Osteoclastogenese

.
BRUNA AGUIAR DO AMARAL BEZERRA
IMUNOEXPRESSO DE FATORES
REGULADORES DA OSTEOCLASTOGNESE
NA DOENA PERIODONTAL EM HUMANOS
E SUA RELAO COM OS PARMETROS
CLNICOS
Natal - RN
2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CINCIAS DA SADE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM PATOLOGIA ORAL
IMUNOEXPRESSO DE FATORES
REGULADORES DA OSTEOCLASTOGNESE
NA DOENA PERIODONTAL EM HUMANOS
E SUA RELAO COM OS PARMETROS
CLNICOS
Tese apresentada ao Programa de Psgraduao

em
Patologia
Oral
da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte como parte dos requisitos para
obteno do ttulo de Doutora em Patologia
Oral
Doutoranda: Bruna Aguiar do Amaral Bezerra

Orientador: Prof. Dr. Antnio de Lisboa Lopes Costa
Natal - RN
2011
DEDICATRIAS
A Deus, que sem a Sua presena em minha vida, nada seria to suave como tem sido e eu no
seria uma pessoa to feliz como sou. Obrigada meu Deus por tudo que acontece na minha
vida e por ser to maravilhoso comigo. Estou aqui graas a F que tenho em Ti.
Aos meus queridos pais, Jos Ivo e Teresa, exemplos de pessoas humanas, pelos
ensinamentos que me passaram da vida, pelos valores que me ensinaram a cultivar, pelo
caminho que me orientaram a seguir, por estarem sempre ao meu lado para o que der e vier
e simplesmente pelo amor incondicional que sempre me dedicaram. No sei como agradecer
pela famlia maravilhosa que vocs me proporcionaram. Vocs so tudo para mim!!! Como
grande o meu amor por vocs!!!
Ao meu marido, Diogo, que est ao meu lado desde a graduao e acompanhou toda minha
trajetria acadmica sempre me apoiando, me animando, me dando fora e entendendo os
momentos de renncias pela cincia. Obrigada meu amor pela sua cumplicidade, por ser to
compreensivo, me ajudar sempre que preciso e me fazer to feliz!
Amo-te muito!!!
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
As minhas amadas e lindas irms, Cris e Bia, tambm minhas colegas de profisso,
pela amizade, companheirismo e desabafos. Por estarem ao meu lado em todos os momentos.
Vocs so flores que fazem minha vida mais feliz. Amo muito!!!
A minha querida sogra, Cres, obrigada pelo incentivo, apoio, compreenso e
carinho que sempre me dedicou. Uma grande amiga que Diogo me deu.
Ao Meu querido orientador e eterno professor, Dr. Antnio de Lisboa Lopes Costa,
por todo o apoio que tem me dado desde o incio da minha graduao e pelo incentivo no
meu ingresso no Programa de Ps-graduao em Patologia Oral. Obrigada por ter
acreditado e confiado em mim durante todo meu trajeto na Faculdade de Odontologia. Por
ser uma pessoa to amiga, compreensiva e humana. Meu agradecimento especial!
A Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte pelo
incentivo e por todas as oportunidades recebidas durante minha vida acadmica e pela
oportunidade de realizar mais uma ps-graduao nesta querida Instituio.
Aos professores do Programa de Ps-graduao em Patologia Oral, Dra. Roseana,
Dra. Llia Batista, Dra. Llia Maria, Dr. Leo, Dr. Hbel, Dra. Marica, Dra. ricka, Dra
Ana Miryam e Dr. Manuel, por toda contribuio, pela disponibilidade, pelos
conhecimentos transmitidos, pelo apoio e incentivo na busca da cincia e principalmente pela
amizade.
Ao professor Dr. Kenio, pela imensa ajuda, compromisso, presteza e competncia na
anlise estatstica dessa pesquisa. E por todos os ensinamentos que me foram transmitidos
desde a graduao, em especial no Mestrado.
Aos colegas e amigos que fiz ao longo desses quatro anos de doutorado:
Meus colegas de turma, em especial a Bruna Rafaela, com a qual convivo
desde a graduao (minha dupla na clnica), passando pelo mestrado e agora no doutorado,
amizade que se solidifica a cada dia, obrigada por tudo! Alexandre, que conheo desde
pequena, tambm fez mestrado na minha turma, uma pessoa maravilhosa e muito prestativa,
obrigada; Valria, a qual conheci s quando ingressei no doutorado, uma doura de pessoa,
extremamente competente e sempre disponvel; Cassiano, exemplo de seriedade e dedicao,
com quem pude aprender muitos ensinamentos. A todos vocs meu muito obrigada, porque
vocs contriburam diretamente nessa nossa jornada!
Os primeiros doutores: Karuza (obrigada por tudo irmzinha), Cristina,

Polliana, e George, obrigada pela ajuda que prestaram quando ingressei no doutorado,
sempre esclarecendo dvidas na histopatologia. Carinho que irei guardar para sempre.
A turma de Bethnia (amiga que ganhei), Ruth (minha querida amiga),
Dbora (pena que agora longe), Marcelo (desde a graduao) e Pedro Paulo (sempre
solcito). Obrigada a todos vocs pela amizade! Cada um do seu jeito de ser, contribuiu
enormemente para a minha trajetria no doutorado. Alegrando a sala de microscopia com
conversas e momentos de descontrao bem como, pelos conhecimentos compartilhados e
pela presteza em ajudar.
Aos colegas que convivi ao ingressarem no mestrado: Emeline, Maiara,
Marianne, Felipe, Cyntia, Joabe e Thas. Obrigada a todos pela convivncia prazerosa,
pelos ensinamentos compartilhados e pelos momentos de descontrao. Em especial a
Emeline que contribuiu enormemente para essa pesquisa.
A turma mais nova do doutorado, Ana Rafaela, Alessandra, guida e
Adriana, que s fizeram somar no ambiente histopatolgico, agregando conhecimento,
alegria e amizade.
Aos funcionrios da Patologia Oral, Hvio (enorme colaborador dessa pesquisa,
principalmente no desenvolvimento da tcnica de imuno-histoqumica), Sandrinha (que
ajudou muito em toda parte laboratorial da pesquisa, sempre com seu jeitinho alegre de ser),
Canind (que com seu jeito brincalho de me aperrear, tambm contribuiu bastante para
esse trabalho), Gracinha (que com sua simpatia esteve sempre disponvel), Lourdinha (com
seu humor, alegrando nossos intervalos com um cafezinho), Idelzute (pela solicitude) e
Ricardo (que chegou mais recentemente, mas tambm sempre esteve disposto a ajudar).
Obrigada a todos vocs pelos momentos vividos e pelas gentilezas!
Aos funcionrios da Biblioteca, em especial a Ceclia e Ocean, que sempre me
atenderam prontamente e contriburam muito em toda minha jornada desde a graduao.
Aos professores de Periodontia, Dr. Seabra, que contribuiu enormemente para minha
formao, desde minha graduao at o mestrado; Dra. Delane que me recebeu com muito
carinho na disciplina de Periodontia (como professora substituta), sempre transmitindo
conhecimento; Bruno e Euler, os quais pude conviver mais recentemente na disciplina,
agradeo a vocs pelo entendimento e por terem me ajudado sempre que estava com
problemas de horrios. Pelos conhecimentos compartilhados e pela experincia que

transmitem. Muito obrigada!
Ao meu tio Jnior (Nazareno), tambm professor de Periodontia, por todo apoio e
incentivo desde a minha graduao,sempre me ajudando com materiais cientficos e
esclarecendo dvidas. Obrigada pela ateno e carinho que sempre me dedicou!
Aos professores doutores da Clnica Integrada Nvel II e Nvel III da UFRN, Suhem,
Cristina, Alex, Isana, Joo Paulo, Sally Isauremi, Bethnia e Rejane, pelos momentos de
agradvel convivncia na clnica C desde novembro de 2009, pelos ensinamentos e pelo
incentivo que sempre me demonstraram na concluso da minha tese.
A Andria, ricka e Marcilene, funcionrias da Clnica C por toda a ajuda que
sempre deram e pelo compromisso com o trabalho.
As funcionrias D. Ftima (minha Fatinha) e Incia, da disciplina de Traumatologia,
com as quais convivo desde menina, obrigada por toda ateno, carinho e solicitude que
sempre me dedicaram. Vocs so especiais!
A Adriane Galvo de Souza (querida Dri), atendente do meu consultrio, pela
dedicao, profissionalismo e amizade.
A todos os colegas do CEO de Macaba, os quais sempre me incentivaram no
transcorrer do meu doutorado, e com os quais vivi momentos maravilhosos, em especial a
ngela que nunca mediu esforos para resolver meus problemas com relao ao doutorado.
A prefeita de Macaba, Marlia Dias, que me acolheu e confiou no meu trabalho
deixando que eu permanecesse no CEO mesmo com tempo comprometido pelo doutorado.
Aos mais recentes colegas da Aeronutica, em especial a minhas amigas Ruth, Ksia
e Ldia e a nossa chefe Cap Regina em nome da qual agradeo a todos que fazem parte da
odontologia da BANT que acompanharam e contriburam para a fase final do meu
doutorado.
As minhas colegas e eternas amigas Tatiana, Camila e Indianara que no convvio
depois de formadas me deram fora e me ajudaram nos momentos que precisei durante todo
o perodo da ps-graduao. Amizade que iniciou na graduao, sempre com muita
cumplicidade e que se fortalece a cada dia. Amo vocs amigas!
A todos os meus amigos que me que me proporcionam momentos de alegria e

descontrao, pelas farras e festas. Afinal momentos de laser so essenciais para uma vida
saudvel e estmulos para continuar na jornada profissional.
A toda minha famlia pelo apoio e vibrao positiva que me dedicaram durante toda
minha caminhada.
E a todos que no citei o nome, mas sei que foram importantes para a conquista do
meu doutorado.
10
RESUMO
11
RESUMO
A doena periodontal uma infeco oral iniciada por periodontopatgenos que
desencadeiam a resposta imune culminando com a destruio tecidual. Essa destruio
mediada pelo hospedeiro atravs da induo da produo e ativao de enzimas lticas,
citocinas e da estimulao da osteoclastognese. O objetivo deste estudo foi comparar a
expresso imuno-histoqumica dos fatores envolvidos na reabsoro ssea, RANKL (Ligante
do Receptor Ativador do Fator Nuclear kappa B), OPG (Osteoprotegerina) e TNF- (Fator de
Necrose Tumoral Alfa) entre a gengiva clinicamente saudvel, a gengivite e a periodontite
crnica, correlacionando-os com os parmetros clnicos periodontais. A amostra consistiu de
83 casos, sendo 12 de gengivas clinicamente saudveis, 42 de gengivite e 29 de periodontite,
oriundos de 74 pacientes adolescentes e adultos com idade mdia de 35 anos, sem alteraes
sistmicas e no fumantes, predominantemente do sexo feminino e da raa parda. No houve
diferena estatisticamente significativa para expresso do anticorpo anti-RANKL (p=0,581) e
da razo RANKL/OPG (p=0,334) quando se comparou as trs condies clnicas, mas o antiOPG e anti-TNF- mostraram diferenas estatisticamente significativas entre os tipos de leso
(p=0,001 e p<0,001, respectivamente), revelando maior imunoexpresso na periodontite. Nos
casos de periodontite, a varivel perda de insero clnica (PIC) mostrou diferena
estatisticamente significativa e correlao positiva, respectivamente, com a imunomarcao
dos anticorpos anti-RANKL (p=0,002; p=0,001 e r=0,642), anti-OPG (p=0,018; p=0,014 e
r=0,451), anti-TNF- (p=0,032; p=0,014 e r=0,453) e com a razo percentual de
RANKL/OPG (p=0,018; p=0,002 e r=0,544). A mobilidade dentria (MB) apresentou
diferena estatisticamente significativa somente com a imunoexpresso do anti-RANKL
(p=0,026), e a profundidade de sondagem (PS) apresentou correlao positiva com o antiRANKL (p=0,028 e r=0,409), ambos nos casos de periodontite. Somente nos casos de
gengivite o TNF- apresentou correlao positiva com o RANKL (p=0,012 e r=0,384) e com
a razo RANKL/OPG (p=0,027 e r=0,341). Diante desses resultados, conclui-se que a maior
imunoexpresso do TNF- na periodontite demonstra uma relao com a progresso e
severidade da doena periodontal e a correlao entre todos os anticorpos e a perda de
insero clnica demonstra o envolvimento destes na reabsoro ssea periodontal.
Palavras-chave: Reabsoro ssea, RANKL, OPG, TNF-, periodontite, doena periodontal,

citocinas, imuno-histoqumica.
12
ABSTRACT
13
ABSTRACT
Periodontal disease is an infection initiated by oral periodontal pathogens that trigger
an immune response culminating in tissue destruction. This destruction is mediated by the
host by inducing the production and activation of lytic enzymes, cytokines and the stimulation
of osteoclastogenesis. The aim of this study was to compare the immunohistochemical
expression of factors involved in bone resorption, RANKL (Ligand Receptor Activator of
Nuclear Factor kappa B), OPG (Osteoprotegerin) and TNF- (tumor necrosis factor alpha)
between the gingival healthy, gingivitis and chronic periodontitis and correlate them with
clinical parameters. The sample consisted of 83 cases and 12 clinically healthy gums, 42
gingivitis and 29 periodontitis, from 74 adolescent and adult patients with a mean age of 35
years, without systemic changes and non-smokers, predominantly female and race brown.
There was no statistically significant difference for the expression of anti-RANKL (p = 0.581)
and RANKL / OPG ratio (p = 0.334) when comparing the three conditions, but the anti-OPG
and anti-TNF- showed statistically significant between the types of injury (p = 0.001 and p
<0.001, respectively), showing greatest expression in periodontitis. In cases of periodontitis,
the variable clinical attachment loss (PIC) was statistically significant and positive
correlation, respectively, with immunostaining of anti-RANKL (p = 0.002, p = 0.001 and r =
0.642), anti-OPG (p = 0.018, p = 0.014 and r = 0.451), anti-TNF- (p = 0.032, p = 0.014 and r
= 0.453) and the percentage ratio of RANKL / OPG (p = 0.018, p = 0.002 and r = 0.544). The
tooth
mobility
(MB)
showed
statistically
significant
difference
only
with
immunohistochemical anti-RANKL (p = 0.026), and probing depth (PD) was positively

correlated with anti-RANKL (p = 0.028 and r = 0.409), both in cases of periodontitis. Only in
cases of gingivitis TNF- was positively correlated with RANKL (p = 0.012 and r = 0.384)
and the RANKL / OPG ratio (p = 0.027 and r = 0.341). Given these results, we conclude that
the greatest expression of TNF- in periodontitis demonstrates a relationship with the
progression and severity of periodontal disease and the correlation between all antibodies and
clinical attachment loss demonstrates their involvement in periodontal bone resorption.
Key words: Bone resorption, RANKL, OPG, TNF-, periodontites, periodontal diseases,
cytokines, immunohistochemical.
14
LISTA DE ILUSTRAES
15
LISTA DE ILUSTRAES
Pgina
Figura 1.
Mecanismo de ao do RANKL expresso por vrios tipos

celulares e a induo da osteoclastognese atravs da sua ligao
com o RANK nos precursores osteoclsticos..................................
Figura 2.
34
Abundncia de OPG em relao ao RANKL, inibindo a ligao

do
RANKL
ao
RANK,
resultando
em
reduo
da
osteoclastognese e promoo da apoptose de osteoclastos

existentes..........................................................................................
Figura 3.
35
Perda ssea induzida em periodontite mostrando a ao da

resposta Th1, Th17, IL-17, PGE2, TNF-, RANKL, OPG e
receptores toll like (TLR).............................................................
Figura 4.
36
Estimulao e inibio da formao osteoclstica e reabsoro

ssea envolvendo interao entre citocinas inflamatrias e outros
mediadores agindo no eixo RANK/RANKL /OPG.........................
Figura 5.
Condio clnica e intensidade do infiltrado inflamatrio. Natal,

RN. 2011..........................................................................................
Figura 6.
Fotomicrografia
de
gengiva
clinicamente
saudvel
67
Fotomicrografia de gengivite crnica exibindo moderado e difuso

infiltrado inflamatrio (H/E, 200X).................................................
Figura 9.
67
(H/E,
400x).................................................................................................
Figura 8.
65
Fotomicrografia de gengiva clinicamente saudvel demonstrando

a presena de leve infiltrado inflamatrio (H/E, 200x)...................
Figura 7.
43
68
Fotomicrografia de gengivite crnica destacando infiltrado

inflamatrio linfoplasmocitrio e perivascular (H/E, 400x)...........
68
Figura 10. Fotomicrografia de periodontite crnica exibindo intenso e difuso

69
infiltrado inflamatrio (H/E, 200x)......................................

Figura 11. Fotomicrografia de periodontite crnica destacando infiltrado
inflamatrio plasmocitrio (H/E, 400x)...................................
69
Figura 12. Fotomicrografia de periodontite crnica exibindo infiltrado

inflamatrio em toda profundidade do espcime (H/E, 100x)........
Figura 13. Fotomicrografia
de
periodontite crnica exibindo
70
intenso
infiltrado inflamatrio plasmocitrio (H/E, 400x)...................

Figura 14. Intensidade do infiltrado inflamatrio e perda de insero clnica.
70
16
Natal, RN. 2011................................................................................
71
Figura 15. Fotomicrografia demonstrando a imunomarcao para RANKL

em regio perivascular e subepitelial em gengiva clinicamente
saudvel (LSAB, 400x)....................................................................
73
Figura 16. Fotomicrografia destacando forte imunomarcao para RANKL

em gengiva clinicamente saudvel associada principalmente a
linfcitos (LSAB, 400)...................................................................
73
Figura 17. Fotomicrografia demonstrando marcao para RANKL em regio

perivascular e associada a clulas inflamatrias em gengivite
crnica (LSAB, 400)......................................................................
74
Figura 18. Fotomicrografia exibindo fraca imunomarcao para RANKL em

relao quantidade de clulas inflamatrias na gengivite crnica
(LSAB, 400)...................................................................................
74
Figura 19. Fotomicrografia demonstrando forte imunopositividade para

RANKL com distribuio difusa acompanhando o intenso
infiltrado inflamatrio linfoplasmocitrio na periodontite crnica
(LSAB, 400)...................................................................................
75
Figura 20. Fotomicrografia demonstrando moderada marcao para OPG em

gengiva clinicamente saudvel (LSAB, 400).................................
75
Figura 21. Fotomicrografia exibindo fraca imunomarcao para OPG em

gengivite crnica (LSAB, 400)......................................................
76
Figura 22. Fotomicrografia demonstrando imunomarcao mais acentuada

da OPG na periodontite crnica (LSAB, 400)...............................
76
Figura 23. Fotomicrografia exibindo fraca imunomarcao para TNF- na

gengiva clinicamente saudvel, com discreto infiltrado linfocitrio
(LSAB, 400)...................................................................................
78
Figura 24. Fotomicrografia demonstrando moderada imunoexpresso para

TNF-
em
gengivite
crnica
associada
infiltrado
linfoplasmocitrio (LSAB, 400)...................................................
78
Figura 25. Fotomicrografia exibindo forte imunomarcao para TNF- em

periodontite crnica, expresso praticamente em todas as clulas
inflamatrias, predominantemente linfoplasmocitrio (LSAB,
400)................................................................................................
79
17
LISTA DE QUADROS E TABELAS
18

Pgina
Quadro 1.
Quadro 2.
Quadro 3.
Tabela 1.
Variveis
independentes,
definio,
classificao
categorias.........................................................................................
Variveis
dependentes,
definio,
classificao
56
categorias.........................................................................................
57
Clone, especificidade, recuperao antignica, diluio, tempo de

incubao e fabricante dos anticorpos utilizados............................
58
Freqncia absoluta e percentual das variveis independentes

categricas e medidas de tendncia central e disperso para a
varivel independente, idade. Natal/RN, 2011................................
Tabela 2.
63
Medidas de tendncia central e disperso para as variveis

independentes e quantitativas do estudo relacionadas aos
parmetros clnicos de todos os casos. Natal/RN, 2011..................
Tabela 3.
64

independentes e quantitativas do estudo relacionadas aos casos de
periodontite. Natal/RN, 2011..........................................................
Tabela 4.
64

dependentes e quantitativas: RANKL, OPG e RANKL/OPG em
relao varivel independente principal: condio clnica e sua
significncia estatstica. Natal/RN, 2011.........................................
Tabela 5.
72
Medidas de tendncia central e disperso para a varivel

dependente e quantitativa: TNF- em relao varivel
independente principal: condio clnica e sua significncia
estatstica. Natal/RN, 2011..............................................................
Tabela 6.
77
Anlise comparativa das variveis dependentes RANKL, OPG,

RANKL/OPG e TNF-, com a varivel independente: perda de
insero clnica, considerando os casos de periodontite crnica.
Natal/RN, 2011................................................................................
Tabela 7.
80
Anlise comparativa das variveis dependentes RANKL, OPG,

RANKL/OPG
TNF-,
com
varivel
independente:
mobilidade dentria, considerando os casos de periodontite

crnica. Natal/RN, 2011..................................................................
81
19
Tabela 8.
Coeficiente de correlao de Spearman (r) e sua significncia

estatstica entre a marcao dos anticorpos RANKL, OPG, TNF e a razo RANK/OPG, e a varivel independente: profundidade
de sondagem, no grupo Clinicamente Saudvel (CS). Natal/RN,
2011.................................................................................................
Tabela 9.
82

estatstica entre a marcao dos anticorpos RANKL, OPG, TNF e a razo RANK/OPG, e a varivel independente: profundidade
de
sondagem,
no
grupo
da
Gengivite
(G).
Natal/RN,
2011.................................................................................................
Tabela 10.
83

estatstica entre a marcao dos anticorpos RANKL, OPG, TNF e a razo RANK/OPG, e as variveis independentes:
profundidade de sondagem, recesso gengival e perda de insero
clnica, no grupo da Periodontite Crnica (PC). Natal/RN,
2011.................................................................................................
84
20
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
21
L ISTA D E ABREVIATU RAS E SIGLAS

Clulas Th:
Do ingls t helper cell, traduzida como clulas T auxiliares.
CFU-GM:
Do ingls colony forming unit for granulocytes and macrophage, traduzido

como unidade formadora de colnia de granulcito-macrfago.
Doena Periodontal
DP:
ELISA:
EPI:
Do ingls Enzyme Linked Immunosorbent Assay,traduzido como Ensaio

Imunoenzimtico
Equipamento de Proteo Individual
FAOs:
Fatores ativadores osteoclsticos
IL:
Interleucinas
INF-:
Do ingls Interferon gamma, traduzido como interferon gama
IP:
ndice de Placa
LSAB:
MB:
Do ingls labeled streptavidin biotin, traduzido como conjugado estreptoavidinabiotina.

Mobilidade dentria
MC:
Mucosa ceratinizada
M-CSF:
NF-B:
Do ingls macrophage colony-stimulating factor, traduzido como fator

estimulador de colnia de macrfago.
Do ingls matrix metalloproteinases, traduzido como metaloproteinases de
matriz.
Do ingls nuclear factor B, traduzido como fator nuclear B.
OPG:
Do ingls osteoprotegerin, traduzido como osteoprotegerina.
OPGL:
Do ingls OPG ligand, traduzido como ligante da osteoprotegerina.
PGE2
Do ingls Prostaglandin E2, traduzido como Prostaglandina E2
PIC:
Perda de insero clnica
PS:
Profundidade de Sondagem
RANK:
RG:
Do ingls receptor activator of nuclear factor B, traduzido como receptor

ativador do fator nuclear B.
Do ingls receptor activator of nuclear factor B ligand, traduzido como ligante
do receptor ativador do fator nuclear B.
Recesso Gengival
RNA:
Do ingls ribonucleic acid, traduzido como cido ribonuclico.
RNAm:
Do ingls mRNA, messenger ribonucleic acid, traduzido como RNA mensageiro
SS:
Sangramento sondagem
TIMPs:
TNF:
Do ingls Tissue inhibitors of metalloproteinases, refere-se aos inibidores das

MMPs
Do ingls tumor necrosis factor, traduzido como fator de necrose tumoral.
TNF-:
Do ingls tumor necrosis factor-, traduzido como fator de necrose tumoral-.
TLR
Do ingls toll-like receptor, traduzido como receptor do tipo toll
TRAF:
Do ingls TNF receptor-associated factor, traduzido como fator associado ao

receptor do fator de necrose tumoral.
Tris-hidroximetil-aminometano.
MMPs:
RANKL:
TRIS-HCL:
22
SUMRIO
23
SUMRIO
RUSUMO
ABSTRACT
LISTA DE ILUSTRAES
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Pgina
1
INTRODUO...............................................................................
25
REVISO DA LITERATURA......................................................
28
2.1
DOENA PERIODONTAL.............................................................
29
2.2
REGULAO DO METABOLISMO SSEO...............................
32
2.2.1
RANK, RANKL e OPG Consideraes gerais..........................
32
2.2.2
RANK, RANKL e OPG e a doena periodontal...........................
35
2.3
CITOCINAS E A PERDA SSEA PERIODONTAL......................
40
2.3.1
Fator de necrose tumoral alfa (TNF-).........................................
44
PROPOSIO................................................................................
49
MATERIAIS E MTODOS...........................................................
51
4.1
IMPLICAES TICAS.................................................................
52
4.2
CARACTERIZAO DO ESTUDO...............................................
52
4.3
POPULAO...................................................................................
52
4.4
PROCESSO DE AMOSTRAGEM...................................................
52
4.4.1
Coleta dos espcimes teciduais gengivais......................................
52
4.4.2
Critrios de Incluso.......................................................................
53
4.4.3
Critrios de excluso.......................................................................
53
4.5
AMOSTRA.......................................................................................
54
4.6
EXAME CLNICO PERIODONTAL..............................................
54
4.7
ELENCO DE VARIVEIS..............................................................
56
4.8
ANLISE MORFOLGICA...........................................................
57
4.9
ESTUDO IMUNO-HISTOQUMICO..............................................
57
4.10
ANLISE DAS CLUAS IMUNOMARCADAS...........................
60
4.11
ANLISE DOS DADOS.................................................................
61
RESULTADOS................................................................................
62
5.1
CARACTERIZAO DA AMOSTRA...........................................
63
5.2
ANLISE MORFOLGICA...........................................................
65
5.2.1
O infiltrado inflamatrio e as condies clnicas..........................
65
5.2.1.1
Gengiva clinicamente saudvel......................................................
65
24
5.2.1.2
Gengivite crnica............................................................................
66
5.2.1.3
Periodontite crnica........................................................................
66
5.2.2
Anlise comparativa entre a intensidade do infiltrado

inflamatrio e a perda de insero clnica....................................
71
5.3
RESULTADOS IMUNO-HISTOQUMICOS.................................
71
5.3.1
Anlise dos percentuais de positividade da imunoexpresso

para os anticorpos anti-RANKL, anti-OPG e da razo
RANKL/OPG e a condio clnica.................................................
71
5.3.2

para o anticorpo anti-TNF e a condio clnica......................
77
5.3.3

para os anticorpos anti-RANKL, anti-OPG, da razo
RANKL/OPG e anti-TNF em relao perda de insero
clinica................................................................................................
80
5.3.4

para os anticorpos anti-RANKL, anti-OPG, da razo
RANKL/OPG e anti-TNF em relao mobilidade
dentria............................................................................................
80
5.3.5
Correlao entre as variveis RANKL, OPG, RANKL/OPG,

TNF e a profundidade de sondagem para os casos de gengiva
clinicamente saudvel.....................................................................
81
5.3.6

TNF e a profundidade de sondagem para os casos de
gengivite crnica..............................................................................
82
5.3.7

TNF e a profundidade de sondagem para os casos de
periodontite crnica........................................................................
83
DISCUSSO....................................................................................
85
CONCLUSES...............................................................................
99
REFERNCIAS..............................................................................
101
APNDICES....................................................................................
109
10
ANEXOS
113
25
INTRODUO
26
1 INTRODUO
A doena periodontal provavelmente uma das doenas crnicas mais comuns nos
adultos, e iniciada na presena do seu fator etiolgico principal, o biofilme dentrio
(GRSKA et al. 2003). uma infeco bacteriana crnica caracterizada por inflamao
persistente e destrutiva dos tecidos de suporte dos dentes: tecido conjuntivo e osso alveolar,
sendo uma das grandes responsveis pela perda dentria na populao adulta (MILLER et al.,
2006). Essa destruio mediada pelo hospedeiro atravs da induo da produo e ativao
de enzimas lticas e da estimulao da osteoclastognese.
A perda ssea alveolar mediada pela resposta imunolgica do hospedeiro frente ao
acmulo de biofilme um dos sinais mais importantes da periodontite.
Entretanto, a
emergncia atual da osteoimunologia tem aumentado o interesse em definir os mecanismos

que constituem a base da reabsoro ssea na doena periodontal. Entre outros mecanismos,
destaca-se a remodelao ssea, que coordenada pela interao entre RANK, RANKL e
OPG, expresses que so fortemente reguladas por mediadores inflamatrios e produtos
bacterianos (SANTOS et al., 2010)
Recentes achados sobre a via RANKL/RANK/OPG tm esclarecido o envolvimento
dessas protenas como sendo molculas chaves na regulao do metabolismo sseo e biologia
da reabsoro ssea. Os papis chaves da expresso do RANKL e OPG na regulao da
destruio ssea periodontal tm sido demonstrado em vrios estudos in vivo e recentes
estudos clnicos (CROTTI et al., 2003; LU et al., 2006; SOEDARSONO et al., 2006;
BOSTANCI et al., 2007b; BUDUNELI et al., 2008), confirmando que ambos RANKL e OPG
podem ser detectados no fluido crevicular gengival e indicando aumento dos nveis de
RANKL e diminuio da OPG em pacientes periodontalmente comprometidos, tanto no
fluido gengival crevicular como em tecidos gengivais.
Alm dessas molculas, para atingir concentraes crticas de mediadores
inflamatrios que levam reabsoro ssea necessria a expresso de citocinas proinflamatrias, tais como Interleucinas (IL)-1,-6, -11 e -17, TNF- (Fator de Necrose Tumoral
Alfa) , fator inibitrio de leucemia e oncostatin M (LU et al., 2006; COCHRAN, 2008).
Durante a resposta inflamatria, essas citocinas pro-inflamatrias, podem induzir a
osteoclastognese pelo aumento da expresso do RANKL e diminuio da produo de OPG
nas clulas estromais e osteoblastos. Em contraste, mediadores antiinflamatrios como IL-4,
IL-10, IL-13 e IL-18 bem como o IFN- e IFN-, podem diminuir a expresso de RANKL
27
e/ou aumentar a expresso de OPG para inibir a osteoclastognese (LU et al., 2006;
COCHRAN, 2008).
Diferentes citocinas tm sido citadas devido ao seu papel na imunopatologia da doena
periodontal, e seus nveis no fluido crevicular gengival tm se mostrado aumentados nos
casos de agravo nos parmetros clnicos da doena. Alm disso, o tratamento e a melhora das
condies periodontais tm sido associados com a diminuio dos nveis de certas citocinas
no fluido crevicular gengival (TELES et al. 2009).
Diante disto, esta pesquisa visa comparar a expresso do RANKL, OPG e TNF-,
atravs da tcnica de imuno-histoqumica, em tecidos gengivais de indivduos saudveis, com
gengivite induzida por biofilme dental e com periodontite crnica, correlacionando-a com os
parmetros clnicos periodontais. Com os resultados deste experimento pretende-se contribuir
para o esclarecimento do papel desses marcadores na patognese e progresso da doena e
verificar a associao dos mesmos com a perda ssea periodontal.
28
REVISO DA LITERATURA
29
2 REVISO DA LITERATURA
2.1 DOENA PERIODONTAL

A doena periodontal (DP), cujo fator etiolgico o biofilme dentrio, uma infeco
bacteriana crnica caracterizada por inflamao persistente que acomete os tecidos
periodontais de proteo e/ou sustentao. Classificando-se em gengivite crnica, a condio
inflamatria limitada s gengivas livre e inserida, e em periodontite a condio
imunoinflamatria que envolve todo o tecido periodontal (gengiva livre e inserida, cemento,
ligamento e osso alveolar), conduzindo destruio progressiva das estruturas de suporte
(ligamento periodontal e osso alveolar), sendo uma das grandes responsveis pela perda
dentria na populao adulta (LINDHE, KARRING, LANG, 2005; LU et al., 2006; MILLER
et al.,2006).
Essa destruio mediada pelo hospedeiro atravs da induo da produo e ativao
de enzimas lticas e da estimulao da osteoclastognese (GRAVES, 2008). A
infeco/inflamao da doena periodontal est associada com bactrias anaerbicas e gramnegativas que colonizam a rea subgengival e causa elevao local e sistmica das
prostaglandinas e citocinas pro-inflamatrias, resultando em destruio tecidual (BUDUNELI
et al., 2008). As bactrias Porphyromonas gingivallis, Tannerella forsythensis e
Aggregatibacter actinomycetemcomitans tm sido apontadas como os principais agentes
etiolgicos da periodontite. Essas bactrias expressam um grande nmero de potentes fatores
de virulncia e induzem mediadores da resposta inflamatria do hospedeiro, levando a
destruio de tecido conjuntivo e reabsoro ssea alveolar (WARA-ASWAPATI et al.,
2007).
A resposta imune do hospedeiro, tanto inata quanto adaptativa, frente a esses
microrganismos, leva a destruio dos tecidos periodontais, no entanto, recentes estudos tm
sugerido que a resposta imune exerce um duplo efeito, podendo contribuir tanto para a
proteo quanto para a destruio na doena periodontal (TAUBMAN et al., 2005).
As alteraes inflamatrias podem permanecer confinadas rea gengival por vrios
anos, porm em algumas reas, com a presena contnua do biofilme periodontopatognico, a
gengivite poder evoluir para doena periodontal destrutiva, resultando em perda do
ligamento periodontal e osso alveolar.
Estas alteraes inflamatrias na gengiva so
revertidas quando se retomam as medidas adequadas de higiene oral (LE, THEILADE,

JENSEN, 1965; LINDHE, KARRING, LANG, 2005).
30
A reversibilidade da condio de doena foi descrita pelo estudo da Gengivite

experimental em humanos de Le e colaboradores em 1965, que demonstrou o efeito do
biofilme dentrio no desenvolvimento da gengivite. Neste estudo, mostrou-se que 100% dos
indivduos inflamam as gengivas em at 21 dias de acmulo de biofilme dentrio, e ento
sinais clnicos de gengivite se estabelecem apresentando-se com vermelhido e edema
gengival, maior tendncia ao sangramento dos tecidos moles sondagem delicada, perda
parcial do pontilhado. Nesta fase, se o biofilme dentrio for removido e forem institudas
medidas eficazes de controle do mesmo, os sinais clnicos so reversveis (LINDHE,
KARRING, LANG, 2005).
Os estudos que avaliam a progresso da doena periodontal, mostram que
obrigatoriamente a Periodontite deve ser precedida de uma Gengivite. No entanto, alguns
indivduos podem ser acometidos por gengivite durante toda a vida e nunca sofrer perdas no
periodonto de sustentao, ou seja, no desenvolverem a periodontite, pois mecanismos de
defesa do hospedeiro, inerentes ao paciente, exercem um papel decisivo na patogenia e na
susceptibilidade da doena (LE et al. 1978, LE, ANERUD, BOYSEN, 1992; LINDHE,
KARRING, LANG, 2005). As caractersticas clnicas da periodontite so: inflamao
gengival (alteraes de cor e textura), sangramento sondagem, presena de bolsa
periodontal, perda de insero gengival e do osso alveolar, hiperplasia ou recesso gengival,
exposio de furca, mobilidade e inclinao dentrias aumentadas e, eventualmente,
esfoliao dos dentes (LINDHE, KARRING, LANG, 2005).
Em 1976, Page & Schroeder classificaram a progresso da inflamao gengival e
periodontal, com base nas evidncias clnicas e histopatolgicas, para descrever a
histopatognese da doena. Dessa forma, a progresso da doena periodontal foi dividida em
quatro estgios: leso inicial, leso precoce, leso estabelecida e leso avanada (LINDHE,
KARRING, LANG, 2005). .
O estgio de leso inicial, onde a gengiva ainda considerada clinicamente sadia,
aparece aps 4 dias de acmulo de biofilme dentrio e constitui basicamente uma reao
inflamatria aguda. Os tecidos afetados incluem parte do epitlio juncional e a poro mais
coronal do tecido conjuntivo adjacente. So observados dilatao e aumento da
permeabilidade dos vasos, infiltrado inflamatrio que ocupa de 5 a 10% do tecido conjuntivo,
com perda de colgeno nesta rea e a principal caracterstica histolgica o aumento na
migrao de neutrfilos do plexo vascular gengival para o sulco gengival atravs do epitlio
juncional (GONALVES et al., 2005).
31
Na leso precoce, observada aps cerca de 7 dias de acmulo de biofilme dentrio,

ocorre aumento no nmero de vasos do plexo gengival, o infiltrado j ocupa 15% da rea e a
principal caracterstica um predomnio de linfcitos e macrfagos com poucos plasmcitos
presentes. Neste estgio a gengivite j comea a ser evidenciada clinicamente como uma
gengivite leve (GONALVES et al., 2005).
Quando o biofilme dentrio se acumula por 2 a 3 semanas, tem incio o terceiro
estgio, denominado de leso estabelecida e caracterizado clinicamente por uma gengivite de
moderada a severa. Ocorre aumento na extenso da rea afetada e comea um aumento na
proporo de plasmcitos que passam a ocupar at 30% da rea afetada. Linfcitos e
macrfagos so ainda detectados no tecido conjuntivo e neutrfilos no epitlio sulcular. O
epitlio juncional aumenta suas projees digitiformes em direo ao tecido conjuntivo, j
iniciada de forma discreta no estgio anterior, alm de iniciar a sua projeo para apical,
aprofundando o sulco gengival clnico (GONALVES et al., 2005).
A leso estabelecida pode permanecer sem evoluir para o estgio seguinte ou pode
evoluir dando lugar ao estgio de leso avanada que caracteriza clinicamente a periodontite.
Este ltimo estgio caracterizado principalmente pelo incio da reabsoro ssea
acompanhada por uma predominncia de at 50% de plasmcitos e mudana nos linfcitos
que passam a predominar os do tipo B ao invs dos do tipo T (GONALVES et al., 2005).
Socransky et al. (1984) propuseram a hiptese da exploso, na qual a periodontite
crnica progride em episdios de exacerbao e remisso. No entanto, achados de outros
estudos similares indicaram que a progresso da periodontite crnica pode ser um processo
destrutivo lento e contnuo, ao invs de exibir um padro explosivo. Atualmente, considerase que a progresso da periodontite crnica um processo contnuo na maioria dos indivduos
e dos stios, podendo ocorrer ocasionalmente perodos de exacerbao (LINDHE, LANG,
KARRING, 2010).
Existe uma relao estabelecida entre a reabsoro ssea periodontal e o biofilme
dentrio. O processo inflamatrio que ocorre na doena periodontal caracterizado pela
infiltrao de leuccitos, os quais limitam o nvel da invaso bacteriana. E so diversos
fatores que promovem o recrutamento dos leuccitos, incluindo produtos bacterianos,
citocinas, resposta imune inata e adaptativa, quimiocinas, mediadores lipdicos e sistema
complemento (GRAVES, 2008).
Embora investigaes sobre a patognese da periodontite sejam tradicionalmente
centradas no papel da infeco bacteriana, nas duas ltimas dcadas tem-se aumentado o
interesse pela resposta imune do hospedeiro, fator que modula a doena periodontal. Agora
32
entendido que as respostas imune e inflamatria so crticas na patognese da periodontite e

so formadas por um nmero de fatores relacionados ao hospedeiro, tanto intrnsecos
(genticos), como induzidos (ambientais), que contribuem para a variao individual
(TAUBMAN, KAWAI, HAN, 2007).
A resposta inicial infeco bacteriana uma reao inflamatria local que ativa a
resposta imune inata. A amplificao dessa resposta inicial localizada resulta na liberao de
citocinas e outros mediadores e na propagao da inflamao atravs do tecido gengival. A
falha no encapsulamento desse front inflamatrio dentro do tecido gengival resulta na
expanso da resposta para o osso alveolar adjacente. O processo inflamatrio ento, controla a
destruio do tecido conjuntivo e osso alveolar que so sinais cardinais da DP (COCHRAN,
2008).
O papel da resposta imune na doena periodontal complexo, pois existem evidncias
que uma resposta imune deficiente aumenta a destruio periodontal e, ao mesmo tempo,
evidncias mostram que uma resposta imune vigorosa pode levar a doena periodontal
(GRAVES, 2008).
De uma perspectiva biolgica, pode-se considerar a doena periodontal compreendida
em trs fases: inflamao, destruio do tecido conjuntivo de fixao seguida pela migrao
apical do epitlio juncional, e alterao na remodelao/reabsoro do osso alveolar com
conseqente perda de densidade e altura ssea (FRODGE et al. 2008).
2.2 REGULAO DO METABOLISMO SSEO

2.2.1 RANK, RANKL e OPG Consideraes gerais
O osso um tecido dinmico que permanentemente renovado como um mecanismo
intrnseco de se regenerar e como um meio de integrar os vrios produtos qumicos,
hormonais e biomecnicos de estmulos externos. Em nvel celular, a remodelao ssea
segue uma seqncia de repetidos ciclos de reabsoro pelos osteoclastos, os quais derivam
da linhagem de moncitos e macrfagos, seguidos pela formao ssea pelos osteoblastos,
que so provenientes de clulas mesenquimais pluripotentes (HOFBAUER, HEUFELDER,
2001).
Em condies fisiolgicas normais, existe um equilbrio entre a reabsoro e formao
ssea, o que promove uma homeostase ssea, incluindo a manuteno da integridade
estrutural do metabolismo do clcio. Em certas condies sseas inflamatrias, o balano
alterado de modo que a formao ssea aumentada, como na osteopetrose, ou ocorre
33
reabsoro ssea excessiva, como observada na osteoporose e periodontite (COCHRAN,

2008).
A reabsoro ssea um processo de mltiplas etapas, iniciando-se com proliferao
de precursores dos osteoclastos imaturos, seguindo com a diferenciao e maturao desse
tipo celular, e finalmente a degradao das matrizes orgnicas e inorgnicas do tecido sseo
(TEITELBAUM, 2000). A osteoclastognese regulada por uma cascata de eventos que
envolvem a participao de molculas e citocinas pro-inflamatrias bem como do eixo
RANKL/RANK/OPG, o qual apresenta um papel crucial em leses patolgicas que envolvem
inflamao crnica (COCHRAN, 2008).
Recentes achados sobre a via RANKL/RANK/OPG tm esclarecido o envolvimento
dessas protenas como sendo molculas chaves na regulao do metabolismo sseo e biologia
da reabsoro ssea. A formao, diferenciao e atividade dos osteoclastos so reguladas por
essas trs protenas que so membros da superfamlia dos ligantes e receptores do fator de
necrose tumoral (LU et al., 2006; ANDRADE et al., 2008; COCHRAN, 2008).
O RANK um membro da superfamlia do receptor do Fator de Necrose Tumoral, que
se associa intracelularmente com Fatores associados com receptor TNF (TRAFs). um
receptor transmembrana tipo I primariamente expresso em clulas da linhagem dos moncitos
e macrfagos, incluindo os precursores dos osteoclastos, clulas B e T, clulas dendrticas e
fibroblastos (KHOSLA, 2001; LU et al., 2006; COCHRAN, 2008).
O RANKL, tambm conhecido como OPGL (Ligante da Osteoprotegerina) ou ODF
(Fator de Diferenciao dos Osteoclastos) um peptdeo de 317 aminocidos, que existe em
duas formas: a mais comum, com 40-45 kDa, a forma ligada membrana, e a outra com
31kDa, a forma solvel. Membro da famlia do TNF, sendo considerada a mais importante
citocina envolvida em vrios estgios da reabsoro ssea produzido e expresso pelos
osteoblastos ligado membrana ou clivado na forma solvel, e tambm produzido por
outros tipos celulares incluindo fibroblastos, linfcitos T e B (TEITELBAUM, 2000;
KHOSLA, 2001). O RANKL uma protena necessria e importante na osteoclastognese,
pois se liga ao RANK presente na superfcie dos pr-osteoclastos e osteoclastos, estimulando
a diferenciao dos pr-osteoclastos e a ativao dos osteoclastos maduros, inibindo a
apoptose dos osteoclastos maduros. Citocinas inflamatrias, tais como o TNF-, presentes no
fluido crevicular de pacientes com periodontite so relacionadas com a estimulao da
produo de RANKL (CROTTI et al., 2003; LU et al., 2006).
A OPG uma protena solvel que funciona como receptor e tem propriedades
antagnicas ao RANKL porque age como inibidor ao interagir com alta afinidade com o
34
RANKL,
impedindo
sua
ligao
ao
RANK,
levando
assim,
diminuio
da
osteoclastognese. A superrregulao do RANKL e a sub-regulao da OPG tem sido

implicada em diversas doenas, incluindo osteoporose, artrite reumatide e doena
periodontal. A OPG produzida pelas clulas do ligamento periodontal, fibroblastos
gengivais e clulas epiteliais e, como o RANKL, modulada por citocinas inflamatrias
presentes na periodontite. (CROTTI et al., 2003; LU et al., 2006; COCHRAN, 2008)
A reabsoro e formao sseas so reguladas pela relativa concentrao do RANKL
expresso por vrias clulas, bem como do receptor RANK no pr-osteoclasto e do receptor
solvel OPG. Quando a expresso de RANKL relativamente elevada em relao ao OPG,
RANKL fica disponvel para ligar-se ao RANK no precursor do osteoclasto, inclinando o
balano a favor da ativao e formao dos osteoclastos e reabsoro ssea, ou seja, quando o
RANK liga-se ao seu ligante especfico, inicia-se a osteoclastognese (Figura 1). A ligao do
RANKL ao pr-osteoclasto ocorre no estgio em que estas clulas de origem hematopoiticas
se diferenciam em unidade formadora de colnia de granulcitos e macrfagos (CFU-GM).
Essa ligao na CFU-GM na presena de fator estimulante de colnia de macrfagos (MCSF) induz a diferenciao de pr-osteoclastos em clulas multinucledas que se tornam
osteoclastos maduros. Quando a concentrao da OPG relativamente maior que a expresso
do RANKL, OPG liga-se ao RANKL inibindo sua ligao ao RANK (Figura 2). Desse modo,
leva a uma reduo na formao de osteoclastos e a apoptose dos osteoclastos pr-existentes
(COCHRAN, 2008).
Figura 1. Mecanismo de ao do RANKL expresso por vrios tipos celulares e a induo da

osteoclastognese atravs da sua ligao com o RANK nos pr-osteoclastos (adaptado de
COCHRAN, 2008).
35
Figura 2. Abundncia de OPG em relao ao RANKL, inibindo a ligao do RANKL ao

RANK, resultando em reduo da osteoclastognese e promoo da apoptose de osteoclastos
existentes. (adaptado de COCHRAN, 2008).
2.2.2 RANK, RANKL, OPG e a doena periodontal.

A perda ssea alveolar induzida em periodontite pode ser ilustrada atravs da figura 3.
Quando os patgenos periodontais colonizam a regio, induzem reaes inflamatrias nos
tecidos circundantes e clulas imunolgicas, como as clulas B (B), macrfagos (M) e
clulas T, incluindo clulas Th1 e Th17 so recrutadas para o foco inflamatrio. A produo
de citocinas pr-inflamatrias e de prostaglandina E2 reforado no stio inflamatrio. As
clulas T ativadas secretam RANKL em forma solvel. As citocinas pr-inflamatrias e
prostaglandina E2 desempenham papis importantes na destruio do osso alveolar atravs da
induo da expressso de RANKL pelos osteoblastos. Alm disso, receptores Toll-like
ligam-se diretamente sobre os osteoblastos e osteoclastos e os sinais mediados por esses
receptores induzem a expresso de RANKL pelos osteoblastos e melhoram a atividade de
reabsoro ssea pelos osteoclastos (KOIDE et al. 2010).
36
Figura 3. Perda ssea induzida em periodontite mostrando a ao da respota Th1, Th17, IL17, PGE2, TNF-, RANKL, OPG e receptores Toll-like (TLR) (KOIDE et al. 2010).
Os papis chaves da expresso do RANKL e OPG na regulao da destruio ssea

periodontal tm sido demonstrado em vrios estudos in vivo e recentes estudos clnicos
(CROTTI et al.; 2003; LU et al., 2006; SOEDARSONO et al., 2006; BOSTANCI et al.
2007b; BUDUNELI et al., 2008), confirmando que ambos RANKL e OPG podem ser
detectados no fluido gengival crevicular e indicando aumento dos nveis de RANKL e
diminuio da OPG em pacientes periodontalmente comprometidos, tanto no fluido gengival
crevicular como em tecidos gengivais.
Crotti et al. (2003) compararam os nveis de RANKL e OPG nos tecidos
granulomatosos adjacentes a reas de perda ssea alveolar de pacientes com periodontite
crnica em relao a pacientes sem periodontite, utilizando imuno-histoqumica. Avaliaram
tambm quais tipos celulares expressavam esses fatores. Os resultados mostraram nveis
significativamente altos da protena RANKL expressa em tecidos com periodontite, enquanto
os nveis da protena OPG foram significativamente baixos. O RANKL estava associado a
linfcitos e macrfagos e a OPG estava associada a clulas endoteliais em ambos os tecidos.
Para detectar expresso do RNAm do RANKL utilizaram a hibridizao in situ e observaram
que muitos leuccitos expressaram o RNAm do RANKL nos casos de periodontite.
37
Com o objetivo de estudar os aspectos da inflamao, degradao do colgeno e do

turnover sseo da periodontite, Miller et al. (2006) avaliaram os nveis da IL-1, da MMP-8
e da OPG na saliva de 57 adultos, comparando 28 indivduos com doena periodontal de
moderada a severa com 29 indivduos saudveis. Os nveis da IL-1 e da MMP-8 foram
significativamente maiores nos indivduos doentes. Em contrapartida, elevados nveis
salivares de OPG no distinguiram indivduos saudveis dos doentes, mas apresentaram
correlao com a profundidade de sondagem em stios com bolsas maior ou igual a 4 mm, no
entanto a correlao da OPG com a perda de insero maior ou igual a 2 mm no foi
significativa.
Com o propsito de avaliar a expresso do RNAm do RANKL e OPG e a relao
desses fatores com bactrias periodontopatognicas na doena periodontal, Wara-aswapati et
al. (2007) coletaram amostras de tecidos gengivais e placas subgengivais de 15 pacientes com
periodontite crnica e 15 pacientes periodontalmente sadios. O RNA foi extrado dos tecidos
e submetidos ao RT-PCR usando primers especficos para RANKL e OPG. Os autores
encontram aumento dos nveis de RNAm do RANKL nos tecidos que exibiam periodontite
crnica e a razo RANKL/OPG foi significativamente mais alta nos indivduos doentes. Alm
disso, observaram que a expresso do RANKL, mas no da OPG foi significativamente
correlacionada com o aumento do nmero de P. gingivallis.
Bostanci et al. (2007a), ao investigarem a expresso do RNAm (real time PCR) do
RANKL e OPG em tecidos gengivais de 5 grupos de pacientes: saudveis, com gengivite,
com periodontite crnica, com periodontite crnica associada ao uso de drogas
imunossupressoras e com periodontite agressiva generalizada, observaram forte expresso do
RANKL em mais de 50% dos tecidos com periodontite, mas apenas 25% dos tecidos com
gengivite. Quando se comparou aos indivduos saudveis, os nveis de RANKL foram
significativamente maiores em todas as 3 formas de periodontites, mas no nos casos de
gengivite, e o aumento mais proeminente foi observado nas periodontites agressivas
generalizadas. Ao contrrio, a OPG foi expressa por todos os tecidos, e seus nveis
marcadamente diminudos nas periodontites crnicas, mas no em outras formas de doena
periodontal.
Em outro estudo, Bostanci et al. (2007b) compararam os nveis de RANKL e OPG e
sua razo relativa no fluido crevicular gengival de indivduos saudveis e com doena
periodontal (gengivite, periodontite crnica, periodontite crnica associada ao uso de drogas
imunossupressoras e periodontite agressiva generalizada), mensurando as concentraes no
fluido crevicular atravs do ELISA. Os resultados mostraram baixos nveis de RANKL nos
38
grupos saudveis e com gengivite. No houve diferena nos nveis de RANKL e OPG entre
os grupos de periodontite crnica e periodontite agressiva generalizada, enquanto estes foram
mais baixos no grupo de periodontite crnica associada ao uso de drogas imunossupressoras.
A razo RANKL/OPG foi significativamente mais elevada nos trs grupos de periodontite,
comparados com o grupo saudvel e com gengivite, e houve correlao positiva com a
profundidade de sondagem e o nvel de insero clnica. Os autores sugerem que a razo
RANKL/OPG pode ser um fator prognstico para a ocorrncia da doena.
Lu et al. (2006) avaliaram o perfil da OPG, RANKL, IL-6 e Oncostatin M (OMS) em
fluido crevicular gengival em humanos atravs do ELISA e realizaram anlise imunohistoqumica para identificao da OPG e do RANKL em clulas do tecido conjuntivo
gengival. Os autores compararam quatro grupos: stios clinicamente saudveis, stios
levemente doentes, stios moderadamente doentes e stios severamente doentes. No ELISA,
encontraram elevados nveis de RANKL, mas no de OPG em stios doentes de indivduos
com periodontite. Entretanto, a imunoexpresso da OPG e RANKL no mostrou correlao
com a severidade da doena, mas a contagem do RANKL no fluido crevicular gengival
apresentou correlao positiva e significativa com a IL-6. A marcao imuno-histoqumica
mostrou clulas RANKL-positivas significativamente distribudas nas zonas inflamadas do
tecido conjuntivo de indivduos com periodontite crnica quando se comparou com tecido
saudvel, enquanto poucas clulas OPG-positivas foram observadas, tanto no tecido doente
quanto no tecido saudvel.
A pesquisa de Dereka et al. (2010) teve como propsito determinar os nveis de
RNAm do RANKL e OPG, estimados pela tcnica RT-PCR, em tecidos gengivais de 14
indivduos com periodontite crnica avanada aps terapia periodontal no cirrgica e
comparar com 11 indivduos periodontalmente saudveis. Alm disso, avaliaram a expresso
imuno-histoqumica dessas protenas. Os autores observaram que o nvel de RNAm do
RANKL no grupo de periodontite foi menor que o nvel encontrado no grupo saudvel, e
tambm inferior quando comparado com o nvel de RNAm da OPG do grupo com
periodontite. Os resultados tambm mostraram que o RNAm da OPG foi mais intensamente
expresso no grupo saudvel quando comparado ao grupo com periodontite, alm disso
apresentou nveis mais elevados comparados aos nveis de RNAm do RANKL. A razo
RANKL/OPG apresentou tendncia a aumentar no grupo com periodontite, mas no mostrou
significncia estatstica. A imuno-histoqumica foi realizada em apenas 4 indivduos
saudveis e 8 com periodontite, e apresentou expresso de RANKL no epitlio oral e mais
intensamente nas clulas inflamatrias, enquanto a expresso da OPG foi observada mais
39
frequentemente no epitlio oral que nas clulas inflamatrias e nas amostras com periodontite
mais que nos espcimes saudveis. Os autores indicaram um possvel envolvimento dessas
protenas na ativao das vias que regulam o reparo dos tecidos periodontais.
Soedarsono et al. (2006) ao estudarem a associao do polimorfismo dos genes
RANK/RANKL/OPG com a periodontite agressiva em 99 pacientes japoneses, verificaram
atravs da anlise de associao com tipos allicos, que os polimorfismos identificados nos
genes RANK/RANKL/OPG no tinham associao com a periodontite agressiva nessa
populao. Embora RANK/RANKL/OPG afete a remodelao ssea e desenvolva um papel
vital na regulao da fisiologia e patologia ssea, os autores no observaram forte evidncia
do maior papel dos polimorfismos na patognese da periodontite agressiva. Entretanto, sugere
que o mecanismo preciso da destruio ssea na periodontite agressiva permanece incerto, e
que mais pesquisas so requeridas para avaliar outras citocinas relacionadas
osteoclastognese na via RANK/RANKL/OPG que sejam marcadores genticos para
periodontite agressiva.
Chen et al. (2008), usando um modelo experimental de doena periodontal induzida
pela injeo de lipopolissacardeo (LPS) em primeiros molares de ratos Wistar, com ou sem a
transferncia do gene OPG para o periodonto, observaram que a injeo de LPS induzia
reabsoro ssea periodontal severa e que onde foi feita a transferncia local do gene OPG
houve induo da produo de OPG, e inibio da osteoclastognese e da reabsoro ssea
alveolar.
Buduneli et al. (2008), ao analisarem a concentrao salivar de RANKL e OPG
comparando indivduos fumantes e no fumantes com periodontite crnica, atravs do ELISA,
observaram que os indivduos fumantes apresentaram nveis significativamente mais baixos
de OPG em relao aos no fumantes, e nveis mais elevados de RANKL, mas sem diferena
estatisticamente significativa. Nos grupos sem terapia de suporte periodontal, os indivduos
fumantes exibiram nveis significativamente mais altos de agravos clnicos periodontais que
os no fumantes, enquanto nos grupos que estavam em terapia de manuteno, no houve
diferena significativa nos parmetros clnicos entre fumantes e no fumantes. Detectaram
diferena significativa nas concentraes de RANKL e OPG entre os grupos sem tratamento e
o grupo em manuteno. Os autores sugerem que as concentraes de RANKL e OPG so
afetadas pelo fumo, pois no s os fumantes sem tratamento, mas tambm os que estavam em
terapia de manuteno, exibiram altos nveis de RANKL e baixos nveis de OPG, em relao
aos no fumantes.
40
Sakellari, Menti, Konstantinidis (2008) investigaram os nveis de RANKL livres em

amostras de fluido gengival crevicular de pacientes saudveis e periodontalmente
comprometidos, atravs do ELISA, e correlacionaram com os parmetros clnicos e patgenos
periodontais importantes. Os resultados obtidos pelos autores mostraram: que a mdia dos
nveis de RANKL foi significativamente mais alta no grupo com periodontite comparado com
o controle; que houve correlao estatisticamente significativa entre os nveis de RANKL e a
contagem subgengival de T. denticola; e nenhuma correlao foi observada ente os nveis de
RANKL e a contagem das outras espcies, bem como com os parmetros clnicos.
Ernst et al. (2007) encontraram que as concentraes do RANKL e IL-10, mensuradas
atravs do ELISA, em tecidos periodontalmente comprometidos, foram correlacionadas
negativamente, enquanto RANKL e a IL-1, mostraram correlao positiva. No entanto, no
houve diferena significativa nas concentraes da IL-10 entre tecidos saudveis e doentes.
Para interpretar o fenmeno da correlao negativa entre a IL-10 e o RANKL, os autores
isolaram clulas mononucleares do sangue perifrico dos pacientes saudveis e doentes e
estimularam in vitro com a bactria Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa), tanto na
presena de IL-10 como na ausncia. Nesta anlise, encontraram que a adio da IL-10
suprimia tanto a proliferao quanto a produo de RANKL pelos linfcitos ativados pelo Aa,
indicando que a correlao negativa entre a IL-10 e o RANKL nos tecidos gengivais pode
resultar da funo supressora da IL-10, que age reduzindo a produo de RANKL pelas
clulas T ativadas.
Com o objetivo de avaliar os nveis de fatores relacionados osteoclastognese
(RANKL e OPG) no fluido crevicular de indivduos diabticos tipo2 bem controlados e
descompensados e a periodontite crnica antes e aps trs e seis meses de terapia periodontal
no cirrgica, Santos et al. (2010) estudaram 18 indivduos diabticos compensados e 20
descompensados. Os autores verificaram que as concentraes de RANKL e da razo
RANKL/OPG foram maiores nos indivduos descompensados em todos os perodos
analisados, enquanto que os nveis de OPG foram menores. Em adio, RANKL/OPG
diminuiu nos indivduos bem controlados, mas no nos indivduos descompensados aps trs
meses. Todos os parmetros clnicos melhoraram significativamente em ambos os grupos
aps tratamento.
2.3 CITOCINAS E A PERDA SSEA PERIODONTAL

sabido que a imunidade depende de duas respostas imunes especficas, a resposta
celular e a humoral, e o equilbrio entre elas fortemente regulado por fatores associados com
41
clulas apresentadoras de antgenos e citocinas produzidas pelas clulas CD4 + (Clulas T

helper - Th), as quais so divididas em Th1, Th2 e Th17, de acordo com o perfil de citocinas.
Vrios estudos tm demonstrado que algumas citocinas, tais como IL-1, IL-12, TNF-, INF, so envolvidas com a resposta Th1 e induzem principalmente a resposta mediada por
clulas. Em contraste, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 so envolvidas com a resposta Th2 e
promove a imunidade humoral devido produo de fatores de crescimento e de
diferenciao de clulas B. E citocinas como IL-17 e IL-23 esto envolvidas com a resposta
Th17. Os produtos caractersticos das citocinas das clulas Th1 e Th2 so mutuamente
inibitrios na diferenciao e funo efetora. Por exemplo, o INF- seletivamente inibe a
proliferao de clulas Th2, enquanto as IL-4 e IL-10 inibem a sntese de citocinas proinflamatrias pelas clulas Th1, tais como o TNF- que induz vrios eventos associados com
a inflamao, destruio tecidual, reabsoro ssea e produo de metaloproteinases de matriz
e prostaglandina E2. Todas as citocinas desenvolvem um papel crucial na resposta imuneinflamatria, e o desfecho da infeco pode ser atribudo ao equilbrio na razo relativa entre
elas. (GRSKA et al., 2003).
O reconhecimento que a periodontite envolve um componente inflamatrio bem como
altera o metabolismo sseo, tem fornecido uma nova perspectiva sobre a etiologia da doena.
Investigaes sobre a doena periodontal so agora consideradas dentro da osteoimunologia,
integrando a imunologia com a biologia ssea (COCHRAN, 2008). Diversos mediadores
inflamatrios e molculas que destroem os tecidos tm sido detectadas nos tecidos gengivais,
no fluido do sulco gengival e na saliva de pacientes afetados pela periodontite (MILLER et
al., 2006).
Vrias citocinas e fatores de crescimento so cruciais para diferenciao e maturao
do osteoclasto que a clula responsvel pela reabsoro ssea. Dentre estes, podemos citar
as interleucinas (IL-1, IL-3, IL-6, IL-11), TNF e GM-CSF. Estes fatores atuam pela
estimulao das clulas progenitoras de osteoclastos ou participando em um sistema
parcrino, no qual os osteoblastos e clulas da medula ssea esto fortemente envolvidos. Este
sistema parcrino essencial para o metabolismo do osso e seus mediadores incluem as
molculas RANK, RANKL e OPG. Quando o RANK liga-se ao seu ligante especfico, iniciase a osteoclastognese (LACEY et al., 1998; KUMAR, FAUSTO, ABBAS, 2005).
O tecido gengival inflamado contm numerosos tipos de mediadores inflamatrios, os
quais so capazes de estimular a reabsoro ssea e degradao da matriz extracelular,
incluindo IL-1, IL-3 L-6, IL-11, IL-17, Oncostatin M (OMS), TNF-, TNF-, bradicinina,
trombina e prostaglandinas (HOLMLUND, HNSTRM e LERNER, 2004). Essas citocinas
42
steo-reabsortivas so capazes de induzir a ostelise por meio da estimulao da reabsoro

ssea por osteoclastos presentes em torno do osso alveolar, no entanto, para que essa
reabsoro ocorra, necessrio que precursores dos osteoclastos sejam recrutados para rea
do osso perialveolar por essas citocinas que so descritas com um nome genrico de fatores
ativadores osteoclastos (FAOs) (LINS et al., 2007).
As quimiocinas representam uma grande famlia de citocinas quimiotticas que
estimulam o recrutamento das clulas inflamatrias e so produzidas por clulas do
periodonto, tais como fibroblastos, clulas endoteliais, macrfagos, osteoclastos, clulas
epiteliais, leuccitos polimorfo nucleares, moncitos e linfcitos. Algumas quimiocinas
contribuem para a induo da reabsoro ssea porque estimulam um ou mais passos da
reabsoro incluindo o recrutamento, diferenciao, ou fuso das clulas precursoras de
osteoclastos ou melhoram a sobrevivncias dos mesmos (SILVA, et al., 2007).
A inflamao e destruio tecidual vista na periodontite associada com o tecido
granuloamatoso contendo clulas inflamatrias, tais como linfcitos T e B, plasmcitos e
algumas clulas da linhagem de moncitos e macrfagos. Essas clulas so aptas a produzir
uma variedade de mediadores inflamatrios. Altos nveis de vrias citocinas, tais como
Interleucinas-1 (IL-1), IL-1, IL-6, prostaglandina E2 (PGE2) e TNF- , tem sido
encontrados em tecido e fluido crevicular gengival de pacientes portadores de periodontite
avanada (CROTTI et al., 2003).
Existe forte evidncia do papel da Interleucina 1 (IL-1) na mediao da perda ssea
estimulada pela patognese periodontal. Em humanos, sua expresso elevada no fluido
crevicular gengival em locais de recente perda ssea e/ou de insero em pacientes com DP.
A IL-6 contribui para reabsoro ssea sendo ento considerada uma citocina pr-inflamatria
e apesar de ser detectada nos tecidos gengivais clinicamente sadios, a sua secreo mostra-se
mais significativa e acentuada em stios de inflamao periodontal, estando essa citocina
intimamente associada atividade da doena (LU et al., 2006). Os stios inflamatrios da
periodontite apresentam nveis mais elevados de IL-6, quando comparados queles da
gengivite (LINS et al, 2007). O TNF- tambm possui um significante papel na perda ssea
caracterstica da DP (GRAVES, 2008).
Um desequilbrio entre o biofilme dental e a resposta imunolgica do hospedeiro
resulta em superexpresso de citocinas pro-inflamatrias e subseqente destruio do osso
alveolar. Entretanto, o mecanismo preciso da destruio ssea ainda no tem sido claramente
elucidado (LU et al., 2006). Em contraste com outras condies normais em que existe a
remodelao ssea, ou seja, a quantidade de formao ssea equivalente quantidade de
43
reabsoro ssea, a doena periodontal no apresenta formao ssea subseqente

reabsoro. (GRAVES, 2008).
A perda ssea decorrente de uma resposta a uma reao inflamatria depende de dois
fatores crticos. Primeiro, a concentrao dos mediadores inflamatrios presentes no tecido
gengival deve ser suficiente para ativar as vias que levam a reabsoro ssea. Segundo, os
mediadores inflamatrios devem penetrar no tecido gengival para alcanar uma distncia
crtica do osso alveolar (COCHRAN, 2008). Page & Schroeder (1981) mostraram que a
reabsoro ssea cessa quando criada uma distncia de 2,5mm entre o biofilme e o osso, e
concluram que as distncias menores que 2,5mm so provocadas pela invaso bacteriana no
tecido conjuntivo gengival: quanto mais prximas s clulas inflamatrias do osso, maior o
nmero de osteoclastos formados e, portanto, maior quantidade de degradao ssea.
Para atingir concentraes crticas de mediadores inflamatrios que levam a
reabsoro ssea necessria a expresso de citocinas pro-inflamatrias, tais como (IL)-1,-6,
-11 e -17, TNF-, fator inibitrio de leucemia e Oncostatin M. Durante a resposta
inflamatria, essas citocinas pro-inflamatrias, podem induzir a osteoclastognese pelo
aumento da expresso do RANKL e diminuio da produo de OPG nas clulas estromais e
osteoblastos. Em contraste, mediadores antiinflamatrios como IL-10 e IL-13, podem
diminuir a expresso de RANKL e/ou aumentar a expresso de OPG para inibir a
osteoclastognese (Figura 3). (LU et al., 2006; COCHRAN, 2008).
Figura 4. Estimulao e inibio da formao osteoclstica e reabsoro ssea envolvendo

interao
entre
citocinas
inflamatrias
RANK/RANKL/OPG (COCHRAN, 2008).
outros
mediadores
agindo
no
eixo
44
2.3.1 Fator de necrose tumoral alfa (TNF- )

O principal membro da superfamlia do TNF, o TNF-/ TNFSF1A uma citocina prinflamatria e imuno-regulatria que exerce um papel central no processo inflamatrio e na
apoptose celular e est envolvida na patognese de vrias condies inflamatrias (FRODGE
et al. 2008; MENDONA, 2008). produzido por moncitos-macrfagos e secretado por
uma variedade de tipos celulares aps receber o estmulo de certos componentes das bactrias
gram-negativas e exibe propriedades biolgicas pela ligao com dois receptores de altaafinidade (TNF-R), com tamanhos moleculares de 55 kDa e 75 kDa. (NIKOLOPOULOS et
al. 2008; MENDONA, 2008).
O TNF- induz uma srie de respostas biolgicas atravs dos seus dois receptores de
superfcie celular, denominados TNFR1 e TNFR2 (tambm chamado de TNFRp55 e TNFR
p75, respectivamente). Ambos podem traduzir sinais intracelulares que estimulam a quebra
proteoltica de I kB, um inibidor citoplasmtico do NFK B.
O NFkB ativado ento
translocado para o ncleo, onde induz a transcrio de vrios genes TNF -responsivos. Alm
disso, a ligao do TNF ao seu receptor TNFR1 desencadeia a morte celular programada em
muitas clulas. Este processo depende da presena do "domnio de morte", localizado na
regio citoplasmtica de TNFR1, que ausente em TNFR2 (KOBAYASHI et al. 2000)
O TNF- frequentemente encontrado em stios de inflamao, bem como na
circulao, e acredita-se que seja responsvel pela modulao da inflamao sistmica. A
circulao desta citocina principalmente derivada da liberao local pelos macrfagos e
clulas T em leses articulares inflamatrias, bem como pela circulao das clulas
mononucleares perifricas. Tem sido sugerido que o TNF- um importante fator na
progresso da periodontite e que participa da destruio tecidual pela estimulao da
produo de metaloproteinases da matriz (MMPs) (NILSSON e KOPP 2008).
Um dos papis mais importantes do TNF- inclui a regulao da diferenciao de
clulas hematopoiticas em clulas progenitoras. Pode tambm estimular a produo de
molculas de adeso como ICAM-1 auxiliando os leuccitos em sua capacidade de adeso s
clulas endoteliais (LINS et al. 2007), estimular produo de outras citocinas e quimiocinas,
como IL-1, IL-1, IL-6 e IL-8 e de MMPs (MENDONA, 2008). Finalmente, tal citocina
um dos reguladores mais importantes do processo de destruio ssea local caracterstica da
doena periodontal (GRAVES, 2008), agindo diretamente na estimulao dos precursores
osteoclsticos e indiretamente no controle do sistema OPG/RANKL, molculas-chaves do
metabolismo sseo (BOYCE et al., 2005; CSAR-NETO et al. 2008).
45
Diversos relatos apontam que o TNF- atua sinergicamente com a IL-1 e a IL-6,
promovendo a reabsoro ssea, e atua de forma similar a IL-1, induzindo forte diferenciao
osteoclstica pela modulao da expresso do RANKL. (LINS et al. 2007; CSAR-NETO et
al. 2008). O TNF- pode causar reabsoro atravs da habilidade de estimular a IL-1 e GMCSF, inibindo a sntese de colgeno do osso e induzindo colagenases a estimular a
diferenciao osteoclstica na presena de Fator
est imula nte
de
colnia
de
macrfagos M-CSF (FRODGE et al. 2008). Ento, o TNF- atua na reabsoro ssea
agindo tanto diretamente nos osteoclastos ou indiretamente atravs da induo da formao
osteoclstica atravs da estimulao do RANKL produzidos pelos osteoblastos. Dessa forma,
esta citocina pode influenciar a reabsoro ssea tanto na presena como na ausncia do
RANKL (BARTOLD et al., 2010).
Altos nveis da citocina TNF- tm sido encontrados no fluido crevicular gengival e
tecidos gengivais de leses periodontais, e claramente identificada como potente indutor de
destruio tecidual e reabsoro ssea em diferentes formas de doena periodontal
(MENEZES, COLOMBO, 2008). Alm de ser uma citocina crtica na resposta inflamatria a
infeces, a variabilidade gentica na produo do TNF- aps estmulos infecciosos pode
ter uma influncia potencial para o desfecho clnico da doena (SCAPOLI, MAMOLINI,
TROMBELLI L, 2007).
Frodge et al. (2008) avaliaram os nveis de TNF- e RANKL na saliva para verificar a
associao desse marcador com a remodelao e destruio ssea periodontal. Os resultados
mostraram que a mdia dos nveis de TNF- foi significativamente mais alta em indivduos
com doena periodontal e que os indivduos com nveis mais altos dessa citocina
apresentaram maior sangramento sondagem, profundidade de sondagem 4mm e perda de
insero 2mm.
Rai (2008) investigou os nveis salivares de TNF- em 25 pacientes com periodontite
e 10 pacientes saudveis e observou nveis significativamente mais altos dessa citocina nas
amostras dos pacientes com periodontite sugerindo que a permanente e prolongada presena
de altos nveis de TNF- na saliva pode contribuir para a progresso da periodontite.
Da et al. (2009) com o intuito de determinar o efeito da terapia periodontal no
cirrgica nos nveis de TNF- do soro de indivduos portadores de diabetes tipo 2, avaliaram
45 indivduos sendo 15 com diabetes bem controlada, 15 indivduos descompensados e 15
indivduos sistemicamente saudveis. O ndice de placa, o ndice gengival, a profundidade de
sondagem, a perda de insero clnica, o ndice de sangramento gengival, o valor da
hemoglobina glicada e a concentrao de TNF- circulante foram mensurados na linha base e
46
trs meses aps a terapia periodontal no cirrgica. Todos os parmetros clnicos periodontais
e os nveis de TNF- no soro diminuram significativamente trs meses aps a terapia. Os
valores da hemoglobina glicada foram significativamente menores somente nos indivduos
com diabetes tipo 2 bem controlada. Os autores concluram que embora a terapia periodontal
no cirrgica elimine a infeco e inflamao local e sistmica atravs da diminuio do
TNF-, esta no suficiente para reduzir os valores da hemoglobina glicada em pacientes
descompensados, sem um controle rigoroso da glicemia, num curto perodo de tempo.
Em outro estudo, Da et al. (2010) estudaram indivduos com doena renal crnica
com o objetivo de avaliar a associao entre os parmetros clnicos periodontais (IP, IG e PS)
e os nveis de TNF- e IL-8 no fluido crevicular gengival de 43 pacientes submetidos
hemodilise que possuam doena periodontal e 43 pacientes sistemicamente saudveis. Os
autores encontraram que os nveis do TNF- no fluido crevicular gengival dos pacientes
submetidos hemodilise foram significativamente maiores do que nos pacientes controle e
verificaram associao positiva entre essa citocina e os parmetros clnicos periodontais.
A artrite reumatide e a periodontite so condies inflamatrias crnicas comuns que
apresentam caractersticas clnicas e patognicas similares. Vrios estudos tm mostrado o
efeito benfico do tratamento periodontal sobre a severidade da artrite reumatide (ORTIZ, et
al., 2009). A atividade do TNF- considerada a de maior importncia patolgica nas
periodontites e artrites reumatides, e sua inibio por antagonistas biolgicos tem mostrado
sucesso (NILSSON e KOPP, 2008). Recentemente, agentes que bloqueiam o TNF- tm sido
desenvolvidos para o uso teraputico em pacientes com artrite reumatide e estudos em
animais e humanos sugerem que o anti- TNF- tambm pode ser usado na terapia para reduzir
a severidade das periodontites (NILSSON e KOPP, 2008; ORTIZ et al., 2009).
Diante disto, autores como Ortiz et al. (2009), se propuseram a avaliar o efeito da
terapia periodontal com e sem agentes bloqueadores de TNF- em 40 pacientes portadores de
artrite reumatide e periodontite severa. Nesse estudo, 20 indivduos receberam a medicao
de controle para artrite e os outros 20 receberam a mesma medicao associada com o antiTNF- . Os dois grupos foram aleatoriamente alocados para tratamento, sendo divididos em 4
grupos de 10: Grupo A (somente tratamento periodontal), grupo B (nenhum tratamento
periodontal e nenhuma droga anti-TNF- ), grupo C (tratamento periodontal e droga antiTNF-) e grupo D (somente anti-TNF- ). Os autores encontraram que a terapia anti- TNF-
sem o tratamento periodontal no teve efeito significativo na condio periodontal, no
entanto, os pacientes que receberam tratamento periodontal mostraram uma significativa
diminuio na mdia DAS28 (ndice que avalia a atividade da artrite) e reduo na
47
concentrao do TNF- do soro (Elisa), concluindo que a terapia periodontal de raspagem e

alisamento corono-radicular associada higiene oral pode contribuir para reduo dos sinais e
sintomas da artrite reumatide, bem como reduzir os nveis de TNF- no soro .
Ainda devido similaridade da periodontite com a artrite reumatide com relao ao
TNF- induzindo a reabsoro ssea, os benefcios do bloqueio dessa citocina, levou autores
como Pers et al. (2008) a determinar a sua eficcia no tratamento da periodontite. Os autores
detectaram que a perda de insero clnica diminuiu aps a terapia anti-TNF-, sugerindo que
o bloqueio da atividade do TNF- pode inibir a reabsoro ssea e ajudar no tratamento da
doena periodontal.
Mayer et al. (2009) tambm estudaram a influncia do anti-TNF- nos parmetros
clnicos e imunolgicos do periodonto comparando 10 indivduos com artrite reumatide que
receberam a infuso do anti-TNF-, 10 indivduos com artrite reumatide sem a terapia antiTNF- e 10 indivduos controle. Foram avaliados os nveis de TNF- no fluido crevicular
gengival bem como os parmetros clnicos: IP, IG, PS, PIC, Sangramento a sondagem. Os
autores encontraram uma correlao positiva e significativa entre os nveis de TNF- e a
perda de insero clnica. O tratamento com anti- TNF- reduziu os nveis de TNF- no
fluido crevicular gengival e levou a melhora clnica da condio periodontal.
Com o objetivo de investigar a associao entre mediadores pr-inflamatrios
circulantes (TNF- , IL-1, PGE2, serotonina, fator reumatide) e a periodontite em pacientes
com artrite reumatide, Nilsson e Kopp (2008) avaliaram 19 pacientes, dos quais coletaram
parmetros periodontais (nvel de insero, sangramento sondagem, profundidade de
sondagem) e avaliaram os nveis desses mediadores. Os resultados mostraram que pacientes
com altos nveis de TNF- em repetidas amostras de plasma tiveram maior freqncia de
sangramento sondagem, bem como aumento de profundidade de sondagem e maior perda de
nvel de insero comparados com aqueles que apresentaram baixos nveis.
Ao avaliarem a relao entre os parmetros clnicos periodontais e o perfil de citocinas
em tecidos gengivais inflamados e amostras de soro de 25 pacientes com periodontite crnica,
Grska et al. (2003) observaram atravs do Elisa que as concentraes da IL-1, TNF-, IL-2
e INF- foram em mdia significativamente mais altas nas amostras de soro e bipsias de
tecidos gengivais de pacientes com periodontite comparados com pacientes saudveis. Em
contraste, os nveis de IL-4 e IL-10 foram geralmente mais baixos ou no detectveis nos
pacientes doentes e significativamente mais altos nos pacientes saudveis. No foi observada
nenhuma associao entre as concentraes dessas citocinas e os parmetros clnicos
periodontais.
48
Mediadores inflamatrios, tais como TNF- e IL-1, iniciam a destruio tecidual

atravs da produo de proteases que degradam a matriz extracelular, principalmente as
MMPs, e ativam mecanismos de reabsoro ssea pela interao entre o RANK e o RANKL
o que leva a diferenciao e ativao de osteoclastos.
Por outro lado, citocinas
antiinflamatrias, tais como IL-10, apresentam papel protetor, inibindo tanto as MMPs atravs
da induo das TIMPs, como o sistema RANK/RANKL ao estimular a produo de OPG,
inibindo assim, a reabsoro ssea (CLAUDINO et al., 2008).
49
PROPOSIO
50
3 PROPOSIO
O propsito deste estudo foi comparar a expresso imuno-histoqumica de fatores
relacionados com a reabsoro ssea: RANKL e OPG, e uma citocina pr-inflamatria (TNF) na doena periodontal, entre os espcimes teciduais de gengiva clinicamente saudvel, de
gengivite induzida por biofilme dentrio e de periodontite crnica, correlacionando-a com os
parmetros clnicos periodontais, com o intuito de fornecer subsdios para melhor
compreenso do papel desses marcadores na patognese e progresso da doena periodontal.
51
MATERIAIS E MTODOS
52
4 MATERIAS E MTODOS
4.1 IMPLICAES TICAS
A presente pesquisa foi submetida apreciao do Comit de tica em Pesquisa da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) sob protocolo 040/2009 e obteve o
parecer favorvel sob o nmero: 150/2009 (anexo I).
4.2 CARACTERIZAO DO ESTUDO

O estudo caracterizou-se como uma pesquisa descritiva observacional baseada em
estudo morfolgico e anlise comparativa da imunoexpresso dos anticorpos RANKL, OPG e
TNF- em espcimes de gengivas clinicamente saudveis, gengivas com gengivite induzida
por biofilme dental e gengivas em stios de periodontite crnica.
4.3 POPULAO
A populao objeto do presente estudo foi constituda por indivduos adolescentes e
adultos sem alteraes sistmicas e no fumantes que necessitassem de procedimentos
periodontais ressectivos, sejam para fins estticos ou curativos, com diagnstico clnico de
gengiva clinicamente saudvel, gengivite ou periodontite crnica, dos quais os espcimes
teciduais gengivais obtidos fossem registrados e emblocados em parafina, no Servio de
Anatomia Patolgica da Disciplina de Patologia Oral do Curso de Odontologia da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN, compreendendo o ano de 2009.
4.4 PROCESSO DE AMOSTRAGEM

4.4.1 Coleta dos espcimes teciduais gengivais
Os espcimes foram obtidos nas clnicas da Disciplina de Periodontia da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, de pacientes submetidos a cirurgias periodontais ressectivas
para fins estticos (gengivoplastia e cirurgia para correo de sorriso gengival), curativos
(cirurgias de aumento de coroa clnica por indicao prottica ou restauradora) ou ainda de
exodontias indicadas, quando se fez necessria a exrese da papila interdental para melhor
coaptao das bordas na sutura e regularizao do rebordo alveolar para fins protticos. Todos
os espcimes foram fixados em Formol a 10% e encaminhados ao Servio de Anatomia
Patolgica da Disciplina de Patologia Oral do Curso de Odontologia da Universidade Federal
53
do Rio Grande do Norte/UFRN. Antes dos procedimentos cirrgicos, realizou-se um exame

clnico periodontal detalhado para o correto diagnstico e indicao cirrgica por um
especialista em Periodontia.
Todos os indivduos pr-selecionados para essa pesquisa, foram informados da
natureza, benefcios, possveis riscos do presente estudo e seu direito de desistncia durante
qualquer etapa do mesmo. Foram includos pacientes que, aps a leitura do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (apndice I), aceitaram participar da pesquisa mediante
assinatura do mesmo, atestando que estavam cientes do objetivo da pesquisa e concordaram
em participar da mesma.
4.4.2 Critrios de incluso
Foram includos na amostra espcimes de pacientes:
Portadores de gengivite induzida por biofilme dental;
Portadores de periodontite crnica;
Portadores de gengivas clinicamente saudveis que se submeteram a cirurgias

estticas;
Que se submeteram a cirurgias para: aumento de coroa clnica para fins protticos e
restauradores; gengivoplastia para correo de aumento gengival induzido pelo
biofilme dental; exodontias por indicao, ortodntica, prottica ou periodontal que
necessite da remoo cirrgica da papila interdental.
4.4.3 Critrios de excluso

Foram excludos da amostra espcimes de pacientes:
Portadores de Periodontite Agressiva;
Portadores de Gengivites associadas a outros fatores que no sejam ao biofilme dental;
Que apresentaram alteraes sistmicas citadas durante anamnese;
Que tinham feito uso de antibiticos ou antimicrobianos locais ou sistmicos pelo

menos 3 meses antes do procedimento;
Que fossem fumantes;
54
Que foram submetidos a cirurgias periodontais que no necessitava da remoo do

tecido gengival, como: enxertos gengivais; enxertos de tecido conjuntivo; retalhos
para raspagem a campo aberto com inciso intra-sulcular e marginal.
4.5 AMOSTRA
A amostra constou de 83 espcimes gengivais obtidos de 74 pacientes:
Grupo controle (CS): Doze espcimes de gengiva clinicamente saudvel colorao

rsea, consistncia firme, contorno festonado da margem gengival, papilas firmes que
ocupam todo o espao disponvel abaixo das reas de contato e ausncia de
sangramento sondagem delicada (LINDHE, KARRING E LANG, 2005).
Profundidade de sondagem menor que 3mm em todos os stios.
Grupo G: Quarenta e dois espcimes de gengiva exibindo clinicamente Gengivite

induzida por biofilme profundidade de sondagem pode estar alterada, apresentando
sangramento espontneo ou sondagem periodontal, sem perda de insero
periodontal.
Grupo PC: Vinte e nove espcimes de gengiva exibindo clinicamente Periodontite

Crnica (PC) - profundidade de sondagem maior ou igual a 4mm, apresentando
sangramento espontneo ou sondagem periodontal, com perda de insero
periodontal.
4.6 EXAME CLNICO PERIODONTAL

Para realizao do exame periodontal, todos os cuidados de biossegurana foram
tomados: Equipamento de Proteo Individual (EPI) para o examinador; esterilizao em
autoclave para os materiais crticos; descontaminao do equipo e cadeira. O exame clnico
periodontal foi realizado por um nico examinador. Antes do exame clnico, os pacientes prselecionados responderam a uma ficha clnica (apndice II) contendo dados pessoais e
demogrficos, anamnese e exame periodontal para anlise dos parmetros abaixo:
Profundidade de Sondagem (PS): definida como a distncia que vai da margem

gengival livre at o ponto em que a extremidade de uma sonda periodontal inserida na
bolsa com fora moderada encontra resistncia (LINDHE, KARRING e LANG,
2005). A sondagem de sulcos e bolsas foi realizada utilizando-se sonda periodontal
55
com marcao de Williams (Trinity periodontia Jaragu, SP, Brasil), nos seguintes
locais: vestibular, disto-vestibular, msio-vestibular, lingual, msio-lingual e distolingual.
Perda de Insero Clnica (PIC): Distncia compreendida entre a juno cementoesmalte e o fundo do sulco ou bolsa periodontal, medida em milmetros com auxlio
de uma sonda periodontal com marcao de Williams.
Recesso gengival (RG): definida como a distncia em milmetros da juno cementoesmalte at a margem gengival livre. A verificao da presena de recesso gengival
tambm ser realizada atravs do auxlio de uma sonda periodontal com marcao de
Williams, nos seguintes locais: vestibular, disto-vestibular, msio-vestibular, lingual,
msio-lingual e disto-lingual.
Sangramento Sondagem (SS): definido como sangramento que ocorre aps

sondagem, quando a sonda inserida at o fundo do sulco gengival ou bolsa
periodontal e removida suavemente ao longo da superfcie do dente (LINDHE,
KARRING e LANG, 2005). Cada dente na ficha ser representado por um quadrado e
cada superfcie dentria por um tringulo (vestibular, palatina/lingual, mesial e distal).
Desse modo foi considerado positivo ou negativo.
o Positivo - presena de sangramento sondagem at 30 segundos aps retirada
da sonda
o Negativo ausncia de sangramento sondagem
Mobilidade (MB): O aumento da mobilidade dentria resultante da perda contnua dos

tecidos de suporte na doena periodontal progressiva ou da sobrecarga dentria e
trauma de ocluso, foi classificado, no presente estudo, em: Grau I: mobilidade da
coroa do dente somente no sentido vestbulo-lingual e/ou palatino; Grau II:
mobilidade da coroa dentria nos sentidos vestbulo-lingual e/ou palatino e msiodistal ; Grau III: mobilidade da coroa do dente nos sentidos vertical (movimento de
intruso) e horizontais. Neste estudo, a mobilidade dentria foi avaliada com auxlio
do cabo de espelho e pina clnica.
Mucosa Ceratinizada (MC): definida como a distncia que vai da margem gengival
livre at a juno muco-gengival, compreendendo a gengiva livre e a gengiva inserida
(LINDHE, KARRING e LANG, 2005). A mucosa ceratinizada ser avaliada tambm
56
com o uso da sonda periodontal com marcao de Williams e medida em milmetros,

no centro da face vestibular de cada dente.
4.7 ELENCO DE VARIVEIS

As variveis independentes esto apresentadas no quadro 1 e as variveis dependentes
so apresentadas no quadro 2.
VARIVEL
DEFINIO
CLASSIFICAO
CATEGORIA / ESCALA
DE MEDIDA
INDEPENDENTE
Conformao particular que distingue

o macho da fmea, atribuindo-lhes um
papel determinado e conferindo-lhes
certas caractersticas distintivas.
Mutuamente Exclusiva
Idade
Durao ordinria da vida.
Quantitativa contnua
Anos
Raa
Classificao da populao com base

na cor da pele.
Categrica Nominal
1-Branca
mutuamente exclusiva
2-Parda
Sexo
Categrica Nominal
1- Masculino
2 Feminino
3-Negra
Profundidade
de Sondagem
Perda de
Insero clnica
Recesso
Distncia compreendida entre a

margem gengival e o fundo do sulco
ou bolsa periodontal.
Milmetros
Distncia compreendida entre a juno

cemento-esmalte e o fundo do sulco ou
bolsa periodontal.
Milmetros
Distncia que vai da juno cementoesmalte at a margem gengival livre.
Milmetros
Mobilidade dentria, classificada em

Grau I: mobilidade da coroa do dente
somente no sentido vestbulo-lingual
e/ou palatino; Grau II: mobilidade da
coroa dentria nos sentidos vestbulolingual e/ou palatino e msio-distal ;
Grau III: mobilidade da coroa do dente
nos sentidos vertical e horizontais.
Categrica ordinal
Grau I
Gengival
Mobilidade
Quadro 1. Variveis independentes, definio, classificao e categorias.
Grau II
Grau III
57
VARIVEL
DEFINIO
CLASSIFICAO
CATEGORIA / ESCALA
DE MEDIDA
DEPENDENTE
Anticorpo anti-RANKL
N me ro de cl ul a s RAN KLposi t i va s n o t ot al d e 5
ca mpo s
par a
cad a
cas o
an al i sad o, send o os val or es
ex pre ssos em p erc ent a ge m.
Quantitativa
Nmero
Anticorpo anti-OPG
N me ro d e cl ul as O P Gposi t i va s n o t ot al d e 5
ca mpo s
par a
cad a
cas o
Quantitativa
Nmero
Anticorpo anti- TNF-
N me ro de c l u l as TNF -posi t i va s n o t ot al d e 5
ca mpo s
par a
cad a
cas o
Quantitativa
Nmero
Quadro 2. Variveis dependentes, definio, classificao e categorias
4.8 ANLISE MORFOLGICA

A anlise morfolgica foi realizada em microscopia de luz, a partir de cortes
histolgicos de 5m de espessura, corados pela tcnica da Hematoxilina / Eosina (H/E). Esta
anlise teve por objetivo verificar a qualidade dos espcimes teciduais para posterior preparo
dos cortes de imuno-histoqumica e avaliar a intensidade do infiltrado inflamatrio de acordo
com adaptao de Tsai et al. (2004). Cada espcime teve o infiltrado graduado no aumento de
400X, considerando trs teros partindo do epitlio para o tecido conjuntivo. Sendo
considerado leve quando as clulas inflamatrias estavam restritas ao 1/3 superior do campo
prximo ao epitlio, moderado quando o infiltrado ocupava entre 1/3 e 2/3 do campo; e
intenso quando se apresentaram localizadas em mais de 2/3 do campo em direo a
profundidade do espcime. A anlise morfolgica foi do tipo cega, ou seja, o nico
examinador no tinha conhecimento do diagnstico clnico do espcime que analisava.
4.9 ESTUDO IMUNO-HISTOQUMICO

Os e spcimes fixados em formol a 10% e emblocados em parafina foram
su bmetidos a cortes histolgicos de 3m de espessura, montados em lminas de vidro
previamente limpas, preparadas com adesivos base de 3-aminopropyltrietoxi-silano (Sigma
Chemical CO, St. Louis, MO, EUA). Aps esse processo, as lminas foram submetidas
58
tcnica
da
imuno-histoqumica
pelo
mtodo
da
estreptoavidina-biotina
(SABC -
str ep toavidin biotin co mp lex), usando anticorpos primrios a nt i-RA NKL, anti-OPG
e a nt i- TNF- conforme especificaes no quadro 3.
Clone
Especificidade
Recuperao Antignica
Diluio
Tempo de
incubao
N-19 (sc-7628)*
RANKL
Citrato pH6.0 Pascal
1:200
Overnight
N-20 (s c-8468)*
OPG
Citrato pH6.0 Pascal
1:200
Overnight
2c8*
TNF-
Pepsina 0,5% 30`37C
1:100
Overnight
Quadro 3. Clone, especificidade, recuperao antignica, diluio, tempo de incubao e

fabricante dos anticorpos utilizados. * Santa Cruz Biotechnology
A tcnica da imuno-histoqumica se procedeu seguindo os seguintes passos laboratoriais:

Desparafinizao em banhos de Xilol:
o Xilol 1 (30 minutos) 59
o Xilol 2 (20 minutos) Temperatura Ambiente (TA)
Rehidratao em cadeia descendente de etanis:
o Etanol Absoluto I (5 minutos) TA
o Etanol Absoluto II (5 minutos) TA
o Etanol Absoluto III (5 minutos) TA
o Etanol 95 (5 minutos) TA
o Etanol 80 (5 minutos) - TA
Remoo do pigmento formlico com hidrxido de Amnia a 10% em etanol a 95%
(10 minutos) TA
Lavagem em gua corrente (10 minutos)
Passagem dupla em gua destilada (5 minutos cada)
Recuperao antignica
59

Bloqueio da peroxidase endgena com perxido de hidrognio (H2O2) 10 volumes (2
trocas)
Incubao em soluo tampo TRIS-HCL (Tris-hidroximetil-aminometano, Sigma
Chemical, CO, St. Louis, MO, EUA)
Incubao dos anticorpos primrios diludos em soluo tampo de TRIS-HCL (pH
7,4) acrescida de albumina srica bovina a 1% conservada em azida sdica a 0,1%
(BSA Bioset / AS, So Paulo, Brasil)
Recuperao antignica: Citrato pH6 por 10 minutos na panela Pascal
Incubao dos anticorpos primrios: Anti-RANKL, anti-OPG e anti- TNF- conforme
a otimizao da tcnica (Quadro 3)
Lavagem dupla de 5 minutos cada, em soluo de Tween 20 a 1% em TRIS-HCL.
Incubao em TRIS-HCL 2 trocas (5 minutos cada)
Incubao do anticorpo secundrio Biotinylated link (Kit Santa Cruz Cytomation
LSAB+ System-HRP) durante 30 minutos
Lavagem TRIS-HCL, pH 7,4
Incubao TRIS-HCL, pH 7,4 (02 passagens 05 minutos cada).
Incubao do complexo estreptoavidina HRP (Kit DAKO Cytomation LSAB+
System-HRP) durante 30 minutos - TA
Lavagem TRIS-HCL, pH 7,4.
Incubao TRIS-HCL, pH 7,4 (02 passagens 05 minutos cada).
Incubao em soluo cromgena preparada em 25 a 30 mg de diaminobenzidina
(93,3-diaminobenzidina, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA) diluda em 100 ml
de TRIS-HCL, acrescida de 1,2 ml de perxido de hidrognio a 10 volumes, durante
03 minutos em cmara escura.
60
gua corrente 10 minutos

gua destilada (02 passagens) 05 minutos cada
Contracolorao com hematoxilina de Mayer 10 minutos -TA
gua corrente 10 minutos
gua destilada (02 passagens) 05 minutos cada
Desidratao
Diafanizao
Montagem da lamnula em resina Permount (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ,
USA).
4.10 ANLISE DAS CLULAS IMUNOMARCADAS

Foi realizada anlise quantitativa da marcao imuno-histoqumica dos antgenos em
todos os espcimes includos na amostra. O parmetro consistiu na positividade da marcao,
sendo consideradas positivas as clulas do tecido conjuntivo que exibiram colorao
acastanhada, quer seja no ncleo ou seu citoplasma, independente da intensidade da
marcao. Em aumento de 100x os campos foram escolhidos e, com aumento final de 400x,
foram contadas as clulas positivas. Dessa forma, calculou-se os ndices de marcao dos
anticorpos do estudo em porcentagem de clulas positivas no total de cada caso.
Para a anlise das protenas RANKL, OPG e TNF- sob aumento total de 400x, foram
capturadas imagens de 05 campos de cada um dos casos (Adaptado de MENEZES et al.,
2006), por meio de mquina fotogrfica digital OLYMPUS E-330 (Olympus CorporationTokyo, Japan), acoplada ao microscpio OLYMPUS CX41 (Olympus Corporation- Tokyo,
Japan). As imagens obtidas foram analisadas, por meio do programa Image J (Image and
Processing Analysis in Java- Rasband, W.S., ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda,
Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2004), por dois observadores, em momentos
distintos. Atravs desse programa, foram contadas as clulas positivas e negativas para cada
anticorpo, de cada um dos 05 campos de todos os casos, e obteve-se o percentual mdio de
clulas positivas de cada caso. A contagem das clulas foi do tipo cega e realizada por dois
examinadores, ou seja, no momento da contagem, os examinadores no sabiam o diagnstico
clnicos dos casos.
61
4.11 ANLISE DOS DADOS

Os resultados obtidos foram organizados em um banco de dados em uma planilha de
Excel, os quais foram posteriormente transferidos para software SPSS 17.0 para ambiente
Windows, que foram submetidos a testes estatsticos adequados, a fim de testar as hipteses
levantadas. As variveis categricas que caracterizaram a amostra foram descritas com suas
freqncias absolutas e percentuais e as variveis quantitativas foram descritas com medidas
de tendncia central e disperso.
A anlise descritiva tambm foi realizada para os aspectos histopatolgicos das
amostras de tecido gengival no que diz respeito distribuio do infiltrado por teros,
classificando a intensidade do infiltrado inflamatrio em leve, moderado e intenso, bem como
a associao com condio clnica e com a perda de insero clnica.
O teste de Kruskal-Wallis foi empregado para avaliar a existncia de diferena entre a
imunoexpresso dos anticorpos anti-RANKL, anti-OPG, da razo RANKL/OPG e do antiTNF- e a condio clnica. Para verificar uma possvel diferena entre a quantidade de
clulas imuno-positivas para os anticorpos anti-RANKL, anti-OPG e anti-TNF- e a razo
percentual de RANKL/OPG, com relao perda de insero clnica e mobilidade dentria,
nos casos de periodontite crnica, empregou-se o teste de Mann-Whitney. Para anlise de
possveis correlaes entre a quantidade de clulas imunomarcadas pelos anticorpos antiRANKL, anti-OPG, anti-TNF- e a razo RANKL/OPG entre si e com a profundidade de
sondagem, recesso gengival e perda de insero clinica em todos os casos, foi aplicado o
coeficiente de correlao de Spearman.
Todos os testes foram realizados tomando como base o nvel de significncia de 5% (p<0,05).
62
RESULTADOS
63
5 RESULTADOS
A amostra do estudo foi composta por 83 espcimes de tecidos gengivais obtidos de
74 indivduos adolescentes e adultos sem alteraes sistmicas e no fumantes, e
posteriormente dividia em trs condies clnicas distintas, de acordo com o diagnstico
clnico-radiogrfico: espcimes de gengiva clinicamente saudveis que compuseram o Grupo
CS (controle), amostras de tecido com gengivite crnica (Grupo G) e de periodontite crnica
(Grupo PC).
5.1 CARACTERIZAO DA AMOSTRA

As caractersticas descritivas da amostra no que se refere ao sexo, raa, idade,
condio clnica e mobilidade dentria, sendo esta ltima aplicada somente para os casos de
periodontite crnica, podem ser observadas na Tabela 1.
Tabela 1. Freqncia absoluta e percentual das variveis independentes categricas e medidas

de tendncia central e disperso para a varivel independente, idade. Natal/RN,
2011.
Varivel Independente
Sexo
Categoria
Feminino
Masculino
67
16
80,7
19,3
Branca
Parda
Negra
33
44
06
39,8
53,0
7,2
Saudvel
Gengivite crnica
Periodontite crnica
12
42
29
14,46
50,60
34,94
9
6
3
11
31,0
20,7
10,3
37,9
Raa
Condio clnica
Mobilidade dentria
Idade
Ausente
Grau I
Grau II
Grau III
Varivel quantitativa
Mdia DP
35,22 14,93
Mediana
33
Q25-Q75
23-47
64
A amostra analisada no estudo foi proveniente de indivduos adolescentes e adultos

que no apresentavam alteraes na condio sistmica e no eram fumantes, com idade
mdia de 35 anos, predominantemente do sexo feminino e a raa com predominncia de
indivduos pardos. Com relao mobilidade dentria, a maioria dos casos de periodontite
crnica (68,9%) apresentou algum grau de mobilidade dentria (Tabela 1).
A tabela 2 mostra os parmetros clnicos, profundidade de sondagem e recesso
gengival, analisados para todos os espcimes.
Tabela 2. Medidas de tendncia central e disperso para as variveis independentes e

quantitativas do estudo relacionadas aos parmetros clnicos de todos os casos.
Natal/RN, 2011.
Varivel independente
Mdia DP
Mediana
Q25-Q75
2,92 1,63
2,5
23
Recesso gengival
0,90 1,68
0,00
01
Na tabela 3, esses parmetros clnicos juntamente com a perda de insero clnica

foram observados separadamente para os casos de periodontite crnica, bem como a mdia de
idade dos indivduos portadores dessa doena.
Tabela 3. Medidas de tendncia central e disperso para as variveis independentes e
quantitativas do estudo relacionadas aos casos de periodontite. Natal/RN, 2011
Varivel independente
Mdia DP
Mediana
Q25-Q75
Idade
47,66 11,02
47,0
40,0-53,5
4,26 2,1
3,0
3,0-5,75
Recesso gengival
2,57 1,97
3,0
0,0-4,0
Perda de Insero clnica
6,74 2,59
6,50
5,0-8,25
A amostra total apresentou uma considervel variao na profundidade de sondagem,

sendo esta entre 1mm e 10mm e na recesso gengival entre 0 e 7mm. Quando se avaliou
somente o grupo PC, observou-se que a mdia da idade foi superior a da amostra total, bem
como a mdia dos parmetros clnicos. A perda de insero clnica, observada s nos casos de
periodontite, variou entre 2mm e 14mm, observando-se assim, que na amostra existiram casos
de periodontite leve, moderada e severa, no entanto 82,76% foram de periodontite severa.
65
5.2 ANLISE MORFOLGICA
5.2.1 O infiltrado inflamatrio e as condies clnicas
A anlise descritiva dos aspectos histopatolgicos das amostras de tecido gengival no

que diz respeito distribuio do infiltrado por teros, classificando a intensidade do
infiltrado inflamatrio em leve, moderado e intenso, bem como a associao com condio
clnica, podem ser observadas na Figura 5.
100,00%
80,00%
60,00%
40,00%
20,00%
0,00%
Saudvel
Gengivite
Periodontite
Total da
amostra
Leve
58,30%
14,30%
0%
15,70%
Moderado
41,70%
40,50%
17,20%
32,50%
0%
45,20%
82,80%
51,80%
Intenso
Figura 5. Condio clnica e intensidade do infiltrado inflamatrio. Natal, RN. 2011.
Quando se avaliou a intensidade do infiltrado inflamatrio em todos os espcimes sem

subdiviso da condio clnica, observou-se que a totalidade da amostra foi constituda em
sua maior parte por infiltrado inflamatrio de moderado a intenso, constituindo 84,3% dos
casos.
5.2.1.1Gengiva clinicamente saudvel
Todos os casos de gengivas clinicamente saudveis apresentavam um epitlio de
superfcie pavimentoso estratificado ceratinizado, com fragmento de epitlio sulcular,
pavimentoso estratificado no ceratinizado. Na lmina prpria evidenciou-se que todos os
casos exibiram de leve a moderado infiltrado inflamatrio, sendo este em situao
justaepitelial at o tero mdio do espcime, com distribuio difusa e predominantemente
linfoplasmocitrio (Figuras 6 e 7).
66
5.2.1.2 Gengivite crnica

Os casos classificados como gengivite crnica, exibiram infiltrado inflamatrio de
distribuio difusa, sendo por vezes observada uma coleo de clulas inflamatrias em forma
de placa justaepitelial e geralmente em situao perivascular. O tipo de infiltrado que
predominou foi o linfoplasmocitrio. A maioria dos casos (85,7%) exibiu um infiltrado
inflamatrio de moderado a intenso, ou seja, envolvendo de dois a trs teros da profundidade
do espcime (Figuras 8 e 9).
5.2.1.3 Periodontite crnica
Os casos classificados como periodontite crnica, exibiram infiltrado inflamatrio de
distribuio difusa, sendo por vezes observada uma coleo de clulas inflamatrias de forma
predominantemente difusa. A vascularizao apresentou-se mais pronunciada, com vasos
sanguneos dilatados e ingurgitados de hemcias. A maioria dos casos exibiu um intenso
infiltrado inflamatrio (82,8%), ocupando os trs teros da profundidade do espcime,
predominantemente plasmocitrio (Figura 10, 11, 12 e 13).
67
Figura 6. Fotomicrografia de gengiva clinicamente saudvel mostrando a

presena de leve infiltrado inflamatrio (H/E, 200X).
Figura 7. Fotomicrografia de gengiva clinicamente saudvel (H/E, 400X).
68
Figura 8. Fotomicrografia de gengivite crnica exibindo moderado e difuso

infiltrado inflamatrio (H/E, 200X).
Figura 9. Fotomicrografia de gengivite crnica destacando infiltrado inflamatrio

linfoplasmocitrio em situao perivascular (H/E, 400X).
69
Figura 10. Fotomicrografia de periodontite crnica exibindo intenso e difuso

infiltrado inflamatrio (H/E, 200X).
Figura 11. Fotomicrografia de Periodontite crnica destacando infiltrado

inflamatrio plasmocitrio (H/E, 400X).
70
Figura 12. Fotomicrografia de periodontite crnica exibindo infiltrado inflamatrio

em toda profundidade do espcime (H/E, 100X).
Figura 13. Fotomicrografia de periodontite crnica exibindo intenso infiltrado

inflamatrio plasmocitrio (H/E, 400X).
71
5.2.2 Anlise comparativa entre a Intensidade do infiltrado inflamatrio e a

Perda de insero clnica
As variveis qualitativas, intensidade do infiltrado inflamatrio e perda de
insero clnica foram cruzadas na tentativa de se obter alguma associao. Para
isto, a varivel perda de insero clnica, relacionada ao grupo da periodontite
crnica, foi categorizada pela mediana que teve o valor de 6,5mm, subdividindo o
grupo em menor e maior perda de insero.
A figura 14 mostra os resultados relacionados intensidade do infiltrado
inflamatrio nos casos de periodontite crnica, comparando com a perda de
insero clnica.
150,00%
100,00%
50,00%
0,00%
Moderada
Severa
0 a 6,5mm
> 6,5mm
31,30%
0,00%
69%
100%
FIGURA 14. Intensidade do infiltrado inflamatrio e perda de Insero Clnica.

Natal, RN. 2011.
Quando se comparou a intensidade do infiltrado inflamatrio com a perda
de insero clnica, observou-se que, nenhum caso de periodontite apresentou
infiltrado inflamatrio leve, apenas 31,30% dos casos (n=5) com perda de
insero menor ou igual a 6,5mm apresentaram intensidade moderada e que
quanto maior a perda de insero, maior a tendncia de o infiltrado ser mais
intenso.
5.3 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUMICOS
5.3.1 Anlise dos percentuais de positividade da imunoexpresso para os

anticorpos anti-RANKL, anti-OPG e da razo RANKL / OPG e a condio
clnica.
Na tabela 4 observa-se os dados referentes anlise estatstica para as
variveis quantitativas: RANKL e OPG, com base nos percentuais de clulas
72
imuno-positivas no total de clulas para tais anticorpos e da razo RANKL/OPG

em relao s trs condies clnicas.
Tabela 4. Medidas de tendncia central e disperso para as variveis dependentes
quantitativas: RANKL, OPG e RANKL/OPG em relao varivel
independente principal: condio clnica e sua significncia estatstica.
Natal/RN, 2011.
Anticorpo
RANKL
Mediana
Saudvel
(n=12)
54,81
Gengivite
(n=42)
50,78
Periodontit
e (n=29)
51,63
Q25-Q75
49,86 67,17
39,00 69,12
40,31 75,39
Mdia
47,92
39,83
42,69
Mediana
62,99
59,23
68,56
Q25-Q75
57,38 72,79
50,87 64,51
62,91 72,71
Mdia
44,75
32,38
54,79
Mediana
0,882
0,880
0,828
Q25-Q75
0,696 1,149
0,671 1,205
0,597 1,026
Mdia
45,08
44,81
36,66
p*
0,581
Postos
OPG
0,001
Postos
RANKL/OPG
0,334
Postos
* Teste de Kruskal Wallis
Analisando a tabela 4 pode-se observar
que houve diferena
estatisticamente significativa para OPG, quando foram comparadas as trs

condies clnicas, sendo o maior nmero de clulas positivas para este anticorpo
encontrado nos casos de periodontite crnica, seguidos dos casos de gengiva
clinicamente saudvel. Com relao ao RANKL, no foi encontrada diferena
estatisticamente significativa, no entanto, os casos de periodontite crnica
apresentaram maior positividade que os casos de gengivite crnica, fato
semelhante ao da OPG. Quando foi comparada a razo RANKL/OPG, no se
observou diferena estatisticamente significativa entre os trs grupos. As figuras
73
de 15 a 22, a seguir, demonstram essa imunoexpresso que foi considerada em

todas as clulas do tecido conjuntivo.
Figura 15. Fotomicrografia demonstrando marcao para RANKL em

regio perivascular e subepitelial em gengiva clinicamente saudvel
(LSAB, 400).
Figura 16. Fotomicrografia destacando forte imunomarcao para RANKL

em gengiva clinicamente saudvel associada principalmente a linfcitos
(LSAB, 400).
74
Figura 17. Fotomicrografia demonstrando marcao para RANKL em regio

perivascular e associada a clulas inflamatrias em gengivite crnica (LSAB,
400).
Figura 18. Fotomicrografia exibindo fraca imunomarcao para RANKL em

relao quantidade de clulas inflamatrias na gengivite crnica (LSAB,
400).
75
Figura 19. Fotomicrografia demonstrando forte imunopositividade para

RANKL com distribuio difusa acompanhando o intenso infiltrado
inflamatrio linfoplasmocitrio na periodontite crnica (LSAB, 400).
Figura 20. Fotomicrografia demonstrando moderada marcao para OPG

em gengiva clinicamente saudvel (LSAB, 400).
76
Figura 21. Fotomicrografia exibindo fraca imunomarcao para OPG em gengivite

crnica (LSAB, 400).
Figura 22. Fotomicrografia demonstrando imunomarcao marcante da OPG na

periodontite crnica (LSAB, 400).
77
5.3.2 Anlise dos percentuais de positividade da imunoexpresso para o

anticorpo anti-TNF- e a condio clnica.
A tabela 5 expressa os dados referentes anlise estatstica para a varivel
quantitativa TNF-, com base nos percentuais de clulas imuno-positivas no total
de clulas em relao s trs condies clnicas.
Tabela 5. Medidas de tendncia central e disperso para a varivel dependente

quantitativa: TNF- em relao varivel independente principal:
condio clnica e sua significncia estatstica. Natal/RN, 2011
Condio
Clnica
Saudvel
12
Gengivite
42
29
Periodontite
* Teste de Kruskal Wallis
TNF-
Mdia
Postos
21,08
40,02
53,52
Med
p*
Q25-75
<0,001
36,31
50,33
57,52
22,72 45,21
40,06 58,46
49,91 67,70
Os casos de periodontite crnica apresentaram maior expresso imunohistoqumica para TNF-, mostrando diferena estatisticamente significativa,
seguidos dos casos de gengivite crnica. Esses dados podem ser observados nas
figuras 23, 24 e 25 a seguir.
78
Figura 23. Fotomicrografia exibindo fraca imunomarcao para TNF- na

gengiva clinicamente saudvel, com discreto infiltrado linfocitrio (LSAB,
400).
Figura 24. Fotomicrografia demonstrando moderada imunoexpresso para

TNF- em gengivite crnica associada a infiltrado linfoplasmocitrio (LSAB,
400).
79
Figura 25. Fotomicrografia exibindo forte imunomarcao para TNF- em periodontite

crnica expresso praticamente em todas as clulas inflamatrias, predominantemente
linfoplasmocitrias. (LSAB, 400).
80

anticorpos: anti-RANKL, anti-OPG, RANKL / OPG e anti-TNF- em
relao perda de insero clnica.
A verificao de uma possvel diferena entre a quantidade de clulas
imuno-positivas para os anticorpos anti-RANKL, anti-OPG e anti-TNF- e a
razo percentual de RANKL/OPG, com relao perda de insero clnica, nos
casos de periodontite crnica, foi investigada com base na mediana da perda de
insero (Tabela 6).
Tabela 6. Anlise comparativa das variveis dependentes: RANKL, OPG,

RANKL / OPG e TNF-, com a varivel independente: perda de
insero clnica, considerando os casos de periodontite crnica.
Natal/RN, 2011.
Anticorpos
RANKL
Perda de
Insero Clnica
0 a 6,5mm
16
Mdia dos
Postos
10,69
> 6,5mm
13
20,31
0 a 6,5mm
16
11,63
> 6,5mm
13
19,15
0 a 6,5mm
16
11,63
> 6,5mm
13
19,15
0 a 6,5mm
16
11,94
> 6,5mm
13
18,77
OPG
RANKL / OPG
TNF-
p*
0,002
0,018
0,018
0,032
* Teste de Mann-Whitney
Todos os anticorpos avaliados apresentaram diferena estatisticamente
significativa na imunopositividade com relao perda de insero clnica, ou
seja, os casos com maior perda de insero apresentaram maior quantidade de
clulas positivas.

anticorpos: RANKL, OPG, RANKL / OPG e TNF- em relao
mobilidade dentria.
A avaliao de uma possvel diferena entre a quantidade de clulas
imuno-positivas para os anticorpos anti-RANKL, anti-OPG e anti-TNF- e a
razo percentual de RANKL/OPG, com relao mobilidade dentria, nos casos
81
de Periodontite crnica, foi investigada com base nas duas categorias em que foi
dividida a mobilidade dentria: At grau I, correspondendo aos casos com
ausncia de mobilidade ou mobilidade grau I; Grau II e III, os casos que
apresentaram mobilidade grau II ou grau III. (Tabela 07).
Tabela 7. Anlise comparativa das variveis dependentes: RANKL, OPG,

RANKL / OPG e TNF-, com a varivel independente: mobilidade
dentria, considerando os casos de periodontite crnica. Natal/RN,
2011.
Anticorpos
RANKL
OPG
RANKL / OPG
TNF-
Mobilidade
dentria
At grau I
n
15
Mdia dos
Postos
11,60
Grau II e III
14
18,64
At grau I
15
12,07
Grau II e III
14
18,14
At grau I
15
12,33
Grau II e III
14
17,86
At grau I
15
12,93
Grau II e III
14
17,21
p*
0,026
0,055
0,081
0,176
* Teste de Mann-Whitney
Na tabela 7 observa-se diferena estatisticamente significativa para a

imunopositividade do RANKL com relao Mobilidade dentria, e a expresso
da OPG encontrou-se no limiar de significncia. A imunoexpresso para o TNF-
e para a razo de RANKL/OPG, no apresentou diferena estatisticamente
significativa, no entanto, evidenciou-se grande tendncia para estes anticorpos de
apresentarem maior quantidade de clulas positivas nos casos de maior
mobilidade dentria, ou seja, nos casos mais avanados da doena, do mesmo
modo que para o RANKL e OPG.
5.3.5 Correlao entre as variveis RANKL, OPG, TNF-, RANKL/OPG e a

profundidade de sondagem para os casos de gengiva clinicamente saudvel
Para verificao de possveis correlaes entre a quantidade de clulas
imunomarcadas pelos anticorpos anti-RANKL, anti-OPG, anti-TNF- e a razo
82
RANKL/OPG entre si e com a mediana da varivel independente, profundidade

de sondagem, nos casos de Gengiva clinicamente saudvel, foi aplicado o
coeficiente de correlao de Spearman (Tabela 8).
Tabela 8. Coeficiente de correlao de Spearman (r) e sua significncia estatstica

entre a marcao dos anticorpos RANKL, OPG, TNF- e a razo
RANKL/OPG, e a varivel independente: profundidade de sondagem,
no Grupo CS. Natal/ RN, 2011.
PS
n
12
r
-0,047
p
0,885
n
12
OPG
r
0,681*
p
0,015
n
12
RANKL/OPG
r
-0,493
p
0,103
n
12
TNF-
r
0,035
p
0,913
* Correlao significativa para p<0,05
** Correlao significativa para p<0,01
RANKL
RANKL
12
0,140
0,665
12
0,783**
0,003
12
0,182
0,572
OPG
12
-0,413
0,183
12
0,000
1,000
RANKL/OPG
12
0,413
0,183
A tabela 8 mostra uma correlao positiva forte e altamente significativa

entre o RANKL e a razo RANKL/OPG. A profundidade de sondagem
apresentou uma correlao positiva fraca com a imunomarcao da OPG.
5.3.6 Correlao entre as variveis RANKL, OPG, TNF-, RANKL/OPG e a

Profundidade de Sondagem para os casos de gengivite crnica.
RANKL/OPG entre si e com a mediana da varivel independente: profundidade
de sondagem, nos casos de Gengivite crnica, foi aplicado o teste de correlao
de Spearman (Tabela 9).
83
Tabela 9. Coeficiente de correlao de Spearman (r) e sua significncia estatstica

entre a marcao dos anticorpos RANKL, OPG, TNF- e a razo
RANKL/OPG, e a varivel independente: profundidade de sondagem,
no Grupo G. Natal/ RN, 2011.
PS
RANKL
OPG
RANKL/OPG
TNF-
n
r
p
n
r
p
n
r
p
n
r
p
42
0,122
0,443
42
0,141
0,373
42
0,028
0,862
42
-0,072
0,648
RANKL
42
0,091
0,567
42
0,886**
<0,001
42
0,384*
0,012
OPG
42
-0,326*
0,035
42
-0,033
0,837
RANKL/OPG
42
0,341*
0,027

** Correlao significativa para P<0,01
Na tabela 9 observa-se uma forte correlao positiva e altamente
significativa entre o RANKL e a razo RANKL/OPG. O valor do coeficiente de
correlao de Spearman foi significativo na imunomarcao para RANKL, OPG,
TNF- e RANKL/OPG, demonstrando uma fraca correlao positiva entre a
imunomarcao do TNF- com RANKL e com o RANKL/OPG. Uma correlao
negativa e significativa foi observada entre a OPG e o RANKL/OPG.
5.3.7 Correlao entre as variveis RANKL, OPG, TNF-, RANKL/OPG,

Recesso e Profundidade de Sondagem para os casos de periodontite crnica.
RANKL/OPG entre si e com as medianas das variveis independentes:
profundidade de sondagem, recesso gengival e perda de insero clnica, nos
casos de Periodontite crnica, foi aplicado o teste de correlao de Spearman
(Tabela 10).
84
Tabela 10. Coeficiente de correlao de Spearman (r) e sua significncia

estatstica entre a marcao dos anticorpos RANKL, OPG, TNF- e a
razo RANKL/OPG, e as variveis independentes: profundidade de
sondagem, recesso gengival e perda de insero clnica, no Grupo
PC. Natal/ RN, 2011.
PS
PIC
RANKL
OPG
RANKL/OPG
TNF-
n
r
p
n
r
p
n
r
p
n
r
p
n
r
p
n
r
p
RG
29
-0,45
0,818
PS
29
29
0,588** 0,661**
0,001
<0,001
PIC
29
29
29
0,322
0,409* 0,642**
0,088
0,028
<0,001 RANKL
29
29
29
29
0,274
0,320
0,451*
0,408*
0,150
0,090
0,014
0,028
OPG
29
29
29
29
29
0,263
0,336
0,544* 0,933** 0,110
0,168
0,074
0,002
<0,001 0,571 RANKL/OPG
29
29
29
29
29
29
0,283
0,212
0,453*
0,257
0,003
0,238
0,137
0,270
0,014
0,178
0,988
0,214

** Correlao significativa para P<0,01
A tabela 10 mostra que a varivel perda de insero clnica apresentou

fraca correlao positiva e significativa com a imunomarcao dos anticorpos
anti-RANKL, anti-OPG, anti-TNF- e da razo RANKL/OPG, bem como com os
parmetros clnicos: profundidade de sondagem e recesso gengival. O RANKL
apresentou fraca correlao positiva significativa com a OPG e com a
profundidade de sondagem e forte com a razo RANKL/OPG.
85
DISCUSSO
86
6 DISCUSSO
A doena periodontal uma infeco localizada que envolve os tecidos de suporte dos
dentes (gengiva, ligamento periodontal, cemento radicular e osso alveolar) e inclui tanto
processos
reversveis
(gengivite),
como
irreversveis
(periodontite)
(BASCONES-
MARTINEZ et al., 2011). A gengivite induzida pelo biofilme comea na margem gengival,
podendo estender-se atravs da unidade gengival remanescente, apresentando sinais clnicos
de inflamao gengival, tais como, eritema, sangramento, sensibilidade, pouca firmeza e
aumento gengival, sem apresentar perda de insero nem de osso alveolar. A intensidade
individual desses sinais e sintomas clnicos pode variar entre os indivduos, como tambm
entre os stios de uma mesma dentio (LINDHE, LANG, KARRING, 2010). Alm disso, a
gengivite pode permanecer nesse estado ou, com a presena contnua do biofilme
periodontopatognico, progredir para o estado de periodontite. Entretanto, nem toda gengivite
evolui para periodontite embora toda periodontite apresente uma histria prvia de gengivite.
Dessa forma, considera-se que a periodontite crnica inicia-se como uma gengivite induzida
pelo biofilme que, sem tratamento, pode progredir (LINDHE, KARRING, LANG, 2005).
Na periodontite, h destruio do tecido conjuntivo acompanhada pela migrao apical
do epitlio juncional, perda ssea e eventual perda dentria. A primeira manifestao clnica
da periodontite o aparecimento de bolsas periodontais, que oferecem um nicho favorvel
para a colonizao bacteriana. Ela pode ser diagnosticada pelo exame clnico com sonda
periodontal para determinar a profundidade da bolsa em combinao com imagens de raios-X.
(LINDHE, LANG, KARRING, 2010; BASCONES-MARTINEZ et al., 2011).
pacfico na literatura que o agente etiolgico da doena periodontal o biofilme
dentrio, composto por microrganismos que colonizam a superfcie dentria supra ou
subgengivalmente e que a periodontite representa uma resposta inflamatria especfica contra
agentes microbianos residentes no biofilme subgengival. Estima-se que cerca de 700 espcies
diferentes de microrganismos so capazes de colonizar a cavidade bucal, e todo indivduo
pode alocar 150 ou mais espcies diferentes. As relaes ecolgicas entre a microbiota
periodontal e o seu hospedeiro so, na sua maioria, inofensivas. Ocasionalmente, um
subgrupo de espcies bacterianas pode acarretar destruio do periodonto. O equilbrio
resultante, de fundamental importncia, geralmente alcanado espontaneamente ou por meio
de terapia (LINDHE, LANG, KARRING, 2010).
A importncia clnica da doena periodontal deriva em parte de sua elevada
prevalncia, pois esta patologia afeta uma porcentagem relativamente alta da populao adulta
em pases desenvolvidos e em desenvolvimento e sua prevalncia varia significativamente em
87
diferentes regies do mundo, havendo indcios que parece ser mais prevalente nos pases em
desenvolvimento (SUSIN et al., 2004). Segundo Bartold et al. (2010) 90% da populao sofre
de gengivite e 60% tem periodontite crnica. Estudos no Brasil que avaliaram a gengivite
atravs da presena de sangramento sondagem ao redor de todos os dentes, verificaram que
esta tem uma prevalncia extremamente alta, de aproximadamente 100% e a de periodontite
tambm consideravelmente alta (ARAJO e SUKEKAVA, 2007). Susin et al. (2004)
avaliaram a freqncia e extenso de perda de insero em 853 indivduos brasileiros
dentados entre 30 e 103 anos, sendo 388 do sexo masculino e 465 do sexo feminino. Os
resultados mostraram que aproximadamente 79% e 52% dos indivduos exibiram,
respectivamente, perda de insero > 5mm e > 7mm. Homens, no brancos, de baixa condio
scio-econmica apresentaram maior perda de insero clnica.
No entanto, com o aumento da idade, parece haver reduo no percentual de
indivduos com doena gengival sem destruio ssea, com concomitante aumento no
percentual de indivduos com doena periodontal destrutiva crnica e uma ocorrncia de
100% de periodontite destrutiva aps os 40 anos de idade. As evidncias de diversos estudos
epidemiolgicos verificaram uma alta prevalncia de doena periodontal destrutiva na
populao adulta em geral e um claro aumento na prevalncia da doena com a idade, sendo
assim, a doena periodontal parece ser um grande problema mundial de sade pblica que
afeta a maior parte da populao adulta aps os 35-40 anos (LINDHE, LANG, KARRING,
2010).
A amostra da presente pesquisa foi composta de 50,60% casos de gengivite crnica, o
que confirma a alta prevalncia dessa doena, sendo o restante (49,40%) divididos em
gengiva clinicamente saudvel (14,46%) e periodontite crnica (34,94%). Os dados que
caracterizaram a amostra apresentaram-se de acordo com a literatura no que diz respeito a
epidemiologia da doena, sendo composta por adultos com idade mdia de 35 anos,
predominantemente do sexo feminino, da raa no branca. Alm disso, pode-se observar que
os indivduos com periodontite apresentaram mdia de idade de 47 anos, o que tambm
corrobora com a informao de que, com o avanar da idade, aumenta o percentual de
periodontite crnica, ou seja, indivduos com idades maiores apresentam maior prevalncia de
periodontite. Na amostra total a mdia de idade foi inferior aos casos de periodontite crnica
isolada, pois os casos de gengivite crnica e gengiva clinicamente saudveis representaram
65% da amostra que foi composta por indivduos mais jovens.
Em concordncia com os nossos achados, Crotti et al. (2003) verificaram que a mdia
de idade no grupo com periodontite foi de 45,2 anos e que a idade pode ser um fator que
88
influencia sistemicamente o nvel de remodelao ssea. Dereka et al. (2010) tambm

observaram a mdia de idade superior no gupo de indivduos com periodontite crnica
avanada, sendo 51,3 anos, enquanto os indivduos periodontalente saudveis apresentaram
mdia de 25,8 anos de idade. No estudo de Bostanci et al.(2007b) a mdia de idade dos
indivduos com periodontite crnica foi de 51 anos, com profundidade de sondagem maior ou
igual a 6mm e perda de insero clnica maior ou igual a 4mm.
Com relao aos parmetros clnicos avaliados, todos os indivduos da nossa pesquisa
apresentaram uma considervel variao na profundidade de sondagem, sendo esta entre 1mm
e 10mm e na recesso gengival entre 0 e 7mm. Esta variao pode ser vista devido
heterogeneidade da amostra, ou seja, os casos de gengiva clinicamente saudvel e gengivite
crnica apresentaram menores valores para essas variveis, enquanto os casos de peridontite
crnica so responsveis pelos valores mais altos na amostra. Quando se avaliou somente o
grupo da periodontite crnica, observou-se que a mdia desses parmetros clnicos foi
superior a da amostra total. A perda de insero clnica, observada s nos casos de
periodontite, variou entre 2mm e 14mm, observando-se assim, que na amostra existiram casos
de periodontite leve, moderada e severa, no entanto 82,76% foram de periodontite severa,
sendo a perda de insero clnica maior ou igual a 5mm. Com relao mobilidade dentria, a
maioria dos casos de periodontite crnica (68,9%) apresentou algum grau de mobilidade
dentria, o que est associado com a perda de insero clnica. Mesmo avaliando somente os
casos de periodontite crnica observou-se ainda uma considervel variao nos parmetros
clnicos.
Essa variabilidade de manifestaes clnicas e de diferentes graus de progresso da
doena periodontal pode ser atribuda aos diferentes componentes da microbiota subgengival,
entretanto, evidncias sugerem fortemente que a resposta inflamatria do hospedeiro que
leva a destruio tecidual, e a diversidade de respostas do hospedeiro pode ser responsvel por
grande parte dessa variabilidade de manifestaes clnicas. Portanto, mesmo as bactrias
sendo necessrias para a iniciao da doena, elas no so suficientes para causar a sua
progresso, a menos que exista uma associao com a resposta inflamatria e susceptibilidade
do hospedeiro (BARTOLD et al., 2010). A iniciao da periodontite causada por bactrias
anaerbicas gram-negativas, tais como: Porphyromas gingivalis, Treponema denticola e
Tannerella forsythia. Estas, por sua vez, expressam potenciais fatores de virulncia, tais com
toxinas, proteases, adesinas e lipopolissacardeos que interagem com receptores Toll like
culminando com a resposta inflamatria de citocinas, contribuindo para a patognese da
periodontite. (GARLET et al. 2006; KOIDE et al., 2010).
89
A histopatologia dos casos avaliados na presente pesquisa exibiu, em todos os casos,

um epitlio de superfcie pavimentoso estratificado ceratinizado, com fragmento de epitlio
sulcular, sendo pavimentoso estratificado no ceratinizado. Na lmina prpria evidenciou-se
que todos os casos exibiram de leve a intenso infiltrado inflamatrio, dependendo do tipo de
condio clnica, sendo os casos de periodontite com infiltrado inflamatrio mais intenso
(82,8%) e predominantemente linfoplasmocitrio, sem nenhum caso de leve infiltrado
inflamatrio e os casos de gengivite com apenas 14,30% de infiltrado leve, 40,50% moderado
e 45,20% intenso. A vascularizao tambm foi mais abundante nos casos mais avanados da
doena. Os casos de gengiva clinicamente saudvel apresentaram infiltrado inflamatrio de
leve (58,30% dos casos) a moderado (41,70%).
De acordo com a literatura, os sintomas clnicos da inflamao podem parecer sutis
nos estgios iniciais da gengivite, mas as alteraes histopatolgicas fundamentais so bem
marcadas. Ocorrem alteraes na rede vascular com vasodilatao, aumentando a exsudao
de fluido crevicular gengival e protenas, o que torna o tecido edematoso. As clulas
inflamatrias saem dos vasos e se acumulam no tecido conjuntivo lateral ao epitlio juncional,
sendo o infiltrado composto inicialmente por macrfagos e linfcitos, e posteriormente os
plasmcitos dominam a leso com substancial depleo do colgeno, como ocorre na
periodontite. Resultados de exames de bipsias humanas revelaram que, em indivduos
jovens, linfcitos ocuparam uma proporo um tanto maior que os plasmcitos, por outro
lado, em indivduos mais velhos, os plasmcitos eram o tipo celular predominante em leses
de periodontite (LINDHE, LANG, KARRING, 2010).
Corroborando o presente estudo, Lemos (2009) detectou, em ratos, que o grupo
controle, caracterizado como leso inicial, exibiu 73,4% de discreto infiltrado inflamatrio e
apenas 26,7% moderado, compatvel com o quadro de gengiva clinicamente saudvel. Esse
achado pode ser explicado por Page e Shroeder (1976) que afirmaram que este um termo
usado para descrever o nvel de sade gengival que pode ser atingido por pacientes que
limpam os dentes de maneira meticulosa, mas consistentemente, caracteriza-se por pequeno
infiltrado inflamatrio que envolve tanto o epitlio juncional como o tecido conjuntivo
subjacente, abrigando linfcitos e macrfagos, enquanto os neutrfilos predominam na regio
do sulco crevicular.
Ainda em concordncia com os achados morfolgicos deste estudo, Seabra (2006)

observaram que 69,9% do infiltrado inflamatrio na periodontite foi difuso e
linfoplasmotcitrio e na gengivite 53,8% do infiltrado foi perivascular e justaepitelial e
90
tambm linfoplasmocitrio. O aumento da intensidade do infiltrado inflamatrio, com

predominncia de clulas tipo crnica (LINS, 2003), associado dilatao vascular,
aumentando a permeabilidade dos vasos e a estase sangunea, bem como a angiognese para a
chegada de mais clulas de defesa, fazem com que a gengivite passe a ser clinicamente
detectvel pela presena de edema e eritema gengival (SEABRA, 2006).
Quando da comparao da intensidade do infiltrado inflamatrio com a perda de
insero clnica, categorizada pela mediana, para os casos de periodontite, observou-se que
apenas 31,3% (n=5) dos casos apresentaram moderada intensidade do infiltrado inflamatrio,
sendo estes com perda de insero menor ou igual a 6,5mm e nenhum caso de periodontite
apresentou infiltrado inflamatrio leve. Verificando assim que, quanto maior a perda de
insero, maior a tendncia de o infiltrado ser mais intenso, corroborando mais uma vez com
a literatura clssica da histopatognese da leso com relao aos estgios de progresso da
doena periodontal (PAGE e SHROEDER, 1976).
A principal caracterstica da perda ssea mediada pela inflamao na periodontite o
aumento da atividade osteoclstica sem o correspondente aumento na formao ssea. Est
bem estabelecido que a inflamao e o sistema imunolgico esto diretamente envolvidos no
desenvolvimento da periodontite e mais recentemente, o papel do sistema imune no
metabolismo sseo tem sido reconhecido com o termo osteoimunologia e poder ser o centro
do desenvolvimento para novos meios de preveno e controle de perdas sseas patolgicas
em doenas como a periodontite (BARTOLD et al., 2010).
Embora a periodontite seja uma das mais prevalentes patologias humanas associada
perda ssea, o mecanismo de formao de osteoclastos e reabsoro ssea nessa doena ainda
no totalmente esclarecido. Sabe-se que algumas citocinas inflamatrias que estimulam a
reabsoro ssea, tais como: IL-1, TNF, PGE2, INF- e IL-6 esto presentes nos tecidos
periodontais, e o papel dos mediadores chaves da atividade osteoclstica, RANK, RANKL e
OPG tem sido amplamente estudado em tecidos periodontalmente saudveis e inflamados
(CROTTI et al., 2003; BARTOLD et al., 2010; SANTOS et al., 2010). RANKL e OPG so
conhecidos com importantes reguladores positivo e negativo, respectivamente, da
osteoclastognese e reabsoro ssea (BUDUNELI et al., 2009; SANTOS et al., 2010).
Diversos relatos apontam que o TNF- atua na reabsoro ssea agindo tanto diretamente nos
osteoclastos ou indiretamente atravs da induo da formao osteoclstica atravs da
estimulao do RANKL produzidos pelos osteoblastos. (LINS et al. 2007; CSAR-NETO et
al. 2008; BARTOLD et al., 2010).
91
A literatura corrobora, em sua maioria, com a informao de que a sobre-regulao do

RANKL e a sub-regulao da OPG possam ser consideradas o mecanismo principal da
modulao local da destruio ssea na periodontite (LU et al., 2006). Diversos estudos
usando metodologias variadas, tais como Elisa (BOSTANCI et al. 2007b; LU et al., 2006;
BUDUNELI et al., 2008; SANTOS et al., 2010), RT-PCR (DEREKA et al., 2010); Real
time-PCR (WARA-ASWAPATI et al., 2007; BOSTANCI et al. 2007a) hibridizao in situ
(CROTTI et al.; 2003) e imuno-histoqumica (CROTTI et al.; 2003; LU et al., 2006;
DEREKA et al., 2010) mostraram aumento da concentrao de RANKL e decrscimo nos
nveis de OPG no fluido crevicular gengival e tecido gengival de indivduos com periodontite.
Alm disso, a hiptese que o aumento da razo RANKL/OPG nos tecidos periodontais seja
associada com a severidade de doena tambm tem sido confirmada por algumas dessas
pesquisas (BARTOLD et al., 2010; SANTOS et al., 2010; BOSTANCI et al., 2007).
No fluido crevicular gengival, a deteco da protena RANKL atravs do Elisa, indica
sua presena dentro do exsudato biolgico na sua forma solvel (BOSTANCI et al., 2008), e a
expresso
imuno-histoqumica
mostra
clulas
RANKL-positivas
significativamente
distribudas nas zonas inflamadas do tecido conjuntivo de indivduos com periodontite (LU et
al., 2006).
Os resultados obtidos no presente estudo no esto totalmente em concordncia com a
literatura, pois no foi observada diferena estatisticamente significativa da imunoexpresso
do RANKL quando se comparou a periodontite com a gengivite e com a gengiva clinicamente
saudvel, mas os casos de periodontite crnica apresentaram maior positividade que os casos
de gengivite crnica, no entanto, os casos saudveis apresentaram maior positividade em
relao aos outros grupos. No entanto, a imunoexpresso para a OPG apresentou diferena
estatisticamente significativa entre os grupos, sendo a periodontite com o maior nmero de
clulas OPG-positivas seguida pela gengiva clinicamente saudvel e pela gengivite. Em
relao razo RANKL/OPG tambm no foi verificada diferena estatisticamente
significativa entre as trs condies clnicas.
Corroborando esta pesquisa, Dereka, et al. (2010) no detectaram diferena
estatisticamente significativa para a razo RANKL/OPG, mas detectaram altos nveis de
RNAm de RANKL no grupo saudvel em relao ao grupo com periodontite, bem como
mostraram que no grupo com periodontite crnica os nveis de RNAm do RANKL foram
inferiores comparados aos nveis de RNAm da OPG. Do mesmo modo, no presente estudo
verificou-se que no s no grupo da periodontite crnica, como nos demais, a expresso da
OPG foi maior do que a do RANKL.
92
Contrariamente aos resultados encontrados, Crotti et al. (2003) e Lu et al. (2006)

comparando tambm a imunoexpresso de RANKL e OPG entre indivduos com periodontite
e sem periodontite, observaram que o RANKL foi significativamente mais expresso e a OPG
significantemente menos expressa em tecidos com periodontite. Resultados semelhantes
foram encontrados por Wara-aswapati et al.(2007) e Bostanci et al.(2007a) ao investigarem a
expresso de RNAm do RANKL e OPG em tecidos gengivais, pois tambm observaram
maior expresso de RNAm do RANKL enquanto que os nveis de RNAm da OPG foram
marcadamente diminudos nos casos de periodontite.
Outros pesquisadores, como Bostanci et al. (2007b), Ernst et al. (2007) e Sakellari,
Menti, Konstantinidis (2008), que analisaram a concentrao dessas protenas no fluido
crevicular gengival atravs do ELISA, corroboram como os autores acima ao apresentarem
nveis de RANKL tambm mais elevados nos indivduos periodontalmente comprometidos.
Essas diferenas nos resultados encontrados podem estar relacionadas com as
diferenas metodolgicas dos estudos e com o fato de diversos passos modularem os nveis de
expresso das protenas, pois embora os nveis de RNAm sejam correlacionados com a
expresso da protena, diversos outros passos podem modular essa expresso, incluindo o
controle da traduo e a modificao ps-traduo. Ou seja, a discrepncia sugere que,
embora as clulas inflamatrias estejam equipadas com a informao gentica para sintetizar
RANKL elas no so capazes de, finalmente, produzir a protena, provavelmente devido s
modificaes ps-transcricionais (WARA-ASWAPATI et al., 2007; DEREKA et al., 2010).
Talvez isso explique a existncia de elevados nveis da protena RANKL no grupo
saudvel em relao ao grupo com periodontite, ao contrrio da maioria da literatura. Alm
disso, as provveis diferenas das etapas do processo patolgico entre os indivduos do grupo
com periodontite, podem refletir padres de evoluo diferentes neste grupo (DEREKA et al.,
2010), visto que a doena est relacionada com o indivduo e somente alguns experimentam
destruio avanada que afeta vrios dentes e a progresso da doena provavelmente
contnua, com episdios curtos de exacerbao intercalados com perodos de remisso em
stios localizados. Sendo assim, no tem como identificar em que perodo os casos do presente
estudo se encontravam, e isso parece interferir na expresso do RANKL.
Sabe-se que quando a concentrao da OPG relativamente maior que a expresso do
RANKL, OPG liga-se ao RANKL inibindo sua ligao ao RANK, levando a uma reduo na
formao de osteoclastos e a apoptose dos osteoclastos pr-existentes (COCHRAN, 2008).
Diante disso, pode-se pensar que a elevada expresso da OPG em relao ao RANKL
encontrada nos casos de periodontite desta pesquisa possa ser uma tentativa do sistema
93
imunolgico do hospedeiro de tentar combater a osteoclastognese no momento especfico da

doena. Pois em perodos de exacerbao da doena, o que se espera que esteja ocorrendo
maior destruio tecidual e provavelmente, os nveis de RANKL seriam maiores, mas a
amostra foi obtida em um momento pontual, e no se pode identificar com preciso a
atividade da doena.
Em todas as condies clnicas do presente estudo, os anticorpos foram expressos nas
clulas inflamatrias, fibroblastos, clulas epiteliais e clulas endoteliais, bem como foi
observada marcao na matriz extracelular principalmente para o RANKL. Esses resultados
esto de acordo com os estudos que observaram a expresso do RANKL em clulas do
ligamento periodontal, osteoblastos, osteoclastos, clulas estromais, linfcitos T, clulas
endoteliais e epiteliais e a expresso da OPG em fibroblastos, clulas do ligamento
periodontal, clulas da polpa dentria e clulas endoteliais (WARA-ASWAPATI et al., 2007).
Nesse sentido, Kawai et al. (2006) determinaram que os linfcitos T e B ativados so a
maior fonte celular da produo da protena RANKL em tecidos gengivais periodontalmente
doentes, do mesmo modo, o presente estudo mostrou que as principais responsveis pela
imunomarcao do RANKL foram as clulas inflamatrias que predominaram nas leses, os
linfcitos e plasmcitos. Crotti et al. (2003) tambm observaram altos nveis da protena
RANKL expressa nos tecidos com periodontite, sendo associada a linfcitos e macrfagos e
por vezes na matriz extracelular e nveis significativamente baixos de OPG em tecidos com
periodontite, sendo associada a clulas endoteliais. Dereka et al. (2010) detectaram que o
RANKL estava expresso tambm no epitlio, porm mais intensamente nas clulas
inflamatrias e que a expresso da OPG era mais freqente no epitlio oral nas amostras de
periodontite.
Os maiores fatores reguladores da destruio das estruturas de suporte periodontal so
mediadores inflamatrios liberados pelas clulas do hospedeiro e em um hospedeiro
susceptvel, a exacerbao da resposta ocorre resultando em excessiva produo de citocinas
pro-inflamatrias, tais como o TNF-, a IL-1 e IL-6, e subsequente perda de suporte
periodontal. O TNF- uma citocina pro-inflamatria multipotente produzida como resultado
da estimulao bacteriana pelos moncitos/macrfagos, leuccitos polimorfo nucleares,
fibroblastos, clulas epiteliais e endoteliais e osteoblastos. Evidncia crescente sugere uma
associao positiva entre o nvel de circulao de TNF- e a gravidade da inflamao
periodontal (PASSOJA et al., 2010). O padro local de citocinas na regio do periodonto tem
sido associado com a progresso e severidade da periodontite. Consequentemente, a expresso
do RANKL tem sido associada com a expresso do TNF-, resultando em aumento da reao
94
inflamatria, enquanto a IL-10 e IL-4 tm sido associadas com a osteoprotegerina e

conseqente reduo da inflamao (GARLET et al., 2006).
A imunomarcao do TNF- no presente estudo mostrou diferena estatisticamente
significativa entre os grupos, sendo a maior expresso imuno-histoqumica dessa protena nos
casos de periodontite crnica, seguidos dos casos de gengivite crnica. Esse resultado
encontrado est em concordncia com os achados de Frodge et al. (2008) e Rai (2008) que
observaram nveis salivares significativamente mais altos dessa protena nos indivduos com
periodontite sugerindo que a presena de altos nveis do TNF- na saliva pode contribuir para
a progresso da doena. Passoja et al. (2010) avaliaram amostras de soro e tambm
observaram nveis de TNF- significativamente mais elevados nos indivduos com
periodontite crnica. Garlet et al. (2006) tambm encontraram maior expresso dessa citocina
em indivduos com gengivite e periodontite crnica comparando com saudveis, atravs do
RT-PCR. Bartold et al. (2010) relataram que a superexpresso do TNF- tem sido associada
com a osteoclastognese em pacientes com periodontite.
Na avaliao da imunoexpresso das protenas RANKL, OPG, a razo entre elas e o
TNF- com relao aos parmetros clnicos periodontais, foi encontrada diferena
estatisticamente significativa para a imunopositividade de todas as protenas com relao
perda de insero clnica, ou seja, os casos com maior perda de insero clnica (maior que
6,5mm) apresentaram maior quantidade de clulas imuno-positivas. Confirmou-se esses
resultados correlacionando a imunomarcao dessas protenas entre si e com os parmetros
clnicos. Observou-se que a varivel perda de insero clnica apresentou fraca correlao
positiva e significativa com a imunomarcao de todas as protenas estudadas, bem como com
os parmetros clnicos: profundidade de sondagem e recesso gengival. A profundidade de
sondagem apresentou fraca correlao positiva significativa com o RANKL. E entre a
imunomarcao das protenas, somente o RANKL apresentou fraca correlao positiva
significativa com a OPG e forte com a razo RANKL/OPG.
Diversos resultados so encontrados no que diz respeito correlao dessas protenas
com os parmetros clnicos. Miller et al. (2006) detectaram que elevados nveis salivares de
OPG no distinguiram indivduos saudveis dos doentes, mas apresentaram correlao com a
profundidade de sondagem em stios com bolsas maior ou igual a 4mm, no entanto a
correlao da OPG com a perda de insero maior ou igual a 2mm no foi significativa.
Bostanci et al. (2007b) verificaram que a razo RANKL/OPG foi significativamente mais
elevada nos trs grupos de periodontite (crnica, agressiva e associada a drogas
imunossupressoras), comparados com o grupo saudvel e com gengivite, e encontraram
95
correlao positiva com a profundidade de sondagem e o nvel de insero clnica. Os autores

referenciados anteriormente, sugerem que a razo RANKL/OPG pode ser um fator
prognstico para a ocorrncia da doena. Mayer et al. (2009) verificaram que o tratamento
com anti- TNF- reduziu os nveis de TNF- no fluido crevicular gengival e levou a melhora
da condio periodontal, mostrando que o efeito dessa terapia parece ser promissor na
periodontite, podendo reduzir a inflamao e a reabsoro ssea. Por outro lado, Sakellari,
Menti, Konstantinidis (2008) mostraram que a mdia dos nveis de RANKL foi
significativamente mais alta no grupo com periodontite comparado com o controle, mas
nenhuma correlao foi observada ente os nveis de RANKL e os parmetros clnicos.
A literatura tem mostrado que indivduos com mais altos nveis de TNF-
apresentaram maior sangramento sondagem, aumento da profundidade de sondagem e maior
perda de insero comparados com indivduos que apresentaram baixos nveis (FRODGE et
al., 2008; NILSSON e KOPP, 2008). Kurtis et al. (2005) e Mayer et al. (2009) detectaram
correlao positiva e estatisticamente significativa entre os nveis do TNF- no fluido
crevicular gengival e a perda de insero clnica. Destarte Grska et al. (2003) no
encontraram correlao entre a concentrao dessa citocina e os parmetros clnicos
periodontais. Teles et al. (2009) afirmaram que as mdias dos nveis salivares das citocinas
estudadas por ele, incluindo o TNF- no funcionaram como marcadores para descriminar a
diferena entre indivduos saudveis e doentes, provavelmente porque a diluio dos
componentes do fluido crevicular gengival na saliva mascara a existncia de diferenas entre
os nveis dessas citocinas entre indivduos saudveis e periodontalmente comprometidos.
Os nossos resultados revelaram que quanto maior perda de insero maior a
imunomarcao das protenas estudadas, ou seja, as protenas esto mais expressas nos casos
mais avanados da doena, corroborando alguns estudos citados acima. O RANKL tambm
mostra correlao com a profundidade de sondagem, confirmando achados de que quanto
mais avanada o estgio da periodontite, maior a participao dessa protena. A correlao
entre o RANKL e a OPG pode ser explicada pela tentativa da defesa do hospedeiro em
responder a forte expresso do RANKL, ou seja, quando a expresso de RANKL aumenta, a
expresso da OPG tambm aumenta como um meio de procurar inibir ou minimizar a
osteoclastognese. A correlao do RANKL com a razo RANKL/OPG obvia, pois se o
RANKL aumenta, a razo tambm aumenta, bem como a correlao da perda de insero com
a profundidade de sondagem e recesso gengival, pois esses dois parmetros clnicos esto
altamente relacionados com a perda de insero.
96
Do mesmo modo que a perda de insero, quando se avaliou a mobilidade dentria do

grupo de periodontite crnica, observou-se diferena estatisticamente significativa para a
imunopositividade do RANKL com relao mobilidade dentria, e a expresso da OPG
encontrou-se no limiar de significncia. A imunoexpresso para o TNF- e para a razo de
RANKL/OPG, no apresentou diferena estatisticamente significativa, no entanto,
evidenciou-se grande tendncia para estes anticorpos de apresentarem maior quantidade de
clulas positivas nos casos de maior mobilidade dentria, ou seja, nos casos mais avanados
da doena, que apresentaram mobilidade grau II ou III.
Nos casos de gengivite tambm se observou forte correlao positiva e altamente
significativa entre o RANKL e a razo RANKL/OPG. O RANKL apresentou ainda fraca
correlao positiva e significativa com TNF-, e a razo RANKL/OPG apresentou fraca
correlao positiva e significativa com o TNF- e correlao negativa com a OPG. Nenhuma
correlao foi observada entre a profundidade de sondagem e a imunoexpresso dessas
protenas.
A razo RANKL/OPG em tecidos periodontais inflamados tem sido encontrada
elevada tanto pelo aumento de RANK ou decrscimo de OPG, ou ambos (WARAASWAPATI et al., 2007; BOSTANCI et al. 2007b). Esses achados so consistentes com
estudos que investigaram o papel dessa razo em condies de reabsoro ssea, tais como, a
artrite reumatide. No somente a razo RANKL/OPG aumenta em stios de inflamao
periodontal, bem como recentes estudos sugerem que essa razo tambm esteja relacionada
com a severidade da doena (BARTOLD et al., 2010; SANTOS et al., 2010; BOSTANCI et
al., 2007).
Nesta pesquisa, a diferena do RANKL e da razo RANKL/OPG no apareceu quando
se comparou os trs grupos do estudo, mas quando se avaliou somente a periodontite
isoladamente, observou-se que quanto mais grave a doena, maior a imunomarcao dessa
protena, bem como da OPG e do TNF-, isto , nos casos de maior perda de insero clnica,
reforando a hiptese que um desequilbrio na razo RANKL/OPG em tecidos periodontais
est associada com a severidade da periodontite e essas protenas so possveis alvos para
regular a destruio ssea na periodontite.
Os nossos achados sugerem um valor diagnstico para a razo RANKL/OPG,
indicando que esta pode estar associada com a progresso da destruio periodontal e com o
estado da inflamao periodontal. Apesar das evidncias de diversos estudos que mostram o
possvel papel da superrregulao do RANKL e sub-regulao da OPG na doena periodontal,
o monitoramento desses marcadores individualmente no fornece informao adequada para o
97
estado da doena. Sugere-se que esses marcadores, bem como a razo entre eles, sejam
estudados concomitantemente tanto nos tecidos periodontais como no fluido crevicular
gengival. Uma vez que a anlise do fluido crevicular gengival detecta protenas solveis no
exsudato biolgico e a expresso imuno-histoqumica mostra clulas positivas distribudas no
tecido em um momento esttico da doena.
Outro fator que deve ser levado em considerao o fato do diagnstico da condio
da doena ser exclusivamente clnico e radiogrfico, isto , no importa para o diagnstico
quais eventos estejam ocorrendo no interior do tecido gengival, nem os achados histolgicos
desse evento, o que importa a deteco da perda ssea clnica e/ou radiograficamente. Alm
disso, dois fragmentos gengivais com diagnstico clnico de periodontite so completamente
diferentes do ponto de vista histolgico. Por esse motivo, como as amostras do presente
estudo foram diagnosticadas clinicamente, como a maioria das pesquisas, isso no significa
dizer que os fragmentos continham leses histologicamente compatveis com o seu
diagnstico clnico.
de conhecimento cientfico que a ligao do RANKL com seu receptor RANK na
superfcie dos pr-osteoblastos resulta na ativao do fator nuclear B, levando a formao
osteoclstica. Enquanto RANKL considerado o orientador da reabsoro ssea
osteoclstica, TNF tem sido reportado ser capaz de induzir reabsoro ssea osteoclstica na
ausncia do RANKL. Alm disso, a produo do RANKL regulada em resposta a presena
de citocinas pro-inflamatrias, tais como TNF- e IL-1. No nosso estudo o RANKL no
mostrou diferena entre as condies clnicas, mas o TNF- apresentou-se mais
imunomarcado tanto nos casos de periodontite crnica em relao gengivite crnica e
gengiva clinicamente saudvel, bem como nos casos com maior perda de insero no grupo
da periodontite crnica. Pelo fato do TNF- poder influenciar a formao osteoclstica tanto
na presena como na ausncia do RANKL, ele pode ser um potencial alvo teraputico para o
controle de patologias que envolvem a reabsoro ssea.
Diante do exposto, observa-se que os achados do presente estudo indicam uma
possvel interao entre a citocina TNF-, o RANKL e a OPG na progresso e severidade da
doena periodontal, bem como no processo de reabsoro ssea da periodontite.
Vrias abordagens teraputicas tm sido propostas para prevenir a perda ssea
induzida pela periodontite: a inibio da interao RANKL-RANK, a utilizao da terapia
com anti-TNF-, a inibio de molculas de sinalizao e inibio da funo dos osteoclastos.
A administrao de inibidores de canais de Ca2+, incluindo difenilhidantona em pacientes
epilpticos, muitas vezes induz crescimento excessivo dos tecidos gengivais. Por isso,
98
acredita-se que o tratamento com inibidores de canais de Ca2+ pode impedir no s a perda do
osso alveolar, mas tambm a perda de ligamento periodontal (KOIDE et al., 2010).
Atualmente, no se sabe qual abordagem a mais eficaz para suprimir a perda ssea no
tratamento da periodontite. Mais estudos so necessrios para estabelecer estratgias
teraputicas, visto que drogas que inibem a reabsoro ssea podero ser utilizadas para o
tratamento da periodontite num futuro prximo. E para se alcanar uma teraputica que
minimize a reabsoro ssea, so necessrias mais pesquisas com o intuito de compreender
melhor os eventos e fatores que esto associados com a perda ssea na periodontite.
99
CONCLUSES
100
7 CONCLUSES
Com base nos resultados da presente pesquisa conclui-se:
No houve diferena estatisticamente significativa na imunoexpresso do RANKL e da

razo RANKL/OPG entre a gengiva clinicamente saudvel, a gengivite induzida pelo
biofilme e a periodontite crnica.
A imunomarcao para o TNF- mostrou diferena estatisticamente significativa entre as

condies clnicas estudadas apresentando-se maior positividade para os casos de periodontite
crnica, sugerindo uma relao com a progresso e severidade da doena periodontal, alm de
indicar que o TNF- pode induzir reabsoro ssea independentemente da presena do
RANKL.
A imunomarcao para a OPG mostrou diferena estatisticamente significativa entre as

condies clnicas estudadas apresentando maior positividade para os casos de periodontite
crnica.
A perda de insero clnica periodontal mostrou diferena estatisticamente significativa e

correlao positiva e significativa com a expresso dos anticorpos estudados. Acreditando no
papel dessas molculas na progresso e severidade da doena periodontal.
A mobilidade dentria e a profundidade de sondagem apresentou diferena estatisticamente

significativa somente com a imunoexpresso do RANKL, revelando que quanto maior a
expresso dessa protena mais avanado era o estgio da periodontite, indicando possvel
papel dessa molcula na induo da reabsoro ssea na periodontite.
101
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Immuno his tochemical
localizat ion
of
t is sue -type
plasmino gen activador and t yp e I plasminogen act ivador inhibito r in rad icular
c yst s. J. Oral Pathol. Med., v.33, p.156-61, 2004.
109
APNDICES
110
APNDICE I
Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Cincias da Sade
Departamento de Odontologia
Programa de Ps-Graduao em Patologia Oral
Doutorado em Patologia Oral
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Este um convite para voc participar da pesquisa Expresso imuno-histoqumica

do RANKL, OPG, TNF- e IL-10 em gengivite e periodontite crnica e concentrao do
RANKL, OPG no fluido gengival antes e depois do tratamento periodontal, coordenada
pelo Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa. Sua participao voluntria, o que significa
que voc poder desistir a qualquer momento, retirando seu consentimento, sem que isso lhe
traga nenhum prejuzo ou penalidade.
Essa pesquisa procura estudar marcadores envolvidos na reabsoro ssea periodontal,
ou seja, molculas que participam da perda de osso que ocorre na doena periodontal,
encontrados no tecido gengival dos pacientes que passaro por cirurgias periodontais ou
extraes dentrias. Caso decida aceitar o convite, a gengiva que j seria retirada durante a
cirurgia que voc ir se submeter ser estocada no laboratrio de Patologia Oral da UFRN
para estudo desses marcadores citados acima. Para a remoo dessa gengiva voc passar pela
mesma cirurgia a qual j estava programada no seu plano de tratamento odontolgico, sendo
realizada sob anestesia local e com tcnicas que causam o menor desconforto durante a
cirurgia e no ps-operatrio. O desconforto do ps-operatrio mnimo se as recomendaes
do ps-operatrio forem seguidas corretamente.
Voc ter o benefcio de ter seu tecido gengival que j ser removido, examinado
microscopicamente por um grupo de pesquisadores da rea de patologia oral, e no caso de
alguma alterao ter a informao do caso para que se procure ajuda. Os riscos de sua
participao nessa pesquisa so mnimos, porque todos os cuidados de biossegurana e da
tcnica sero tomados de acordo com o procedimento ao qual ser submetido independente de
querer ou no participar da pesquisa.
Tambm ser coletada uma amostra do fluido crevicular gengival (lquido que fica
entre a gengiva e o dente) do dente que no ser extrado, em dois momentos: antes do
tratamento e aps o tratamento, para verificar se os nveis dessas molculas envolvidas na
reabsoro ssea diminuem. Esse procedimento no causa dor, nem desconforto, feito com
um fino cone de papel absorvente que ser inserido entre a gengiva e o dente, do mesmo
modo como se procede com a sonda no exame periodontal de rotina.
Todas as informaes obtidas sero sigilosas e seu nome no ser identificado em
nenhum momento. Os dados sero guardados em local seguro e a divulgao dos resultados
ser feita de forma a no identificar os voluntrios.
Se voc tiver algum gasto que seja devido sua participao na pesquisa, voc ser
ressarcido, caso solicite.
111
Em qualquer momento, se voc sofrer algum dano comprovadamente decorrente desta

pesquisa, voc ter direito a indenizao.
Voc ficar com uma cpia deste Termo e toda a dvida que voc tiver a respeito
desta pesquisa, poder perguntar diretamente para Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes
Costa, na Disciplina de Patologia Oral da Faculdade de Odontologia da UFRN ou pelo
telefone 3215-4108.
Dvidas a respeito da tica dessa pesquisa podero ser questionadas ao Comit de tica em
Pesquisa da UFRN no Campus Universitrio da UFRN ou no telefone (84) 3215-3135.
Consentimento Livre e Esclarecido

Declaro que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela ser realizada, os riscos
e benefcios envolvidos e concordo em participar voluntariamente da pesquisa Fatores
reguladores da osteoclastognese na doena periodontal: anlise da expresso imunohistoqumica do RANKL, OPG, TNF- e IL-10.
Participante da pesquisa:
__________________________________________________________
Assinatura do participante:
__________________________________________________________
Pesquisadores responsveis: Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa / Doutoranda
Bruna Aguiar do Amaral
Assinatura do Pesquisador responsvel:
__________________________________________________________
Tel: (84) 88770302 / (84) 32210895 / (84) 3215-4108
Comit de tica em Pesquisa da UFRN End. Campus Universitrio da UFRN

Fone: (84) 3215-3135
112
APNDICE II
Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Cincias da Sade
Departamento de Odontologia
Programa de Ps-Graduao em Patologia Oral
FICHA CLNICA TESE DE DOUTORADO
IDENTIFICAO PESSOAL
NOME:____________________________________________________DATA___/___/____
DATA NASC. ___/___/______ IDADE:______ SEXO: ( ) MASCULINO ( ) FEMININO
RAA:_________ PROFISSO_________________________
ENDEREO:________________________________________________________________
TEL:___________________ CEL: _____________________
ANAMNESE
( )TABAGISMO
( ) ETILISMO
( ) HIPERTENSO
( )DOENA CARDACA
( ) DIABETES
( ) ALERGIA:_______________
( )DOENA PULMONAR
( ) MEDICAMENTO :___________________________
( )USOU ANTIBITICO NOS LTIMOS 3 MESES
( )OUTROS:_______________________________________________________________
EXAME PERIODONTAL
Dente
DV
R PS
V
R
PS
MV
R PS
DL
PS
L
PS
ML
R PS
MB
MC
NI
IG
DIAGNSTICO CLNICO: __________________________________________________

FATORES ETIOLGICOS SECUNDRIOS LOCAIS:___________________________
PROCEDIMENTOS (
) EXODONTIA
( ) CIRURGIA PERIODONTAL
TIPO DE CIRURGIA:_______________________________________________________
113
ANEXO

Osteoclastogenese

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Osteoclastogenese

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.

BRUNA AGUIAR DO AMARAL BEZERRA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

Tese apresentada ao Programa de Psgraduao

Doutoranda: Bruna Aguiar do Amaral Bezerra

Os primeiros doutores: Karuza (obrigada por tudo irmzinha), Cristina,

problemas de horrios. Pelos conhecimentos compartilhados e pela experincia que

A todos os meus amigos que me que me proporcionam momentos de alegria e

Palavras-chave: Reabsoro ssea, RANKL, OPG, TNF-, periodontite, doena periodontal,

immunohistochemical anti-RANKL (p = 0.026), and probing depth (PD) was positively

Mecanismo de ao do RANKL expresso por vrios tipos

Abundncia de OPG em relao ao RANKL, inibindo a ligao

osteoclastognese e promoo da apoptose de osteoclastos

Perda ssea induzida em periodontite mostrando a ao da

Estimulao e inibio da formao osteoclstica e reabsoro

Condio clnica e intensidade do infiltrado inflamatrio. Natal,

Fotomicrografia de gengivite crnica exibindo moderado e difuso

Fotomicrografia de gengiva clinicamente saudvel demonstrando

Fotomicrografia de gengivite crnica destacando infiltrado

Figura 10. Fotomicrografia de periodontite crnica exibindo intenso e difuso

infiltrado inflamatrio (H/E, 200x)......................................

Figura 12. Fotomicrografia de periodontite crnica exibindo infiltrado

periodontite crnica exibindo

infiltrado inflamatrio plasmocitrio (H/E, 400x)...................

Natal, RN. 2011................................................................................

Figura 15. Fotomicrografia demonstrando a imunomarcao para RANKL

Figura 16. Fotomicrografia destacando forte imunomarcao para RANKL

Figura 17. Fotomicrografia demonstrando marcao para RANKL em regio

Figura 18. Fotomicrografia exibindo fraca imunomarcao para RANKL em

Figura 19. Fotomicrografia demonstrando forte imunopositividade para

Figura 20. Fotomicrografia demonstrando moderada marcao para OPG em

Figura 21. Fotomicrografia exibindo fraca imunomarcao para OPG em

Figura 22. Fotomicrografia demonstrando imunomarcao mais acentuada

Figura 23. Fotomicrografia exibindo fraca imunomarcao para TNF- na

Figura 24. Fotomicrografia demonstrando moderada imunoexpresso para

linfoplasmocitrio (LSAB, 400)...................................................

Figura 25. Fotomicrografia exibindo forte imunomarcao para TNF- em

LISTA DE QUADROS E TABELAS

LISTA DE QUADROS E TABELAS

Clone, especificidade, recuperao antignica, diluio, tempo de

Freqncia absoluta e percentual das variveis independentes

Medidas de tendncia central e disperso para as variveis

Medidas de tendncia central e disperso para as variveis

Medidas de tendncia central e disperso para as variveis

Medidas de tendncia central e disperso para a varivel

Anlise comparativa das variveis dependentes RANKL, OPG,

Anlise comparativa das variveis dependentes RANKL, OPG,

mobilidade dentria, considerando os casos de periodontite

Coeficiente de correlao de Spearman (r) e sua significncia

Coeficiente de correlao de Spearman (r) e sua significncia

Coeficiente de correlao de Spearman (r) e sua significncia

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

L ISTA D E ABREVIATU RAS E SIGLAS

Do ingls t helper cell, traduzida como clulas T auxiliares.

Do ingls colony forming unit for granulocytes and macrophage, traduzido

Do ingls Enzyme Linked Immunosorbent Assay,traduzido como Ensaio

Fatores ativadores osteoclsticos

Do ingls Interferon gamma, traduzido como interferon gama

Do ingls labeled streptavidin biotin, traduzido como conjugado estreptoavidinabiotina.

Do ingls macrophage colony-stimulating factor, traduzido como fator

Do ingls osteoprotegerin, traduzido como osteoprotegerina.

Do ingls OPG ligand, traduzido como ligante da osteoprotegerina.

Do ingls Prostaglandin E2, traduzido como Prostaglandina E2

Perda de insero clnica