de atendimento de um paciente com AVC.
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Estudos in vivo
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3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Estudar o efeito neuroprotor do α-bisabolol em camundongos submetidos a

oclusão permanente da artéria cerebral media sobre a lesão cerebral isquêmica, e seus
possíveis mecanismos de neuroproteção.
3.2. Objetivos Específicos
Em animais submetidos à oclusão permanente da artéria cerebral média

(pMCAO) e tratados com o α-bisabolol, avaliar:
!! A área de infarto isquêmico e os déficits sensórios-motores

!! Os déficits de memória trabalho e aversiva
!! Resposta inflamatória por meio da:
•! Imunomarcação para IL-1β e TNF-α.
•! Desidade proteica relativa do NF-κB.
•! Atividade da enzima mieloperoxidase.
!! O estresse oxidativo por meio da:
•! Densidade proteica relativa da SOD-2.
•! Dosagens de Nitrito e TBARS.
!! Apoptose:
•! Densidade proteica relativa das caspases-3 e 9 total e
clivada, citocromo C, PARP total e clivada.
!! Densidade proteica relativa da sinaptofisina, um marcador sináptico.
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4. METODOLOGIA
4.1. Desenho experimental
4.2 Animais
Foram utilizados camundongos Swiss, machos, jovens, pesando entre 25 e 35g,

provenientes do Biotério Central do Campus do Pici da Universidade Federal do Ceará
(UFC) e transferidos para o biotério do Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento de
Medicamentos (NPDM) do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Faculdade de
Medicina, UFC. Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas apropriadas, forradas
com raspas de madeira, com ciclo de claro/escuro de 12h/12h e alimentados com ração
padrão e água à vontade.
No que se refere aos cuidados com os animais este estudo seguiu os princípios
éticos da experimentação animal estabelecidos pelo Conselho Nacional de Controle de
Experimentação Animal (COUA). O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em
Pesquisa Animal (CEPA) da UFC sob o número de registro 109/2015.
4.3 Drogas
(-)-α-Bisabolol (SIGMA®, EUA); Cloridrato de xilazina 2% (Kensol®

Laboratórios König S.A, Argentina); Cloridrato de ketamina 5% (Vetanarcol®,
Laboratórios König S.A, Argentina). Todos os reagentes utilizados eram de grau
analítico.
4.4. Protocolo experimental
Foram utilizados cerca de 130 animais divididos entre os grupos falso-operado,

tratados com veículo ou (-)-α-Bisabolol (α-Bis) na dose de 200 mg/kg, isquemiados
tratados com veículo e isquemiados tratados com α-Bis nas doses de 50, 100 e 200
mg/kg, por via oral.
Para a realização dos procedimentos experimentais (comportamentais, western
blotting bioquímica e imunohistoquimica) os animais foram divididos em subgrupos:
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•! Subgrupo 1: 24 horas após a cirurgia foi realizada a avaliação neurológica e a

análise da área do infarto isquêmico pelo método do TTC Cloreto de
2,3,5Trifeniltetrazol (TTC) (n=6/grupo).
•! Subgrupo 2: 72 horas após a cirurgia foram realizados os testes de campo
aberto, labirinto em Y e esquiva passiva (memória recente) e 96 horas após o
teste da esquiva passiva (memória tardia) (n=8/grupo). Ao final do protocolo
desse protocolo os animais os animais foram perfundidos para a realização da
imunohistoquimica.
•! Subgrupo 3: O teste que avalia a alteração da coordenação motora (teste do
rotarod) foi iniciado 24 horas após a cirurgia. Foram realizados dois dias de
treino (24 e 48 horas após a cirurgia) e após 72 horas foi realizado o teste
(n=8/grupo). Ao final do protocolo 3 os animais os animais foram eutanasiados e
as áreas cerebrais (córtex, estriado e hipocampo) retiradas para a realização do
western blotting (n=4/grupo).
•! Subgrupo 4: 24 horas após a indução da isquemia, os animais foram
eutanasiados e seus cérebros foram dissecados (córtex temporal e corpo estriado
e hipocampo), seguido de dosagem bioquímica nessas estruturas cerebrais para
avaliar a atividade enzimática de MPO (n=6/grupo).
•! Subgrupo 5: 24 horas após a indução da isquemia, os animais foram
eutanaziados e seus cérebros foram dissecados (córtex temporal, corpo estriado e
hipocampo), seguido de dosagem bioquímica de TBARS, nitrito (n=6/grupo)
(Figura 14).
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Quanto ao esquema de tratamento os animais foram divididos em 6 grupos, sendo eles

descritos na tabela 3. Em todos os grupos a administração foi realizada por via oral 3,
24, 48, 72, 96 horas após a cirurgia de pMCAO.
Tabela 3: Grupos de tratamento.

Grupo Tratamento
FO+ veiculo Animais falso-operados e tratados com veiculo (Tween 3% + salina).
FO+ α-Bis 200 Animais falso-operados e tratados com o α-Bis na dose de 200 mg/kg, v.o.
pMCAO+veiculo Animais submetidos à pMCAO tratados com veiculo.
pMCAO+ α-Bis 50 Animais submetidos à pMCAO tratados com o α-Bis 50mg/kg v.o.
pMCAO+α-Bis 100 Animais submetidos à pMCAO tratados com o α-Bis 100mg/kg v.o.
pMCAO+α-Bis 200 Animais submetidos à pMCAO tratados com o α-Bis 200mg/kg v.o.
Figura 14: Desenho experimental dos experimentos in vivo.
Legenda: tto: Tratamento; α-Bis: α-Bisabolol; TTC: Cloreto de 2,3,5-Trifeniltetrazol; AN: Avaliação
neurológica; MPO: Mieloperoxidase; TBARS: ácido tiobarbitúrico; CA: Campo aberto; YM: Y-maze;
MR: memória recente; MT memória tardia. WB: Western Blotting; IH: Imuno-histoquimica; T-RT:
Treino Rotarod; RT (T): Teste Rotarod.
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4.5. Isquemia cerebral focal por oclusão da artéria cerebral média (pMCAO)
(Tamura et al., 1981).
Os animais foram anestesiados com xilazina (10mg/kg) e ketamina (90mg/kg)

administrados por via intraperitoneal para o procedimento cirúrgico. A temperatura foi
mantida entre 36,5 e 37º C com o auxílio de uma lâmpada.
Inicialmente foi realizada uma incisão na linha entre o olho esquerdo e a orelha, o
músculo temporal foi rebatido e, posteriormente, realizada uma craniectomia com uma
broca de 1milimetro, seguido da exposição e cauterização da artéria cerebral média. Em
seguida a incisão foi suturada com fio de seda agulhado 4.0, e os animais foram
colocados em gaiolas para recuperação da cirurgia com livre acesso a água e comida. Os
animais falso-operados (FO) foram submetidos aos procedimentos descritos para
isquemia, exceto a cauterização da artéria cerebral média (Figura 15).
Figura 15: Diagrama estrutural da microcirurgia da MCAO. A imagem da foto da caixa

quadrada direita foi capturada durante o procedimento.
Fonte: Lee el al., 2014
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4.6 Avaliação Neurológica.
A Avaliação Neurológica (sensório-motor) foi realizada 24 horas após a

isquemia. Os achados neurológicos foram pontuados utilizando uma escala previamente
descrita por Garcia et al., (1995), (Tabela 4).
Seis parâmetros foram avaliados, sendo eles: 1. Atividade espontânea, que
analisa a habilidade do animal de se aproximar das quatro paredes de uma caixa de
polipropileno (30 cm de diâmetro) explorando o ambiente; 2. Simetria do movimento
das quatro patas, que avalia se o animal ao ser segurado pela cauda e suspenso no ar
mostra simetria nos membros; 3. Estiramento das patas dianteiras, no qual o animal foi
levado a caminhar sobre as patas dianteiras na borda de uma mesa; 4. Escalada, que
analisa a capacidade do animal agarrar firmemente uma grade de ferro ou de fazer
movimentos circulares quando o animal é puxado pela cauda enquanto escala uma grade
de ferro; 5. Propriocepção corpórea, na qual o animal é tocado com uma pinça em
ambos os lados do corpo e sua reação é observada, esse parâmetro analisa a resposta
sensorial; 6. Resposta ao toque da vibrissa, no qual com uma pinça é feito um toque nas
vibrissas em ambos os lados do animal, esse parâmetro analisa a resposta sensorial.
O total de escores dado a cada animal ao fim da avaliação (escore neurológico)
varia de 3 a 18 pontos, representando o somatório dos escores obtido pelo animal em
cada parâmetro analisado.
Tabela 4: Escala utilizada para a avaliação neurológica.

Escores
Testes 0 1 2 3
Atividade Animal sem Animal não se Animal se Animal se
Espontânea movimento ergue e raramente movimenta, movimenta e se
se movimenta mas não se aproxima de
aproxima de três lados da
três lados da caixa
caixa
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Simetria do Contralateral: Contralateral: Contralateral: Ambos os

movimento sem raros movimentos movimentos lados: movem
das quatro movimento lentos simetricamente
patas
Estiramento Contralateral: Contralateral: Contralateral: Ambos os
das patas sem raros movimentos movimentos lados: movem
dianteiras movimento lentos Simetricamente
Escalada/ … Animal falhou Contralateral Animal escalou
Prensão emescalar e com normalmente e
exibiumovimentos dificuldade de agarra
circulares subir agarrar a
grade
Propiocepção …. Contralateral: sem Contralateral Resposta
Corpórea resposta < Ipsilateral Simétrica
Resposta ao …. Contralateral: sem Contralateral Resposta
toque da resposta < Ipsilateral Simétrica
Vibrissa
Fonte: Adaptado de Garcia et al., 1995.
4.7 Quantificação do dano isquêmico cerebral através da coloração pelo Cloreto de

2,3,5-Trifeniltetrazol (TTC).
A coloração com o cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazol (TTC) foi descrita

primeiramente por Jestaedt e Sandritter (1959) para quantificação da área de infarto do
miocárdio. E neste trabalho foi utilizada para identificar e quantificar as regiões de
infarto decorrentes da isquemia cerebral focal. O TTC é um sal derivado do MTT
(brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-yl] -2,5-difeniltetrazol) que ao ser reduzido pelas
mitocôndrias viáveis (recebe um próton da succinato desidrogenase) adquire coloração
avermelhada, ficando as células que não são mais viáveis (com enzimas inativas) como
uma coloração pálida (correspondendo a área de infarto) (GOLDLUST et al., 1996).
Vinte e quatro horas após a isquemia os animais foram eutanasiados por
decapitação e seus cérebros foram removidos e conservados em salina gelada até o
momento dos cortes, os cérebros foram fatiados na espessura de 2 mm e imersos em
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73!
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solução de 2% de TTC à 37°C por 30 minutos. Em seguida, as fatias tiveram suas

imagens digitalizadas em alta resolução, sendo analisadas as áreas de infarto e as áreas
totais para os cálculos das respectivas percentagens. Tal metragem foi realizada
utilizando-se o software Osíris TM (University of Geneva, Switzerland).
4.8. Avaliaçao comportamental
4.8.1. Avaliação da atividade locomotora (Teste de campo aberto).
O teste do campo aberto foi originalmente descrito por Hall (1934) para analisar
o estado emocional em ratos. O teste foi realizado com o intuito de aferir a capacidade
locomotora dos animais, baseado no modelo de Broadhurst (1957). O campo aberto
consiste de uma arena quadrada (30 x 30 x 15 cm) de acrílico preto com o piso dividido
em nove quadrantes iguais (Figura 16).
No teste o animal foi colocado na arena e deixado para explorar o ambiente por
5 minutos, durante este período foi registrado o número de quadrantes atravessados pelo
animal (número de cruzamentos). Também foi avaliado o número de vezes que o animal
se levantou para explorar o ambiente, mantendo-se suspenso apenas pelas patas
traseiras, caracterizando o comportamento exploratório do tipo rearing. A arena foi
limpa com álcool a 20% após cada teste, para evitar interferência do cheiro de urina e
fezes no teste.
Figura 16: Arena do Campo Aberto.
Fonte: Laboratório de Neurociencias e Comportamento-LNC
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4.8.2 Avaliação da coordenação motora - Teste de rotarod.
A coordenação motora e as alterações no equilíbrio dos animais foram avaliadas

utilizando o equipamento rotarod (Figura 17). O protocolo utilizado foi descrito por
Dunham e Miya (1957).
Este teste baseia-se na habilidade do roedor de caminhar e se manter em
equilíbrio em uma haste giratória. Foram realizados quatros treinos de um minuto por
dia (dois dias de treino) para cada animal. A haste foi iniciada a 4 rpm e acelerada
linearmente a 30 rpm. Vinte e quatro horas após o ultimo treinamento, foi realizado o
teste a uma velocidade constante de 20 rpm. Cada teste consistiu em uma única tentativa
com duração de 60 segundos. Foi registrado o tempo que o animal levou para cair da
haste giratória (tempo de latência).
Figura17. Equipamento Rotarod
Fonte: Insight LTDA.
4.9 Avaliação da memória
4.9.1 Avaliação da memória de trabalho - Teste do labirinto em Y.
A memória operacional ou de trabalho foi avaliada através do teste do labirinto

em Y. Nesse teste o animal é colocado em um labirinto em forma de Y com os três
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braços iguais (SARTER et al., 1988). Os animais apresentam forte tendência de alternar
a entrada nos diferentes ambientes. O labirinto em Y é composto por 3 braços de
madeira com 16 cm de altura, 5 cm de largura e 40 cm de comprimento (Figura 18).
Para a avaliação da memória os braços foram numerados. O animal foi colocado
no aparelho e durante 8 minutos as sequências dos braços os quais os animais entrarem
foram anotadas. Foi considerado acerto cada vez que o animal entrou em 3 diferentes
braços sem repetição.
Figura 18. Labirinto em Y
Fonte: Laboratório de Neurociências e Comportamento-LNC
O resultado foi expresso em porcentagem e obtido através da seguinte fórmula

matemática:
4.9.2 Avaliação da memória aversiva – Teste da Esquiva Passiva.
O teste de esquiva passiva envolve a tendência natural do animal de explorar

além da plataforma e o aprendizado de evitar o choque, um componente aversivo que
constitui uma resposta condicionada.
O aparelho consiste de uma caixa de acrílico (48 x 22 x 22 cm), com o piso
constituído por uma plataforma e uma grade eletrificada (Figura 19). O animal foi
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76!
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colocado na plataforma e deixado para ambientação no aparelho durante um 1 minuto, e

depois retirado. Após 30 segundos, o animal foi colocado novamente na plataforma. O
animal ao descer da plataforma recebeu um choque de 0,5 mA, durante 1 segundo, com
o tempo de latência para entrar sendo registrado, até um máximo de 5 minutos (treino).
Retirou-se o animal e após 15 minutos este foi colocado novamente na plataforma e
registrou-se a latência de descida (avaliação da memória recente). A retenção do
aprendizado (avaliação da memória tardia) foi testada após 24 h, quando o animal foi
colocado na plataforma e o tempo de latência para a descida da plataforma foi
registrada, nessa etapa o animal não recebeu o choque (Gold, 1986).
Figura 19. Aparelho de Esquiva Passiva. (Insight LTDA).
Fonte: Insight LTDA.
4.10. Avaliação do Estresse Oxidativo
4.10.1 Determinação da peroxidação lipídica.
Vinte e quatro horas após a cirurgia foi avaliada a peroxidação lipídica através
da dosagem das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (DRAPER;
HADELY,1990), um indicador de peroxidação lipídica. No dia do ensaio, 60 µL do
homogenato (10% em tampão fosfato) de córtex, hipocampo e estriado foi colocado em
eppendorfs e centrifugado a 1200 rotações por minuto (rpm) 4oC durante 30 minutos.
Após a centrifugação, 100 µL de ácido perclórico a 35% foi adicionado para
interromper a peroxidação e, centrifugado novamente a 5000 rpm 4°C por 10 minutos, o
sobrenadante foi retirado e a este foi adicionado 50µl de ácido tiobarbitúrico 1,2%.
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Depois, levado ao banho de água por 30 minutos a uma temperatura inconstante de 95-
100°C. A solução, foi retirada e colocada para esfriar a temperatura ambiente. Após
esfriar, 150 µL da solução foi colocada nos poços da placa de ELISA e foi feita a leitura
em 535 nm. A curva padrão foi adquirida mediante leitura de diversas concentrações de
malonaldialdeído (MDA) padrão e os resultados foram expressos em concentração
(µM).
4.10.2 Determinação da concentração de nitrito/nitrato.
Este teste também foi realizado 24 horas após a cirurgia. O reativo de Griess (N-
1-naftiletilenodiamina a 0,1% em água bidestilada, sulfanilamida 1% em ácido fosfórico
5%) revela a presença de nitrito/nitrato (NO2/NO3) em uma amostra (urina, plasma,
homogenato tecidual) através da reação de diazotização que forma um cromóforo de
aparência róseo, com um pico de absorbância em 540 nm (GREEN et al., 1982).
Para realização do ensaio, os homogenatos (10% em tampão fosfato) do córtex,
hipocampo e estriado foram centrifugados a 12000 rpm por 15 min a 4°C e 100 µL de
cada sobrenadante foi acrescentado a 100 µL do reagente de Griess. Para o branco, foi
usado 100 µL do tampão fosfato e 100 µL reagente de Griess. Após 10 minutos, foi feita
a leitura das absorbâncias em 540nm. A curva padrão foi adquirida mediante leitura de
diversas concentrações de nitrito padrão e os resultados foram expressos em
concentração (µM). As leituras da absorbância dos padrões (y) foram plotadas contra a
concentração de cada padrão (x), então foi feita a determinação da equação da reta, que
foi usada para a determinação da concentração de nitrito em cada amostra.
4.11. Ensaio para Mieloperoxidase (MPO).
A Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima presente nos grânulos dos neutrófilos,

sendo utilizada como marcador para o conteúdo dessas células nos tecidos.
A extensão da acumulação de neutrófilos no hipocampo, estriado e córtex
temporal foi mensurada no hipocampo, estriado e córtex temporal, através da técnica de
BRADLEY e colaboradores (1982), com algumas modificações, 24 horas após a
cirurgia. As amostras foram homogeneizadas em tampão HTAB (5g de HTAB em 1L
de tampão de fosfato de potássio, pH 6), sendo 1mL de tampão para cada 50mg de
tecido. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 14000 rpm a 4˚C por 2 minutos.
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78!
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Adicionou-se 30µL do sobrenadante da amostra e 200µL da solução de o-dianisidina

526 mM contendo 1mL de peróxido de hidrogênio a 30%.
Neste ensaio, o H2O2 é clivado por meio da MPO liberada das amostras de
tecido por homogeneização com tampão HTAB (detergente). O radical oxigênio (O_)
resultante se combina com diidrocloreto de O-dianisidina, o doador de hidrogênio
(AH2), que é convertido a um composto colorido (A). O aparecimento deste composto,
ao longo do tempo, é medido por espectrofotômetro para determinar o conteúdo de
MPO do ensaio. A absorbância foi medida nos tempos 0:1 e 3 minutos no comprimento
de onda 460nm. Os resultados foram expressos como unidades de MPO por mg de
tecido. E uma unidade de MPO equivale à quantidade que degrada 1µmol/min de
peróxido de hidrogênio (BRADLEY et al., 1982)
5.12. Avaliação da imunoreatividade para (TNF-α e IL-1β).
Cinco dias após pMCAO, os animais (4/grupo), foram anestesiados com xilazina
(10mg/kg) e ketamina (90mg/kg) por via intraperitoneal e perfundidos
transcardialmente com salina, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS. Os cérebros
foram removidos e fixados com paraformaldeído a 4% durante 24 h e armazenados em
sacarose a 30% (4ºC), até a realização dos cortes. Os cortes coronais do córtex e
estriado foram feitos em um criostato (Leica CM3050 S, Heidelberg, Alemanha) a -21
ºC, e armazenados free floating em PBS (4ºC) numa série de “um em seis” de 50 mm
(300 mm de intervalo).
Para a realização da técnica de imunohistoquímica, as fatias cerebrais foram
lavadas três vezes durante 10 min (cada) com PBS e incubadas (PBS + 10% de metanol
e 1,05% de peróxido de hidrogênio), durante 40 minutos à temperatura ambiente, para
bloquear a atividades da peroxidase endógena. Depois de lavados 3 vezes durante 10
min (cada) com PBS, as proteínas endógenas foram bloqueadas com 10% de soro
normal de cabra em PBS suplementado com Triton X-100 (solução de bloqueio)
durante duas horas à temperatura ambiente, as secções foram incubadas com os
anticorpos primários (anti-TNF-α: 1:200, Sigma; e Anti – IL-1β: 1:200, Santa Cruz)
diluída em solução a 4°C de bloqueio durante 48 h. As secções foram então lavadas três
vezes durante 10 min (cada), em PBS e subsequentemente incubadas com conjugado de
avidina-biotina-peroxidase de rábano (coloração Sistema ABC, Santa Cruz
Biotechnology), durante 30 min. Após a lavagem, as lâminas foram incubadas com
!
79!
!
cabra anti-coelho biotinilado (anticorpo secundário), diluído 1:500 em solução de

bloqueio. Como revelador foi utilizado o DAB. As fatias foram montadas em entellan
(Merck, Alemanha), e visualizadas sob um microscópio (Nikon Elipse E200) com
aumento de 40x. Foram selecionadas três fatias de cada animal, aleatoriamente, ao
longo da área da lesão e a quantificação das células foi realizada utilizando o software
ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EUA). As células foram consideradas positivas para TNF-
α e IL-1β quando se apresentaram arredondas e com uma coloração acastanhada e foram
contadas em todo o campo da imagem. Os resultados foram expressos pelo número de
células positivas.
4.13. Quantificação da densidade da proteina citocromo C, Caspase-3 e 9 (total e

clivada), PARP total e clivada, sinaptofisina, SOD-2, NF-kB (no núcleo e no
citoplasma) pela técnica de Western-blot.
As amostras de tecido do corpo estriado, córtex e hipocampo foram

homogeneizadas separadamente em potter com 5 mL de tampão de sacarose 32 mM,
EDTA 1 mM, Hepes 10 mM e BSA 1 mg/mL. Em seguida, foram homogeneizadas e
centrifugadas a 3.000g durante 10 min a 4ºC, para remoção de debris. O sobrenadante
foi submetido a uma nova centrifugação a 25.000g durante 60 min a 4ºC. Após a
centrifugação o sobrenadante foi desprezado e o pellet ressuspendido em 100µL de uma
solução de SDS a 5% com inibidor de protease (5µL/mL). A quantidade de proteína
total presente na amostra foi determinada usando o método de Lowry, e a albumina
sérica bovina utilizada como padrão.
As amostras foram desnaturadas por adição de um tampão contendo – Tris 125
mM, glicerol 20%, DTT 100 mM, SDS 4%, e de Azul de Bromofenol 0,02% - seguida
de aquecimento a 90ºC durante 5 min. Quantidades iguais de proteínas totais (25 µg por
linha) foram aplicadas em cada poço de gel de poliacrilamida-SDS 12,5 %, utilizando-
se o sistema Mini Protean®3Cell (Bio-Rad, EUA). Adiciona-se tampão de corrida (Tris
25 mM; Glicina 192 mM e SDS 0,1%) e em seguida iniciou-se a corrida em condições
constantes de voltagem (120 V) e variável de miliamperagem (80 mA) por 1 hora e 45
min. Após a separação protéica se deu o início da transferência (por 3 horas,100 V, 395
mA) para a membrana de difloureto de polivinildieno (PVDF-Bio-Rad), previamente
ativada por imersão em metanol durante 5 s, seguida de uma imersão de 5 min em água,
!
80!
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e finalmente em tampão de eletrotransferência (Tris 25mM; Glicina 192mM e Metanol

20%) durante 5 min.
Após a transferência as membranas foram coradas em solução de ponceau S,
para verificação da qualidade do processo. Logo em seguida as membranas foram
lavadas (descoradas) com água destilada e bloqueadas com leite desnatado a 5% em
TBS-T por uma hora, sob agitação, à temperatura ambiente. Em seguida as membranas
foram incubadas, overnight a 4ºC sob agitação constante em TBS-T contendo os
seguintes anticorpos primário: anti-caspase 3 total (1:1000; Cell Signalling, USA), anti-
caspase 3 clivada (1:1000; Cell Signalling, USA), anti-caspase 9 total (1:1000; Cell
Signalling, USA), anti-caspase 9 clivada (1:1000; Cell Signalling, USA), anti-caspase 7
total (1:1000; Cell Signalling, USA), anti-citocromo C (1:1000; SantaCruz
Biotechnoloy, USA), anti-NFϏ B subunidade p65 (1:1000; SantaCruz Biotechnoloy,
USA), anti-superoxido dismutase (SOD-2) (1:1000; Abcam, USA), anti-sinaptofisina
(1:1000; SantaCruz Biotechnoloy, USA) e anti-β-actina IgG (1:4000; Sigma, USA)
diluídos em 1% de BSA em TBS-T.
A seguir, as membranas foram lavadas com TBS-T (3 lavagens) e incubadas
com anticorpos secundários marcados com peroxidase: anti-IgG de camundongo
(1:2000; Millipore) e anti- IgG de coelho (1:3300; Bio-Rad) por 1 hora.
Após a incubação por 1 h, a membrana foi novamente lavada com TBS-T (3
lavagens) e a reação de desenvolvimento da cor se processará com a mistura de 5mg do
cromógeno DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride -Sigma) em 15 mL de
TBS-T e 50 µL de peróxido de hidrogênio por 5 min. Para interrupção da reação de
degradação enzimática, a membrana foi lavada com água deionizada e posteriormente
dessecada em temperatura ambiente e, ao final, foi guardada ao abrigo da luz.
Para a análise densitométrica, as bandas foram quantificadas por análise
computadorizada de imagem (com auxílio do software ImageJ versão 1.32j de domínio
público http://rsb.info.nih.gov.ij/) onde a densidade ótica de cada banda foi detectada.
Inicialmente o sistema de análise calcula a média dos valores de densidade ótica para a
região delimitada pelo operador. Esta região deve ter uma área suficiente para abrigar
todas as bandas (uma de cada vez) visíveis no filme, não devendo ser alterada, quando
se passa a analisar outra banda. O valor final de intensidade relativa será expresso em
porcentagem em relação ao grupo falso-operado de todos os experimentos realizados.
!
81!
!
4.13.1 Extração de proteínas

As áreas cerebrais (córtex, hipocampo e corpo estriado) foram maceradas com
auxílio de cadinho e pistilo em nitrogênio líquido. O produto desse processo foi inserido
em microtubo contendo 100 µl de tampão RIPA (25 mM Tris-HCl pH 7,6; 150 mM
NaCl; 5 mM EDTA; 1% NP-40; 1% triton-X-100; 1% deoxicolato de sódio; 0,1% SDS)
e inibidor de protease (SigmaAldrich, EUA, 1µL de inibidor de protease: 100µL de
RIPA). Em seguida, as amostras foram vortexadas por 30 segundos, a cada 10 min por
30 min, e centrifugadas (17 min, 4ºC, 13000 rpm). O pellet foi desprezado e o
sobrenadante (porção que contém as proteínas) foi transferido para um novo microtubo.
Parte das amostras foram processadas para obtenção de extratos nucleares e
citoplasmáticos. Para isso, foi realizado o método de fracionamento conforme protocolo
Genetex®, USA. Brevemente, as amostras foram homogeinizada em tampão de Lise
(Triton 100X 1%) 3000 rpm por 5 min a 4 ºC. O sobrenadante foi coletado (extratos
membranares e citoplasmáticos). O precipitado foi lavado 3 vezes e resuspendido em
Tampão de Lise (150 µL), sendo centrifugadas a 13000 rpm por 15 min a 4 ºC. O
sobrenadante referente ao extrato de proteínas nucleares foi obtido. Posteriormente, a
concentração de proteína nas amostras foi determinada pelo método de Lowry (Lowry
et al., 1951) de acordo com as orientações do fabricante (Bio-Rad Laboratories, Inc.,
USA).
Antes da realização dos testes estatísticos foi realizado o teste de normalidade

para todos os dados. Os escores neurológicos são expressos como mediana (intervalo
interquartílico) e as diferenças foram analisadas pelos testes de Kruskal-Wallis e teste
seguido do teste de Dunn (não paramétricos). Os outros dados comportamentais foram
analisados com o teste de Kruskal-Wallis e teste de Dunn. Testes bioquímicos, imuno-
histoquímicos e westernblotting foram realizados com a maior dose efetiva de (-) -α-
bisabolol (200 mg/kg), e as diferenças foram analisadas com Kruskal-Wallis e teste de
Dunn. Os dados foram expressos em média ± EPM, e o critério de significância
utilizado será de p < 0,05. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software
GraphPad Prism 6.01 (GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA).
!
82!
!
5. RESULTADOS
5.1 Avaliação neurológica de camundongos submetidos a isquemia focal

permanente por oclusão da artéria cerebral média (pMCAO), e tratados com o α-
bisabolol (50, 100, 200 mg/kg).
Os animais submetidos a oclusão da artéria cerebral média (pMCAO),

apresentaram déficits neurológicos significativos, 24h após a isquemia (Escores-FO: 17
(16-18); pMCAO: 12 (8-15)), apresentando principalmente diminuição da capacidade
de responder a estímulos e movimentar o lado contralateral á isquemia. Os animais
tratados com o α-bisabolol na dose de 200 mg/kg, apresentaram diminuição
significativa dos deficits neurológicos causados pela pMCAO (Escores-FO+α-Bis: 18
(17-18); pMCAO+α-Bis 50: 12 (6-17); pMCAO+α-Bis 100: 15 (13-17); pMCAO+α-Bis
200: 15 (12-18) (Figura 20).
Figura 20: O α-bisabolol melhora os déficits sensório-motores em camundongos

submetidos à pMCAO.
*
20 *** *
*
15
Total de Escores
10
0
200 50 100 200
FO+α-Bis pMCAO+α-Bis
Os animais foram isquemiados por pMCAO e tratados 3 horas depois com o α-bisabolol (50, 100, 200
mg/kg). Após 24 horas da pMCAO foi realizada a avaliação neurológica. Os valores representam a
mediana (MIN-MAX). p<0,05 (n= 8). Teste de Kruskal-Wallis seguido, do teste de Dunn. * (p<0,05);
**(p<0,01).
!
83!
!
5.2 Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre o dano isquêmico de
camundongos submetidos à pMCAO.
O efeito do α-bisabolol sobre a extensão da área de infarto isquêmico foi

analisado 24 horas após a cirurgia de pMCAO. Os animais isquemiados apresentaram
uma área isquémica significativa (FO: 0,83 ± 0,17%; pMCAO: 24,50± 4,26%). Os
animais tratados com α-bisabolol na dose de 100 e 200 mg/kg, apresentaram menor
porcentagem de área isquêmica em relação aos animais isquemiados (FO + α-Bis 200:
0,83±0,17%; pMCAO + α-Bis 50: 17,17±5,09%; pMCAO + α-Bis 100: 9,66± 1,35;
pMCAO + α-Bis 200: 5,00±0,25) (Figuras 21e 22).
Figura 21: Fotografia das fatias cerebrais dos animais submetidos a pMCAO e tratados
com o α-Bis (coloração com TTC 1%).
Observar a area isquemica (setas).
!
84!
!
Figura 22: O α-bisabolol diminui a área de infarto isquêmico em camundongos

***
30 **** **
% área isquêmia
20
10
0
200 50 100 200
Os animais foram isquemiados por pMCAO e foram tratados 3 horas depois com α-bisabolol (50, 100,
200 mg/kg). A área do infarto isquêmico foi avaliada 24 horas depois da pMCAO. Os valores
representam a média ± EPM, n=8. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Dunn. **(p<0,01);
***(p<0,001); ****(p<0,0001).
5.3. Avaliação comportamental
5.3.1 Efeito do α-bisabolol 50, 100, 200mg/kg sobre a atividade locomotora de

O teste de campo aberto foi realizado 72 horas após a indução de pMCAO. O

grupo pMCAO apresentaram menor número de crossings e menor número de “rearings”
em relação ao grupo falso operado demontrando assim déficit na atividade locomotora
dos animais isquemiados (Crossings: FO: 106,1±3,81; pMCAO: 67,00±5,08; Rearings:
FO: 40,00±3,78; pMCAO: 9,00±1,26). Os animais tratados com α-bisabolol na dose de
100 e 200mg/kg/dia apresentaram uma diminuição significativa do déficit de atividade
locomotora (Crossings: FO + α-Bis 200: 103,8±2,32; pMCAO + α-Bis 50: 74,38±5,34;
pMCAO + α-Bis 100: 95,13±5,73; pMCAO + α-Bis 200: 97,63±5,83; Rearings: FO +
!
85!
!
α-Bis 200: 37,63± 3,05; pMCAO + α-Bis 50: 9,00± 1,26; pMCAO + α-Bis 100: 20,38±
2,22; pMCAO + α-Bis 200: 24,38±1,42; (Figura 23: A e B).
5.3.2. Efeito do α-bisabolol 50, 100, 200mg/kg sobre a coordenação motora de

Os resultados obtidos no teste de rotarod, realizados 72 horas após a pMCAO

foram ilustrados na figura 24. Como pode ser observado, os animais submetidos a
pMCAO apresentaram deficit de coordenação motora no teste de rotarod, em relação
aos animais falsos operados (latência para cair-FO: 59,38±0,63; pMCAO: 32,25±7,23),
e o tratamento com o α-bisabolol, não conseguiu reduzir esses deficits (latência para
cair- FO + α-Bis 200: 54,38±5,63; pMCAO + α-Bis 50: 39,75±7,46; pMCAO + α-Bis
100: 36,00±9,22; pMCAO + α-Bis 200: 40,00±6,23) (Figura 24).
Figura 23: O α-bisabolol protege os animais submetidos a pMCAO contra a diminuição

da atividade locomotora.
A Crossing
B Rearings
150 60
*** ** ****
***
*** **
Nº de cruzamentos
N0 de Rearings
100 40 *
*
50 20
0 0
200 50 100 200
200 50 100 200
FO+α-Bis pMCAO+α-Bis FO +α-Bis pMCAO+α-Bis
Os animais foram isquemiados e tratados com o α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg), e após 72 horas da
pMCAO foi realizado o teste de campo aberto, n=8. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Dunn.
Os valores representam a média ± EPM. *(p<0,05); **(p<0,01); ***(p<0,001); ****(p<0,0001).
!
86!
!
Figura 24: O α-bisabolol não melhora a coordenação motora dos camundongos

80
**
*
Latência(s) 60
40
20
0
200 50 100 200
FO +α-Bis pMCAO+α-Bis
Os animais foram isquemiados por pMCAO e tratados com o α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg), 3, 24, 48
horas depois da isquemia, e após 72 horas foi realizado o teste do rotarod que avalia a coordenação
motora, n=8, p<0,05. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de Dunn. Os valores representam a média
± EPM. *(p<0,05); **(p<0,01).
5.4. Avaliação de memória
5.4.1. Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memória de trabalho de
Os animais submetidos à pMCAO apresentaram déficit na memória de trabalho

e esse efeito foi prevenido significativamente pelo α-bisabolol na dose de 200mg/kg
(Número de alternações espontanêas: FO: 76,88±2,33 %; FO + α-Bis 200: 76,13±
4,07%; pMCAO: 58,75±4,14%; pMCAO + α-Bis 50: 60,63±4,49 %; pMCAO + α-Bis
100:70,63±2,70%; pMCAO + α-Bis 200: 78,63±4,66% (Figura 25).
!
87!
!
Figura 25: O α-bisabolol protege os camundongos contra os déficits de memória de

trabalho induzidos pela pMCAO.
100 **** *
Alternâncias Espontâneas %
** **
80 **
60
40
20
0
200 50 100 200
Os animais foram isquemiados por pMCAO e foram tratados com o α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg), 3,
24 e 48 horas depois da isquemia, e após 72 horas da pMCAO foi realizado o teste do labirinto em Y, que
avalia a a memória de trabalho, n=8. Os valores representam a média ± EPM. Teste de Kruskal-Wallis,
seguido do teste de Dunn. *(p<0,05); **(p<0,01); ***(p<0,001).
5.4.2. Efeito do α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg) sobre a memória aversiva de
camundongos submetidos a pMCAO
Na avaliação da memoria aversiva através do teste da esquiva passiva, os

animais isquemiados, apresentaram deficits na memoria aversiva, eles não aprenderam a
evitar o choque, não descendo da plataforma, quando avaliados 15 minutos ou 24 horas
após o choque (latência para descer-Mem. Recente: FO: 193,9±33,03s; pMCAO:
31,63±9,41s; Mem. Tardia: FO: 155,9±41,92s; pMCAO: 8,125±1,63s). O α-bisabolol
preveniu os deficits na memoria recente, mas não da memoria tardia (latência para
descer-Mem. Recente: FO + α-Bis 200: 193,8±38,75s; pMCAO + α-Bis 50:
60,63±19,67s; pMCAO + α-Bis 100: 62,75±19,91s; α-Bis +200 pMCAO:
110,5±42,22s), Mem. Tardia: FO + α-Bis 200: 191,5±42,65s; pMCAO + α-Bis 50:
46,00±20,81s; pMCAO + α-Bis100: 52,00±7,83s; pMCAO + α-Bis200: 41,38±8,66s)
(Figura 26).
!
88!
!
Figura 26: O α-bisabolol protege os camundongos contra os déficits de memória

recentes induzidos pela pMCAO.
*
**
***
250
Treino
200 MR
Latência(s)
MT
150
100
50
0
200 50 100 200
FO +α-Bis pMCAO+α-Bis
Os animais foram isquemiados por pMCAO, e foram tratados com o α-bisabolol (50, 100, 200 mg/kg), 3,
24, 48 e 72 horas. 72 horas depois da pMCAO a memória recente foi avaliada, e 96 horas depois a
memoria tardia. Os valores representam a média ± EPM. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste de
Dunn. *(p<0,05); **(p<0,01); ***(p<0,001).
5.5 Avaliaçao da apoptose
5.5.1 Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade proteica relativa de

Citocromo C no córtex, estriado e hipocampo de camundongos submetidos a
pMCAO.
Os animais isquemiados apresentaram um aumento da densidade relativa de

Citocromo C no cortéx avaliada 96 horas após a indução da isquemia cerebral, em
relação aos animais tratados somente com o veiculo: FO: 2,09±0,53; FO + α-Bis 200:
3,30±1,02; pMCAO: 4,66±0,78; pMCAO + α-Bis 200: 3,56±0,8882). Não foram
observadas diferenças significativas no estriado (FO: 1,55±0,32; FO + α-Bis 200:
2,19±0,55; pMCAO: 2,13±0,28; pMCAO + α-Bis 200: 1,65±0,33) e no hipocampo (FO:
10,63±3,40; FO + α-Bis 200: 10,30±2,62; pMCAO: 12,73±1,23; pMCAO + α-Bis 200:
9,55±1,89) (Figura 27).
!
89!
!
5.5.2. Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade proteica relativa da Pró-
Caspase 3 no córtex, estriado e hipocampo de camundongos submetidos a
pMCAO.
Os animais isquemiados apresentaram aumento significativo da densidade
relativa da Pró-Caspase 3 no córtex: FO: 1,40±0,24; pMCAO: 2,92±0,76 mas, o mesmo
não foi observado no estriado: FO: 1,574 ±0,088; pMCAO: 2,03±0,07 e no hipocampo
(FO: 0,50±0,052; pMCAO: 0,59±0,02). O tratamento com o α-bisabolol não conseguiu
reduzir o aumento da densidade relativa da Pró-Caspase 3 nesta área (FO+α-Bis 200:
2,40±,44; pMCAO+α-Bis 200: 2,50±0,53); hipocampo (FO + α-Bis 200: 0,44±0,11;
pMCAO + α-Bis 200: 0,70±0,11) mas, foi observado um aumento da densidade relativa
da Pró-Caspase 3 no estriado (FO + α-Bis 200: 3,07±0,30; pMCAO + α-Bis 200:
2,77±0,25) (Figura 28).
5.5.3. Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade relativa da Caspase 3

clivada no córtex, estriado e hipocampo de camundongos submetidos a pMCAO
Não foram observadas alterações significativas sobre a densidade relativa da
Caspase 3 clivada no córtex (FO: 1,43±0,17; FO + α-Bis 200: 2,06±0,26; pMCAO:
2,05±0,25; pMCAO + α-Bis 200: 2,16±0,43) no estriado (FO: 0,07±0,01; FO + α-Bis
200: 0,14±0,02; pMCAO: 0,16±0,045; pMCAO + α-Bis 200: 0,13±0,03), ou
hipocampo, (FO: 0,32±0,05; FO + α-Bis 200: 0,28±0,06; pMCAO: 0,64±0,22; pMCAO
+ α-Bis 200: 0,44±0,13) (Figura 29).
!
90#
#
Figura 27: O α-bisabolol não diminui a densidade relativa de Citocromo C no córtex de camundongos submetidos a pMCAO.
3
5 *
15
Citocromo C/α-Tubulina
4
2
Estriado
10
Hipocampo
3
Cortéx
2
1 5
1
0 0 0
200 200 200 200 200 200
FO+α-Bis pMCAO+α-Bis FO+α-Bis pMCAO+α-Bis FO+α-Bis pMCAO+α-Bis
Os animais foram isquemiados por pMCAO, foram tratados com a α-bisabolol 200 mg/kg 3, 24, 48 e 72 horas depois, e após 96 horas os animais foram eutanasiados, e suas áreas
foram dissecadas para a realização do Western Blot. Valores expressos em média ± EPM, n=4. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste Dunn *(p<0,05); a (FO); b (FO+α-Bis
200); c (pMCAO); d (pMCAO+ α-Bis 200).
#
91#
#
Figura 28: O α-bisabolol não diminui a densidade relativa da Pró-Caspase 3 no córtex de camundongos após a pMCAO.
4 * 1.0
4
*
Pró-caspase 3/α-Tubulina
* 0.8
3 3
Hipocampo
0.6
Estriado
cortéx
2 2
0.4
1 1 0.2
0 0.0
0 200 200
200 200 200 200
FO+α-Bis pMCAO+α-Bis FO+α-Bis pMCAO+α-Bis
Os animais foram isquemiados por pMCAO, foram tratados com a α-bisabolol 200 mg/kg 3, 24, 48 e 72 horas depois, e após 96 horas os animais foram eutanasiados, e suas
áreas foram dissecadas para a realização do Western Blot. Valores expressos em média ± EPM, n=4. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste Dunn. *(p<0,05); a (FO); b
(FO+α-Bis 200); c (pMCAO); d (pMCAO+ α-Bis 200).
#
92#
#
Figura 29: A pMCAO não modifica a densidade proteica relativa da Caspase 3 clivada no córtex, estriado e hipocampo de camundongos.
3 0.25
caspase 3 clivada/α-Tubulina
1.0
0.20 0.8
2
Hipocampo
Estriado
0.15 0.6
cortéx
0.10 0.4
1
0.05 0.2
0 0.00 0.0
200 200 200 200 200 200
FO+α-Bis pMCAO+α-Bis FO+α-Bis FO+α-Bis pMCAO+α-Bis
pMCAO+α-Bis
áreas foram dissecadas para a realização do Western Blot. Valores expressos em média ± EPM, n=4. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste Dunn. a (FO); b (FO+α-Bis
#
93#
#
5.5.4. Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a relação entre a densidade proteica
relativa da Caspase 3 clivada/ Pró-Caspase 3 no córtex, estriado e hipocampo de

Caspase 3 clivada/ Pró-Caspase 3 no córtex (FO: 1,43±0,17; FO + α-Bis 200: 2,06±0,26;
pMCAO: 2,05±0,25; pMCAO + α-Bis 200: 2,16±0,43). No estriado e no hipocampo os
animais isquemiados apresentaram aumento da densidade relativa da relação entre a
caspase 3 clivada e a Pró-caspase, e o tratamento com o α-bisabolol preveniu
significativamente esse aumento: estriado (FO: 0,07±0,01; FO + α-Bis 200: 0,14±0,02;
pMCAO: 0,16±0,045; pMCAO + α-Bis 200: 0,13±0,03); FO + α-Bis 200: 0,28±0,06;
pMCAO: 0,64±0,22; pMCAO + α-Bis 200: 0,44±0,13) (Figura 30).
5.5.5. Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade proteica relativa da Pró-
Caspase 9 no córtex, estriado e hipocampo de camundongos submetidos a
pMCAO.
Os animais isquemiados não apresentaram aumento significativo da densidade
relativa da Pró-Caspase 9, 96 horas após pMCAO no córtex (FO: 0,82±0,20: pMCAO:
1,10±0,22), o mesmo não foi observado no estriado (FO: 0,20±0,11; pMCAO:
0,15±0,09) e no hipocampo (FO: 1,32±0,11; pMCAO: 1,58±0,51). O tratamento com o
α-bisabolol aumentou a densidade relativa da Pró-Caspase 9 no córtex (FO + α-Bis 200:
1,89±0,43; pMCAO + α-Bis 200: 1,76±0,22; no hipocampo (FO + α-Bis 200:
1,79±0,11; pMCAO + α-Bis 200: 1,43±0,17); e no estriado (FO + α-Bis 200: 0,45±0,19;
pMCAO + α-Bis 200: 0,20±0,09) (Figura 31).
5.5.6. Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade relativa da Caspase 9

clivada no córtex, estriado e hipocampo de camundongos submetidos a pMCAO.

Caspase 9 clivada no córtex (FO: 0,58±0,15; FO + α-Bis 200: 0,86±0,23; pMCAO:
0,95±0,21; pMCAO + α-Bis 200: 0,70±20,17) e no estriado (FO: 0,22±0,08; FO + α-Bis
200: 0,362±0,09; pMCAO: 0,35±0,07; pMCAO + α-Bis 200: 0,23±0,08). No
hipocampo, os animais isquemiados apresentaram aumento da densidade relativa da
caspase 9 clivada (FO: 0,90±0,25; FO + α-Bis 200: 0,50±0,10; pMCAO: 1,103±0,33;
pMCAO + α-Bis 200: 0,62±0,08) (Figura 32).
#
94#
#
Figura 30: O α-bisabolol reduziu a relação entre a densidade proteica relativa da Caspase 3 clivada/ Pró-Caspase 3 no estriado e no hipocampo de
camundongos após a pMCAO, porém não no córtex.
*
Caspase 3 clivada/ Pró-caspase 3
Caspase 3 clivada / Pró-caspase 3

1.5

0.15 * 2.5 *
*
2.0
1.0
Hipocampo
0.10
1.5
Estriado
cortéx
1.0
0.5 0.05
0.5
0.00 0.0
0.0 200 200
200 200
200 200
áreas foram dissecadas para a realização do Western Blot. Valores expressos em média ± EPM, n=4. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste Dunn. *(p<0,05).
#
95#
#
Figura 31: O α-bisabolol aumenta a densidade relativa da Pró-Caspase 9 no córtex de camundongos 96 horas após a pMCAO, porém não no
estriado e no hipocampo.
2.5 *
0.6
*
2.5
2.0
2.0
1.5 0.4
Hipocampo
Estriado
cortex
1.5
1.0
1.0
0.2
0.5 0.5
0.0 0.0 0.0

200 200 200 200 200 200
#
96#
#
Figura 32: A pMCAO não modifica a densidade proteica relativa da Caspase 9 clivada em camundongos.
1.5 2.0
0.5
caspase 9 clivada /α-Tubulina

0.4
1.5
1.0
Hipocampo
Estriado
0.3
cortéx
1.0
0.2
0.5
0.1 0.5
0.0 0.0 0.0

200 200 200 200 200 200
200); c(pMCAO); (pMCAO+α-Bis200).
#
97#
#
5.5.7. Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a relação entre a densidade relativa da
Caspase 9 clivada/ Pró-Caspase 9 no córtex, estriado e hipocampo de camundongos
submetidos a pMCAO.
Nós observamos um aumento significativo sobre a densidade relativa da Caspase

9 clivada/ Pró-Caspase 9 no córtex: (FO: 0,55±0,12; pMCAO: 0,96±0,20); Estriado: (FO:
1,10±0,42; pMCAO: 2,47±0,51); E no hipocampo: (FO: 0,60±0,22; pMCAO:
0,80±0,22). O tratamento com o α-bisabolol, foi capaz de prevenir contra esses
aumentos, Córtex: (FO+α-Bis 200: 0,46±0,12; pMCAO + α-Bis 200: 0,31±0,05);
Estriado: (FO+α-Bis 200: 0,80±0,21; pMCAO + α-Bis 200: 0,83±0,29); Hipocampo:
(FO+α-Bis 200: 0,28±0,05; pMCAO + α-Bis 200: 0,44±0,06) (Figura 33).
5.5.8. Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade relativa da PARP total no
córtex, estriado e hipocampo de camundongos submetidos a pMCAO.

PARP total no córtex (FO: 0,13±0,07; FO+α-Bis 200: 0,31±0,12; pMCAO: 0,28±0,11;
pMCAO + α-Bis 200: 0,47±0,13), no estriado (FO: 0,52±0,16; FO+α-Bis 200:
0,54±0,21; pMCAO: 0,67±0,10; pMCAO + α-Bis 200: 0,74±0,42, ou hipocampo (FO:
0,18±0,03; FO+α-Bis 200: 0,13±0,06; pMCAO: 0,48±0,12; pMCAO + α-Bis 200:
0,40±0,15), dos animais submetidos a pMCAO (Figura 34).
5.5.9. Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a relação entre a densidade relativa da
PARP clivada no córtex, estriado e hipocampo de camundongos submetidos a
pMCAO.
Não foram observadas alterações significativas sobre a densidade proteica

relativa da PARP clivada no córtex (FO: 0,05±0,01; FO+α-Bis 200: 0,19±0,03;
pMCAO: 0,24±0,07; pMCAO + α-Bis 200: 0,12±0,02), estriado (FO: 0,40±0,14; FO+α-
Bis 200: 0,73±0,17; pMCAO: 1,11±0,30; pMCAO + α-Bis 200: 0,61±0,22), e no
hipocampo (FO: 0,05±0,01; FO + α-Bis 200: 0,10±0,04; pMCAO: 0,42±0,16; pMCAO
+ α-Bis 200: 0,34±0,11) (Figura 35).
#
98#
#
Figura 33: O α-bisabolol reduz a relação entre a densidade proteica relativa da Caspase 9 clivada/ Pró-Caspase 9 no córtex, estriado de
camundongos 96 horas após a pMCAO.
Caspase 9 clivada/ Pró-Caspase 9

Caspase 9 clivada/ Pró-Caspase 9

1.5 1.5
* * *
3 *
1.0
Hipocampo
1.0
Estriado
cortéx
0.5 0.5
1
0 0.0
0.0 200 200 200 200
200 200
#
99#
#
Figura 34: A pMCAO não modifica a densidade proteica relativa da PARP total em camundongos.
1.0 0.8
0.8
PARP total/α-Tubulina
0.8
0.6 0.6
Hipocampo
Estriado
0.6
Cortex
0.4 0.4
0.4
0.2 0.2
0.2
0.0 0.0 0.0

200 200 200 200 200 200
FO+α-Bis pMCAO+α-Bis FO+α-Bis FO+α-Bis pMCAO+α-Bis
pMCAO+α-Bis
#
100#
#
Figura 35: A pMCAO não modifica a densidade proteica relativa da PARP clivada no córtex de camundongos.
0.4 0.8
1.5
PARP clivada/α-Tubulina
0.3 0.6
Hipocampo
1.0
Cortex
Estriado
0.2 0.4
0.5
0.1 0.2
0.0 0.0 0.0

200 200 200 200 200 200
#
101#
#
5.5.10. Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a relação entre a densidade proteica
relativa da PARP total/PARP clivada no córtex, estriado e hipocampo de
Não observamos diferenças significativas sobre a relação entre a densidade

relativa da Caspase PARP total/PARP clivada no córtex: (FO: 0,75±0,43; FO+α-Bis
200: 0,98±0,45; pMCAO: 1,14±0,40; pMCAO + α-Bis 200: 0,39±0,10); No estriado
(FO: 1,00±0,58; FO+α-Bis 200: 2,17±0,82; pMCAO: 1,62±0,37; pMCAO + α-Bis 200:
2,11±0,70); E no hipocampo (FO: 0,20±0,12; FO+α-Bis 200: 0,75±0,05; pMCAO:
1,16±0,43; pMCAO + α-Bis 200: 0,58±0,20) (Figura 36).
#
102$
$
Figura 36: A pMCAO não modifica a relação entre a densidade proteica relativa da PARP clivada/PARP total em camundongos.
2.0
4
PARP clivada/PARP total

2.0

1.5
1.5 3
Hipocampo
Estriado
Cortex
1.0
1.0 2
0.5 1 0.5
0.0 0 0.0
200 200 200 200 200 200
áreas foram dissecadas para a realização do Western Blot. Valores expressos em média ± EPM, n=4. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste Dunn.
$
103$
$
5.6. Avaliação da inflamação
5.6.1. Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade proteica relativa de NF-кB
(citoplasmático) no córtex, estriado e no hipocampo de camundongos submetidos a
pMCAO.
A densidade proteica relativa de NF-кB foi avaliada 96 horas após a indução da
isquemia cerebral, e não foi observado alterações significativas no córtex (FO:
1,59±0,47) e no hipocampo (FO: 2,20±0,78; FO + α-Bis 200: 1,76±0,12; pMCAO:
2,38±0,53; pMCAO + α-Bis 200: 2,20±0,39). No estriado, foi observado aumento da
densidade relativa de NF-кB citoplasmático no animal isquemiado em relação ao falso
operado (FO: 1,16±0,34; pMCAO: 02,02±0,09). O tratamento com o α-bisabolol não
reduziu esse aumento (FO + α-Bis 200: 0,24±0,10; pMCAO + α-Bis 200: 2,20±0,39)
(Figura 37).
5.6.2 Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade relativa de NF-кB (nuclear)
no córtex, estriado e hipocampo de camundongos submetidos a pMCAO.
Os animais isquemiados apresentaram aumento da densidade relativa de NF-кB

(nucelar) 96 horas após a indução da isquemia cerebral no córtex (FO: 0,41±0,31;
pMCAO: 2,84±0,79) mas, não no estriado (FO: 0,20±0,02; pMCAO: 0,27±0,07) ou no
hipocampo (FO: 1,18±0,53; pMCAO: 3,83±1,32). O tratamento com o α-bisabolol
reduziu significativamente esse aumento no córtex: (FO + α-Bis 200: 1,79±0,70;
pMCAO + α-Bis 200: 0,64±0,21). No estriado e no hipocampo, não houveram
alterações, estriado: (FO + α-Bis 200: 0,18±0,03; pMCAO + α-Bis 200: 0,18±0,03);
hipocampo (FO + α-Bis 200: 1,73±1,08; pMCAO + α-Bis 200: 4,48±1,71) (Figura 38).
$
104$
$
Figura 37: A pMCAO modifica a densidade proteica relativa de NF-кB (citoplasmático) no estriado de camundongos.
*
*
NF-kB p65 citoplasma/α-Tubulina

NFkB p65 citoplasma/α-Tubulina
NFkB p65 citoplasma/α-Tubulina

2.5 3 4
2.0
3
2
Hipocampo
Estriado
1.5
cortéx
2
1.0
1
1
0.5
0.0 0 0
200 200 200 200 200 200
$
105$
$
Figura 38: O α-bisabolol reduz a densidade proteica relativa de NF-кB (nuclear) no córtex de camundongos 96 horas após a pMCAO.
p65 NFkB / α-Tubulina (nuclear)

8

* 0.4
4 *
6
0.3
Hipocampo
3
Estriado
4
0.2
Cortéx
2
2
0.1
1
0.0 0
0 200 200 200 200
200 200
$
106$
$
5.6.3. Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a atividade da mieloperoxidase (MPO)

no córtex temporal, corpo estriado e hipocampo de camundongos submetidos a
pMCAO.
Na avaliação da enzima mieloperoxidase, 24h após a indução da isquemia por

oclusão da artéria cerebral média, os animais isquemiados apresentaram aumento
significativo da MPO no córtex, (MPO: FO: 6,53± 0,95U/mg de tecido; pMCAO:
12,83±2,01 U/mg tecido), não houve aumento no corpo estriado (MPO: FO: 8,56±1,40;
pMCAO: 9,41±1,60 U/mg de tecido), e no hipocampo (FO: 7,40±1,84; pMCAO:
7,02±0,80 U/mg de tecido). O tratamento com o α- bisabolol diminui a MPO no córtex
apesar não ter sido significativo, (FO + α-Bis 200: 8,11±1,27; pMCAO + α-Bis 200:
8,32±1,50 U/mg de tecido). Não houveram alterações no estriado, (MPO: FO + α-Bis
200: 6,91,40±2,25; pMCAO + α-Bis 200: 8,96±2,87 U/mg de tecido); e nem no
Hipocampo, (MPO: FO + α-Bis 200: 7,94±1,29; pMCAO + α-Bis 200: 6,093±2,49
U/mg de tecido). (Figuras 39).
$
107$
$
Figura 39: O α-bisabolol não reduz o aumento dos níveis de MPO no córtex temporal de camundongos 24h após a pMCAO.
Unidades de MPO/mg de tecido
20

15

10
*
15 8
10
Hipocampo
Estriado
Córtex
6
10
4
5
5
2
0 0 0
200 200 200 200 200 200
Os animais foram isquemiados por pMCAO, foram tratados com a α-bisabolol 200 mg/kg após 3 horas, 24 horas depois suas áreas foram retiradas para a realização do ensaio
da MPO. Valores expressos em média ± EPM, n=6. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste Dunn. *(p<0,05).
$
108$
$
5.6.4. Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a expressão de TNF-α no córtex,

estriado e hipocampo de camundongos submetidos à pMCAO.
A imunomarcação para TNF-α foi realizada 96 horas após a indução da isquemia

cerebral, e foi observado um aumento significativo no número de células TNF-α
positivas, quando comparados aos animais falso-operados, no córtex, no estriado e
hipocampo (áreas: CA1, CA3 e GD) dos animais (cél. TNF-α positivas-Córtex: FO:
1,54±0,04; pMCAO: 34,79±7,85; Estriado-FO: 3,38±0,38; pMCAO: 58,50±9,50;
Hipocampo:(CA1) FO: 1,46±0,21; pMCAO: 23,25±3,12; (CA3)-FO: 2,42±0,63;
pMCAO: 28,75±2,10; (GD)-FO: 1,96±0,39; pMCAO: 34,25±7,23. O tratamento com o
α-bisabolol (200 mg/kg) diminuiu significativamente o número de células TNF-α
positivas no córtex, no estriado e no hipocampo (cél. TNF-α positivas - córtex: FO + α-
Bis 200: 1,54±0,042; pMCAO + α-Bis 200: 17,00±3,51; Estriado: FO + α-Bis 200:
2,00±0,35; pMCAO + α-Bis 200: 17,00±3,51; Hipocampo: (CA1): (FO + α-Bis 200:
2,88±0,43; pMCAO + α-Bis 200: 9,00±1,41); (CA3): FO + α-Bis 200: 1,63±0,38;
pMCAO + α-Bis 200: 15,50±3,38; (GD): FO + α-Bis 200: 2,63±0,59; pMCAO + α-Bis
200: 18,75±3,22 (Figura 40, 41, 42 e 43).
5.6.5. Efeito do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a expressão de IL-1β no córtex,

estriado e hipocampo de camundongos submetidos à pMCAO.
A imunomarcação para IL-1β foi realizada 96 horas após a indução da isquemia

cerebral, e foi observado um aumento significativo no número de células IL-1β
positivas, quando comparados com os animais falso-operados, no córtex no estriado e
no hipocampo (CA1) dos animais (cél. IL-1β positivas - Córtex: FO-6,750±1,97;
pMCAO: 54,00±10,20; Estriado-FO: 4,75±0,75; pMCAO: 44,25±12,45; Hipocampo
(CA1)-FO-7,00±0,71; pMCAO: 10,50±3,71; (CA3)-FO: 10,50±2,18; pMCAO:
9,75±4,42; (GD): FO: 9,00±2,48; pMCAO: 9,00±6,06. O tratamento com o α-bisabolol
(200 mg/kg) diminuiu significativamente o número de células IL-1β positivas no córtex
e no estriado (cél. IL-1β positivas - córtex: FO + α-Bis 200: 4,25±1,38; pMCAO + α-
Bis 200: 38,25±10,77; Estriado: FO + α-Bis 200: 5,25±0,75; pMCAO + α-Bis 200:
22,00±5,87. No hipocampo o α-bisabolol, não diminuiu o numero de células IL-1β
positivas, Hipocampo: (CA1): FO + α-Bis 200: 2,50±0,50; pMCAO + α-Bis 200:
10,00±2,68; (CA3): FO + α-Bis 200: 3,00±0,82; pMCAO + α-Bis 200: 17,75±4,66;
(GD): FO + α-Bis 200: 3,50±0,65; pMCAO + α-Bis 200: 9,25±2,25 (Figura, 44, 45, 46
$
109$
$
e 47)
Figura 40: Fotomicrografia representativa da imunomarção para TNF-α em secções

coronais do córtex e estriado 96 horas após a cirurgia.
Aumento de 100x representativas da imunomarcação para TNF-α em secções coronais do córtex

e do estriado. As setas indicam células TNF-α positivas.
$
110$
$
Figura 41: O α-bisabolol diminuiu a densidade relativa de TNF-α no córtex (A) e

estriado (B) de camundongos 96 horas após a pMCAO.
**
50 ****
n° de células TNF-α +
40
30
Córtex
20
10
0
200 200
100 **
***
80
Estriado
60
40
20
0
200 200
Os animais foram isquemiados por pMCAO, foram tratados com α-bisabolol (200 mg/kg) 3, 24, 48,72
horas depois, a imunoreatividade foi avaliada 96 horas após a pMCAO. Os valores representam a média ±
EPM, n=4. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste Dunn. **(p<0,01); ***(p<0,001); ****(p<0,0001).
$
111$
$
Figura 42: Fotomicrografia representativa da imunomarção para TNF-α em secções

coronais do hipocampo 96 horas após a cirurgia.
Aumento de 100x representativas da imunomarcação para TNF-α em secções coronais do córtex

e do estriado. As setas indicam células TNF-α positivas.
$
112$
$
Figura 43: O α-bisabolol diminui a densidade relativa de TNF-α no hipocampo (CA1,

CA3 e GD) de camundongos 96 horas após a pMCAO.
CA1 CA3
**
30 *** 40
**
***
30
Hipocampo
20
Hipocampo
20
10
10
0 0
200 200
EPM, n=4. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste Dunn. *(p<0,05); **(p<0,01); ***(p<0,001);
****(p<0,0001).
$
113$
$
Figura 44: Fotomicrografia representativa da imunomarção para IL-1β no córtex e no

estriado 96 horas após a cirurgia.
Aumento de 100x representativas da imunomarcação para IL-1β em secções coronais do córtex e do

estriado. As setas indicam células IL-1β positivas.
$
114$
$
Figura 45: O α-bisabolol diminui a densidade relativa de IL-1β no córtex e estriado de

camundongos 96 horas após a pMCAO.
60 *
**
no de células IL-1β +
40
Córtex
20
0
200 200
*
60 * *
40
Estriado
20
0
200 200
EPM, n=4. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste Dunn. *(p<0,05); **(p<0,01).
$
115$
$
Figura 46: Fotomicrografia representativa da imunomarção para de IL-1β no

hipocampo (CA1, CA3 e GD) 96 horas após a cirurgia.
Aumento de 100x representativas da imunomarcação para IL-1β em secções coronais do córtex e do

estriado. As setas indicam células IL-1β positivas.
$
116$
$
Figura 47: O α-bisabolol diminui a densidade relativa de IL-1β no hipocampo (CA1 e

CA3) de camundongos 96 horas após a pMCAO.
CA1
15
*
10
Hipocampo
0
200 200
CA3
25
20
15
Hipocampo
10
0
200 200
GD
15
10
Hipocampo
0
200 200
EPM, n=4. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste Dunn. *(p<0,05).
$
117$
$
5.7 Avaliação do estresse oxidativo
5.7.1 Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade relativa da SOD-2 no córtex,
Os animais tratados com α-bisabolol apresentaram um aumento da densidade

relativa de SOD-2 no cortéx avaliada 96 horas após a indução da isquemia cerebral, em
relação aos animais tratados somente com o veiculo (FO: 1,48±0,21; FO + α-Bis 200:
2,67±0,22; pMCAO: 2,15±0,17; pMCAO + α-Bis 200: 3,25±0,13). Não foram
observadas diferenças significativas no estriado (FO: 1,57±0,24; FO + α-Bis 200:
3,15±0,60; pMCAO: 2,10±0,61; pMCAO + α-Bis 200: 2,46±0,79) e no hipocampo (FO:
12,67±2,42) (Figura 48).
$
118#
#
Figura 48: O α-bisabolol aumenta a densidade proteica relativa da SOD-2 no cortex de camundongos 96 horas após a pMCAO.
#
119#
#
5.7.2 Efeitos do α-bisabolol (200 mg/kg) sobre a dosagem de nitrito/nitrato

(NO2/NO3) no córtex temporal, corpo estriado e hipocampo de camundongos
submetidos a pMCAO.
A figura 49 mostra a concentração de nitrito no córtex, estriado e hipocampo 24

horas após a pMCAO, respectivamente. Não observamos diferenças significativas nos
níveis de nitrito/nitrato nos tecidos cerebrais, após a pMCAO (nitrito/nitrato-µM,
córtex: FO: 11,24±0,60; FO + α-Bis 200: 12,12±1,47; pMCAO: 10,48±1,31; pMCAO +
α-Bis 200: 13,13±1,21 µM; estriado: FO: 10,01±0,49; FO + α-Bis 200: 13,40±2,44;
pMCAO: 24,51±9,14; pMCAO + α-Bis 200: 15,97±3,11 µM; hipocampo: (FO:
13,38±1,04 µM) (Figura 49).
#
120#
#
Figura 49: A pMCAO não modifica os níveis de nitrito/nitrato (NO2/NO3) no córtex

de camundongos.
20
15
Nitrito (µM)
Cortex
10
0
200 200
Os animais foram tratados com α-bisabolol (200 mg/kg) 3 horas após a isquemia sendo as áreas
dissecadas para dosagem de nitrito/nitrato 24 horas após pMCAO (n = 6 animais/grupo). Os valores estão
representados como média ± EPM. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste Dunn.
#
121#
#
5.7.3. Efeitos do α-bisabolol sobre a peroxidação lipídica (TBARS) em tecidos

cerebrais de camundongos submetidos à oclusão permanente da artéria cerebral
media.
Os animais submetidos à pMCAO apresentaram um aumento significativo nas

concentrações de MDA (produto da peroxidação lipídica), no córtex (concentrações de
MDA em µM, córtex: FO: 0,0126±0,0026; pMCAO: 0,0235±0,0021); no estriado
(concentrações de MDA em µM, no estriado: FO: 0,0088±0,0025; pMCAO:
0,0214±0,0037); e no hipocampo (concentrações de MDA em µM, no hipocampo: FO:
0,0120±0,0040; pMCAO: 0,0341±0,0040). O tratamento com o α- bisabolol na dose de
200 mg/kg não foi capaz de diminuir o aumento da concentração de MDA
(concentrações de MDA em µM, córtex: FO + α-Bis 200: 0,0184±0,0010; pMCAO + α-
Bis 200: 0,0232±0,0045; estriado: FO + α-Bis 200: 0,0196±0,0041; pMCAO + α-Bis
200: 0,0190±0,0042; hipocampo: FO + α-Bis 200: 0,0208±0,0075; pMCAO + α-Bis
200: 0,0342±0,0017 (Figura 50).
#
122#
#
Figura 50: A pMCAO modifica os níveis de peroxidação lipídica (TBARS) no córtex,

estriado e no hipocampo de camundongos.
0.03 **
0.02
MDA (µM)
Cortex
0.01
0.00
200 200
Os animais foram tratados com α-bisabolol (200 mg/kg v.o.) 3 horas após a isquemia sendo as áreas
dissecadas para dosagem de MDA em µM 24 horas após pMCAO (n = 6 animais/grupo). Os valores estão
representados como média ± EPM. Teste de Kruskal-Wallis, seguido do teste Dunn; Teste t student;
*(p<0,05); **(p<0,01).
#
123#
#
5.8. Efeito do α-bisabolol 200 mg/kg sobre a densidade relativa de sinaptofisina no

córtex e estriado de camundongos submetidos a pMCAO.
Não foram observadas diferenças significativas na densidade proteica da

sinaptofisina nos animais, após a pMCAO, córtex (FO: 0,74±0,34; FO + α-Bis 200:
2,08±0,55; pMCAO: 0,59±0,18; pMCAO + α-Bis 200: 1,06±0,42); estriado (FO:
10,13±2,72) (Figura 51).
#
124#
#
Figura 51: A pMCAO não modifica a densidade proteica relativa da sinaptofisina no

córtex camundongos.
3
Sinaptofisina /α-Tubulina
2
Cortéx
0
200 200
Os animais foram isquemiados por pMCAO, foram tratados com a α-bisabolol 200 mg/kg 3, 24, 48 e 72
horas depois, e após 96 horas os animais foram eutanasiados, e suas áreas foram dissecadas para a
realização do Western Blot. Valores expressos em média ± EPM, n=4. Teste de Kruskal-Wallis, seguido
do teste Dunn; a (FO); b (FO+α-Bis 200); c (pMCAO); d (pMCAO+ α-Bis 200).
#
125#
#
Estudos in vitro
#
126#
#
A MELHORIA DOS DÉFICITS DE MEMÓRIA PELO TRATAMENTO COM O

α-BISABOLOL EM CAMUNDONGOS COM ISQUEMIA CEREBRAL
ENVOLVE AUMENTO DA LONG TERM POTENTIATION (LTP)?
Estudos in vitro realizado durante “estágio-sanduíche” da aluna Mara Yone Soares Dias
Fernandes, (bolsa CAPES), no Centro de Neurociências e Biologia Celular da
Universidade de Coimbra, Portugal, sob a supervisão do professor Rodrigo António
Cunha.
#
127#
#
6. JUSTIFICATIVA
Até agora, não existe nenhum estudo eletrofisiológico com o α-bisabolol na

plasticidade sináptica. Este estudo visa esclarecer os mecanismos pelos quais o α-
bisabolol atua, analisando seus efeitos sobre a plasticidade sináptica, em modelo de
privação de oxigênio e glicose (modelo in vitro), em fatias hipocampais.
#
128#
#
7. OBJETIVOS
7.1 Objetivos Gerais
Investigar se a melhora nos déficits de memória pelo tratamento com o α-

bisabolol, envolve mecanismos sinápticos e metabólicos usando modelo de privação de
oxigênio e glicose (OGD), em fatias hipocampais de camundongos.
7.2 Objetivos Específicos
!! Avaliar o efeito do α-bisabolol em fatias hipocampais submetidas à OGD na:

•! Transmissão sinaptica basal.
•! Plasticidade de curta duração (PPF) e plasticidade de longa duração
(LTP, DP).
•! Taxa de consumo de oxigênio.
#
129#
#
8. Eletrofisiologia
8.1. Animais
Todos os experimentos foram realizados em fatias de hipocampo de

camundongos C57 black 6 (C57Bl/6) machos adultos (8 a 9 semanas de idade),
provenientes do laboratório Charlie Rivers (Barcelona, Espanha). O estudo foi aprovado
pelo protocolo 138 do Órgão Responsável pelo Bem-Estar Animal (ORBEA) da
Universidade de Coimbra e todos os experiementos foram realizados de acordo com os
princípios e procedimentos descritos na diretiva da União Europeia (2010/63/UE) para o
cuidado e uso de animais de laboratório.
8.2. Registros eletrofisiológicos extracelulares
Os registros eletrofisiológicos foram realizados conforme descrito anteriormente

por Lopes (2015). Primeiramente, os animais foram sacrificados por deslocamento
cervical, em seguida, foram decapitados e os seus cérebros foram rapidamente extraídos
e colocados em uma placa de Petri contendo aCSF gelado e gaseado com uma mistura
de 95% O2/5% CO2. Em seguida, os dois hipocampos foram isolados e depois
seccionados transversalmente em fatias de 400 µm de espessura (Figura 52), usando um
picador de tecido McIlwain (Brinkmann Instruments®, Nova York, NY, EUA).
Posteriormente, as fatias transversais foram deixadas em repouso para a
recuperação funcional e energética, durante, pelo menos, 1 hora, numa câmara de pré-
incubação (câmara pré-incubadora BSC-PC, Harvard Apparatus, Massachusetts, EUA)
com aCSF gaseado a 30.5 ºC.
Nesse estudo, foram utilizadas apenas fatias dorso-mediais do hipocampo. Cada
fatia utilizada para o registro foi transferida para uma câmara de gravação do tipo
imersão de 1 mL (BSC-ZT Zbicz Top®, Harvard Apparatus, Massachusetts, EUA) e
continuamente superfusada com aCSF, Etanol 0,01% (controle) ou com α-bisabolol 3,
10 ou 50 µM (condições testadas) a um fluxo constante de 3 mL/min a 30,5 ºC
(Controlador de temperatura bipolar TC-202A, Harvard Apparatus, Massachusetts,
EUA).
#
130#
#
Figura 52: Esquema de amostragem de um hipocampo de roedores ilustrado no topo.
Seções hipocampais espaçadas ao longo do eixo septotemporal na parte inferior. Fatias com números de
14 a 33 são classificadas como dorsais, enquanto fatias com números de 71 a 90 são ventrais (adaptado de
Jason Snyder, Neurogênese Funcional).
Os registros eletrofisiológicos dos potenciais pós-sinápticos excitatórios de

campo (fEPSPs) foram obtidos através da estimulação elétrica das colaterais de Schaffer
(SC) que geram potenciais pós-sinápticos excitatórios (EPSPs) nos neurônios piramidais
pós-sinápticos da região CA1 (Figura 53) (COSTENLA et al., 2011). O eletrodo de
estimulação, feito de aço inoxidável bipolar, foi posicionado nas colaterais de Schaffer,
entre as regiões CA2 e CA1 do hipocampo.
#
131#
#
Figura 53: Diagrama mostrando como os registros eletrofisiológicos foram obtidos.
A) Representação esquemática do registro do fEPSP na sinapse formada pelas projeções de CA3 para a
CA1 do hipocampo. B) Exemplo de um traço representativo obtido após estimulação: 1) artefato de
estímulo; 2) voley pré-sináptico e 3) potencial pós-sináptico excitatório de campo (fEPSP) (Ilustração de
rato obtida de Bannerman et al., 2004).
#
132#
#
Para quantificar as mudanças nos fEPSPs, o parâmetro o utilizado foi o slope do

sinal medido logo após o voley pré-sináptico. As fEPSPs evocadas foram registradas
utilizando eletrodo de registro obtido através de um sistema de estiramento de
micropipetas Flaming/Brown, modelo P-87 (Sutter Instruments, EUA). O eletrodo de
registro, que consiste numa micropipeta de vidro preenchida com NaCl 4 M (resistência
1-2 MΩ), conectado a um amplificador ISO80 (World Precision Instruments, Berlim,
Alemanha). A estimulação foi realizada usando um estimulador de pulso quadrado
Grass S44 ou Grass S48 (Grass Technologies, Warwick, RI, EUA) e, após amplificação
(ISO80, World Precision Instruments, Hertfordshire, Reino Unido), as gravações foram
digitalizadas usando um conversor de registro analógico-digital (BNC-2110, National
Instruments, Newbury, Reino Unido) (LOPES et al., 2015). Médias de respostas
consecutivas foram adquiridas com o software winLTP (ANDERSON;
COLLINGRIDGE, 2001) para quantificar a inclinação inicial dos fEPSPs médios
usados para estimar o efeito de drogas adicionadas à solução de superfusão.
8.3 Protocolos utilizados:
8.3.1. Curvas de estímulo-resposta: As curvas de estímulo-resposta, ou curva

de “input” e “output” (I/O), foram obtidas pelo aumento gradual da intensidade do
estímulo até a saturação da resposta. A resposta evocada em cada intensidade de
estímulo foi medida pela média da amplitude de três fEPSPs consecutivos evocados por
varreduras da mesma força. Após a curva I/O, O estimulo utilizado foi aquele que gerou
40% da resposta máximo e esse valor foi mantido constante durante todo o
experimento. Esse protocolo foi realizado em todas as fatias e foi repetido durante todo
o experimento em tempos representativos após os tratamentos, conforme indicado na
sessão de resultados.
8.3.2. Facilitação de pulso emparelhado (PPF): A facilitação de pulso
emparelhado é um tipo de plasticidade sináptica de curta duração utilizada para analisar
as funções pré-sinápticas. Para obter o PPR, dois pares de estímulos no fEPSP foram
aplicados às fibras colateral/comissural de Schaffer com um intervalo de 25 e 50 ms
(duração total de 6 minutos), resultando na facilitação da resposta sináptica no segundo
estímulo. A facilitação sináptica foi quantificada como a relação (P2/P1) entre a
amplitude do fEPSP provocada pelo segundo (P2) e o primeiro (P1) estímulos. A
transmissão basal e o índice de PPR foram apresentados como a porcentagem dos
#
133#
#
valores dos slopes ou do índice de PPR, respectivamente, após a administração do

fármaco em relação aos valores anteriores aos tratamentos (basais).
8.3.3. Privação de oxigênio e glicose durante 7 minutos (OGD): OGD in vitro
foi obtido através da perfusão da fatia com aCSF isenta de glicose e gaseado com
nitrogênio (95% N2-5% CO2), o que provocou uma queda da pressão parcial na câmara
de gravação de cerca de 500 mm Hg (normoxia) para uma faixa de 35-75 mm Hg (após
7 minutos de hipóxia) (PUGLIESE et al., 2003). No final do período isquêmico, as
fatias foram recuperadas com aCSF normal, contendo glicose e oxigênio. O efeito do α-
bisabolol foi avaliado antes, durante e depois da OGD em fatias hipocampais através do
monitoramento do tempo da amplitude do fEPSP (PUGLIESE et al., 2003; PUGLIESE
et al., 2006).
8.3.4. Potenciação de longa duração (LTP): Antes da aplicação do protocolo
de LTP, uma linha de base constante (sempre 40% da inclinação máxima do fEPSP sem
contaminação aparente) foi registrada em uma média de 3 varreduras de 20 s cada, por
pelo menos 10 min. A partir deste ponto, a LTP foi induzida através da estimulação de
alta frequência (HFS– um trem de 900 estímulos aplicado a 1 Hz) e mudanças
subsequentes na transmissão sináptica foram registradas durante 1 hora. LTP foi
quantificada como sendo a variação percentual entre a inclinação média dos dez
potenciais obtidos entre 50 e 60 min após a indução de LTP, em relação à inclinação
média do fEPSP, medida 10 minutos antes da aplicação do HFS. Para avaliar o efeito do
do α-bisabolol na LTP, a amplitude da LTP foi comparada em diferentes fatias do
mesmo animal na ausência e na presença da droga.
8.3.5. Despotenciação: Em condições específicas, a despotenciação foi induzida
por meio de uma estimulação de baixa frequência (LFS) (um trem de 900 pulsos de 1
Hz por 15 min), seguido por um registro de 60 min, após o protocolo de LTP A
despotenciação foi quantificada em relação aos últimos 10 minutos da potenciação
induzida anteriormente (Figura 54)
#
134#
#
Figura 54: Desenho experimental utilizado em registros eletrofisiológicos

extracelulares.
Legenda: I/O: Curvas de estímulo-resposta; OGD: Privação de oxigênio e glicose; PPF: Facilitação de
pulso emparelhado; LTP: Potenciação de longa duração; DP: Despotenciação;
#
135#
#
8.4. Respirometria de alta resolução
O consumo de oxigênio foi medido a 32°C por respirometria de alta resolução

utilizando o sistema Oxygraph-2k (OROBOROS Instruments, Innsbruck, Áustria). Esta
é uma técnica simples para determinar os complexos mitocondriais da cadeia
respiratória, “(I-IV) taxa respiratória, capacidade mitocondrial máxima do sistema de
transporte de elétrons e de integridade mitocondrial externa da membrana”.
A calibração do aparelho foi realizada antes do início do experimento, conforme
descrito no manual de instrução. As fatias hipocampais foram colocadas na câmara e
posicionadas em suportes constituídos por uma malha de nylon colada, circundada por
um anel de polipropileno de plástico com um diâmetro 1,6 cm e com uma altura de 3
mm para sustentar o tecido na câmara durante a gravação e, também, para evitar que a
barra de agitação presente na câmara de gravação causasse danos à fatia. Abaixo dos
suportes, havia 2 mL de aCSF sob constante agitação e com alta concentração de
oxigênio (0.7 a 0.9 mM) para assegurar a viabilidade do tecido. A taxa do fluxo de
oxigênio, detectada por sensores posicionados dentro das câmaras, foi realizada em
tempo real de forma contínua utilizando o software DataLab (OROBOROS
instruments).
Inicialmente, a concentração de O2 do meio foi aumentada para valores
próximos da saturação com o carbox. Após oxigenação, as fatias foram colocadas na
câmara em cima do suporte, seguida de reoxigenação e fechamento das câmaras. As
medições foram realizadas com agitação contínua (750 rpm) em 2 mL de aCSF
suplementado com HEPES e FAF-BSA e em alta concentração de O2 (entre 750 e 900
nmol/mL) para garantir oxigenação do núcleo das fatias (LEDO et al., 2017; LEDO et
al., 2005).
Após a recuperação funcional e energética das fatias (por pelo menos 1 hora na
câmara de pré-incubação), elas foram separadas em grupos de três; A primeira série de
experimentos foi realizada com três grupos: aCSF e aCSF+ α-bisabolol 3 µM ou aCSF
+ Etanol 0,01% e aCSF + α-bisabolol 3 µM; Na segunda série de experimentos, após a
recuperação das fatias, elas foram separadas em duas câmaras de pré-incubação (3 fatias
por câmara) e gaseificadas com nitrogênio (95% N2-5% CO2) durante 7 minutos a
32°C. Em seguida, foram rapidamente transferidas para a câmara de gravação no
OROBOROS, contendo aCSF + Etanol 0,01%, ou aCSF + α-bisabolol 3 µM. O
experimento foi iniciado avaliando-se a respiração basal
#
136#
#
Os dados são apresentados como média ± EPM, indicados em todas as legendas das
figuras. Após avaliar a distribuição normal dos grupos, foi realizada a análise
paramétrica e não paramétrica. Caso contrário, ao fazer comparações entre mais de dois
grupos experimentais, a análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida do teste
post hoc de Newman-Keuls (comparando os valores médios de cada grupo), ou teste t
foram realizadas. A significância das diferenças entre as médias foi calculada usando
um teste t de Student pareado, e não pareado ao comparar dois grupos experimentais.
Valores <0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todas as análises
estatísticas foram realizadas com o software GraphPad Prism (v. 6.05).
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137#
#
9. RESULTADOS
9.1. Efeito do α-bisabolol 3, 10 e 50µM, sobre a transmissão sináptica basal em

fatias hipocampais.
Na primeira série de experimentos, foi avaliado o efeito do α-bisabolol na

transmissão sináptica basal usando fatias do hipocampo de camundongos C57Bl/6, mais
precisamente, na região CA1. A Figura 55 mostra que não houve alteração da
transmissão sináptica basal, na presença de diferentes concentrações do α-bisabolol
[Etanol 0,01% (Controle): 100,1±0,36; α-Bis 3µM: 99,10±0,88; α-Bis 10µM:
100,0±0,00; α-Bis 50µM: 100,0±0,00].
A Curva de input/output (curva I/O) foi realizada antes e depois da administração
de diferentes concentrações do α-bisabolol: 3, 10 e 50µM. Não foram observadas
diferenças significativas entres os grupos de tratamento. Antes do tratamento: (Etanol
0,01%: -0,55±0,06; α-Bis 3µM:-0,35±0,07; α-Bis 10µM: -0,24±0,07; α-Bis 50µM: -
0,39±0,07). Depois do tratamento: (Etanol 0,01%:-0,28±0,03; α-Bis 3µM:-0,28±0,09; ;
α-Bis 10µM:-0,16±0,04; α-Bis 50µM:-0,29±0,05) (Figura 56).
9.2. Efeito do α-bisabolol 3, 10 e 50µM, sobre a plasticidade sináptica de curta

duração (PPF) em fatias hipocampais.
A Facilitação de pulso pareado no hipocampo foi realizada por meio da

aplicação de dois pulsos pareados com a mesma tensão de estimulação, separados por
um intervalo de 50ms. Os resultados mostraram que em relação aos mecanismos de
plasticidade sináptica de curta duração nenhum tratamento foi capaz de alterar a PPF
(Etanol 0,01%: 1,86±0,23; α-Bis 3µM:1,63±0,10; α-Bis 10µM: 1,60±0,05; α-Bis
50µM:1,546±0,00). Depois do tratamento: (Etanol 0,01%: 1,51±0,21; α-Bis
3µM:1,57±0,08; α-Bis 10µM:1,52±0,06; α-Bis 50µM:1,52±0,02) (Figura 57).
#
138#
#
Figura 55: O α-bisabolol não altera a transmissão sináptica basal em fatias

hipocampais.
α-BIS 3µM
α-BIS 10µM
α-Bis 50µM
A
120
α-BIS
% sobre a Basal
110
100
90
80
0 5 10 15
Tempo (min)
A. Tempo de duração da amplitude do fEPSP evocada e registada na região hipocampal CA1 antes,
durante a aplicação de diferentes concentrações do α-bisabolol (3, 10 e 50µM), durante 10 minutos. B.
Grafico de colunas representando a amplitude do fEPSP antes, durante e depois da aplicação de diferentes
concentrações do α-bisabolol (3, 10 e 50µM), durante 10 minutos. Valores expressos em média ± EPM,
n=4. One-way ANOVA, seguida do teste Newman-Keuls.
#
139#
#
Figura 56: O α-bisabolol não altera acurva I/O em nenhuma das concentrações testadas.
#
140#
#
Efeito do α-bisabolol sobre a transmissão basal. Curva de input/output: variação dos fEPSPs em resposta
a diferentes intensidades de estímulo (mA) ao longo do tempo, antes e depois do tratamento com o
veiculo (etanol 0,01%), e com diferentes concentrações do α-bisabolol: A- Etanol 0,01%; B- α-BIS 50µM;
C-α-BIS 10µM; D-α-BIS 50µM.
#
141#
#
Figura 57: O α-bisabolol não altera a plasticidade sináptica de curta duração.
Razão entre PPF (PPR). A. Razão entre o segundo e o primeiro estímulo antes e após o tratamento com o
Etanol 0,01%; B. Razão entre PPF, antes e após o tratamento com o α-Bis 3µM; C. Razão entre PPF,
antes e após o tratamento com o α-Bis 10µM; D. Razão entre PPF, antes e após o tratamento com o α-Bis
50µM; Todos os valores são expressos em médias ± EPM. Teste t de Student pareado, n = 4.
#
142#
#
9.3. Efeito do α-bisabolol 3, 10 e 50 µM, sobre a depressão irreversível do fEPSP em

fatias do hipocampo submetidas ao modelo de isquemia cerebral in vitro (OGD).
A figura 58, mostra o efeito do α-bisabolol 3, 10 e 50µM na amplitude de fEPSP

após 7 minutos de OGD. As fatias tiveram um pré-tratamento com o -bisabolol, antes
da aplicação do protocolo da OGD. Em fatias controle, a OGD de 7 minutos induziu um
bloqueio irreversível na neurotransmissão, como indicado pela ausência de recuperação
da amplitude de fEPSP (Etanol 0,01%:15,74±3,67%), mesmo quando foram
perfundidas com aCSF contendo glicose e oxigênio. O tratamento com o -bisabolol
nas 3 concentrações, provocou uma recuperação significativa do fEPSP após 7 minutos
de OGD ( -Bis 3µM:83,72±4,15%; α-Bis 10µM: 84,79±3,00%;α-Bis
50µM:74,81±0,93%).
9.4. Efeito do α-bisabolol 3µM, sobre a transmissão sináptica basal em fatias

hipocampais.
Na segunda série de experimentos, foi avaliado o efeito do α-bisabolol 3µM na

transmissão sináptica basal. A Figura 59 mostra que o α-bisabolol na concentração 3µM
não altera a amplitude do fEPSP em fatias do hipocampo (Controle: 100,1±0,62; α-Bis
3µ: 99,35±0,76) (Figura 59).
A Curva de input/output (curva I/O) foi realizada antes e depois da administração
do α-bisabolol na concentração de 3µM. O resultado mostrou que após o tratamento
com α-bisabolol houve uma redução da curva I/O: (Controle: -0,54±0,13; α-Bis 3µM: -
0,47±0,10) (Figura 60).
#
143#
#
Figura 58: O α-bisabolol protege contra a depressão irreversível da neurotransmissão

induzida por um insulto de privação de oxigenio e glicose (OGD) de 7 minutos.
#
144#
#
Desenvolvimento da despolarização anóxica e falha na transmissão sináptica no hipocampo de

camundongos, após OGD de 7 min. A. Registro representativo de um fEPSP típico no hipocampo de
camundongo, posicionando os eletrodos nas sinapses colateral de Schaffer-CA1. Cada traço compreende
o artefato do estímulo, seguido pelo voley pré-sináptico e pelo fEPSP. A intensidade do estímulo foi
ajustada para evocar um fEPSP sem contaminação apreciável por pico populacional e as respostas foram
quantificadas como a inclinação inicial dos fEPSPs médios (a depressão após o artefato dos estímulos).
Os pontos 1, 2, e 3 indicados no gráfico, correspondem, imediatamente antes da indução do protocolo (1),
apos os 7 min de OGD, (3), 30 min após os 7 min de OGD.B. Gráfico ilustrativo, representando o tempo
de duração da amplitude do fEPSP evocada e registada da região CA1 do hipocampo, antes, durante e
após um insulto de OGD de 7 minutos, em fatias controlo e na presença de diferentes concentrações do α-
bisabolol (3, 10 e 50µM). C. Grafico em colunas representando a amplitude do fEPSP antes, durante e
depois de um insulto de OGD de 7 minutos, em fatias controlo e na presença de diferentes concentrações
do α-bisabolol (3, 10 e 50µM). Todos os valores são expressos em média ± EPM. One-way ANOVA,
seguida do teste Newman-Keuls.Teste t, n = 4. Os dados são expressos como porcentagem dos valores de
referência registrados antes da aplicação de OGD.
#
145#
#
Figura 59: O α-bisabolol não altera a neurotransmissão basal em fatias hipocampais.
% of EPSP change from basal

110
α-Bis 3µM
100
90
80
-10 0 10 20
Time (min)
120
% sobre a Basal
100
80
60
l
M
sa
3μ
Ba
IS
B
α-
A.Tempo de duração da amplitude do fEPSP evocada e registada da região hipocampal CA1 antes,
durante a aplicação do α-bisabolol 3µM, durante 20 minutos. B. Grafico de colunas representando a
amplitude do fEPSP antes, durante e depois da aplicação do α-bisabolol 3µM durante 20 minutos.Valores
expressos em média ± EPM, n=4. Teste t de Student pareado, n = 6.
#
146#
#
!Figura 60: O α-bisabolol não altera a transmissão sináptica basal.
Antes do α-BIS 3 µM
Depois do α-BIS 3µM
-0.8
fEPSP Slope (mV/s)
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Corrente(mA)
Curva input/outpt: Variação dos fEPSPs em resposta a diferentes intensidades de estímulo (mA), em
fatias hipocampais ao longo do tempo (antes e após a introdução do do α-Bis 3µM); Todos os valores são
expresso em médias EPM. Teste t de Student pareado, n = 6.
#
147#
#
9.5. Efeito do α-bisabolol 3µM sobre a plasticidade sináptica de curta duração

(PPF) em fatias hipocampais.
A Facilitação de pulso pareado no hipocampo foi realizada nos intervalos de

50ms e de 25ms. Os resultados mostraram que em relação aos mecanismos de
plasticidade sináptica de curta duração nenhum tratamento foi capaz de alterar a PPF
tanto no intervalo de 50, como no de 25ms: [50ms, antes do Etanol 0,01%: (1,77±0,12);
Depois do Etanol 0,01%:(1,66±0,07)], [25ms antes do Etanol 0,01% (1,85±0,06; Depois
do Etanol 0,01%: (1,67±0,02)]; [50ms, antes do α-Bis 3µM (1,74±0,10; Depois do α-
Bis 3µM :1,78±0,07)], [25ms antes do α-Bis 3µM (1,67±0,15; Depois do α-Bis 3µM:
1,74±0,12)] (Figura 61: A e B).
9.6. Efeito do α-bisabolol 3µM sobre a plasticidade sináptica de longa duração em

fatias hipocampais.
Em relação a amplitude da LTP (induzida por estimulação de alta frequência,

HFS), não houve diferencas significativas entre as fatias controlo, e as fatias tratadas
com o α-bisabolol 3µM (Etanol 0,01%: 148,6±3,52; α-Bis 3µ:166,7±3,75) (Figura 62).
#
148#
#
Figura 61: O Etanol 0,01% e o α-bisabolol 3µM não altera a plasticidade sináptica de
curta duração, nos intervalos de 50 e 25ms.
2.5
Antes do Etanol 0,01%
PPR (% sobre basal)
2.0 Depois do Etanol 0,01%
1.5
1.0
0.5
0.0
25
50
Intervalo (ms)
B
Depois do α-BIS 3µM
2.5 Antes do α-BIS 3 µM
PPR (% sobre basal)
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
25
50
Interval (ms)
Razão entre PPF (relação entre o segundo e o primeiro estímulo), nos intervalos de 50 e 25ms: A. Antes e
após o tratamento com o Etanol 0,01%; B. Antes e após o tratamento com o α-Bis 3µM. Todos os valores
são expressos em médias ± EPM. Teste t de Student pareado, n = 6.
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149#
#
9.7. Efeito do α-bisabolol 3µM sobre a plasticidade sináptica basal de longa

Em relação a amplitude do LTP (induzida por estimulação de alta frequência,

HFS), não houve diferencas significativas entre as fatias controles, e as fatias tratadas
com o α-bisabolol 3µM (Etanol 0,01%: 148,6±3,52; α-Bis 3µ:166,7±3,75) (Figura 62).
Após uma prévia potenciação (HFS) por 60 min, as fatias hipocampais foram
submetidas à estimulação de baixa frequência (LFS), fenómeno chamado de
despotenciação. Nossos dados revelaram que tanto as fatias controles como as fatias
tratadas com α-bisabolol 3µM, não apresentaram diferencas após a LFS (Etanol 0,01%:
79,20±1,05; α-Bis 3µ:87,37±0,69) (Figura 63).
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150#
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Figura 62: O α-bisabolol 3µM não aumenta a amplitude da LTP.
A. Amplitude do fEPSP registrada durante 60 min após a estimulação tetânica para medir a LTP; A seta
indica o momento da aplicação da estimulação tetânica (HFS, 1 s, 100 Hz). B. Gráfico em colunas
representando a magnitude da LTP, correspondente à média da inclinação do fEPSP 50-60 min após a
indução de LTP. C. Registro representativo de um fEPSP típico no hipocampo de camundongo,
posicionando os eletrodos nas sinapses da colateral de Schaffer-CA1, antes (linha de base, linha sólida), e
logo após a estimulação tetânica (após LTP, linha tracejada). Todos os valores são expressos em médias ±
EPM. Teste t de Student pareado, n = 6.
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151#
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Figura 63: O α-bisabolol 3µM não altera a amplitude da Despotenciação.
A. Amplitude do fEPSP registrada durante 60 minutos após a indução do protocolo de depotenciação

(LFS, 15 min, 1 Hz); A seta indica o momento da indução do protocolo da despotenciação. B. Gráfico em
colunas representando a magnitude da despotenciação, correspondente à média da inclinação do fEPSP
50-60 min após a indução do LFS. C. Registro representativo de um fEPSP típico no hipocampo de
camundongo, posicionando os eletrodos nas sinapses da colateral de Schaffer-CA1, antes (linha de base,
linha sólida), e 50-60 min após o LFS (linha tracejada). Todos os valores são expressos em médias ±
#
152#
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9.8. Efeito do α-bisabolol 3µM, sobre a depressão irreversível do fEPSP em fatias

hipocampais submetidas ao modelo de isquemia cerebral in vitro (OGD).
A figura 64, mostra o efeito do α-bisabolol 3µM aplicado após o insulto da OGD
de 7 minutos na amplitude de fEPSP. Após o insulto da OGD, as fatias controlos foram
tratadas com Etanol 0,01%, e houve um bloqueio irreversível da neurotransmissão,
indicado pela ausência de recuperação da amplitude de fEPSP (Controlo:
39,94±7,54%). Em fatias tratadas com o α-bisabolol 3µM após o insulto da OGD, houve
uma recuperação completa da amplitude do fEPSP (α-Bis 3µM: 77,30±8,48%).
9.9. Efeito do α-bisabolol 3µM e do Etanol 0,01%, sobre a curva I/O em fatias
A Curva input/output foi realizada antes, e 30 min após o insulto da OGD. As

fatias foram tratadas com o Etanol 0,01%, logo após os 7 minutos do insulto, mas não
apresentaram aumento da excitabilidade basal: Antes da OGD (Controlo: -0,30±0,08), e
após a OGD (Controlo: 0,00±0,00). Por outro lado, nas fatias tratadas com o α-bisabolol
3µM, foi observada um aumento da excitabilidade basal. Antes da OGD7 (α-Bis 3µM: -
0,3573-0,35±0,09163), depois da OGD7 (α-Bis 3µM: -0,31±0,08) (Figura 65).
#
153#
#
Figura 64: O α-bisabolol protege contra a depressão irreversível da neurotransmissão

induzida por um insulto de OGD de 7 minutos.
A OGD (7min)
OGD 7+α-BIS 3µM
120
Amplitude do fEPSP (% sobre a basal)
OGD (7min)
100
80
60
α-BIS 3µM
40
20
0
-8 -4 0 4 8 12 16 20 24
Tempo (min)
Desenvolvimento da despolarização anóxica e falha na transmissão sináptica no hipocampo de

camundongos, após OGD de 7 min. A. amplitude do fEPSP evocada e registada da região CA1 do
hipocampo, antes, durante e após um insulto de OGD de 7 minutos. Logo após a OGD 7min, as fatias
foram tratadas com o α-bisabolol 3 µM, ou com o veiculo (etanol 0,01%). Esse gráfico mostra o efeito
terapêutico do α-bisabolol 3 µM na isquemia cerebral. B. Gráfico em colunas representando o efeito
terapêutico do α-bisabolol 3 µM na isquemia cerebral. C. Registro representativo de um fEPSP típico no
hipocampo de camundongo, posicionando os eletrodos nas sinapses da colateral de Schaffer-CA1, 30
minutos após a OGD 7 min. Todos os valores são expressos em média ± EPM. Teste t student, n = 6. Os
dados são expressos como porcentagem dos valores de referência registrados antes da aplicação de OGD;
***(p<0,001).
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154#
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Figura 65: O α-bisabolol aumenta a excitabilidade basal após OGD de 7 min.
Curva input/output (estimulo resposta) em fatias de hipocampo, obtida antes da indução do protocolo da
OGD 7min (aCSF), e 30 minutos após a OGD 7 min, na presença do Etanol 0,01% (A); E na presença do
α-bisabolol 3µM (B). Todos os valores são expressos em médias ± EPM. Teste t de Student pareado, n =
6.
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155#
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9.10. Efeito do α-bisabolol 3µM sobre a plasticidade sináptica basal de longa duração
em fatias hipocampais, após a OGD de 7 min.
Após a indução do protocolo da LTP, as fatias controles não responderam ao

estimulo (Etanol 0,01%: 280,0±43,34) enquanto que as fatias tratadas com o α-bisabolol
3µM responderam ao estimulo (a LTP foi aumentada após o tratamento) (α-Bis
3µ:120,7±1,812) (Figura 66).
Após a estimulação tetânica, as fatias hipocampais foram submetidas ao protocolo
da despotenciação estimulação (LFS). Nossos dados revelaram que as fatias tratadas com o
Etanol 0,01% não responderam ao estimulo (controlo e as fatias tratadas com α-bisabolol
3µM, não apresentaram diferencas após a LFS (Etanol 0,01%: 280,0±30,53; α-Bis
3µ:84,51±1,20) (Figura 67).
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156#
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Figura 66: O α-bisabolol aumenta a amplitude da LTP.
OGD 7 + Etanol 0,01%

A
OGD7 + α-BIS 3µM
200
fEPSP Slope (mV/s)
150
100
HFS,
50 100Hz
0 20 40 60
Tempo (min)
A amplitude do fEPSP registrada durante 60 min após a estimulação (HFS, 1 s, 100 Hz); B. Gráfico em
colunas representando a magnitude da LTP, correspondente à média da inclinação do fEPSP 50-60 min
após a indução de LTP. C. Registro representativo de um fEPSP típico no hipocampo de camundongo,
posicionando os eletrodos nas sinapses da colateral de Schaffer-CA1, antes (linha de base, linha sólida), e
50-60 min após a estimulação tetânica (linha tracejada). Todos os valores são expressos em médias ±
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157#
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Figura 67: O α-bisabolol 3µM aumenta a amplitude da Despotenciação.
A
200 OGD7 + α-BIS 3µM
OGD 7 + Etanol 0,01%
fEPSP Slope (% sobre a basal)
150
100
50 LFS, 900pulses 1Hz
0
0 25 50 75
Tempo (min)
A. Amplitude do fEPSP registrada durante 60 minutos após a indução do protocolo de depotenciação

(LFS, 15 min, 1 Hz). B. Gráfico em colunas representando a magnitude da despotenciação,
correspondente à média da inclinação do fEPSP 50-60 min após a indução do LFS. C. Registro
representativo de um fEPSP típico no hipocampo de camundongo, posicionando os eletrodos nas sinapses
da colateral de Schaffer-CA1, antes (linha de base, linha sólida), e 50-60 min após o LFS (linha
tracejada). Todos os valores são expressos em médias ± EPM. Teste t de Student pareado, n = 6.
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158#
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9.11. Efeito do α-bisabolol 3µM, na taxa de consumo de oxigénio, em fatias

hipocampais submetidas ao modelo de isquemia cerebral in vitro (OGD).
Na figura 68, as fatias submetidas a OGD exibiram um burst respiratório, na taxa

de consumo de oxigénio, que com o passar do tempo foi diminuindo em comparação
com o grupo normoxia. Enquanto que nas fatias tratadas com o α-bisabolol não foi
observado o busrt respiratório, e a taxa de consumo de oxigénio se manteve constante,
muito semelhante ao grupo normoxicas. [Normoxia (Alcool 0,01%): 20,25±0,71; OGD
+Alcool 0,01%: 17,21±0,7055; Normoxia + α-Bis 3µM: 21,40±0,27; OGD + α-Bis
3µM: 21,00±0,23; OGD + Alcool 0,01%)] (Figura 68).
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159#
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Figura 68: α-bisabolol 3µM inibe o burst respiratorio após a OGD.
30 Normoxia OGD OGD + Etanol 0,01%
OGD + α-Bis 3M
Fluxo de O2 por massa
20
(pmol s-1 mg-1)
10
0
0 5 10 15
Tempo após OGD7 / min
Taxa de consumo de oxigênio por minuto em fatias hipocampais normalizado pela massa.
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160#
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10! DISCUSSÃO !
O presente estudo demostrou que o α-Bisabolol protegeu contra danos neuronais

induzidos pela isquemia cerebral, por um mecanismo que envolve um efeito
antiinflamatorio e antioxidante.
A fisiopatologia do AVC é complexa e compreende, como principais
mecanismos patogênicos, os danos oxidativos, os mecanismos excitotóxicos
(neurotransmissores excitotóxicos), as vias inflamatórias, o desequilíbrio iónico e a
apoptose (POPA-WAGNER et al., 2018; KNECHT et al., 2017).
As sequelas decorrentes do AVC variam dependendo da localização e da
grandeza da área cerebral que foi atingida, assim como do tempo que o paciente levou
para ser atendido. Alterações motoras e sensoriais, afasia, prejuízo na orientação
espacial e déficits de memória têm sido descritas (BOKURA; ROBINSON, 1997;
BRADVIK; SONESSON; HOLTAS, 1989; GODEFROY et al., 1994).
A disfunção neurológica é considerada a complicação clínica mais grave do
derrame cerebral, mas os roedores são capazes de se adaptar e, por isso, de se recuperar
rapidamente dos déficits sensório-motores após o AVC (REWELL et al., 2017).
Baseados em estudos prévios nossos mostrando a capacidade neuroprotetora do
α-Bisabolol quando aplicado antes da indução da isquemia cerebral focal permanente in
vivo (efeito preventivo) (FERNANDES et al., 2018), decidimos investigar o mecanismo
do efeito neuroprotetor do α-Bisabolol em modelos de isquemia cerebral in vivo e in
vitro. Primeiramente, avaliamos a atividade neurológica (déficits neurológicos sensório-
motores) 24 h após a lesão isquêmica e observamos que os animais isquemiados
apresentaram déficits sensório-motores acentuados quando comparados com o grupo
falso-operado. Um trabalho recente mostrou que ratos submetidos a pMCAO
apresentaram escores de déficit neurológico significativamente menores indicando a
existência da lesão neuronal e provando o sucesso do modelo de AVC isquêmico do
estudo (ZENG et al., 2018).
O tratamento com o α-Bisabolol foi capaz de proteger, 24 horas após a cirurgia,
contra os déficits sensório-motores induzidos pela pMCAO, na dose de 50, 100 e
200mg/kg. Nossos resultados anteriores, mostraram que o tratamento com o α-bisabolol
(100 e 200 mg / kg), protegeu contra os deficits neurológicos, decorrentes da pMCAO.
Outros sesquiterpenóides, como rutaecarpina (YAN et al., 2013), partenolídeo
(DONG et al., 2013) e -cariofileno (CHANG et al., 2013) mostraram efeitos
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161#
#
semelhantes contra danos neuronais e déficits neurológicos, corroborando nossos

achados.
A capacidade do α-Bisabolol de diminuir a extensão da área isquêmica cerebral
foi investigada através da quantificação pelo TTC. Os nossos resultados demonstram
que o grupo dos animais submetidos a pMCAO tiveram um significativo dano
isquêmico, particularmente nas áreas do córtex e do estriado, concordando com Jiang e
colaboradores (2019), que demonstraram recentemente um aumento da extensão da área
de infarto em animais submetidos à oclusão da artéria cerebral média usando a
coloração de TTC. Esses dados demonstram que a indução da isquemia cerebral através
do modelo escolhido foi bem-sucedida. O tratamento com o α-Bisabolol na dose de 100
e 200 mg/kg, administradas por via oral, 3 h após a indução de pMCAO, foi capaz de
diminuir o percentual da área isquêmica.
Previamente já tínhamos observados que o α-Bisabolol, na dose de 100 e 200
mg/kg, administradas 24h antes e 2h após a indução da isquemia, diminuiu
significativamente os déficits neurológicos e a lesão cerebral isquêmica (FERNANDES
et al., 2018). O Borneol, um álcool terpenóide, encontrado na cânfora-do-bornéu tem
sido usado para tratar o AVC na China. Recentemente, foi demostrado que o Borneol
reduziu a área de infarto visualizada pela coloração de TTC em ratos submetidos a
pMCAO, por meio da sua atividade anti-apoptótica e anti-inflamatória (DONG et al.,
2018).
Do ponto de vista clínico, após a injúria cerebal isquêmica, o indivíduo precisa
chegar rápidamente ao hospital para que não saia da janela terapêutica de 4,5 horas,
preconizada pela OMS, para receber o tPA, como tratamento vigente. A janela
terapêutica de 3h encontrada em nossos resultados, demonstra atividade neuroprotetora
do α-Bisabolol e o reconhece como um candidato promissor à substituição nesse
tratamento.
No modelo da pMCAO, a lesão apresenta-se particularmente no córtex temporal
e corpo estriado, assim, um dano nessas áreas ocasiona uma redução da atividade
locomotora (SHENG, 2010). O teste da atividade locomotora é utilizado para avaliar a
função mesocorticoestriatal (KALIVAS et al., 1988).
Nossos resultados demonstraram que os animais submetidos a pMCAO,
avaliados através do teste de campo aberto, apresentaram déficit motor significativo
tanto na exploração horizontal quanto na exploração vertical em relação aos animais
falso-operados. Tais achados são semelhantes em vários estudos, como o de Tsuji et al.,
#
162#
#
(2013), que demostraram que camundongos submetidos a MCAO exibiram déficits

neurofuncionais significativos no teste do campo aberto.
O α-bisabolol, preveniu os déficits locomotores na exploração horizontal
(crossing), e na exploração vertical (rearings). Estes resultados reforçam, também,
outro estudo em que o óleo essencial de Matricaria recutita, constituído principalmente
por -bisabolol, aumentou significativamente a atividade locomotora espontânea
(CAN et al., 2012). Recentemente, Hu e colaboradores (2019), demonstraram que, o
Paeoniflorin, um glucósides monoterpeno preveniu contra os deficits na atividade
locomotora, induzidos pelo modelo de MCAO, por um mecanismo que envolve
ativação da via de sinalização BDNF e p-CREB.
O teste de campo aberto, como a avaliação neurológica, pretende analisar se o
animal não adquiriu nenhuma disfunção motora grave como resultado da cirurgia, o que
afetaria a execução dos testes de memória.
No nosso trabalho, o α-bisabolol, apresentou efeito neuroprotetor, na atividade
locomotora, e os testes de memória não foram prejudicados.
O teste de Rotarod representa, junto com o campo aberto, a principal abordagem
na caracterização fenotípica motora em modelos animais. O tempo de latência é
apontado como a principal medida adquirida na barra rotatória e retrata o produto do
equilibrio dinâmico, da coordenação motora, do planejamento motor, da aprendizagem
motora, e das condições físicas gerais. As quedas mais rápidas, com tempo de latência
menor, em geral, associam-se mais a prejuízos na coordenação motora que á fadiga
muscular com o tempo de latência menor (BROOKS; DUNNET, 2009).
Mais do que se apontar lesão cerebelar ou extrapiramidal, conforme o padrão de
resultados obtido no Rotarod, consegue-se identificar possíveis alterações em estruturas
mediais do sistema motor, como núcleos denteados do cerebelo, pars compacta da
substância negra, núcleos talâmicos ventro-laterais e centro-laterias, no segmento lateral
do globo pálido e no segmento dorso-medial do estriado. Assim, regiões como o lóbulo
floculo-nodular, o núcleo de fastígio do cerebelo, as vias cerebelares, o segmento dorso-
lateral do estriado e os córtices motor e parietal posteriores, igualmente importantes no
sistema motor, são menos sensíveis ao teste de rotarod.
Nossos resultados mostraram que, após a pMCAO, os animais apresentaram
redução na coordenação motora e no equilíbrio, assim como descrito na literatura.
Recentemente, MCBRIDE et al, (2018), demonstraram também que ratos submetidos a
pMCAO, apresentaram prejuízos na coordenação motora, no desempenho do teste de
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163#
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rotarod. O tratamento com o α-Bisabolol, não reverteu os deficits de coordenação

motora no teste do rotarod. Esse achado pode ser principalmente, devido ao fato do teste
de rotarod ser mais sensível a lesões cerebelares, do que a lesões estriatais, em roedores
(CASTON et al., 1995; LALONDE et al., 1995).
Na literatura, encontra-se um trabalho mostrando que a fração terpenóide
de Hygrophila auriculata aumentou o tempo de latência, no teste de rotarod, em um
modelo de isquemia cerebral global transitória em ratos, por um mecanismo que
envolve atenuação da morte neuronal dos neurônios hipocampais, e à proteção cerebral
contra o estresse oxidativo através do aumento de sistemas antioxidantes (KANHERE et
al., 2012).
Atualmente, o acidente vascular cerebral isquêmico representa uma das maiores
causas de demência, déficits neurológicos e déficits na função cognitiva, sozinhos ou
associados a outras patologias, em humanos (PLANTON et al., 2017; O'BRIEN, 2006).
Vários estudos já demostraram que o modelo pMCAO gera déficits motores e de função
cognitiva, devido a prejuízos significativos no hipocampo (DAHLQVIST et al., 2004;
OTTANI et al., 2003).
O hipocampo é o local de ação de influências modulatórias em muitos tipos de
memória ou constituintes de memória: espacial, verbal e contextual, entre outros (KIM
et al., 2016; MALM et al., 2006; BECHARA et al., 1995; IZQUIERDO; MEDINA,
1997). É sabido que a isquemia cerebral leva a déficits na memória de trabalho
(CORBETT; NURSE, 1997). Estudos anteriores mostraram que pacientes com AVC
isquêmico cerebral têm um número reduzido de neurônios em algumas regiões cerebrais
como o córtex e o hipocampo (LI et al., 2011), e que existe uma correlação entre dano
hipocampal induzido por isquemia cerebral e déficit de aprendizado espacial (BLOCK;
SCHWARZ, 1997).
Fonteles e colaboradores (2016) observaram que, após a oclusão permanente da
artéria cerebral média em camundongos, houve déficits na memória de trabalho avaliada
pelo teste do labirinto em Y. Neste estudo, a memória de trabalho foi avaliada 72 h após
a isquemia cerebral por meio do mesmo teste do labirinto em Y e se observou que os
animais isquemiados apresentavam comprometimento na execução dessa tarefa. O
tratamento com o α-bisabolol na dose de 50, 100 e 200 mg/kg foi capaz de proteger os
animais contra esses déficits de memória. Posteriormente demonstramos, o efeito
preventivo do α-bisabolol contra os déficits na memória de trabalho em camundongos
submetidos a pMCAO (FERNANDES et al., 2018). No presente trabalho, o estriado e o
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164#
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córtex-mor foram afetados diretamente pela isquêmia, o que levou ao comprometimento

da memória de trabalho. Esses achados são consistentes com resultados de outros
estudos que mostraram déficits nas funções cognitivas em ratos e camundongos após
isquemia (CARMO et al., 2014; HATTORI et al., 2000; LIMA et al., 2017; WAHL et
al., 1992; YONEMORI et al., 1996). Vários terpenóides já mostraram atividade
neuroprotetora. A rutaecarpina, um terpenoide, melhorou o desempenho nos teste de Y-
maze, em camundongos, após lesão de reperfusão isquêmica (YAN et al., 2013).
O desempenho na tarefa de esquiva passiva requer a integridade das conexões
córtico-hipocampal, mais especialmente o córtex perirrinal e entorrinal (BURWELL et
al., 2004), bem como córtex parietal e frontal, e estriado (D'ESPOSITO et al., 1995;
IZQUIERDO; MEDINA, 1997), que são uma das principais áreas acometidas pelo
pMCAO. Observou-se, neste trabalho, que os animais submetidos à isquemia
apresentaram déficit na memória aversiva recente e tardia. Esses achados, corroboram
com achados da literatura, que demostraram também que os animais subemetidos a
pMCAO, apresentaram deficits no desempenho do teste da esquiva passiva, tanto na
memoria recente como na memoria tardia (YU et al., 2018; YANG et al., 2015).
O presente estudo constatou que (-) - α-bisabolol (200 mg / kg) foi capaz de
inibir os déficits na memória recente, promovendo melhoria na aprendizagem e
memória de camundongos isquêmicos, provavelmente por reduzir o dano neuronal no
córtex e estriado, e consequentemente preservar os circuitos neurais nestas áreas.
Haddadi e colaboradores (2018), mostraram que o carvacrol, um terpenoide,
conseguiu reverter os déficits de memória aversiva em modelo de Doença de
Alzheimer, tendo sugerido que esse efeito se deve a sua atividade inibitória da
acetilcolinesterase.
Jeyakumar et al (2019), demostraram que o α-bisabolol β-D-fucopiranosídeo
apresentou capacidade neuroprotetor na doença de Alzheimer, através da inibição da
enzima acetilcolinesterase. Um outro estudo tambem mostrou que o α-bisabolol
apresenta uma pontente atividade inibitória contra a acetilcolinesterase, na de doença de
Alzheimer (SHANMUGANATHAN et al., 2015)
Em estudo realizado à base de screening, in vitro, de plantas utilizadas na
medicina popular no tratamento de déficits cognitivos, foram descobertas algumas
espécies com atividade inibidora da enzima acetilcolinesterase, tais como Ruta
graveolens, Rosmarinus officinalis, Petroselium crispum, Mentha spicata e Pimpinella
anisum que contêm óleos voláteis com enorme quantidade e diversidade de
#
165#
#
monoterpenos (ADSERSEN et al., 2006).

A inibição da atividade da acetilcolinesterase também já foi relatada para o óleo
volátil de Centella asiatica L. (Apiaceae), que contém os monoterpenos acetato de
bornil, α-pineno, β-pineno e γ-terpineno (HOWES; HOUGHTON, 2003).
Nas últimas décadas, os registros eletrofisiológicos baseados em potencial pós-
sináptico excitatório em campo (fEPSP) tornaram-se a forma de experimentação
eletrofisiológica mais popular para estudos de potencialização e depressão sináptica na
formação hipocampal, devido a sua relativa facilidade e acuracidade, principalmente,
na região do Stratum radiatum de CA1 do Hipocampo, em particular pela geometria
espacial da flexibilidade das fibras de schaffer colaterais em conexão com a árvore
dendrítica apical das células piramidais de CA1, onde se formam a maioria das sinapses
excitatórias dessa região (SHEPHERD, 1990). Usando essa técnica, primeiramente
avaliamos o efeito das diversas concentrações do α-bisabolol (3, 10 e 50 µM) na
excitabilidade e na transmissão sináptica basal, observando as alterações na amplitude do
fEPSP na curva I/O, e na plasticidade sináptica de curta duração, em fatias hipocampais,
mais precisamente na região CA1. Os nossos resultados mostraram que as diferentes
concentrações do α-bisabolol, não alteraram a excitabilidade tecidual,
consequentemente, não alterou a neurotransmissão nas colaterais de Schaffer.
Em trabalho, Silva et al., (2001), observaram que o Linalool um composto
monoterpênico, predominante no óleo essencial de varias espécies vegetais reduziu
significativamente a liberação e a captação de glutamato estimulada por potássio,
em membranas corticais do cérebro, sem interfer com a liberação basal de glutamato,
mostrando assim a participação dos terpenoides na transmissão
glutamatérgica, estimulada por K+.
Existem poucos estudos eletrofisiológicos com o α-bisabolol. Ressalte-se a
importância do presente estudo, considerando que este é o primeiro trabalho realizado
com o α-bisabolol utilizando a metodologia do registro eletrofisiológico extracelular em
situações de isquemia cerebral in vitro (OGD).
Alguns estudos já relataram que compostos monoterpenicos bloqueiam os canais
de Na+ dependente de voltagem causando uma estabilização da excitabilidade na
membrana (SOUSA et al., 2006; GONÇALVES et al., 2008), em diferentes testes de
dor orofacial em camundongos. Alves e colaboradores (2010) demonstraram que em
modelos de nocicepção orofacial induzido por algogênios, em camundongos, o α-
bisabolol exibiu atividade antinociceptiva, através diminuição da excitabilidade
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166#
#
provocada pelo bloqueio irreversível de canais de sódio.

Utilizando as técnicas eletrofisiológicas, realizamos, inicialmente, uma curva
dose-resposta com doses gradativas do α-bisabolol (3, 10 e 50µM), no intuito de
determinar o perfil farmacológico desse fármaco em condições fisiológicas e em
condições patológicas. As informações obtidas através dessa curva foram essenciais
para a escolha da dose necessária para alcançar o efeito desejado. Baseada nesse
principio, foi escolhida a menor dose, de 3µM, para dar continuidade aos experimentos,
por ser capaz de produzir resposta semelhante às duas outras concentrações maiores e
diminuindo, assim, as chances de ocorrerem os efeitos tóxicos. Na dose de 3µM, o α-
bisabolol apresenta efeito farmacológico preventivo para a injúria isquémica.
Nesse trabalho, avaliamos a plasticidade de curta duração através da facilitação
de pulso-pareado. Esse método tem como princípio a aplicação de dois pulsos em um
pequeno intervalo de tempo, o que permite à célula pré-sináptica disparar dois
potenciais de ação, simultaneamente. Isso conduz ao aumento na quantidade da
liberação de neurotransmissores na fenda sináptica, devido à chegada de mais Ca2+ na
célula no segundo pulso e ao Ca2+ residual do primeiro pulso. Consequentemente, o
segundo pulso-pareado origina um declive maior no fEPSP em relação ao primeiro
(KRNJEVIC, 2008). O estudo da razão dessa facilitação antes e depois da aplicação de
diferentes concentrações do α-bisabolol nos permite pesquisar a interferência desse
sesquiterpeno na quantidade de neurotransmissores (envolvimento pré-sináptico na
transmissão sináptica) que estão sendo liberados. Não encontramos diferenças
estatísticas na razão do pulso-pareado (PPR) antes e depois do tratamento com o α-
bisabolol. Os nossos resultados demonstraram que o α-bisabolol, nos intervalos de 25 e
50 ms, não interfere na quantidade de neurotransmissores a serem liberados e não
apresenta um efeito pré-sináptico.
O PPF é um bom índice indireto para mensurar a liberação de glutamato, a partir
de terminais pré-sinápticos (DOBRUNZ; STEVENS, 1997). Vários estudos já
mostraram que a isquemia cerebral leve não está associada à alteração na função pré-
sináptica (LI et al., 2013), consequentemente, não altera a liberação do
neurotransmissor na sinapse da colateral de Schaffer, na região CA1 do hipocampo.
Estudos têm relacionado a plasticidade de curta duração (PPF) com a plasticidade de
longa duração (LTP), e observaram que o PPF diminuiu substancialmente após a
aplicação do HFS. O efeito inibitório da estimulação tetânica no PPF parece ser
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167#
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mediado pelo esgotamento na liberação das vesículas sinápticas, contudo, esses

resultados sugerem que existe uma associação entre o conteúdo do neurotransmissor e o
estresse isquémico.
O forscolina, um diterpeno isolado de Plectranthus forskohlii Willd.
(Lamiaceae), apresenta características anti-hipertensivas em modelos animais, além de
ser considerado como um ativador específico da enzima adenilato ciclase. A adenilato
ciclase está presente em eventos celulares mediados por segundos mensageiros, bastante
relevantes em processos envolvidos na transmissão neuronal (MCKEENA, 1996). Esse
diterpeno é empregado experimentalmente como um ativador da adenilato ciclase
provocando aumento na geração de AMPc. De acordo com Wang e Zhuo (2002), a co-
aplicação de forscolina e da serotonina originou na facilitação da resposta sináptica
mediada por receptores NMDA em neurônios sensitivos da medula espinhal.
Após o início da OGD, ocorre grande efluxo de íons K+ no espaço extracelular,
associado com a ativação dos canais de Na+ e de Ca2+, o que desencadeia a
despolarização sustentada das células do hipocampo coincidindo com o aparecimento da
despolarização anóxica. O aumento intracelular de Ca2+ e/ou a ativação maciça do
receptor de glutamato são alguns dos mecanismos que, também, contribuem para a
despolarização anóxica e que cooperam para o dano celular durante a isquemia.
A excitabilidade dos neurônios da região CA1, investigada durante a isquemia,
mostraram uma hiperexcitabilidade transitória continuada por uma sustentada
hiperpolarização, e diminuição substancial em picos espontâneos ou evocados,
confirmando os achados da literatura (KRNJEVIC, 2008). Foi observado, no nosso
trabalho, que nas células piramidais da região CA1 do hipocampo, a hipóxia leva a uma
grande mudança nas respostas eletrofisiológicas, como é reportado na literatura
cientifica (KRNJEVIC, 2008). Estudos já provaram que um insulto de OGD de 7 min
induz o aparecimento de despolarização anóxica seguida de dano sináptico irreversível e
neurodegeneração de neurônios piramidais na área CA1 de ratos (PUGLIESE et al.,
2003, 2006, 2009; COPPI et al., 2007; TRAINI et al., 2011).
Os nossos resultados mostraram que o α-bisabolol, aplicado antes da indução do
protocolo da OGD, protegeu contra a depressão irreversível do fEPSP provocado pela
OGD, em comparação com o grupo controle.
Na literatura, encontra-se um trabalho que mostra o efeito do (-) - a-bisabolol no
musculo liso, e foi observado que em anéis traqueais de camundongos, o (-) - α-
bisabolol agiu inibindo os canais de Ca2+ dependentes de voltagem (SIQUEIRA et al.,
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2012). Leite e colaboradores (2017), mostraram que o óleo essencial da casca da

Vanillosmopsis arborea Baker, que é rica em α-bisabolol, não foi capaz de inibir a
nocepção provocada pelo glutamato, mostrando assim que o α-bisabolol exerce a sua
atividade antinociceptiva independente da via glutamatérgica. Recentemente, utilizando
a técnica de docking molecular, Leite e colaboradores (2018), demostraram uma
possível interação entre o α-bisabolol e os receptores 5-HT3 e M3.
A plasticidade sináptica de longo prazo envolve tanto o fortalecimento quanto o
enfraquecimento das conexões sinápticas associadas a um conjunto surpreendente de
alterações neuroquímicas, como a inserção sináptica e a remoção de vários subtipos de
AMPA, NMDA e metabotrópicos, as mudanças na liberação pré-sináptica de glutamato
e as mudanças estruturais nas espinhas dendríticas.
Neste trabalho, a realização de registros eletrofisiológicos extracelulares em
fatias hipocampais de camundongos tratados com o α-bisabolol, em condições
fisiológicas, não alteraram a potenciação de longa duração (LTP), em condições
fisiológicas. Hughes e Herron (2018), demonstraram que, em situações fisiológicas, o
canabidiol (CBD), um terpenoide e componente não psicoativo da Cannabis sativa, não
alterou a LTP na região CA1 do hipocampo, em camundongos C57BI/6, no entanto, o
pré-tratamento das fatias hipocampais com canabidiol resgatou o déficit mediado pelo
peptídeo beta-amilóide (Aβ) na LTP, sugerindo que o canabidiol pode ter potencial
terapêutico para o tratamento da doença de Alzheimer. Há evidências de que o
canabidiol exerce a sua neuroproteção através da ativação indireta do receptor de
adenosina (A2AR) ocasionando uma regulação negativa da caspase 9 e reversão da
toxicidade induzida pelo glutamato (CASTILLO et al., 2010).
O ácido betulínico, um tripernoide, preveniu contra os défices
neurocomportamentais e deficits na LTP hipocampal, induzidos pelo peptideo beta
amiloide em ratos, por um mecanismo que envolve ativação de CREB-BDNF,
supressão da enzima acetilcolinesterase (AChE), e a desagregação dos pepitideos beta
amiloides (NAVABI et al., 2018)
A metaplasticidade é fundamental para a estabilização da força sináptica e a
prevenção da saturação de LTP ou LTD. Em análises teóricas, Bienenstock et al.,
(1982) descobriram que, para se prevenir LTP descontrolada e LTD de sinapses levando
a maior probabilidade de futura LTP ou LTD até que as forças sinápticas estejam
saturadas, o limite para indução de plasticidade em longo prazo deve ser regulado de tal
forma que uma história anterior de LTP tornaria mais difícil evocar LTP e mais fácil de
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obter LTD, enquanto o inverso ocorreria após a recente LTD de força sináptica
(BIENENSTOCK et al., 1982).
No presente trabalho, os experimentos foram realizados de forma a tentar reuniar
a maior parte de informações possíveis, no que diz respeito ao efeito do α-bisabolol, na
plasticidade sináptica. Portanto, nós tentamos estudar metaplasticidade em fatias de
hipocampo de camundongos, 60 min após a indução da LTP, em situações fisiológicas,
e na presença de um processo isquémico (OGD). Os resultados não mostraram
diferenças significativas na porcentagem da despotenciação, quando comparados com a
linha de base registrada nos últimos 10 minutos da potenciação induzida anteriormente.
MISNER et al., (2001) demostraram que aplicação direta do ácido retinóico
(terpenoide) em fatias hipocampais de animais trangenicos, ocasionou o resgate da
potenciação de longa duração e a depressão de longa duração, mostrando, que os efeitos
negativos da depleção de vitamina A no hipocampo não são permanentes. A literatura
cientifica mostra que o ácido retinóico exerce a sua neuroprotecção, através da indução
da expressão de calbindina, uma proteína tamponante de cálcio encontrada em
neurónios piramidais CA1 do hipocampo (LOWENSTEIN et al., 1991; WANG;
CHRISTAKOS, 1995). Camundongos deficientes de calbindina sofrem perda de LTP
(JOUVENCEAU et al., 1999). O ácido retinóico promove a indução da atividade da
proteína quinase C (PKC) (SLACK; PROULX, 1990), da Ca2+ ATPase de membrana
(DAVIS et al., 1991) e da fosfatase calcineurina (SNODGRASS, 1992). Juntos, esses
exemplos indicam os potenciais mecanismos pelos quais a sinalização retinóide poderia
modular a plasticidade sináptica.
No presente estudo, também foi avaliado se o efeito protetor do α-bisabolol
(após os 7min de OGD) nas fatias hipocampais está relacionada a patologia e
observamos que o α-bisabolol apresenta tanto efeito protetor como preventivo na OGD,
o que não se observou nos grupos que só receberam o veículo (álcool 0,01%). Trinta
minutos após a indução do protocolo da OGD, as fatias que se recuperaram foram
submetidas a uma nova curva I/O, e em seguida foi aplicado o protocolo de plasticidade
de longa duração.
Observamos que a OGD prejudica a LTP dependente dos rNMDA nas regiões
CA1 do hipocampo. No grupo controle foi observada ausência da excitabilidade basal e
ausência da resposta ao HFS. Estudos anteriores, motraram que a MCAO prejudica a
expressão de LTP na região CA1 do hipocampo (LI et al., 2012; NAZARI et al., 2016;
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SOPALA et al., 2000). Além disso, já foi provado que a magnitude da LTP tende a
baixar depois de 4 meses de MCAO pós-permanente (OKADA et al., 1995).
Varios estudos já mostram que a isquemia cerebral focal pode provocar
prejuízos na plasticidade sináptica e na potenciação de longo prazo (LTP) no hipocampo
(HE et al., 2014; NAZARI et al., 2016). Este perfil tem sido observado apenas na zona
de reperfusão isquêmica. Estímulos nocivos, como o glutamato, o óxido nítrico, os
neutrófilos os monócitos, as citocinas e quimiocinas estão entre os fatores responsáveis
pelo aumento da lesão isquêmica (DOYLE et al., 2008).
Portanto, prejuízo na LTP dependente dos rNMDA nas regiões CA1 e os déficits
de memória observados no presente estudo após a OGD indicam que as regiões
cerebrais que não foram acometidas pelo derrame podem sofrer alterações na função
sináptica. A excitabilidade dos neurônios que permanecem fora da zona de infarto tem
sido apontada, atualmente, como um dos maiores desafios e principais temas de debate
relacionados com o derrame cerebral. ZENG e colaboradores (2017) mostraram que
tanto o modelo de pMCAO como o modelo de lesão neuronal induzida pela privação de
oxigênio-glicose (OGD) in vivo e in vitro levam a déficits cognitivos significativos. Um
estudo recente mostrou também que a LTP ipsilateral é prejudicada em jovens, sete dias
após MCAO, devido a alterações nos receptores dos neurotransmissores, como a
disfunção do NMDA-R e do GABA.
Esses resultados são consistentes com os resultados obtidos nos testes
comportamentais de memória, mais precisamente, no teste da esquiva passiva, onde os
animais submetidos ao modelo de pMCAO apresentaram déficits na realização da tarefa
da esquiva passiva, tanto na memória recente como na memória tardia.
A literatura mostra que o prognóstico de crianças sobreviventes de AVC é
geralmente melhor que em adultos. No cérebro adulto, estudos já mostraram
comprometimento persistente da LTP e déficits de memória (ORFILA et al., 2019;
ORFILA et al., 2017).
A indução de LTP faz parte da codificação da memória. Uma das principais
áreas envolvidas nos processos de memória é o hipocampo, com uma rica literatura
demonstrando disfunção do hipocampo após acidente vascular cerebral isquêmico
experimental (ORFILA et al., 2017; SOPALA et al., 2000). A recuperação endôgena da
função do hipocampo é considerada uma etapa essencial após o evento isquêmico.
Vários fatores, incluindo como as enzimas glicolíticas (DIRNAGL; Meisel, 2008), e
BDNF (LARSSON et al., 1999) já foram apontados como os principais responsáveis
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pela recuperação e neuroprotecção endógena. Portanto, estímulos nocivos como a

isquemia levam ao aumento no número de fatores neuroprotetores, a fim de minimizar
as lesões celulares.
Aqui mostramos pela primeira vez que o tratamento com o α-bisabolol em fatias
do hipocampo pode atenuar os efeitos da OGD na plasticidade de longa duração na
região CA1.
Um estudo realizado por Shinozaki e colaboradores (2007), mostraram que o
Ácido retinóico, um ácido pertencente à classe dos terpenos, exibiu um efeito
citoprotetor após a OGD em ratos. Esses resultados foram confirmados através da
imunomarcação para NeuN, um marcador neuronal, onde foi visualizado que as fatias
hipocampais submetidas à OGD e tratadas com o Ácido retinóico tiveram os neurônios
protegidos contra os danos induzidos por OGD nas regiões CA1, CA2, CA3 e DG.
Wang e colaboradores (2006), mostraram que a Huperzina A, um composto
sesquiterpênico, aumentou significativamente os níveis de BDNF, e potencializou a
fosforilação de MAPK/ERK tanto no córtex cerebral como no hipocampo de
camundongos submetidos a isquemia cerebral transitória/reperfusão em comparação
com o grupo controle, mostrando o efeito neuroprotetor desse composto na isquemia
cerebral. LUNARDI e colaboradores (2013), demostraram tambem que a huperzina A,
reduziu significativamente o comprometimento cognitivo, em modelos animais de
demência, por um mecanismo que envolve inibição seleciva da acetilcolinesterase.
Em estudo de Elisabetsky e colaboradores (1995), verificou-se que o linalool,
um monoterpeno presente no óleo volátil de muitas plantas aromáticas, apresentou
capacidade inibitória de ligação de [3H] glutamato e de [3 H] dizocilpina à membranas
do córtex cerebral, o que indica a participação da transmissão glutamatérgica em seu
mecanismo de ação.
O Tripchlorolide, um composto diterpenico, protegeu contra deficits de memoria
espacial e distúrbios na potencialização de longo prazo (LTP), induzidas pelo modelo de
hipoperfusão cerebral crônica (YAO et al., 2019). A hipoperfusão cerebral crônica é um
mecanismo fisiopatológico responsável pelos deficits cognitivo em varios processos
neurodegenerativos. Yao e colaboradores (2019) demostraram que O Tripchlorolide,
melhora plasticidade sináptica, por regular positivamente a expressão de algumas
proteínas sinápticas e aumentar a densidade das espinhas dendríticas. Esses autores
mostraram também que em situações fisiologicas, o tratamento com Tripchlorolide não
alterou a plasticidade neural, não prejudicando e nem melhorando a cognição. Mas, em
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situações patológicas, melhorou significativamente os déficits cognitivos (YAO et al.,

2019). Esses resultados corroboram com os achados do nosso trabalho, onde
observamos que em situações fisiológicas, o α-bisabolol, não alterou a plasticidade de
longa duração (potenciação e despotenciação de longa duração). Na presença da
isquemia cerebral, o sesquiterpeno em estudo, atenuou os efeitos da OGD, na
plasticidade de longa duração.
Durante a isquemia cerebral, as células nervosas sofrem danos irreversíveis
devido à cessação completa da glicose e do fornecimento de oxigênio ao núcleo
isquêmico (GENG et al., 2018; BREKKE et al., 2017; MCKENNA et al., 2015;
FALKOWSKA et al., 2015). Assim, melhorar o metabolismo da glicose e controlar a
apoptose nas células neuronais é de grande importância para a reversão dos danos
causados pela isquemia cerebral (XIE et al., 2018; YU et al., 2018). A mitocôndria
desempenha um papel crucial na indução de apoptose através de vias independentes e
dependentes de caspases (OBRENOVITCH, 2008). Em resposta ao estresse oxidativo
induzido pela isquemia cerebral, a integridade da membrana externa mitocondrial é
perdida, levando à translocação de Bax do citosol para a membrana externa
mitocondrial e a subsequente liberação de citocromo c e outras proteínas pró-
apoptóticas, incluindo o fator indutor de apoptose (FIA) (UREN et al., 2005; XING et
al., 2008). Nesse trabalho, a apoptose, ou o processo de morte celular programada, foi
investigado tanto pela via intrínseca como pela via extrínseca.
A via mitocondrial da apoptose foi avaliada através da avaliação da densidade
relativa do citocromo c, e foi observado um aumento da sua liberação nos animais
submetidos a pMCAO, confirmando os estudos de Cheng e colaboradores (2016) que,
igualmente, mostraram esse aumento na liberação de citocromo c na fase subaguda da
isquemia cerebral em modelo de pMCAO e, em estudo anterior, que o ácido ferúlico
exerce efeitos anti-apoptóticos ao inibir a liberação de citocromo c e a ativação de
caspase-3 na fase subaguda da isquemia cerebral (CHENG et al., 2016). O citocromo c,
após ser liberado, liga-se ao fator de ativação da protease apoptótica-1 (Apaf-1),
estimulando a formação do apoptosoma que, subsequentemente, induz apoptose
dependente das caspases (UREN et al., 2005). Além disso, o FIA mitocondrial é
liberado no citosol e é translocado para o núcleo, onde desencadeia a fragmentação do
DNA em larga escala de maneira independente das caspases (SEVRIOUKOVA, 2011).
Após isquemia cerebral, os membros da família Bcl-2 desempenham o papel crucial de
determinar se os neurônios passarão por sobrevivência ou morte na penumbra isquêmica
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(CHENG et al., 2016). Os membros da família Bcl-2 podem ser classificados nos três
grupos seguintes: proteínas anti-apoptóticas, como Bcl-2 e Bcl-xL, proteínas pró-
apoptóticas, como Bax e Bak e a proteína somente de homologia Bcl-2 (NIIZUMA et
al., 2010; CHENG et al., 2016).
Nesse trabalho, foi demonstrado que o citocromo c liberado no citosol se liga ao
fator ativador da protease apoptótica 1, consequentemente, leva à ativação da caspase-9,
a qual é importante na morte das células neuronais após isquemia (LANA et al., 2014,
2016, 2017a, b; MARTÍNEZ-FÁBREGAS et al., 2014; SUEN et al., 2008). A caspase-
9, por sua vez, é ativada por altos níveis de glutamato, como ocorre durante a isquemia
(LI et al., 2009).
O nosso trabalho demonstrou que o tratamento com o α-Bisabolol em modelos
roedores de isquemia cerebral, reduz a liberação mitocondrial do citocromo c.
NAGOOR e colaboradores (2019) mostraram que o α-bisabolol suprime a ativação da
via mitocondrial da apoptose no miocárdio, através da redução da liberação
mitocondrial do citocromo c. Estudo recente, mostrou que a administração do ácido
ferúlico (FrA) em ratos, 30 min antes da oclusão da artéria cerebral média (MCAO),
seguido por 3 dias após a isquemia exerce efeitos anti-apoptóticos ao inibir liberação de
citocromo c e ativação de caspase-3 na fase subaguda da isquemia cerebral no córtex
penumbral (CHENG et al., 2019).
A HSP70, proteína de choque térmico de 70 kilodaltons, desempenha um papel
importante na neuroproteção contra a apoptose induzida por acidente vascular cerebral
isquêmico transiente (ZHAO et al., 2012; XIA et al., 2017) e permanente (TSUCHIYA
et al., 2003; GAO et al., 2013). A apoptose é considerada um fator essencial para a
exacerbação da isquémia cerebral (TSUCHIYA et al., 2003; BROUGHTON et al.,
2009), enquanto a superexpressão de HSP70 protege contra lesão isquêmica através da
atividade anti-apoptótica na área isquêmica (HISHIYA; TAKAYAMA, 2008; XIA et
al., 2017). A superexpressão de HSP70 está intimamente relacionada com a redução da
apoptose mediada pelo citocromo c durante a fase aguda da MCAO permanente
(TSUCHIYA et al., 2003), enquanto a diminuição da expressão de HSP70 desencadeia
a liberação de citocromo c no citosol e acelera a apoptose dependente de caspases
(SHENG et al., 2011).
Ambas as vias, intrínseca e extrínseca, da apoptose acabam por se fundir na
porção terminal da chamada cascata das caspases. As caspases sinalizam para a
apoptose e clivam esses substratos levando à condensação e fragmentação nuclear,
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externalização de fosfolipídios de membrana que irão sinalizar para estas células serem
fagocitadas por macrófagos (NICHOLSON, 1997; BOATRIGHT, 2003). São
conhecidas 14 caspases humanas, sendo que somente seis, as caspases-3, -6, -7, - 8, -9, -
10, participam da apoptose (BOATRIGHT et. al., 2003). A etapa final da via das
caspases é representada pela ativação da caspase-3, desencadeando a ativação da
proteólise do conteúdo celular, colapso do citoesqueleto (SEBBAGH et al., 2001), e
fragmentação de DNA (WOLF et al., 1999). Portanto, a caspase-3 é considerada um
indicador universal de uma célula apoptótica. Nesse trabalho, a investigação das
caspases, no processo de morte celular programada, realizou-se através da quantificação
da relação entre a caspase-3, caspase-7, caspase-9, total e clivada. A caspase-3 é a
enzima executora mais importante no cérebro, a qual é ativada precocemente após a
isquemia, particularmente em regiões mais próximas a área de infarto (KUNZ et al.,
2010) e observou-se um aumento da atividade desta protease nos animais submetidos a
pMCAO, coincidindo com vários estudos que já haviam demonstrado um aumento de
transcrição das caspases, inclusive a caspase-3, em diferentes modelos de isquemia
(ZHENG et al., 2018).
O α-Bisabolol foi capaz de diminuir a densidade proteica da caspase-3 no
estriado e no hipocampo dos animais, mostrando a atividade anti-apoptótica deste
composto. Recentemente, um estudo mostrou que o pré-tratamento e o co-tratamento
com o α-bisabolol possuem efeitos anti-apoptoticos, através da redução da caspase-3 em
animais submetidos ao infarto do miocárdio (NAGOOR et al., 2019). Segundo Li e
colaboradores (2017), o componente ativo do extrato de Ginkgo biloba, o bilobalide
(um terpenoide) reduz os níveis da caspase-3 em animais submetidos ao modelo de
oclusão da artéria cerebral média (MCAO). Nossos resultados demonstraram que a
oclusão permanente da artéria cerebral média aumenta significativamente a liberação da
caspase-9 no córtex temporal, estriado e hipocampo, corroborando os achados da
literatura (Li et al., 2017).
O tratamento com o α-Bisabolol, foi capaz de reduzir a caspase-9 no córtex e
estriado. A curdiona, que pertence à classe dos terpenos, mostrou efeito neuroprotetor
contra a lesão cerebral induzida pela isquemia/reperfusão cerebral, através da
diminuição das caspase-3 e caspase-9, indicando um efeito anti-apoptótico,
principalmente, devido as suas propriedades antioxidantes e anti-apoptóticas (LI et al.,
2017).
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Deste modo, a diminuição da área de infarto isquémico, observada após o

tratamento com o α-Bisabolol, se deve pelo menos em parte, a sua atividade anti-
apoptótica.
Alterações na função mitocondrial têm sido relatadas em vários distúrbios
neurológicos e neurodegenerativos (LIN; BEAL,2012; MCBRIDE et al., 2006), daí a
importância do estudo da função mitocondrial.
O estudo da respiração mitocondrial em estruturas discretas do cérebro de
roedores como o hipocampo, tem sido dificultado pela impossibilidade de isolar
quantidades adequadas de mitocôndrias para realizar estudos bioenergéticos clássicos. O
uso de preparações de tecidos inteiros acoplados à respirometria de alta resolução
oferece uma ferramenta poderosa para estudar a respiração mitocondrial e fluxos
metabólicos no tecido cerebral, porque apenas uma pequena quantidade de tecido (5-10
mg) é necessária para a realização desse protocolo. Utilizando fatias intactas do
hipocampo em oposição a mitocôndrias isoladas ou neurônios/ astrócitos, a
ciatoarquitetura tecidual, a comunicação intercelular e a conectividade são mantidas.
No presente estudo, a taxa de consumo de oxigênio foi avaliada, utilizando a
técnica da respirometria de alta resolução. A respirometria de alta resolução permite o
registro on-line imediato das taxas de consumo de O2 (HÜTTER et al., 2006) para
preparações de tecido intacto, ou seja, fatias do hipocampo.
No presente trabalho observamos que a hipoxia diminuiu a respiração
mitocondrial, 15 minutos após a OGD. Os nossos resultados mostraram que, nos
primeiros minutos, as fatias submetidas a OGD apresentaram um “Burst na respiração”,
observado através do aumento na taxa de consumo de oxigênio nos primeiros 5 minutos
e, com o passar do tempo, a taxa de consumo foi diminuindo em comparação com o
grupo normoxia.
Varios autores já mostraram que a hipóxia aguda reduz a taxa de consumo de
oxigénio celular, diminuindo a respiração mitocondrial, em diferentes tipos de células.
(HEERLEIN et al., 2005; HOCHACHKA, 1986; STOREY; STOREY, 1990).
Halliwell e Gutteridge (1999), demostraram que períodos de exercício intenso
podem intensificar o estresse oxidativo devido à hipóxia e reoxigenação transitórias, que
ocorrem no músculo exercitado em função das contrações e relaxamentos estabelecidos
ciclicamente. Durante a contração, a compressão vascular estabelece um quadro de
isquemia e, portanto, de hipóxia. No relaxamento, ocorre a reperfusão e,
conseqüentemente, a reoxigenação. Sob condições de hipóxia, os equivalentes reduzidos
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podem se acumular no interior da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial,

originando em um fenômeno conhecido como estresse redutivo (reductive stress). Na
reoxigenação, uma explosão (burst) de reduções monoeletrônicas pode converter o
oxigênio molecular em radicais superóxido.
Em fatias tratadas com o α-bisabolol, não foi observado o “Burst respiratório”;
A respiração foi constante e muito semelhante às fatias normóxicas. Trumbeckaite et al.
(2013) analisaram alterações mitocondriais induzidas pela privação de oxigênio /
glicose (OGD) em homogeneizados de culturas organotípicas de fatias de hipocampo,
utilizando a técnica de respirometria de alta resolução, e observaram que a OGD /
reperfusão acarretou déficits na respiração e o tratamento com o MK 801, um
antagonista do rNMDA, protegeu as mitocôndrias dos danos induzidos por OGD.
Braga e colaboradores (2008) relataram uma Inter-relação entre neutrófilos
polimorfonucleares humanos, espécies reativas de oxigênio e reações inflamatórias.
Esses autores demonstraram que, o bisabolol foi capaz de inibir o Burst respiratório,
durante as explosões respiratórias de Neutrófilos polimorfonucleares humanos
induzidas por estimulantes corpusculares (Candida albicans). Esses achados chamam a
atenção para o possível uso de bisabolol como meio de melhorar a rede antioxidante e
restaurar o equilíbrio redox por antagonizar o estresse oxidativo. No entanto, estudos
mostram que a ativação dos receptores CB1 mitocondriais (mtCB1) reduziria o
consumo de oxigênio (XU et al., 2016) e da capacidade respiratória máxima do sistema
transportador de elétrons (DJEUNGOUE-PETGA; HEBERT- CHATELAIN, 2017)
enquanto a administração de antagonistas como o rimonabanto, aumentaria o consumo
de oxigênio (FLAMMENT et al., 2009).
A isquemia cerebral é responsável pela degeneração dos neurônios hipocampais
através de diversos fatores como excitotoxicidade, estresse oxidativo e citocinas
inflamatórias, especialmente nos neurônios piramidais da região CA1 do hipocampo
(CAI et al., 2011). Sabe-se que a regeneração neuronal, plasticidade sináptica,
neurogênese e sinaptogênese são processos indispensáveis para a recuperação de
déficits cognitivos. Na busca de melhor compreender os mecanismos pelos quais o α-
bisabolol foi capaz de reverter os déficits de memória induzidos pela pMCAO,
realizamos a quantificação da expressão da sinaptofisina e avaliamos o estresse
oxidativo e a neuroinflamação.
A sinaptofisina é uma proteína associada à membrana que pode ser encontrada
em todas as terminações nervosas do sistema nervoso central e periférico. A
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quantificação da sinapsofisina oferece um novo método para monitorar a densidade

sináptica e está relacionada com a plasticidade sináptica. (LAN et al., 2013; NAVONE
et al., 1986). Como um marcador protéico de vesículas sinápticas, a sinapofisina não é
necessária para a entrega do transmissor, mas é indispensável para a plasticidade
sináptica (BECHER et al., 1999) e é uma importante proteína envolvida na
aprendizagem e memória (RUNE; FROTSCHER, 2005; BECHER et al., 1999).
Avaliando a integridade da sinapse neuronal através da quantificação de sinaptofisina,
verificou-se que os animais isquemiados não apresentaram redução da expressão de
sinaptofisina no córtex temporal e no estriado. Outros autores mostraram diminuição da
sinaptofisina em modelo de isquemia focal permanente (FONTELES et al., 2016).
Qian et al., (2015) mostraram que camundongos C57BL/6J machos,
adultos, submetidos à isquemia cerebral por oclusão da artéria cerebral média (MCAO)
exibiram perda axonal e redução da expressão da sinaptofisina na área isquêmica,
avaliadas pelo ensaio histológico. Estudos mostraram que o tratamento com o ácido
maslínico, um triterpeno pentacíclico natural de plantas de Olea europaea, preveniu
significativamente do dano axonal, promoveu a regeneração axonal e aumentou a
sinaptofisina 7 dias após a isquemia. Adicionalmente, o tratamento com ácido
maslínico, um triterpeno derivado do óleo seco de bagaço de azeitona, demonstrou
aumentar a atividade da Akt e promover a fosforilação de GSK-3 em camundongos
submetidos à oclusão permanente da artéria cerebral média. Esses achados sugerem
que o ácido maslínico promove a sinaptogênese e regeneração axonal através da
regulação da via de sinalização de Akt / GSK-3β, que pode fornecer neuroproteção.
Em condições fisiológicas, pequenas quantidades de EROs estão envolvidas na
via fisiológica no cérebro. Existe um equilíbrio entre a produção e a degradação de
EROs que é importante para a homeostase. O excesso de EROs pode ser eliminado
pelos sistemas de defesa antioxidante (sequestradores), que incluem antioxidantes
enzimáticos e não enzimáticos (ou químicos) (OUYANG et al., 2015; CHEN et al.,
2011; CHAN, 2001).
Antioxidantes enzimáticos são proteínas como superóxido dismutase (SODs),
glutationa peroxidase (GPx) e catalases (CATs), enquanto antioxidantes não
enzimáticos incluem glutationa (GSH) e NAD(P)H (OUYANG et al., 2015; KAHLES;
BRANDES, 2012). A isquemia/reperfusão cerebral perturba o equilíbrio entre a
produção e a depleção de EROs pelo aumento da geração de EROs, através do
consumo de captadores de EROs e pela inativação dos sistemas antioxidantes, que
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finalmente levam ao acúmulo excessivo de EROs. O excesso de EROs contribui para

o dano tecidual cerebral, causando disfunção celular e morte celular por meio da
peroxidação lipídica e oxidação de proteínas, DNA e RNA (OUYANG et al., 2015;
CHEN et al., 2011; CHAN, 2001). Assim, a busca de um fármaco que reduza os níveis
de EROs, apresenta benefícios para a terapia do acidente vascular cerebral.
A SOD2 é considerada uma das mais importantes enzimas de defesa contra o
estresse oxidativo. Estudos demonstraram que a SOD2 diminui consideravelmente após
a lesão isquêmica cerebral/ reperfusão (JUNG et al., 2009). Sugawara et al. (2002)
mostraram que o aumento da SOD2 mitocondrial torna os animais menos propensos ao
insulto isquêmico, enquanto que a sua depleção esta relacionada a diversos modelos de
isquemia cerebral. Sun et al. (2017) constataram uma redução rápida da SOD2 após
lesão isquêmica cerebral em camundongos neonatos. Durante a fase isquêmica, ocorre o
desacoplamento da cadeia transportadora de elétrons na mitocôndria e quando ocorre a
reperfusão com consequente retorno da oferta de oxigênio o estresse oxidativo é
intensificado (LIPTON, 1999). No presente trabalho, apesar de não ter sido observado
depleção da SOD2, o tratamento com o α-bisabolol na dose de 200mg/kg aumentou os
níveis dessa enzima, mostrando um efeito aintioxidante.
Recentemente, um estudo demonstrou que o α-bisabolol diminuiu
significativamente déficits locomotores causados pela rotenona devido a sua capacidade
antioxidade, promovento aumento da SOD (LEITE et al., 2018). Rocha e colaboradores
(2011a) constataram que o α-bisabolol apresenta competências de gastroproteção
associadas ao aumento da atividade da SOD. Os efeitos do α-bisabolol sobre os
marcadores normais de estresse oxidativo indicam que ela apresenta uma potente
atividade antioxidante.
Um dos principais elementos celulares acometidos pelo estresse oxidativo é a
membrana celular que sofre um processo de peroxidação. O MDA é um aldeído de
cadeia curta, sendo o principal produto da peroxidação lipídica. Vários pesquisadores
têm apontado os níveis elevados de TBARS após pMCAO como marcadores de estresse
oxidativo (JUNG et al., 2017; SADEGHNIA et al., 2017). Na avaliação dos níveis de
MDA no córtex, estriado e hipocampo, os animais apresentaram um aumento
significativo nas concentrações de MDA nessas áreas. Houve aumento da peroxidação
lipídica e desestabilização da membrana plasmática como consequência da injúria
neuronal causada pela pMCAO, 24h após a cirurgia.
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Recentemente, Sampaio e colaboradores (2019), mostraram que o tratamento

com o α-bisabolol promoveu a diminuição de MDA em animais submetidos ao modelo
de I/R renal, por meio da redução dos níveis de TBARS.
Após a hipóxia, há um rápido aumento nos níveis de cálcio intracelular que
ativa a óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) na presença da proteína quinase
C e quinase dependente de calmodulina (CDK). Essa ativação da nNOS leva à geração
de óxido nítrico (NO). O NO em altas concentrações pode danificar as células neuronais
formando o ânion peroxinitrito, após a combinação com o ânion
superóxido (BHATTACHARYA et al., 2013). Essa molécula é extraordinariamente
tóxica e danifica proteínas, lipídeos de membrana e DNA. De maneira indireta,
podemos quantificar a produção do NO através da dosagem de seu metabólito nitrito. É
possível que a dosagem bioquímica de nitrito/nitrato, pelo método de Griess, não seja
tão sensível para este modelo. Em estudos anteriores (Fernandes et al., 2018)
observamos um aumento da imunorreatividade para iNOS no córtex temporal e no
corpo estriado nos animais submetidos a pMCAO e o tratamento com o alfa-bisabolol
(200mg/kg) preveniu esse aumento.
No presente estudo, a pMCAO não promoveu um aumento de nitrito no córtex
24h após a cirurgia. O estresse oxidativo é melhor observado no modelo de isquemia/
reperfusão devido a um grande aumento na produção de radicais de oxigênio após a
reperfusão, não sendo tão perceptível no modelo de isquemia cerebral focal permanente
utilizado neste trabalho.
Pravalika e colaboradores (2019) observaram o aumento nos níveis de nitrito
24h após a pMCAO. Alguns autores já demostraram que o tratamento com o α-
bisabolol preveniu contra o aumento dos níveis de nitrito em modelo de isquemia
tromboembólica (DOHARE; VARMA; RAY, 2008) e contra o aumento de nitrito e da
expressão de iNOS em modelo de isquemia focal transitória (JIANG et al., 2007; KIM
et al., 2011). Sabe-se que o α-bisabolol é um potente antioxidante. Vinholes et al.
(2013) e Rocha et al. (2011) relataram a sua ação nos modelos de inflamação e de
nocicepção em ratos. Assim, o efeito antioxidante do α-bisabolol pode estar envolvido
no seu efeito neuroprotetor contra o dano neuronal induzido pelo pMCAO, uma vez que
o composto preveniu o tecido cerebral do aumento das EROs. Em 1998, Zasshj realizou
um estudo mostrarando os efeitos do oxido nítrico (NO) na formação da LTP no
hipocampo. Demonstrou que, em situações fisiológicas, o NO participa dos mecanismos
da LTP nas sinapses do hipocampo, e em situações patológicas como após a isquemia
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cerebral transitória, que a deficiência de LTP hipocampal foi precedida por um aumento
na produção de NO no hipocampo. Esses achados sugerem que a produção de NO, em
parte via NO sintase indutível, é responsável pela deficiência de LTP após isquemia
cerebral transitória no hipocampo de ratos (DIAS et al., 2016; ZSSHJ,1998).
A neuroinflamação é uma grande ameaça após acidente vascular cerebral com
opção limitada para intervenção terapêutica (DIRNAGL, 2004). A resposta
neuroinflamatória exacerbada é nociva para os neurônios e pode levar ao agravamento
da patologia do AVC. Estudos recentes têm demostrado que o aumento do estresse
oxidativo, o comprometimento dos sistemas antioxidantes, a superprodução e liberação
de mediadores pró-inflamatórios e aumento da expressão de mieloperoxidase (MPO)
são proeminentes e subsequentes ao acidente vascular cerebral (BHATTACHARYA et
al., 2013; PRAVALIKA et al., 2018). À vista disso, avaliamos a expressão de TNF-α,
IL-1β, NF-κB e a MPO após a isquemia.
A MPO é um importante biomarcador inflamatório associado ao AVC (DHOTE;
BALARAMAN, 2008). O aumento da MPO tem sido relatado em diversas doenças
neurodegenerativas e está associado com o dano celular que pode desencadear o insulto
neuronal (LU et al., 2016; YAP et al., 2007).
Estudos mostram que níveis baixos de MPO ativam alguns processos
relacionados com a neurogênese, tais como: a diferenciação celular, a proliferação, a
migração e sobrevivência de células recém-formadas, indicando uma estreita ligação
entre a neurogênese e a MPO. Kim et al., (2009) relataram que a inibição da MPO
aumentou a sinalização do fator neurotrófico derivado do cérebro, elemento de resposta
ao cAMP (BDNF-CREB), o que indica que níveis aumentados de MPO podem afetar
adversamente as vias de sinalização envolvidas na neurogênese (KIM et al., 2009).
No presente trabalho, a dosagem da MPO foi realizada 24 h após a indução da
pMCAO e foi observado um aumento da sua concentração no córtex temporal dos
animais isquemiados, em comparação com os animais falsos-operados, corroborando os
achados de PRAVALIKA et al. (2019) outro autor que demostrou que a concentração
de MPO permanece aumentada nas regiões corticais até 72 horas após a isquemia.
PRAVALIKA e colaboradores (2018), relataram aumento dos níveis séricos e
plasmáticos de MPO em pacientes com AVC (PRAVALIKA et al., 2018).
No presente estudo, o tratamento com o α-bisabolol não foi capaz de reduzir a
concentração da MPO no córtex cerebral, diferentemente do constatado em nosso
estudo anterior e possivelmente em razão do desenho experimental ser diferenciado nas
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duas pesquisas, onde demostramos que o tratamento preventivo (antes da isquemia)

com o α-bisabolol nas doses de 100 e de 200mg/kg foi capaz de reduzir a concentração
da MPO no córtex cerebral em modelo de pMCAO. Rocha et al. (2011) também
mostraram que o α-bisabolol (100 e 200mg/kg, por via oral) reduz a concentração da
MPO em animais com lesões gástricas induzidas pelo etanol devido a sua potente
atividade antiinflamatória. Fernández et al. (2001) afirmaram que a aplicação tópica de
lupeol, um triterpeno, reduz significativamente a atividade da MPO e estimula a
produção de PGE2 pelos macrófagos. Um estudo recente apontou uma relação entre o
GSH e MPO; Pravalika et al., (2019) demonstraram que a MPO é responsável por gerar
HOCl em locais de lesão e inflamação, o que é ainda associado com uma diminuição na
concentração reduzida de GSH (WINTERBOURN, 1997). Mesmo baixas concentrações
de HOCl podem inativar rapidamente o GPx. Enzimas de eliminação
de H 2O 2 como catalase ou GPx com GSH pode impedir a produção de HOCl
(ARUOMA; HALLIWELL, 2019).
O NF-κB é um fator de transcrição que desempenha um papel fundamental na
regulação das respostas imune e inflamatória, aumentando o nível de citocinas,
quimiocinas, fatores de crescimento e moléculas de adesão celular (CHEN et al., 1999),
incluindo IL-1β, IL-6 e TNF-α. A região promotora do iNOS e da COX-2 contém um
sítio de ligação do NF-κB e a ativação de NF-κB leva à regulação transcricional da
expressão desses genes pró-inflamatórios (XIE et al., 1994). A proteína ativadora do
fator de transcrição-1 (AP-1) também é ativada por esses estímulos, que também são
conhecidos por estarem envolvidos na regulação transcricional da resposta inflamatória
(ZENZ et al., 2008). A inibição da ativação do NF-κB envolve a supressão das
proteínas inibitórias IκB mais abundantes, fosforilação IkBα (inibição da quinase IKK)
que induzem a sua degradação e NF-kB pode translocar para o núcleo para ativar a
expressão gênica (WAN; LENARDO, 2010). Alguns autores já mostraram que a
pMCAO induz a um aumento significativo da expressão de NF-kB. Um estudo anterior
indicou que as respostas pró-inflamatórias exacerbam a lesão cerebral de I/R,
especialmente no estágio inicial dessa condição (TANG et al., 2014; ZHANG et al.,
2013).
Os nossos resultados mostraram um aumento da expressão do NF-κB, 96 horas
após a pMCAO, tanto no núcleo como no citoplasma. Reforçando os nossos resultados
Zhang et al. (2019) demonstraram um aumento da expressão de NF-κB no córtex dos
animais 24 horas após a pMCAO. Um estudo anterior indicou que as respostas pró-
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inflamatórias exacerbam a lesão cerebral de I/R, especialmente no estágio inicial dessa

condição (ZHANG et al., 2013). O sesquiterpeno, β-patchoulene (β-PAE) exibe
habilidades antiinflamatórias bem estabelecidas e é amplamente utilizado no tratamento
de numerosas doenças inflamatórias (WU et al., 2018; CHEN et al., 2017). Segundo
Chen e colaboradores (2017), o aumento da secreção de TNF-α, IL-6 e IL-1β induzida
por LPS foi acentuadamente suprimido pelo pré-tratamento com β-PAE e esse efeito
pode estar associado à inativação da NF-α, via de sinalização κB no lavado
broncoalveolar. Além disso, no edema de pata induzido por carragenina, o pré-
tratamento com β-PAE inibiu a liberação de TNF-α, IL-1β, IL-6, prostaglandina E2 e
óxido nítrico de maneira dose-dependente (ZHANG et al., 2016). A superexpressão de
TNF-α, IL-6 e IL-1β foi significativamente suprimida pela β-PAE através da inativação
da via de sinalização do NF-κB em lesão gástrica induzida por etanol em modelo in vivo
(LIU et al., 2017).
KIM et al. (2011) demostraram que o α-bisabolol exerce a sua atividade anti-
inflamatória especificamente através da regulação negativa da expressão de mediadores
pró-inflamatórios como iNOS e COX-2, via inibição da sinalização de AP-1 e NF-κB.
Guesmi e colaboradores (2017) realizaram um estudo com o Teucrium
alopecurus, uma planta endêmica limitada ao sul da Tunísia. Entre vários outros
sesquiterpenos, a Teucrium (TA-1) apresenta na sua composição o α-bisabolol. Nesse
estudo, Guesmi e colaboradores mostraram que a TA-1 inibiu a ativação do NF-κB
através da inibição da fosforilação das proteínas IκB, impedindo a sua translocação
nuclear, para expressão gênica (GUESMI et al., 2017).
No presente trabalho, 96h após a pMCAO, ocorreu um aumento significativo
dos níveis de IL-1β e do TNF-α no córtex, estriado e nas regiões CA1, CA3 e GD do
hipocampo.
Mangin et al. (2019) demonstraram que ratos diabéticos submetidos à oclusão
permanente da artéria cerebral média apresentavam aumento da expressão da IL-1β ao
longo de 24horas, em diversas regiões hipocampais. O aumento dos níveis de IL-1β
cerebral foi associado com prejuízo na LTP hipocampal em modelo de isquemia global
e focal (MANGIN et al., 2019: YOSHIKA et al., 1999; TOGASHI et al., 2001) e de
inflamação por LPS (TANAKA et al., 2011). No presente trabalho, a pMCAO
aumentou a IL-1β, e o tratamento com o α-bisabolol diminuiu os níveis dessa citocina.
Os resultados deste estudo mostraram que os efeitos imunomoduladores e
antiinflamatórios induzidos pelo α-bisabolol foram consistentes com outros relatos que
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demonstraram a capacidade do α-bisabolol inibir a liberação de citocinas pró-

inflamatórias induzidas pelo LPS em camundongos e células dendríticas humanas
(MATTSON; MEFFERT, 2006; OAKLEY et al., 2003), confirmando os nossos
resultados.
Cheng et al. (2019) demostraram que o α-bisabolol promove efeito anti-
inflamatório no miométrio de mulheres gravidas e esse efeito foi associado à inibição da
produção de TNF-α e IL-1β e ao aumento da citocina inflamatória IL-10. O exato
mecanismo de ação do α-bisabolol responsável por inibir a produção de TNFα e IL-1β
ainda não está completamente esclarecido (OAKLEY et al., 2003).
Após o AVC isquêmico, a ativação exacerbada da microglia pode agravar o
dano tecidual e a morte neuronal (LEE et al., 2014; MICHELL,ROBINSON et al.,
2015) produzindo citocinas inflamatórias excessivas, quimiocinas e oxigênio /
nitrogênio, radicais livres, como NO, TNF-α, IL-1β, IL-6 e espécies reativas de
oxigênio (ROS). (SPENCER et al., 2016; KRAFT; HARRY, 2011). Lambertsen e
colaboradores (2005) provaram que os macrófagos da microglia, especialmente a
microglia ativada, eram a fonte predominante de TNF-α após indução de pMCAO.
Rocha et al. (2011) demostraram que o α-bisabolol preveniu contra o aumento dos
níveis do TNF-α no fluido peritoneal de ratos com peritonite induzida por carragenina,
demostrando assim, possuir propriedade antiinflamatoria. As células que expressavam
IL,1β apresentavam características morfológicas de microglia e macrófagos no modelo
pMCAO (DAVIES et al., 1999). Além disso, em ratos submetidos a pMCAO, a
microglia ativada era considerada uma fonte importante de IL-6 (SUZUKI et al., 1999).
Em conjunto, a regulação da atividade da microglia pode ser útil para a recuperação do
AVC isquêmico.
Alguns relatos mostraram que o α-bisabolol não é tóxico tanto em modelos
animais como em ensaios clínicos dermatológicos (SHIN et al., 2014; YUAN et al.,
2015). Assim sendo, a diminuição de vários marcadores inflamatórios, nesse trabalho,
podemos sugerir que o α-bisabolol apresenta um efeito anti-inflamatório significativo
diante de eventos cerebrais isquêmicos.
Neste trabalho, foi demonstrado que camundongos submetidos à isquemia focal
permanente (pMCAO) apresentaram déficits na função neurológica e déficits na
memória, provavelmente, devido a lesões no hipocampo, estriado e córtex, provocados
pelo modelo. Os nossos resultados em conjunto demonstram a capacidade
neuroprotetora e de neuroresgate do α-bisabolol frente a isquemia cerebral focal
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permanente, visto que sua administração foi realizada com uma janela de 3 h após a
indução de pMCAO. O tratamento com o do α-bisabolol reduziu a lesão neuronal, e
protegeu contra alterações comportamentais, cognitivas e sensoriais. Também foi
investigado o mecanismo neuroprotetor do α-bisabolol e observou-se atividade
sinaptogênica, anti-apoptótica, antioxidante e antinflamatória, o que se pode inferir que
o efeito neuroprotetor dá-se, por meio destes mecanismos.
Este estudo é o primeiro que evidencia o efeito neuroprotetor do α-bisabolol em
modelos in vitro de AVC. Utilizando técnicas eletrofisiológicas, em fatias hipocampais,
observamos que em situações fisiológicas, o tratamento com o α-bisabolol não alterou a
plasticidade sináptica de curta e de longa duração. E, em situações patológicas (OGD
7min), o tratamento com o α-bisabolol demostrou efeitos preventivos e terapêuticos
contra a depressão irreversível do fEPSP, em comparação com o grupo controle, e
preveniu contra os prejuízos na plasticidade sináptica de longa duração (LTP e
despotenciação) provocados pela OGD.
Com estes resultados, pode-se concluir que este composto tem o potencial de ser
uma nova terapia adjuvante para o AVC, visto que é capaz de atuar em mais de um fato
envolvido na fisiopatologia da isquemia cerebral. É uma substância que pode ser testada
em humanos, pois possui baixa toxicidade e é amplamente encontrada em vegetais.
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Figura 104: Modelo hipotético proposto para sítio de ação do α-bisabolol no modelo de
isquemia cerebral focal permanente.
A isquemia cerebral promove o aumenta dos níveis intracelulares de Ca2+, que consequentemente,
aumenta a expressão de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α e IL-1β, produção de espécies reativas
de oxigénio, e levam a morte celular. O α-bisabolol inibe a expressão de TNF-α, IL-1β, a densidade da
proteina NF-Κb; aumenta os níveis de SOD-2, reduz a peroxidação lipídica; reduz o Citocromo C e as
Caspases, diminuindo, desta forma, a neuroinflamação, o estresse oxidativo e a apoptose.
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Tabela 5: Resumo dos efeitos do α-bisabolol nos diferentes testes realizados nesse
estudo.
Testes Comportamento Cortex Estriado Hipocampo

Avaliação Neurológica M
TTC M
Campo aberto M
Y-maze M
Esquiva passiva M
Rotarod NA
MPO NA NA NA
TNF-α
IL-1β NA
NF-Kb (citoplasma) NA NA
NF-Kb (núcleo) NA NA
SOD-2 NA NA
Nitrito/Nitrato NA NA NA
TBARS
Citocromo c NA NA NA
Pró-Caspase 3
NA
Caspase 3 clivada NA NA NA
Caspase 3 clivada/ Pró- NA
Caspase 3
Pró-Caspase 9 NA NA
Caspase 9 clivada NA NA NA
Caspase 9 clivada/ Pró-
Caspase
PARP total NA NA NA
Parp clivada NA NA NA
Sinaptofisina NA NA NA
Plasticidade sináptica basal NA NA NA
Pasticidade sináptica de NA NA NA
curta duração
Plasticidade sináptica de NA NA NA
longa duração
Plasticidade sináptica basal
(OGD)
Plasticidade sináptica de
longa duração (OGD)
Oroboros
a
Abreviaturas: M, Melhorou; NA, Não tem ação; , Aumentou; , Diminuiu.
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CONCLUSÃO
O α-bisabolol diminuiu os déficits sensórios-motores e de memória, a área de

infarto isquêmico ocasionado pela pMCAO.
O α-bisabolol diminuiu a área de infarto isquêmico ocasionado pela pMCAO.
O mecanismo de neuroproteção do α-bisabolol está relacionado em parte com
sua: ação anti-inflamatória, sendo evidenciada pela diminuição das citocinas TNF-α, IL-
1β, e da densidade relativa do NF-κB; antiapoptotica, pela redução da densidade relativa
das caspases e do citocromo c; e antioxidante pelo aumento da densidade relativa da
SOD2.
Não foi evidenciada uma alteração da densidade relativa da sinaptofisina, e na
dosagem bioquímica de Nitrito. O α-bisabolol diminuiu os níveis de TBARS nos
animais submetidos a pMCAO.
Em modelo de insquemia in vitro, o α-bisabolol protegeu contra depressão
irreversível do fEPSP e contra os deficits na plasticidade de longa duração.
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2019 Tese Mysdfernandes

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

MARA YONE SOARES DIAS FERNANDES

α-BISABOLOL PROTEGE DA LESÃO CEREBRAL ISQUÊMICA, POR UM

α-BISABOLOL PROTEGE DA LESÃO CEREBRAL ISQUÊMICA, POR UM

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Orientador: Prof. Dr. Geanne Matos de

α-BISABOLOL PROTEGE DA LESÃO CEREBRAL ISQUÊMICA, POR UM

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Aprovada em: 30/08/2019.

Agradeço primeiramente a Deus, por ter abençoado a minha trajetória. A fé que

À minha orientadora, Professora Geanne Matos de Andrade, por ter me aceitado

A todos os meus colegas do Laboratório de Neurociência e Comportamento,

Ao Adriano, pelo carinho, e pelo empenho e dedicação em ajudar na execução

A Universidade Federal do Ceará, pela oportunidade dе fazer о curso. Pelo sеu

Ao Professor Doutor Ângelo Tomé, por se mostrar sempre disponível em ajudar

Ao Henrique Silva, por me ter ensinado as bases dos registros eletrofisiológicos

A Marlene Pereira, agradeço de coração pela amizade, pelos ensinamentos, e

A todos os meus colegas no grupo das Purinas do CNC, nomeadamente, Ana

A Doutora Ana Ledo do laboratório de Biologia Redox do CNC, por suas

Agradeço também ao Órgão Financiador FUNCAP, a CAPES pelas bolsas

α-BISABOLOL PROTEGE DA LESÃO CEREBRAL ISQUÊMICA, POR UM

Palavras-chave: Isquemia Cerebral; α-Bisabolol; Estresse Oxidativo;

α-BISABOLOL PROTECTS FROM ISCHEMICAL BRAIN INJURY BY A

The pathophysiology of stroke involves the reduction blood supply, a condition of

Keywords: Cerebral ischemia; α-Bisabolol; Oxidative stress; Neuroinflammation; LTP.

Figura 3: Esquema demonstrativo das artérias cerebrais anteriores e posteriores, 36

Figura 5: Mecanismos potenciais de dano neuronal após isquemia..................... 42

Figura 6: Resumo geral dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos na 47

Figura 17: Aparelho de Rotarod............................................................................ 74

Figura 20: O α-bisabolol melhora os déficits sensório-motores em camundongos 82

Figura 29: A pMCAO não modifica a densidade proteica relativa da Caspase 3 92

Figura 30: O α-bisabolol reduziu a relação entre a densidade proteica relativa da 94

Figura 31: O α-bisabolol aumenta a densidade relativa da Pró-Caspase 9 no 95

Figura 32: A pMCAO não modifica a densidade proteica relativa da Caspase 9 96

Figura 33: O α-bisabolol reduz a relação entre a densidade proteica relativa da 98

Figura 37: A pMCAO modifica a densidade proteica relativa de NF-кB 104

Figura 40: Fotomicrografia representativa da imunomarção para TNF-α em 109

Figura 42: Fotomicrografia representativa da imunomarção para TNF-α em 111

Figura 43: O α-bisabolol diminui a densidade relativa de TNF-α no hipocampo 112

Figura 44: Fotomicrografia representativa da imunomarção para IL-1β no córtex 113

Figura 46: Fotomicrografia representativa da imunomarção para de IL-1β no 115

Figura 47: O α-bisabolol diminui a densidade relativa de IL-1β no hipocampo 116

Figura 48: O α-bisabolol aumenta a densidade proteica relativa da SOD-2 no 118

Figura 49: A pMCAO não modifica os níveis de nitrito/nitrato (NO2/NO3) no 120

Figura 50: A pMCAO modifica os níveis de peroxidação lipídica (TBARS) no 122

Figura 51: A pMCAO não modifica a densidade proteica relativa da 124

Figura 52: Esquema de amostragem de um hipocampo de roedores ilustrado no 130

Figura 53: Diagrama mostrando como os registros eletrofisiológicos foram 131

Figura 54: Desenho experimental utilizado em registros eletrofisiológicos 134

Figura 57: O α-bisabolol não altera a plasticidade sináptica de curta 141

Figura 58: O α-bisabolol protege contra a depressão irreversível da 143

Figura 59: O α-bisabolol não altera a neurotransmissão basal em fatias 145

Figura 60: O α-bisabolol não altera a transmissão sináptica basal.......................... 146

Figura 62: O α-bisabolol 3µM não aumenta a amplitude da LTP........................... 150

Figura 63: O α-bisabolol 3µM não altera a amplitude da Despotenciação............. 151

Figura 64: O α-bisabolol protege contra a depressão irreversível da 153

Figura 66: O α-bisabolol aumenta a amplitude da LTP.......................................... 156

Figura 67: O α-bisabolol 3µM aumenta a amplitude da Despotenciação............... 157

Tabela 1: Resumo dos sintomas e respetivos prognósticos associados a um 32

Tabela 2: Resumo de alguns compostos que falharam na avaliação clínica para 34

Tabela 3: Grupos de tratamento............................................................................ 69

Tabela4: Avaliação neurológica........................................................................... 71

ACM Artéria cerebral média