UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA

TRATAMENTO EXPERIMENTAL DE CES NATURALMENTE INFECTADOS COM O VRUS DA CINOMOSE NA FASE NEUROLGICA COM O USO DE RIBAVIRINA E DIMETIL-SULFXIDO (DMSO)

SIMONE HENRIQUES MANGIA

BOTUCATU SP 2008

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA

TRATAMENTO EXPERIMANTAL DE CES NATURALMENTE INFECTADOS COM O VRUS DA CINOMOSE NA FASE NEUROLGICA COM O USO DA RIBAVIRINA E DIMETIL-SULFXIDO (DMSO)

SIMONE HENRIQUES MANGIA

Dissertao apresentada junto ao Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria para obteno de ttulo de Mestre em Medicina Veterinria

Orientador: Prof. Ass. Dr. Antonio Carlos Paes

FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA SEO TCNICA DE AQUISIO E TRATAMENTO DA INFORMAO DIVISO TCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECRIA RESPONSVEL: Selma Maria de Jesus

Mangia, Simone Henriques. Tratamento experimental de ces naturalmente infectados com o vrus da cinomose na fase neurolgica com o uso da Ribavirina e Dimetil-Sulfxido (DMSO) / Simone Henriques Mangia. Botucatu : [s.n.], 2008 Dissertao (mestrado) Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Botucatu, 2008. Orientador: Antonio Carlos Paes Assunto CAPES: 50501062 1. Co - Doenas 2. Cinomose - Tratamento

CDD 636.70896 Palavras-chave: Ces; Cinomose; Dimetil-Sulfxido; Encefalite;

Morbillivirus; Ribavirina; Tratamento

Nome do Autor: Simone Henriques Mangia Ttulo: TRATAMENTO EXPERIMENTAL DE CES NATURALMENTE

INFECTADOS COM O VRUS DA CINOMOSE NA FASE NEUROLGICA COM O USO DA RIBAVIRINA E DIMETIL-SULFXIDO (DMSO).

COMISSO EXAMINADORA

Prof. Ass. Dr. Antonio Carlos Paes Presidente e Orientador Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica FMVZ UNESP Botucatu

Profa. Ass. Dra. Regina Kiomi Takahira Membro Departamento de Clnica Veterinria FMVZ UNESP Botucatu

Prof. Associado I Dr. Rogrio Tortelly Membro Departamento de Patologia e Clnica Veterinria Faculdade de Veterinria UFF

Data da Defesa: 07 de maro de 2008

Dedicatria

Dedico esta pesquisa minha me, Sandra da Cunha Henriques, por ter me apoiado e orientado em todos os momentos da minha vida. Esta dedicatria serve como agradecimento para tudo que recebi na minha trajetria.

Dedico esta pesquisa ao meu orientador, Prof. Ass. Dr. Antonio Carlos Paes, por ser o idealizador deste estudo, que me fez aprender a superar e criar opes em momentos de dificuldade.

Agradecimentos
Agradeo a Deus pela oportunidade de enriquecer meus conhecimentos nesta inestimvel universidade e por ter feito tantos amigos aqui. Agradeo a minha me e av, Sandra e Dilma, por todos os valores que me ensinaram, pelo amor e dedicao, alm de toda compreenso pela minha ausncia. Tambm sinto muita a falta de vocs! Obrigada por toda a ajuda que me deram nesse perodo, permitindo que eu pudesse terminar mais uma fase da minha vida. Agradeo a toda famlia Mangia, principalmente meus padrinhos, Eunice e Marciano, por estarem sempre por perto nos momentos mais importantes da minha vida, pelos ensinamentos e amor que sempre recebi. Obrigada pelo apoio e compreenso! Agradeo aos meus tios, Marcos e Aparecida e os primos, Anna Luiza e Marcos Jr., por toda a ajuda que me ofereceram, pelos momentos de alegria vividos e pela compreenso da minha ausncia. Agradeo s minhas amigas cariocas, Danielle, Mirian e Cheryl pelo apoio que recebi durante todo esse perodo, pelos maravilhosos e inesquecveis momentos de diverso e pelo apoio nas horas tristes. Vocs so eternas! Agradeo s minhas amigas de Botucatu, Fernanda, Andreza e Ana Paula, por estarem sempre do meu lado, nos momentos bons e ruins, pelos conselhos e pela ajuda que me ofereceram aos finais de semana para a boa execuo do experimento. Agradeo ao meu orientador, Prof. Ass. Dr. Antonio Carlos Paes, por confiar em mim para execuo desta pesquisa, pelos ensinamentos e orientao profissional. Obrigada pela convivncia agradvel. Agradeo Profa. Regina Kiomi Takahira, Eduardo Cirrose e todos os residentes do Laboratrio Cnico Veterinrio da UNESP Botucatu, pela realizao dos exames complementares pesquisa, trabalhos cientficos e boa convivncia.

Agradeo

Profa.

Jane

Megid

por

disponibilizar

os

exames

de

imunofluorescncia direta, me dando a oportunidade de melhorar os resultados desta pesquisa, por incentivar em outras pesquisas e boa convivncia. Foi muito bom te conhecer melhor neste perodo! Aos professores, Hlio Langoni, Mrcio Garcia Ribeiro, Jane Megid, Rafael Modolo, Paulo Francisco Domingues, agradeo pelos ensinamentos, por me aceitarem no departamento e por apoiarem nessa pesquisa. Agradeo s amigas, Amanda Keller Siqueira e Tatiana Salerno, pela companhia na hora do caf, que significou momentos de descontrao, conselhos, idias de novos trabalhos e at alguns desabafos. Agradeo aos dois grandes amigos, Roberto Bolsanello e Andr Luiz Mangia, um em cada lugar diferente, mas considerados irmos, pelo apoio e pelos momentos de alegria durante este perodo. Aos amigos, Aruaque e Guilherme e todos os colegas do forr que conheci em Botucatu, obrigada pelos momentos de diverso. Aos amigos de ps-graduao, Accia Elias, Ana Paula Contente, Ana Paula Flamnio, Andr Peres Barbosa, Audrey Renn, Fbio Shimabukuro,Gustavo Lara, Janana Biotto, Juliana Machado, Juliano Sorovar, Luciano Eloy, Marcela Zampolli Trocarelli, Melissa Hartmann, Rodrigo Costa da Silva, Vanessa Salgado, Veruska Maia, Walkria Prado e todos os ps-graduandos do departamento, obrigada por colaborarem com a realizao deste experimento com amizade e auxlio. Aos residentes da Disciplina de Enfermidades Infecciosas dos Animais, Rodrigo, Jeniffer, Camila, Marta e Suzan, agradeo por colaborarem com o desenvolvimento da pesquisa, pois sem vocs no teria conseguido concluir o experimento. Aos residentes da Disciplina de Zoonoses, Leila, Felipe, Dulce, Haroldo, obrigada pela ajuda e orientao no diagnstico de toxomplasmose.

Agradeo aos tcnicos e funcionrios, Fernando, Tnia, Adriana, Rodrigo Carreira, Adilson (Pardal), Carlos Eduardo (Kadu), Josiane, Benedito e Marcus, pela amizade, momentos de descontrao e todo apoio. Wander e Serginho, obrigada pela convivncia agradvel, apoio e momentos de descontrao que auxiliaram na conduta do experimento. Aos funcionrios da ps-graduao, do arquivo, da biblioteca obrigada pela inestimvel ajuda. Agradeo ao Prof. Aristeu Vieira da Silva a ajuda na realizao e interpretao das anlises estatsticas desta pesquisa. Agradeo a BIOLUNIS Farmacutica Ltda. por ceder o medicamento antiviral, essencial para a realizao da pesquisa. Clnica Veterinria Pharmazoo, agradeo por me receber como parte da equipe, pelo apoio e compreenso e pelo crescimento profissional, permitindo que conseguisse me manter em Botucatu para a realizao da pesquisa. Capes pelo apoio financeiro e importante para realizao da pesquisa. A todos aqueles que me ajudaram e por um lapso de memria no citei, muito obrigada!

Epgrafe
Aproveite bem, o mximo que puder, o poder e a beleza da juventude. Ou ento, esquece. Voc nunca vai entender mesmo o poder e a beleza da juventude at que tenham se apagado. Mas pode crer, daqui a vinte anos, voc vai evocar as suas fotos e perceber de um jeito que voc nem desconfia hoje em dia quantas, tantas alternativas se escancaravam sua frente. E como voc realmente estava com tudo em cima. Voc no est gordo, ou gorda. No se preocupe com o futuro. Ou ento preocupe-se, se quiser, mas saiba que procupao to eficaz quanto mascar chiclete para tentar resolver uma equao de lgebra. As encrencas de verdade em sua vida tendem a vir de coisas que nunca passaram pela sua cabea preocupada, que te pegam no ponto fraco s quatro da tarde de uma tera-feira modorrenta. Todo dia enfrente pelo menos uma coisa que te meta medo de verdade. Cante. No seja leviano com o corao dos outros, no ature gente de corao leviano. Use fio dental. No perca tempo com inveja. s vezes, se est por cima; s vezes, por baixo... A peleja longa e, no fim, s voc contra voc mesmo. No esquea os elegios que receber, esquea as ofensas. Se conseguir isso, me ensine. Guarde as antigas cartas de amor. Jogue fora os extratos bancrios velhos. Estique-se. No se sinta culpado por no saber o que fazer da vida. As pessoas mais interessantes que conheo no sabiam aos 22 o que queriam fazer da vida. Alguns dos quarentes mais interessantes que conheo ainda no sabem. Tome bastante clcio. Seja cuidadoso com os joelhos: voc vai sentir falta deles. Talvez voc case, talvez no. Talvez tenha filhos, talvez no. Talvez se divorcie aos 40, talvez dance ciranda em suas bodas de diamante. Faa o que fizer, no se autocongratule demais e nem seja severo demais com voc. As suas escolhas tm sempre metade das chances de dar certo. assim para todo mundo. Desfrute de seu corpo, use-o de toda maneira que puder mesmo. No tenha medo de seu corpo ou do que as outras pessoas possam achar dele. o mais incrvel instrumento que voc jamais vai possuir. Dance... Mesmo que no tenha onde, alm de seu prprio quarto.

Leia as instrues, mesmo que no v segui-las depois. No leia revistas de beleza. Elas s vo fazer voc se achar feio. Dedique-se a conhecer os seus pais. impossvel prever quando eles tero ido embora, de vez. Seja legal com os seus irmos. Eles so a melhor ponte com o seu passado e, possivelmente, quem vai sempre mesmo te apoiar no futuro. Entenda que amigos vo e vm. Mas nunca abra mo de uns poucos e bons. Esforce-se de verdade para diminuir as distncias geogrficas e destinos de vida, porque quanto mais velho voc ficar, mais voc vai precisar das pessoas que conheceu quando jovem. More uma vez em Nova Iorque, mas v embora antes de endurecer. More uma vez no Hava, mas se mande antes de amolecer. Viaje. Aceite certas verdades inescapveis: os preos vo subir, os polticos vo saracotear, voc tambm vai envelhecer. E quando isso acontecer, voc vai fantasiar que quando era jovem os preos eram razoveis, os polticos eram decentes e as crianas respeitavam os mais velhos. Respeite os mais velhos. No espere que ningum segure a sua barra. Talvez voc arrume uma boa aposentadoria privada, talvez case com um bom partido, mas no esquea que um dos dois pode, de repente, acabar. No mexa demais nos cabelos, seno quando voc chegar aos 40, vai aparentar 85. Cuidado com os conselhos que comprar, mas seja paciente com aqueles que os oferecem. Conselho uma forma de nostalgia. Compartilhar conselhos um jeito de pescar o passado do lixo, esfreg-lo, repintar as partes feias e reciclar tudo por mais do que vale.

Publicado no jornal americano Chicago Tribune em 1 de junho de 1997 Autora: Mary Schmich

10

LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Relao de animais que compuseram os dois grupos 88 89

experimentais, com idade, sexo, raa e resultado da reao de imunofluorescncia direta no esfregao sangneo........................ Tabela 02 Tabela 03 Tempo de evoluo dos sinais neurolgicos entre os grupos......... Resultado da reao de imunofluorescncia direta de esfregao sangneo dos animais nos gurpo 1 e 2.......................................... Tabela 04 Tabela 05 Evoluo da cinomose na fase neurolgica entre os grupos.......... Relao entre a evoluo da doena com o histrico vacinal dos animais............................................................................................ 91 Tabela 06 Relao entre a evoluo da doena frente ao tempo de desenvolvimento dos sinais neurolgicos at o incio do tratamento....................................................................................... Tabela 07 Relao dos sinais clnicos neurolgicos encontrados nos diferentes grupos, no momento que foram atendidos no Hospital Veterinrio...................................................................................... Tabela 08 Relao das leses neurolgicas nos grupos e a evoluo da doena............................................................................................. 95 Tabela 09 Mdia, desvio padro e nvel de significncia da contagem de hemcias......................................................................................... Tabela 10 Mdia, desvio padro e nvel de significncia da concentrao de hemoglobina................................................................................... Tabela 11 Mdia, desvio padro e nvel de significncia do volume globular........................................................................................... 100 Tabela 12 Mdia, desvio padro e nvel de significncia na contagem de plaquetas......................................................................................... 101 99 98 94 92 89 90

11

Tabela 13 -

Mdia, desvio padro e nvel de significncia entre os grupos com relao contagem total de 101 leuccitos........................................................................................

Tabela 14 -

Mdia, desvio padro e nvel de significncia entre os grupos com relao contagem de 103 linfcitos.........................................................................................

Tabela 15 -

Mdia, desvio padro e nvel de significncia na contagem de moncitos........................................................................................ 104

Tabela 16 -

Mdia e desvio padro dos valores encontrados nos dois grupos na dosagem de uria no soro........................................................... 105

Tabela 17 -

Representao mdia dos valores de protena na urina entre os dois grupos e nvel de 108 significncia....................................................................................

Tabela 18 -

Relao do nmero de hemcias no sedimento urinrio nos dois grupos e nvel de significncia....................................................... 109

Tabela 19 -

Relao do nmero de leuccitos no sedimento urinrio nos dois grupos e nvel de significncia....................................................... 110

Tabela 20 -

Mdia, desvio padro e nvel de significncia dos valores de protena no lquor dos dois grupos................................................. 112

Tabela 21 -

Mdia, desvio padro e nvel de significncia da contagem de clulas nucleadas no lquor dos animais dos dois gurpos.............. 113

Tabela 22 -

Mdia, desvio padro e nvel de significncia da porcentagem de linfcitos no lquor dos animais dos dois grupos........................... 115

Tabela 23 -

Mdiana e nvel de significncia da contagem diferencial de linfcitos no lquor dos animais dos dois grupos, nos diferentes momentos........................................................................................ 116

12

LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Representao grfica da avaliao clnica diria dos animais dos dois grupos experimentais....................................................... Figura 02 Representao grfica da variao das mdias da contagem de hemcias entre os dois grupos........................................................ Figura 03 Representao grfica da variao das mdias da contagem total de leuccitos entre os dois grupos.................................................. 102 Figura 04 Representao grfica da variao das mdias da contagem de linfcitos entre os dois grupos........................................................ 103 Figura 05 Grfico representando as variaes das mdias de protena, albumina e globulina do soro dos dois grupos............................... Figura 06 Representao grfica da contagem de clulas nucleadas no lquor nos dois grupos.................................................................... Figura 07 Representao grfica da porcentagem de linfcitos no lquor nos dois grupos.............................................................................. 115 114 106 98 90

13

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

% - porcentagem m nanmetro C graus Celsius < - menor que > - maior que L microlitro mg miligramas mL - mililitros dL - decilitro - marca registrada - alfa ALT alanina-aminotransferase ATP adenosina trifosfato CPK creatinina fosfo-quinase CDV vrus da cinomose DL 50 dose letal 50 DMSO Dimetil Sulfxido DMS dimetil sulfoxide DMF dimetil formamide DMSO2 dimetil sulfone DMS dimetil sulfide EDTA cido etilenodiaminotetractico ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay F protena de fuso FA fosfatase alcalina Fc receptor de anticorpos de alta afinidade de macrfagos FDA Food and Drug Administration g gama G1 grupo 1 G2 grupo 2 GC grupo controle GGT gama-glutamiltransferase 14

GSH Gonadotropina corinica humana GTP guanosina tri-fosfato g/Kg gramas por quilo HA hemaglutinina IFD imunofluorescncia direta IFN interferon IgA imunoglobulina A IgG imunoglobulina G IgG1 imunoglobulina G1 IgG2 imunoglobulina G2 IgM imunoglobulina M IL interleucina IMP inosina mono-fosfato IND Investigated new drugs L polimerase ou grande LCR lquido cefalorraquidiano mg/Kg miligramas por quilo g/mL microgramas por militro M protena de membrana MHC Complexo de histocompatibilidade principal MMP matrix metaloproteases mRNA RNA mensageiro NADPH2 nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato, forma reduzida NC nervo craniano NP nucleoprotena P fosfoprotena PBS Soluo salina tamponada PCR reao em cadeia pela polimerase PGE2 prostaglandina E2 pH presso de hidrognio ROS radicais livres de oxignio RT-PCR reao em cadeia pela polimerase precedida de transcrio reversa rpm rotao por minuto SLAM molcula sinalizadora da ativao de linfcitos 15

SNC Sistema nervoso central spp. espcie SRD sem raa definida SSPE paencefalite subaguda esclerosante U.S. United States TIMP inibidores tissulares da matrix metaloproteases TNF fator de necrose tumoral * Em virtude do uso consagrado na literatura tcnica, algumas abreviaturas seguem sua grafia no ingls.

16

SUMRIO
RESUMO............................................................................................................. ABSTRACT......................................................................................................... INTRODUO................................................................................................... REVISO DE LITERATURA.......................................................................... 1 2 3 4 5 6 7 8 ESTRUTURA VIRAL............................................................. RESISTNCIA VIRAL........................................................... TROPISMO VIRAL................................................................ EPIDEMIOLOGIA.................................................................. PENETRAO CELULAR.................................................... PATOGENIA........................................................................... PATOGENIA DA IMUNOSSUPRESSO............................. NEUROPATOGENIA............................................................. 8.1 8.2 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 ENCEFALITE DO CO VELHO............................... DESMIELINIZAO................................................. 19 20 21 27 28 29 29 30 32 32 33 34 38 39 42 44 45 47 51 51 54 56 59 60 61 63 64 64 66

SINAIS CLNICOS.................................................................. ENFERMIDADES RELACIONADAS COM O VRUS DA CINOMOSE............................................................................. PATOLOGIA CLNICA.......................................................... ACHADOS ANTOMO-PATOLGICOS............................ PROGNSTICO...................................................................... DIAGNSTICO....................................................................... TRATAMENTO...................................................................... PROFILAXIA.......................................................................... RIBAVIRINA FRENTE AOS Paramyxovirus........................ MECANISMO DE AO....................................................... PROPRIEDADES DA RIBAVIRINA..................................... 19.1 Viramidine: Pr-droga da ribavirina............................ RIBAVIRINA E O SISTEMA IMUNE................................... CONTRA-INDICAES E EFEITOS COLATERAIS DA RIBAVIRINA.......................................................................... DIMETIL SULFXIDO COMO SOLVENTE DE NUCLEOTDEOS....................................................................

17

23

PROPRIEDADES DO DIMETIL SULFXIDO.................... 23.1 23.2 23.3 23.4 23.5 23.6 23.7 23.8 23.9 DMSO e membranas celulares..................................... Captura de radicais livres............................................. Solvente orgnico......................................................... Efeitos no Trato Gastro-intestinal................................ Antimicrobiano............................................................ Indicaes aprovadas para uso..................................... Efeitos no sistema nervoso...........................................

66 66 66 67 69 70 70 71 71 71 72 74 76 77 78 79 80 80 82 82 83 83 84 85 86 87 89 91

Protetor tecidual, antinflamatrio e antisqumico........ 68

Antifngico................................................................... 70

23.10 Metabolismo e excreo.............................................. 24 25 DIMETIL SULFXIDO E OS ERITRCITOS...................... EFEITOS COLATERAIS E CONTRA-INDICAES DO DIMETIL SULFXIDO.......................................................... OBJETIVOS........................................................................................................ MATERIAIS E MTODOS............................................................................... 1 2 3 4 5 6 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL................................... GRUPOS EXPERIMENTAIS.................................................. DOSES E DROGAS EXPERIMENTAIS................................ AMBIENTE E ALIMENTAO DOS CES........................ EXAMES COMPLEMENTARES........................................... 6.1 6.2 6.3 6.4 7 8 1 2 3 Hemograma.................................................................. Anlises bioqumicas................................................... Urinlise....................................................................... Anlise do lquor..........................................................

ANIMAIS.................................................................................. 77

REAO DE IMUNOFLUORESCNCIA DIRETA............. ANLISE ESTATSTICA....................................................... ANIMAIS................................................................................. AVALIAO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS............... EVOLUO DA DOENA FRENTE AOS DADOS EPIDEMIOLGICOS..............................................................

RESULTADOS....................................................................................................

18

4 5 6

EVOLUO DA DOENA FRENTE AOS SINAIS CLNICOS E AS LESES NEUROLGICAS....................... 92 EXAMES COMPLEMENTARES........................................... 97 EFEITOS COLATERAIS......................................................... 116

DISCUSSO......................................................................................................... 118 CONCLUSES.................................................................................................... 135 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................... 137 ARTIGO PARA PUBLICAO....................................................................... 153

19

MANGIA, S. H. Tratamento experimental de ces naturalmente infectados com o vrus da cinomose na fase neurolgica com o uso da Ribavirina e Dimetil-Sulfxido (DMSO). Botucatu, 2008. 152p. Dissertao (Mestrado) Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista. RESUMO Este estudo teve por objetivos testar a eficcia da ribavirina em ces acometidos de cinomose na fase neurolgica; avaliar os efeitos colaterais da mesma atravs do monitoramento hematolgico e provas bioqumicas; avaliar a resposta imunolgica no sistema nervoso central dos ces atravs do exame de lquor; adaptar uma dose e via de administrao adequada da ribavirina em ces e testar a eficcia do DMSO como permeante de membranas biolgicas atuando como vetor da ribavirina. Foram utilizados 20 ces com sinais clnicos neurolgica, divididos em dois grupos de tratamento, sendo que um grupo recebeu a ribavirina e outro a associao da ribavirina e o DMSO, sem distino de sexo e raa, com idades at seis anos e tempo de evoluo mximo de 10 dias. Todos os animais foram avaliados clinicamente e realizado o teste de imunofluorescncia direta de sangue para incluso no estudo. Os exames complementares foram realizados de forma rotineira, o lquor foi colhido antes e aps o tratamento, as drogas foram administradas durante 15 dias consecutivos e realizada a avaliao clnica diria dos animais. Pelos resultados observamos que a ribavirina demonstrou atividade efetiva contra o vrus da cinomose, exercendo leves efeitos colaterais na medula ssea, sistema imune e sistema gastro-intestinal. No lquor observamos diminuio da produo de anticorpos e verificamos que o DMSO tornou a ao da ribavirina mais eficaz.

PALAVRAS-CHAVE: Ces; Cinomose; Dimetil-Sulfxido; Encefalite; Morbillivirus; Ribavirina; Tratamento

20

MANGIA, S. H. Experimental treatment of naturally infected dogs with canine distemper virus, in neurological stage, using Ribavirin and Dimethylsulphoxide (DMSO). Botucatu, 208. 152p. Dissertation (Master) College of Veterinary Medicine and Animal Science, Campus of Botucatu, So Paulo State University. ABSTRACT This study aimed to test the ribavirin efficacy in dogs infected with canine distemper virus in neurological stage; to evaluate this collateral effects by hematological and biochemical evaluation; to evaluate the immunological response on dogs central nervous system (CNS) by cerebrospinal fluid (CSF) analysis; to adapt a dose and an adequate administration route of ribavirin in dogs and to test the efficacy of dimethylsulphoxide (DMSO) in increasing the permeability of biological membranes acting as ribavirin vector. Twenty dogs with neurological signs, divided in two treatment groups, without sex and breed distinction, till six years old and a maximum evolution time of 10 days were used. All animals were selected based on clinical sings and the blood direct fluorescent test (DFA). The hemogram, biochemical and urinalsis test were carried out. At the complementary tests, CSF was collected before and after the treatment, and ribavirin and its association with DMSO were administered during 15 days, consecutive, and the animal clinical evaluation was carried out daily. Based on the results, ribavirin demonstrated effective activity against canine distemper virus, besides its light collateral effects in bone marrow, immune and gastrointestinal systems. In CSF, the lowering of antibody production, and the positive effects of DMSO on ribavirin efficacy were observed.

KEYWORDS:

Dogs;

Canine

Distemper;

Dimethylsulphoxide;

Encephalitis;

Morbillivirus; Ribavirin; Treatment.

21

Introduo
22

Segundo Spinola, a cinomose foi observada na Europa desde a segunda metade do sculo XVIII, proveniente da sia. Sua natureza contagiosa j era reconhecida desde meados do sculo XIX, porm, foi Carr quem, aps uma srie de estudos, considerou-a como enfermidade ocasionada por vrus (CORRA & CORRA, 1992). Os estudos de Carr no foram aceitos, pois todos os pesquisadores e profissionais atribuiam os sinais e sintomas encontrados patogenicidade da B. brochiseptica. Aps os trabalhos de Laidlaw e Dunkin, 1926, foi aceita a etiologia viral da enfermidade (CORRA & CORRA, 1992 apud CARR, 1905). No entanto, outros autores relatam que a cinomose uma enfermidade conhecida desde 1760, altamente contagiosa e febril, de carter aguda ou subaguda (SHIN et al., 2004 apud MURPHY et al., 1999). A partir de 1930, a enfermidade passou a ser perfeitamente conhecida em suas formas clnicas e etiolgicas (CORRA & CORRA, 1992). Appel & Summers (1999), relatam que na primeira metade do sculo XX, a cinomose foi considerada uma das doenas fatais mais comuns em ces em todo o mundo. Posteriormente, nos anos 60 e com o surgimento de vacinas especficas, este quadro modificou-se (TIPOLD et al., 1992). Durante sculos, as infeces pelos Morbillivrus tm tido imenso impacto na vida de humanos e animais. Entre os carnvoros, o vrus da cinomose causa srias enfermidades em vrias espcies, selvagens e domsticas. Mesmo sendo controlada com vacinao em ces domsticos e animais de cativeiro, uma doena de difcil erradicao j que o vrus possui distribuio global e ampla variedade de hospedeiros (BARRETT, 1999). Diferentes espcies da ordem Carnvora, como Ailuridae, Canidae, Hyaenidae, Mustelidae, Procyonidae, Ursidae, Viverridae e Felidae so relatadas como susceptveis infeco pelo vrus da cinomose e a mortalidade varia bastante entre as espcies (APPEL & SUMMERS, 1995). Em 1955, uma grande quantidade de focas do gnero Lobdon carcinophagus morreram na proximidade de uma base na Antrtica, onde havia uma matilha de ces. Os ces no eram vacinados contra cinomose e foi sugerido que os mesmos transmitiram a infeco para as focas. Bengtson et al. (1991) atravs de testes sorologgicos confirmaram alta prevalncia de anticorpos contra o vrus da cinomose nestas focas.

23

Desde a epizootia em focas nos anos de 1988 e 1989 no Mar do Norte da Europa, descobriu-se que os Morbillivirus podiam acometer mamferos aquticos (HASS & BARRETT, 1996). Nos anos de 1987 e 1988, o vrus da cinomose foi responsvel pela morte de cem focas (Phoca sibirca) no Lago Baikal na Rssia (GRACHEV et al., 1989) e foi isolado em outro tipo de foca no Canad (LYONS et al., 1993). O vrus da cinomose foi responsvel pela morte de focas do gnero Phoca caspica, em junho de 1997. As mortes foram observadas prximo ao Azerbaijo, ao leste no Mar Cpsio. A anlise da amostra de uma das focas revelou a presena do cido nuclico do vrus da cinomose (FORSYTH et al., 1998). A relao gentica entre as cepas virais de diferentes partes do mundo pde ser estabelecida atravs das tcnicas de biologia molecular e permitiu traar com mais certeza a origem de novos surtos. Vrios laboratrios relataram estudos similares para diferenciar geograficamente linhagens distintas do vrus da cinomose que acomete animais domsticos e selvagens (BARRETT, 1999). Em 1992, diversas espcies de grandes feldeos morreram com cinomose nos zoolgicos da Amrica. Dois anos aps, lees do Parque Nacional do Serengeti na Tanznia, morreram em grande nmero, e a cinomose foi identificada como causa (BARRETT, 1999). O estudo retrospectivo de Myers et al. (1997), utilizando amostras de lees e tigres que morreram em zoolgico da Sua entre os anos de 1972 a 1992, revelou que 19 das 42 amostras eram positivas ao antgeno do Morbillivirus. Atualmente, a cinomose rara em vrios pases devido vacinao, mas ainda considerada uma enfermidade importante por acometer vrias espcies da famlia Felidae e pode ocorrer eventualmente na populao canina vacinada (VAN MOLL et al., 1995; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Em regies endmicas, como no Brasil, crescente o nmero de mortes de ces vtimas da cinomose. Alm disso, a mesma tem sido considerada como re-emergente em pases onde j esteve controlada (SILVA et al., 2007). Embora a vacinao contra a cinomose venha sendo utilizada amplamente por vrias dcadas, a doena ainda importante e surtos foram recentemente relatados em vrios pases, como Dinamarca, Estados Unidos, Japo, Finlndia e Alemanha (JZWIK & FRYMUS, 2005; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). No Brasil, alguns relatos clnico-patolgicos e sorolgicos indicam a elevada presena da infeco na populao canina (HEADLEY & GRAA, 2000; SILVA et al., 2004). Alguns 24

fatores como a persistncia do vrus no ambiente e em animais portadores, o aparecimento de novas cepas e o desenvolvimento de infeco e doena mesmo em animais vacinados tm contribudo para a manuteno do carter enzotico da virose e a ocorrncia ocasional de surtos (BHM et al., 2004). Alguns achados sugerem que existam diferenas antignicas em reas geogrficas distintas, nos tipos virais selvagens com relao s cepas vacinais, responsveis pelo ressurgimento da doena. O sequenciamento gentico e anlise filogentica so mtodos que no indicam a relao evolucionria entre amostras coletadas em diversas regies geogrficas, mas ajudam a entender as diferenas antignicas entre amostras biolgicamente diferentes (CASTILLO et al., 2007). A reao cruzada imunolgica entre os vrus do sarampo e da cinomose foi descrita pela primeira vez em 1957. No mesmo ano, Polding & Simpson e Goret et al., apresentaram evidncias da relao imunolgica entre a cinomose e a peste dos ruminantes. Em 1953, o soro e a gama-globulina de um adulto humano demostraram a presena de anticorpos especficos neutralizantes para o vrus da cinomose. Alteraes citopticas produzidas pelo vrus da cinomose em culturas celulares de fgado de co eram semelhantes s causadas pelo vrus do sarampo. No estudo realizado por Imagawa et al. (1960), foi relatado que o soro anti-cinomose poderia neutralizar o vrus do sarampo. Em 1979, foi relatado por Stephenson & Meulen a relao antignica entre os vrus do sarampo e da cinomose atravs da comparao entre a resposta imune de humanos e animais. As anlises comparativas do polipeptdeo L do vrus do sarampo e do vrus da cinomose mostravam reao cruzada antignica e demonstraram as funes das outras protenas estruturais. O vrus da cinomose pertence famlia Paramyxoviridae, gnero Morbillivirus, e apresenta relao antignica com os vrus do sarampo, da peste bovina e da peste de pequenos ruminantes (TIPOLD et al., 1992; HASS & BARRETT, 1996; BARRETT, 1999). O sarampo considerado uma doena sria em todo mundo, com mortalidade aproximada de 800.000 crianas por ano, sendo primariamente associado com desnutrio e infeco secundria por bactrias e protozorios. A infeco pelo vrus do sarampo tambm pode ocasionar complicaes no sistema nervoso central (SNC) com apresentaes distintas: encefalomielite aguda desmielinizante, encefalite do sarampo com corpsculos de incluso e panencefalite subaguda esclerosante (RIMA & DUPREX, 2006). 25

No existe agente antiviral especfico para o tratamento da cinomose e mesmo com vacinao permanece como a pior doena em ces. A ribavirina uma alternativa de tratamento, pois mostrou alguma eficcia contra Vrus Respiratrio Sincicial, Vrus da Febre de Lassa e Vrus do Sarampo (ELIA et al., 2007). O interesse na quimioterapia antiviral comeou em 1950, quando a pesquisa de agentes anti-tumorais gerou interesse em inibidores da sntese de DNA e foram produzidos vrios compostos capazes de inibir a sntese de DNA viral. Agentes antivirais foram administrados pela primeira vez com sucesso nos anos 1960, quando Bauer impediu doenas administrando thiosemicarbazone (methisazone) em pacientes expostos varola e Kaufman obteve melhora de pacientes com herpes utilizando idoxirudine tpico (BEAN, 1992). Em 1970, a ribavirina foi sintetizada pela primeira vez como parte de esforo intensivo de buscar por novos agentes antivirais. No primeiro momento, surgiu para ser um anlogo a nucleotdeo capaz de abrir o anel de pirimidina, porm, estruturalmente e funcionalmente mais parecido a guanosina (BEAN, 1992). Nestas pesquisas iniciais, envolvendo poucos agentes antivirais com eficcia, muitos tinham apenas efetividade in vitro. Entretanto, a ribavirina (1--Dribofuranosyl-1H-1,2,4-triazole-3-carboxamide) um agente antiviral que mostrou atividade in vitro contra grande variedade de DNA e RNA vrus (GILBERT & KNIGHT, 1986). A ribavirina foi aprovada pela U.S. Food and Drug Administration para o tratamento peditrico da infeco pelo vrus sincicial respiratrio e sua combinao com alfa-interferon para infeco crnica pelo vrus da hepatite C. Recentemente, benefcios teraputicos do antiviral esto sendo avaliados para o tratamento de sndrome respiratria severa aguda e infeco do vrus da varola, em casos de bioterrorismo (WU et al., 2005). O registro histrico do dimetil sulfxido (DMSO) foi iniciado em 1867 quando o qumico russo, Alexander Saytzeff descreveu a oxidao do dimetil sulfide, identificou o produto e descreveu algumas propriedades solventes extraordinrias do DMSO. Houve pouco interesse nas descobertas at 1950, quando essas propriedades foram exploradas em vrios processos industriais. Pesquisadores de indstrias descobriram que servia como solvente para vrios herbicidas, fungicidas, antibiticos e hormnios de plantas, nas quais aumentava a penetrao e a eficcia. Cientistas trabalharam com DMSO e relataram outras propriedades incomuns: penetrava rapidamente na pele sem 26

causar danos; sua aplicao tpica em qualquer parte do corpo rapidamente resultava em distinta e agressiva halitose lembrando alho ou ostra, devido ao odor do metablito dimetil sufide. O DMSO capaz de carrear vrios solutos atravs da pele, sendo necessrio cuidado no manuseio e conhecer as solues ou compostos com potencial txico, tambm capaz auxiliar na cura de queimaduras lenta ou rapidamente e aliviar dor e edema de injrias. Essas observaes estimularam novas pesquisas com o DMSO para outras aplicaes mdicas e biolgicas. Robert Herschler da companhia de papel Crown Zellerbach, e Stanley Jacob da Universidade de Oregon Medical School, foram fortes proponentes para o incio dos estudos do DMSO como agente teraputico. O primeiro relato de investigao laboratorial do DMSO em sistemas orgnicos de mamferos foi publicado em 1959 (BRAYTON, 1986; ALI, 2001). Lovelock e Bishop mostraram que o DMSO superior ao glicerol para criopreservao de espermatozides bovino e eritrcito humano e observaram que a soluo de DMSO era capaz de manter a motilidade espermtica por vrias horas em temperatura ambiente, o que sugeria baixa toxicidade celular (BRAYTON, 1986). O primeiro relato do DMSO como agente farmacolgico foi publicado em 1964 e a condio para investigao de novas drogas (IND) foi garantida pela Food and Drug Administration (FDA). Em novembro de 1965 a FDA terminou seus estudos clnicos sobre o DMSO, pois Rubin demonstrou que induzia as alteraes lenticulares em alguns animais de laboratrios. Em 1966, a mesma moderou o policiamento para permitir evoluo nas pesquisas para tratamento de condies srias como escleroderma, infeco persistente de Herpes Zoster e severa artite reumatide, para as quais no havia teraputica satisfatria. Em 1968, foi permitida sua utilizao tpica por at 14 dias de tratamento. Em 1970, a FDA aprovou a utilizao na veterinria em doenas musculares em cavalos e em 1972 foi aprovado para uso em ces. No ano de 1978, a FDA autorizou o uso da soluo de 50% de DMSO nos casos de cistite intersticial em humanos e em maio de 1980 estabeleceu regulamentos especficos nos testes clnicos do DMSO (BRAYTON, 1986; ALI, 2001).

27

Reviso de Literatura
28

A cinomose uma enfermidade infecto-contagiosa, causada por um RNA-vrus do gnero Morbillivirus, famlia Paramyxoviridae, ordem Mononegavirales. Possui trs formas de apresentao clnica: aguda, subaguda e crnica, com manifestaes gastroentricas, respiratrias e neurolgicas. So descritas trs formas de encefalite causada pelo vrus da cinomose: encefalite dos ces jovens, encefalite em ces adultos e encefalite do co velho (CORRA & CORRA, 1992). Os Morbillivirus receberam esse nome do diminutivo morbus, que significa praga, e historicamente, o termo foi utilizado para diferenciar o sarampo da varola e da escarlatina. Como um dos seis gneros da famlia Paramyxoviridae, os Morbillivirus so responsveis por vrias doenas graves em humanos e animais (RIMA & DUPREX, 2006).

1 Estrutura viral
O vrus da cinomose possui dimetro varivel (150-250 m) com genoma constitudo por uma fita simples de RNA contendo aproximadamente 15.690 nucleotdeos (VON MESSLING & CATTANEO, 2002). O genoma envolto por nucleocapsdeo helicoidal, que consiste na nucleoprotena (NP), associado protena matrix e ao complexo polimerase, incluindo as protenas P (fosfoprotena) e L (polimerase ou grande). A protena de membrana (M) est localizada na face interna do envelope e exibe as duas glicoprotenas, hemaglutinina (HA) e protena de fuso (F), que so responsveis pela fixao na membrana dos plasmcitos (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; MARTELLA et al., 2007). A HA possui atividade de hemoaglutinao, sendo responsvel pela fixao do vrus na clula hospedeira e pelo tropismo celular, tambm reconhecida atualmente por possui mais variaes antignicas. A protena F proporciona a ligao entre a membrana celular do hospedeiro e o envelope viral e a formao de sinccios (STERN et al., 1995; WILD et al., 1995; LAN et al., 2006). Essas glicoprotenas so derivadas da membrana da clula hospedeira na formao de novos vrions (HASS & BERRETT, 1996). A protena matrix dos paramyxovirus ocupa um papel crucial nos processos de montagem e produo de novas partculas virais (BELLINI et al., 1986). As protenas P e L possuem a funo de transcrio e replicao viral (BARRETT, 1999), ao mesmo passo que a NP a principal reguladora da replicao viral e da transcrio, e

29

consequentemente, a primeira protena exposta ao sistema imune que estimula a produo de anticorpos nos primeiros estgios da infeco (LATHA et al., 2007). Imhoff et al. (2007), afirmam que o colesterol est envolvido na formao e manuteno de membranas celulares e consequentemente para a formao das protenas HA e F do envelope viral. Os autores demonstraram que a reduo do colesterol do envelope viral reduz a infectividade do vrus da cinomose, e quando este interage com clulas de menor teor de colesterol h diminuio na formao de sinccios.

2 Resistncia viral
O vrus sensvel ao ter e aos solventes lipdicos, instvel a pH menor que 4,5 e inativado pelo calor em uma hora a 55C e em 30 minutos a 60C. Em climas quentes no sobrevive nos canis aps os enfermos terem sido retirados, pois vivel apenas por uma hora a temperatura de 20C e por 20 minutos nos exsudatos. inativado com formol a 0,5% em quatro horas, com fenol a 0,75% em 10 minutos a 4C e com desinfetantes constitudos por amnia quartenria a 0,3% em 10 minutos (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006).

3 Tropismo viral
A molcula sinalizadora da ativao de linfcitos (SLAM) tem mostrado ser um receptor eficiente para as cepas selvagens, considerada um membro da superfamlia das imunoglobulinas, podendo controlar a induo de polissacardeos na produo de IL-12, fator de necrose tumoral (TNF) e xido ntrico pelos macrfagos. Estudos por imunohistoqumica demonstraram que a expresso da SLAM no SNC limitada quando comparada com tecidos linfides. Por isso, sugere-se que existam outros receptores para o vrus (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; YANAGI et al., 2006). Todos os Morbillivirus apresentam forte linfotroprismo relacionado ao receptor SLAM, o que sugere a penetrao do vrus no SNC atravs de clulas mononucleares de sangue perifrico (RUDD et al., 2006). Plattet et al. (2005) demonstraram que na ausncia do receptor SLAM, a protena HA tem um papel importante na fuso celular. Foi sugerido no referido estudo que a presena ou ausncia do receptor SLAM pode determinar a citlise ou a infeco persistente in vivo, porm ainda falta identificar o receptor do SNC ao vrus da cinomose em ces. 30

No estudo realizado por Von Messling et al. (2006), a replicao da cepa selvagem do vrus da cinomose foi demonstrada em clulas epiteliais do trato respiratrio nos estgios tardios da infeco, sugerindo que o acometimento do epitlio pulmonar precedido pela proliferao nos rgos linfides. Foi sugerido por esses autores que o vrus inicialmente induz a expreso da SLAM em linfcitos e macrfagos encontrados nas tonsilas e, posteriormente, utiliza outro receptor ainda desconhecido para infectar clulas epiteliais. O vrus da cinomose pantrpico, porm, existem diversas cepas, algumas mais neurotrpicas e virulentas que outras; sendo as mais patognicas, a Snyder Hill e R252, que so altamente neurotrpicas e imunossupressoras (CORRA & CORRA, 1992; MORO & VASCONCELOS, 1998; ALVES et al., 2006).

4 Epidemiologia
Enfermidade de ocorrncia mundial afeta animais das famlias Canidae, Mustelidae, Hyaenidae, Procyonidae, Ailuridae, Viverridae, Felidae, Ursidae, Phocidae, Tayassuidae, e Cercopithecidae. A patogenicidade da infeco pelo vrus da cinomose varia de acordo com a espcie e pode resultar em infeces inaparentes ou causar alta mortalidade. No entanto, o mais importante agente infeccioso que acomete a populao canina, devido alta morbidade e mortalidade (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; VAN MOLL et al., 1995; HEADLEY & GRAA, 2000; GEBARA et al., 2004; CHO & PARK, 2005). Todos os vrus isolados pertencem a um mesmo sorotipo. As vrias amostras isoladas produzem enfermidades com durao e sinais clnicos distintos: algumas causam enfermidade de mediana patogenicidade, enquanto outras causam enfermidade aguda, altamente mortal, com ou sem encefalite aguda, e outras, ainda, causam encefalite tardia, aps uma enfermidade branda, ou mesmo aps a recuperao da enfermidade aguda. H ainda aquelas que levam muito tempo para exteriorizar seus efeitos encefalitognicos, como o que ocorre na encefalite do co velho ou na hard pad disease (CORRA & CORRA, 1992). As estirpes Onderstepoort e Rockborn so as mais utilizadas em todo o mundo para a elaborao de vacinas contra o vrus da cinomose (MOCHIZUKI et al., 2002). A estirpe Snyder Hill, por apresentar grande potencial neurotrpico, a mais utilizada em experimentos de inoculao intracerebral,

31

tanto em estudos da patognese viral quanto em desafio ps-vacinal (NEGRO et al., 2006 apud SLATER, 1970). A encefalomielite considerada causa comum na morte de ces e aproximadamente 15% de todas as inflamaes do SNC so causadas pelo vrus da cinomose, sendo que essa porcentagem pode ser mais alta em regies endmicas (SAITO et al., 2005). Estudos realizados por Silva et al. (2007) confirmam que aproximadamente 12% dos ces necropsiados morreram devido s complicaes neurolgicas causadas pelo vrus da cinomose. A cinomose pode ocorrer em qualquer poca do ano, mas no inverno h elevao na ocorrncia da enfermidade. O co representa o principal reservatrio para o vrus da cinomose e serve como fonte de infeco para animais selvagens. No h diferena de susceptibilidade da infeco entre machos e fmeas, no entanto, ces das raas dolicoceflicas so mais afetados que os braquioceflicos (CORRA & CORRA, 1992; GRANCHER et al., 2004; GREENE, 2006). A idade de maior incidncia da cinomose nos ces coincide com a poca em que diminui a taxa de anticorpos maternos passivamente transmitidos, isto , entre 60 e 90 dias de idade, demonstrando a relao entre susceptibilidade e a idade, porm, o vrus da cinomose pode acometer animais de todas as idades (CORRA & CORRA, 1992; BIAZZONO et al., 2001; GEBARA et al., 2004). Mais de 50% das infeces so subclnicas ou com sinais clnicos moderados (SILVA et al., 2007), ou seja, a taxa de infeco maior do que o nmero dos animais que manifestam a enfermidade, estimando-se em at 75% de ces suscetveis que eliminam o vrus sem qualquer sinal clnico da doena (CORRA & CORRA, 1992; GEBARA et al., 2004). Acima de 30% dos ces exibem sinais de envolvimento neurolgico durante ou aps a infeco sistmica pelo vrus da cinomose e a maior parte dos carnvoros selvagens que morrem pela doena possui evidncias de infeco no SNC (RUDD et al., 2006). A transmisso ocorre principalmente por aerossis e gotculas que contm os vrus, atravs de secrees respiratrias, fezes e urina (CORRA & CORRA, 1992).

32

5 Penetrao celular
O mecanismo de fuso de membrana caracterizado pela ao das glicoprotenas virais. A quebra e a ativao destas, em alguns Paramyxovirus e Ortomyxovirus, dependem de proteases tissulares especficas, que determinam o tropismo restringindo a fuso para tecidos selecionados. O processo de fuso comea com o contato do receptor celular com a protena HA, esta muda sua conformao transmitindo lateralmente um sinal para a protena F, que sofre quebra e ativao, expondo o peptdeo de fuso hidrofbico e inserindo-o na membrana plasmtica. O peptdeo reduz o espao entre a membrana e o envelope, promovendo a fuso (VON MESSLING et al., 2001; VON MESSLING et al., 2004b; YANAGI et al., 2006). A entrada especfica do Morbillivirus em linfcitos o receptor universal SLAM, determinante da imunossupresso. O SLAM encontrado nas clulas T, timcitos imaturos, uma poro das clulas B, moncitos ativados e clulas dendrticas, permitindo a disseminao viral no sistema linfide (VON MESSLING et al., 2005).

6 Patogenia
Durante a exposio natural, o vrus da cinomose se propaga por gotas de aerossis e entra em contato com o epitlio do trato respiratrio superior. No perodo de 24 horas, as partculas virais se replicam nos macrfagos e se disseminam pela via linftica local, para as tonsilas e linfonodos bronqueais (TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; MORO & VASCONCELOS, 1998; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; GREENE, 2006). O estudo de imunohistoqumica realizado por Daimn et al. (2005), mostrou que o vrus se replica primeiro nos macrfagos alveolares, seguidamente nos pneumcitos do tipo II e epitlio respiratrio. Com dois a quatro dias ps-infeco, o nmero de partculas virais aumenta nas tonsilas, linfonodos retrofarngeos e bronqueais, mas um nmero baixo de clulas mononucleares infectadas encontrado em outros rgos linfides. No perodo de quatro a seis dias ocorre a replicao viral no sistema linfide, medula ssea, timo, bao, linfonodos mesentricos, placas de Peyer, clulas estomacais, clulas de Kupffer e clulas mononucleares ao redor dos vasos pulmonares e bronqueais. A ampla proliferao viral nos rgos linfides induz um aumento inicial na temperatura

33

corporal, entre o segundo e o sexto dia, ocorrendo leucopenia, causada por danos virais nas clulas linfides, afetando as clulas T e B (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; MORO & VASCONCELOS, 1998; GREENE, 2006). A disseminao do vrus no epitlio e nos tecidos do SNC ocorre no perodo de oito a dez dias ps-infeco, por via hematgena ou pelo lquor dependendo da resposta imune humoral ou celular do animal (TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; JONES et al., 2000; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; GREENE, 2006). Nos ces com nveis intermedirios de resposta imune mediada por clulas e com ttulos de anticorpos que aparecem tardiamente aps nove a 14 dias, o vrus se dissemina pelos tecidos. Os sinais clnicos podem desaparecer com o aumento da titulao de anticorpos e o vrus eliminado da maioria dos tecidos, assim que os ttulos de anticorpos aumentam, mas podem persistir por longos perodos em tecidos uveais e neurnios e tegumentos, bem como nos coxins plantares. A recuperao da infeco est associada com a imunidade a longo prazo e interrupo da replicao viral. A proteo pode ser comprometida se o co for exposto a cepa altamente virulenta, dose infectante elevada e/ou sofrer imunossupresso (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006).

7 Patogenia da imunossupresso
Um quadro proeminente da infeco de ces gnobiticos com vrus da cinomose a linfopenia prolongada e depleo linfide sistmica. A infeco fatal pelo vrus da cinomose esta associada depleo sistmica de reas de linfcitos T e B. A infeco resulta em leucopenia devido linfopenia que se inicia uma semana aps a infeco (MORO & VASCONCELOS, 1998). Segundo Schobesberger et al. (2005) a queda significativa de linfcitos foi observada antes da viremia, trs dias ps-infeco. A causa da linfopenia em animais infectados pelo vrus da cinomose ocorre provavelmente devido a habilidade do vrus em se replicar e destruir os tecidos linfides. A replicao viral causa extenso perodo de imunossupresso, durante o qual podem ocorrer infeces oportunistas que agravam o quadro clnico. Simultneamente ocorre a perda de resposta dos linfcitos aos agentes mitognicos. A infeco pelo vrus in vitro e in vivo reduz drasticamente a habilidade dos macrfagos e moncitos de

34

produzir IL-1 e aumenta a sntese de prostaglandina E2 (PGE2). Sabe-se que a PGE2 um agente imunossupressor, com capacidade de inibir a produo de IL-2 e interferon gama (IFN-g) (MORO & VASCONCELOS, 1998). Entretanto, nos relatos atuais foi observado que a cintica da infeco viral no est correlacionada com a da depleo de linfcitos e a morte celular. No perodo de trs a seis dias aps a infeco, h um aumento na apoptose, porm o vrus no detectvel. Esses efeitos podem ser mediados pela produo de citocinas inflamatrias, que afetam a homeostasia dos linfcitos (KUMAGAI et al., 2004; SCHOBESBERGER et al., 2005). J nos relatos de Kajita et al. (2006), foi descrito o mecanismo utilizado pela cepa Onderstepoort, capaz de induzir apoptose atravs da utilizao de mediador de apoptose de clulas de mamferos (caspase-3), o qual faz uma cascata com transmisso de sinais proteolticos. Baseado nos relatos de Schobesberger et al. (2005), a determinao do nmero de linfcitos tem um valor prognstico no desenvolvimento da doena. Na cinomose aguda, as clulas Th1 e CD4+ representam o principal alvo para o vrus. A infeco ltica de CD4+ pode ter inmeras conseqncias, pois essa clula tem papel importante na induo e regulao da resposta imune. A depleo de clulas CD4+ associada atrofia de folculos secundrios pode ser relevante para imunossupresso (MORO & VASCONCELOS, 1998; KUMAGAI et al., 2004). Como conseqncia da infeco, a arquitetura do bao e linfonodos so parcialmente destrudas; observando-se drstica infeco nas placas de Peyer e tonsilas sugerindo comprometimento da resposta de anticorpos da mucosa (IgA), que protege contra patgenos que atravessam barreiras epiteliais (VON MESSLING et al., 2004b). A imunossupresso e resposta imune anormal contribuem na susceptibilidade s infeces secundrias, que podem influenciar bastante na morbidade e mortalidade da doena (HASS & BARRETT, 1996; KAJITA et al., 2006).

8 Neuropatogenia
Alguns estudos sugerem que a infeco do SNC ocorre precocemente, na fase sistmica da doena. Neste caso, a cinomose progride da doena sistmica para neurolgica, aparentemente por falha do sistema imune na invaso viral no crebro e na medula espinhal (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al, 1995; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995).

35

Os sinais da cinomose quando acomete o SNC so polimrficos. O curso clnico e neuropatolgico da encefalomielite est relacionado com a variedade da cepa viral e a idade do animal afetado (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al, 1995; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995). Os resultados encontrados por Silva et al. (2007) permitiram concluir que a diferena entre o tipo de leso desenvolvida por filhotes e adultos pode ser tnue, e que embora possa haver maior freqncia de desmielinizao em filhotes deve-se levar em considerao que filhotes tambm desenvolvem leses mais crnicas, assim como ces adultos podem desenvolver leses mais agudas. A difuso viral depende do grau de resposta imune sistmica do hospedeiro e a presena de anticorpos antivirais. Alm disso, a deposio de imunocomplexos pode facilitar a sua difuso no endotlio vascular do SNC. Livre ou associado s plaquetas ou linfcitos, o vrus penetra nas clulas endoteliais vasculares das meninges, nas clulas do plexo coride do quarto ventrculo e nas clulas ependimrias lineares do sistema ventricular (GREENE, 2006). A freqente ocorrncia de leses periventriculares e subpiais, e o fato do vrus ser encontrado facilmente nas clulas do plexo coride e do epndima, sugerem que penetre nos tecidos cerebrais atravs do lquor. Neste, o agente pode ser encontrado em clulas monucleares fundidas com clulas ependimrias (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995). A infeco do epitlio do plexo coride tem mostrado ser produtiva atravs de todo o curso de infeco com o vrus continuamente sendo produzido. A propagao do vrus atravs das vias do SNC, provavelmente explica a precoce distribuio de leses em reas subependimrias, tais como o crtex cerebral, trato ptico e nervos, velo medular rostral, pednculos cerebelares e medula espinhal (GREENE, 2006). No entanto, nos estudos de Rudd et al. (2006) foram encontradas evidncias de que o vrus penetra atravs do bulbo olfatrio e se dissemina pela rota olfatria at o SNC, nos casos de infeco por via aergena, diferente do que foi proposto anteriormente. Quando uma efetiva resposta imune antiviral neutralizante ausente na fase aguda da cinomose, anticorpos IgM anti-vrus da cinomose aparecem nas duas primeiras semanas da infeco. Apesar da ausncia de manguitos perivasculares, numerosas clulas CD8+ so encontradas nas leses agudas desmielinizantes e tambm distribudas difusamente no parnquima cerebral, correlacionado de forma desigual com reas de infeco viral. No lquor destes animais altos ttulos de IL-8 foram 36

encontrados, isto sugere que a ativao inicial das clulas da micrglia serve como uma alavanca para a invaso de clulas T no SNC (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). A IL-1 importante na patognese de todos os tipos de leses neurolgicas causadas pelo vrus da cinomose. responsvel por estimular a proliferao de astrcitos, que pode significar o incio das leses, como as encontradas na cinomose no inflamatria subaguda, que evidenciam frequentemente astrogliose reativa. Encontrada principalmente nos espaos perivasculares da inflamao subaguda e nas leses crnicas, a IL-1 age de forma importante na propagao da doena (GRNE et al., 2000). A encefalite aguda, que ocorre inicialmente no curso da infeco em animais jovens ou imunossuprimidos, caracterizada por injria viral direta (SUMMERS et al., 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006). O vrus causa leso multifocal nas substncias cinzenta e branca. Leses na substncia cinzenta so resultados de infeco neuronal e necrose, e podem levar a uma poliencefalomalcea predominante. Leses na substncia branca so caracterizadas por danos mielnicos e esto associados com replicao viral nas clulas da glia. Mudanas inflamatrias so mnimas devido imunodeficincia resultante de imaturidade fisiolgica do sistema imune e/ou decorrente da imunossupresso viral induzida (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006). Durante a fase inicial da encefalite a expresso do RNA mensageiro (mRNA) e da protena viral so altas nas reas afetadas e uma possvel conseqncia o aumento da produo do Fator de Necrose Tumoral (TNF) pelos astrcitos. A sua importncia na progresso das leses cerebrais tambm sustentada pela abundncia do vrus na forma imunorreativa presente nas leses no inflamatrias, que se caracterizam pela desmielinizao. O TNF tem sido evidenciado como causa da destruio de oligodendrcitos e perda de mielina (GRNE et al., 2000). A encefalite multifocal em ces adultos acomete frequentemente animais entre quatro e seis anos, com curso crnico. Esta enfermidade no precedida nem coincidente com os sinais sistmicos que so vistos nos ces jovens (CORRA & CORRA, 1992). O antgeno do vrus fica restrito a poucos astrcitos e a expresso do MHC proeminente em todas as clulas da micrglia, sendo responsvel pela desmielinizao contnua e disseminada infiltrao mononuclear perivascular. As alteraes iniciam com hiperplasia dos astrcitos e proliferao microglial em estruturas 37

subpiais e subependimrias na substncia branca. Esta forma tambm est associada com a concentrao alta de anticorpos antimielnicos, podendo ser uma reao secundria ao processo inflamatrio. Anticorpos contra o vrus interagem com macrfagos infectados em leses no SNC, causando sua ativao com liberao de radicais livres de oxignio, do tipo superxido. Esta atividade por sua vez pode levar destruio de oligodendrcitos e bainha de mielina (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006; STEIN et al., 2006). Os estudos de Brge et al. (1989) demonstraram que os anticorpos antivirais estimulam a produo de radicais livres de oxignio (ROS) em culturas cerebrais de ces infectadas com o vrus da cinomose. O mecanismo de produo de ROS depende da expresso do antgeno viral na superfcie de clulas infectadas marcadas com receptores Fc (receptor de anticorpos de alta afinidade) nos macrfagos. Os ROS fazem degradao de fosfolipdios na parte cortical do crebro, destruindo protenas da bainha de mielina e interferindo na produo da mesma. Nesta fase da doena, nos infiltrados perivasculares encontramos CD8+, CD4+ e linfcitos B, e citocinas pro-inflamatrias, IL-1, IL-6 e IL-12, indicando uma resposta imune-mediada (WNSCHMANN et al., 1999; MARKUS et al., 2002). A produo de TNF e tambm de IL-1 e IL-6 pelas clulas locais importante na induo de molculas de adeso endotelial, como pr-requisito para a migrao de clulas inflamatrias para o SNC e a progresso das leses no estgio crnico, caracterizado por inflamao severa. Alm disso, a produo de TNF por clulas inflamatrias no responsvel apenas pelo processo de desmielinizao pela destruio direta de oligodendrcitos resultando na perda de mielina, mas pode levar ao recrutamento de mais leuccitos (GRNE et al., 2000). Os estudos realizados por Vandevelde & Zurbriggen (1995) mostraram que o vrus persiste em reas na camada branca fora das leses inflamatrias desmielinizantes. Isto acontece no desenvolvimento progressivo da doena crnica se a resposta imune for mais lenta do que a replicao viral. A persistncia viral a chave para a patognese das leses crnicas (ZURBRIGGEN et al., 1995a; ZURBRIGGEN et al., 1995b; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). possvel que o vrus reduza sua expresso nestas reas do SNC, em analogia a panencefalite subaguda esclerosante em humanos. A persistncia est associada com a diminuio da regulao dos genes que codificam protenas de membrana e superfcie, diminuindo, desta forma, a sua expresso na superfcie celular. Estas clulas 38

persistentemente infectadas podem continuar a sobreviver, pois a infeco restrita e a difuso viral no provoca lise celular (ZURBRIGGEN et al., 1995a; ZURBRIGGEN et al., 1995b; MEERTENS et al., 2003; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). No estudo ultra-estrutural de Meertens et al. (2003), foram encontrados relativamente pequenos indcios do vrus nas clulas persistentemente infectadas, mesmo que o nucleocpsdeo seja encontrado em grandes quantidades e as glicoprotenas expostas. O autor demonstra a diferena entre as cepas Onderstepoort e A75/17 com relao persistncia viral. A cepa A75/17 foi capaz de diminuir a expresso de suas protenas de superfcie (H e F) em relao Onderstepoort, com isso, pode-se observar caractersticas distintas entre as cepas virais com relao a persistncia viral. Foi sugerido que a infeco de astrcitos pelo vrus da cinomose no inicia uma reao inflamatria, ocorre por uma ao viral em limitar o seu desenvolvimento, diminuir a destruio celular, no liberar protenas virais e debris celulares no meio extracelular. A persistncia do vrus nos casos de cinomose favorecida pela estratgia do mesmo, que se dissemina com impedimento ou retardamento da sua deteco pelo sistema imune, de maneira similar ao que props Oldstone e Rall para outros sistemas virais (ZURBRIGGEN et al., 1995a; ZURBRIGGEN et al., 1995b; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). 8.1 Encefalite do Co Velho ou Old Dog Encephalitis A encefalite do co velho comumente observada em ces com mais de seis anos e se caracteriza por ser principalmente uma panencefalite. uma forma rara, crnica, de carter inflamatrio progressivo na camada cinzenta dos hemisfrios cerebrais e do tronco enceflico, resultante da persistncia viral nos neurnios aps infeco aguda pelo vrus da cinomose. Esta enfermidade acomete animais que so imunocompetentes e que apresentam a persistncia viral no SNC, com leses restritas e caracterizadas por infiltrao perivascular disseminada com linfcitos e plasmcitos, proliferao difusa da micrglia, astrogliose, degenerao neuronal e neuronofagia. Estas leses esto em todo crtex cerebral e tambm no ncleo basal, tlamo e hipotlamo. A resposta imune dominada por infiltrado de clulas T e aumento da regulao do MHC classe II (CORRA & CORRA, 1992; SUMMERS et al., 1995; GREENE, 2006). Geralmente o cerebelo no acometido nesta forma (CORRA & CORRA, 1992).

39

8.2 Desmielinizao O incio das leses desmielinizantes ocorre aproximadamente trs semanas psinfeco e durante o perodo de intensa imunossupresso e ausncia de inflamao. A desmielinizao coincide com a replicao viral nas clulas da glia, com predileo por algumas regies como cerebelo, sistema ptico e medula espinhal (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; VANDEVELDE, 2004; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). O sistema matrix metaloproteases (MMP) est envolvido na patognese da desmielinizao, por abrir a barreira hemato-enceflica pela quebra de componentes da membrana basal, favorecendo a migrao de clulas inflamatrias para o interior do SNC, desencadeando a liberao de TNF-, que desintegra a bainha de mielina (MIAO et al., 2003; VANDEVELDE, 2004). A reconstituio da matrix extracelular ocorre sob o controle do fator de crescimento por equilibrar a secreo de MMP e seus inibidores tissulares (TIMP). Ento, um desbalano entre MMP e TIMP resulta em incio e progresso das leses. Uma reduo de TIMP nas leses crnicas com aumento do nvel de expresso de MMP favorece a hiptese para a progresso das leses na encefalite desmielinizante da cinomose (MIAO et al., 2003). No estudo realizado por Khuth et al. (2001) foi possvel observar a expresso de MMP e TIMP, que esto com a regulao aumentada em locais especficos, ocorrendo principalmente na regio rostral do crebro, crtex, hipocampo e hipotlamo. Concomitantemente h um aumento da regulao ou induo de citocinas proinflamtrias, havendo uma relao entre a replicao viral no SNC, a produo citocinas inflamatrias e essa a quantidade de MMP e TIMP. Sugere-se que a induo de citocinas inflamatrias causada pela replicao viral, sendo responsveis pela regulao de MMP e TIMP. O exato mecanismo do incio das leses da mielina no estgio agudo imunossupressor da cinomose ainda est incerto (STEIN et al., 2004; VANDEVELDE, 2004; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Segundo Grne et al. (2000), as reas com desmielinizao recente e sem inflamao so consideradas uma conseqncia da replicao viral no interior de oligodentrcitos levando a destruio celular e a perda de

40

habilidade para manter a bainha de mielina (MIAO et al., 2003; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). A explicao bvia segundo Vandevelde & Zurbriggen (1995) para o fenmeno de desmielinizao a infeco de oligodendrcitos, que so clulas produtoras de mielina. Porm, em estudos de microscroscopia ptica, observaram que a maioria das clulas infectadas so astrcitos. Estudos realizados em microscpios eletrnicos revelaram que a infeco de oligodentrcitos rara na cinomose. Concluram em seus estudos que o vrus causa uma infeco discreta nos oligodentrcitos, que mesmo assim pode ser responsvel pelo fenmeno de desmielinizao. Estudo ultra-estrutural revelou microvacuolizao e perda de organelas por degenerao de oligodentrcitos. As mudanas morfolgicas so precedidas por disfunes metablicas nestas clulas, com a diminuio drstica da atividade da cerebrosdeo sulfo-transferase (uma enzima especfica de oligodentrcitos) aps infeco do vrus. possvel que a transcrio do vrus interfira nas funes especializadas destas clulas, que so necessrias para manuteno das membranas mielnicas (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; VANDEVELDE, 2004; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Nos achados de Stein et al. (2004), o vrus induziu a ativao das clulas da micrglia, que podem ter um importante impacto na patognese de desmielinizao aguda da cinomose, devido a um difuso aumento da regulao do MHC na camada branca. A ativao destas clulas libera fatores txicos que podem induzir a destruio da mielina (MIAO et al., 2003; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; STEIN et al., 2006). A formao de radicais livres de oxignio (ROS) pela micrglia pode alterar a transmisso sinptica e destruir diretamente os neurnios. Esta formao de ROS pode ser considerada responsvel pela atividade convulsiva em alguns animais (STEIN et al., 2006). A desmielinizao crnica coincide com a recuperao do sistema imune, seis a sete semanas ps-infeco, manguitos perivasculares linfocitrios, plasmcitos e moncitos ocorrem inicialmente nas leses induzidas pelo vrus no crebro. A reao inflamatria nas leses desmielinizantes pode levar a progresso da destruio do tecido. Citocinas pro-inflamatrias esto aumentadas, mas as citocinas antinflamatrias permanecem em nveis normais. possvel que astrcitos, o primeiro alvo do vrus,

41

participem da amplificao desta resposta imune (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Leses crnicas desmielinizantes so caracterizadas pela reduo ou possvel perda das protenas virais, com aumento da regulao do MHC e infiltrao massiva de CD8+, CD4+ e clulas B (MIAO et al., 2003; VANDEVELDE, 2004). O estgio crnico da doena est caracterizado por complicaes imunolgicas. A inflamao est associada com a sntese de anticorpos citotxicos-dependentes, que podem induzir a desmielinizao por ao dos anticorpos anti-mielina. Vandevelde & Zurbriggen (1995) concluram que as reaes auto-imunes na cinomose so provavelmente um epifenmeno e que no so primrias neste processo de desmielinizao (TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE, 2004). O experimento realizado por Krakowka et al. (1973) descreve a presena de anticorpos anti-mielina no soro de ces infectados apresentando encefalomielite desmielinizante. Baixos nveis de anticorpos (<1:8) foram detectados nos soros do grupo controle, possivelmente estes aparecem no momento da mielinizao no crebro. A demonstrao de imunoglobulinas nas leses desmielinizantes no SNC de ces infectados com o vrus uma tentativa de provar que estas possuem um papel ativo na progresso da doena. Os autores concluram que estes anticorpos so fatores que contribuem na patognese da desmielinizao da cinomose e funcionam amplificando as leses bsicas no inflamatrias induzidas pelo vrus no crebro. Anticorpos anti-mielina no soro podem estar presentes por longo tempo na cinomose. Estes anticorpos so produzidos no local das leses cerebrais inflamatrias e podem ser encontrados no lquor de ces infectados. Resposta mediada por clulas contra a protena bsica da mielina foi encontrada em ces experimentalmente infectados (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). No entanto, Summers et al. (1995), descrevem que fragmentos de mielina so fagocitados, principalmente por clulas da micrglia, menos por astrcitos e raramente por oligodentrcitos, induzindo a retirada destes fragmentos pelos macrfagos. Macrfagos, que esto em grande nmero nas leses de cinomose, possuem um papel importante. Anticorpos antivirais destinados a superfcies de clulas infectadas com o vrus interagem com os receptores Fc de macrfagos e essa interao resulta numa exploso respiratria dos mesmos que liberam ROS. Esses radicais podem ser responsveis pela destruio de oligodentrcitos e compartimentos de mielina. Quimicamente a produo de ROS no sistema xantina/xantina-oxidase, seletivamente 42

destri culturas de oligodentrcitos, que so ricos em compostos ferrosos (VANDEVELDE, 2004; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Existem algumas evidncias experimentais que o vrus induz alteraes nas funes de macrfagos. A produo de IL-1 por macrfagos in vitro pode diminuir e de prostaglandina E aumentar como resultado de infeco viral. A fagocitose, dependente ou independente de receptores Fc, assim como a habilidade de liberar ROS e a atividade procoagulante dos macrfagos tambm alterada aps a infeco. Considerando a relao entre o sistema de coagulao e funes inflamatrias, essas observaes mostram que a infeco pelo vrus da cinomose pode desencadear um potencial destrutivo dos macrfagos e providenciar, alm disso, suporte para a hiptese que a desmielinizao espectadora ocorra na cinomose crnica (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995).

9 Sinais Clnicos
Os ces clinicamente acometidos encontram com as seguintes caractersticas: falta de vacinao ou doses incompletas, vacinas inapropriadas, colostro da me com ttulos inadequados de anticorpos, imunossupresso e histria de exposio a ces infectados (GREENE, 2006). Podero ocorrer sinais clnicos digestivos, respiratrios, ou neurolgicos, isoladamente, conjuntamente ou alternadamente. s vezes surgem sinais neurolgicos diretamente, o que no comum (CORRA & CORRA, 1992). Aps perodo de incubao de seis dias ou mais, surge a primeira fase clnica da doena, que corresponde ao pico febril e localizao nos rgos linfides, onde ocorre hipertermia at 41C, anorexia, congesto conjuntival discreta e corrimento seroso ocular e nasal, sendo que geralmente esta fase passa despercebida ao proprietrio. Seguem-se dois a trs dias, onde tudo parece voltar ao normal, mas se houver progresso do vrus por falta de anticorpos, haver disseminao para as clulas epiteliais e ocorrendo o segundo pico febril com sintomas caractersticos (CORRA & CORRA, 1992). Os sinais no sistema respiratrio so: rinite, conjuntivite, descarga nasocular serosa e mucopurulenta, pneumonia intersticial no incio e posterior evoluo para broncopneumonia devido infeco secundria, caracterizada por tosse estridente,

43

mida e produtiva, alm de crepitaes na auscultao (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006). No sistema gastrointestinal h ocorrncia de vmitos intermitentes, anorexia, diarria pastosa a lquida, escura, com ou sem presena de sangue, ocorrendo desidratao em poucos animais (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006). Os sinais neurolgicos so mltiplos e conseqentes da replicao viral em neurnios e clulas gliais, refletindo desta forma, a distribuio do vrus e as conseqentes leses no SNC. Estes podem apresentar-se tardiamente, semanas, meses ou anos aps a recuperao de infeces inaparentes, ou da cinomose aguda (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006), porm, esta apresentao tardia rara com intervalos de meses ou anos. Hiperestesia e rigidez cervical e para-espinhal podem ser encontrados em ces como resultado de inflamao das meninges, entretanto, sinais de leses enceflicas so predominantes em relao aos sinais meningeais (GREENE, 2006). Quando h acometimento da medula espinhal sinais como paresia e incordenao de membros so os nicos achados neurolgicos. Outros sinais comuns incluem a doena vestibular com movimento de cabea, nistagmo, dficits em outros nervos cranianos e da propriocepo; e na doena cerebelar encontraramos ataxia com hipermetria e cabea pendente. Cegueira uni ou bilateral, s vezes com midrase, ocorrem devido o freqente envolvimento do trato e nervo pticos. Atrofia muscular generalizada rara como apresentao clnica de leso focal no crtex (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Podem ocorrer convulses parciais ou generalizadas, porm, a convulso do tipo goma de mascar, classicamente associada com a infeco pelo vrus da cinomose, frequentemente ocorre em ces que desenvolvem poliencefalomalcea nos lobos temporais (GREENE, 2006). Outros sinais neurolgicos incluem: apatia, estupor, alteraes de comportamento, reflexos espinhais anormais, hiperestesia, mioclonias e incontinncia urinria (MORO et al., 2003). As mioclonias ou contraes tnico-clnicas so sinais comuns da cinomose e podem estar presentes quando no h outros sinais neurolgicos. Acometem um nico msculo ou grupo de msculos, como auriculares, temporais, reto-abdominal, flexores dos membros (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GREENE, 2006). O mecanismo neural para as mioclonias se origina com 44

irritao local de neurnios motores da medula espinhal ou do ncleo do nervo craniano. considerado um sinal patognomnico da cinomose, porm tambm pode ser observada em outras doenas inflamatrias do sistema nervoso dos ces (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Silva et al. (2007) demonstram que a mioclonia foi o sinal neurolgico mais prevalente com 38,4% dos ces afetados. Segundo estes autores, a cinomose sempre deve ser considerada a primeira opo no estabelecimento dos diagnsticos diferenciais frente a um co com mioclonia. Na encefalite do co velho, o sinal neurolgico mais comum a diminuio visual. uma enfermidade progressiva e acompanhada pelo desenvolvimento de depresso mental, andar compulsivo em crculos, mioclonias, hipercinesia e obstinada vontade de querer manter a cabea pressionada contra paredes ou objetos. O animal afetado pode manifestar uma mudana de personalidade e falha em reconhecer pessoas, objetos e outros animais (CORRA & CORRA, 1992; SUMMERS et al., 1995; VITE, 2005).

10 Enfermidades relacionadas com o vrus da cinomose

Silva et al. (2007) demonstraram que a toxoplasmose a enfermidade mais freqentemente associada cinomose, no entanto, dos 620 casos estudados apenas cinco apresentaram a co-infeco e em apenas um animal foi observado leses no encfalo. Poucos estudos mencionam a presena do antgeno do vrus da cinomose ou do RNA viral na medula ssea e suas leses em ces infectados. Contudo, o RNA do vrus da cinomose tem sido demonstrado na doena de Paget em tecidos da medula em humanos. Em ces, observa-se uma osteoesclerose metafsica em 42% dos ces infectados com o vrus. Esta leso foi encontrada em metfises de mero, rdio, ulna, fmur, tbia e fbula, com aumento da densidade medular. As leses podem variar de moderada a severa e pode ser encontrada em animais com sintomatologia sistmica ou neurolgica (BAUMGRTNER et al., 1995). Em ces experimentalmente infectados, as alteraes foram detectadas com oito dias aps a infeco e se caracterizam por necrose de osteoclastos. Entre 23 e 32 dias aps a infeco, necrose e atrofia de osteoblastos e de clulas da medula ssea esto presentes. As clulas da medula, osteoclastos e osteoblastos sofrem uma reduo moderada a severa, principalmente nas metfises. A tcnica de imuno-histoqumica

45

demonstra a presena do antgeno viral no citoplasma e ncleo de clulas mielides, osteoblastos, osteoclastos e, ocasionalmente, em ostecitos. No so encontradas leses em animais velhos e no h indcios de persistncia viral nos tecidos da medula ssea ou alteraes permanentes na membrana (BAUMGRTNER et al., 1995).

11 Patologia Clnica
Sabe-se que a resposta hematolgica varia de um indivduo para outro, bem como a fase da infeco viral (SILVA et al., 2005). A anemia pode ser atribuda ao aumento da destruio dos eritrcitos ou pela diminuio de sua produo. A destruio determinada pela presena do vrus no eritrcito ou pela deposio de imunocomplexos na membrana destas clulas. A queda da produo pode ser atribuda falncia da medula ssea devido ao estresse desencadeado pela doena. Na maioria dos casos, os eritrcitos apresentam-se normocticos e normocrmicos e no h sinais de regenerao medular, como hemcias nucleadas, policromasia, anisocitose ou corpsculos de Howell-Jolly (SILVA et al., 2005). Os achados hematolgicos freqentes so linfopenia, s vezes combinado com leucopenia ou leucocitose, anemia, monocitose e raramente trombocitopenia (TIPOLD et al., 1992). O leucograma a caracterstica mais varivel e as infeces bacterianas oportunistas no trato digestivo e respiratrio podem ser observadas, justificando a leucocitose por neutrofilia e o desvio a esquerda (SILVA et al., 2005). A linfopenia uma caracterstica consistente, mas pode estar ausente em alguns casos. Em estudos, Silva et al. (2005) obervaram que ces jovens infectados experimentalmente com o vrus da cinomose desenvolveram marcada linfopenia, achado freqente e relevante no experimento. Segundo Corra & Corra (1992) a linfopenia absoluta causada pela depleo dos tecidos linfides e depende da cepa viral ser mais ou menos imunossupressora e ocorre, principalmente, em ces jovens que desenvolvem rapidamente a enfermidade sistmica ou sinais neurolgicos precoces. Nas observaes encontradas por Silva et al. (2005), a trombocitopenia um achado freqente. Os autores sugerem que na infeco por Morbillivirus ocorre aumento de anticorpos anti-plaquetas e a trombocitopenia imunomediada com remoo das plaquetas pelo sistema reticulo endotelial.

46

As incluses citoplasmticas denominadas corpsculo de Lentz ou SinigagliaLentz, que aparecem em algumas clulas do sangue, em pequeno nmero nos linfcitos, neutrfilos e hemcias, possuem particular relevncia no diagnstico clnico da cinomose. A ocorrncia dessas incluses em leuccitos evidencia a presena do vrus, mas quando no encontradas possuem pouco valor na determinao da ausncia do vrus, j que so observadas somente na fase virmica da doena (CORRA & CORRA, 1992; JONES et al., 2000). No exame bioqumico os achados no so especficos para a infeco, porm, pode ocorrer hipoalbuminemia ou hiperglobulinemia. Evidente hipoglobulinemia encontrada em filhotes infectados antes de nascer ou neonatos com imunossupresso persistente causada pelo vrus (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Segundo Silva et al. (2005), leses no epitlio intestinal causadas pelo vrus, com conseqente diarria, alm da prpria apatia determinada pela doena levam o animal a recusar o alimento. Desta forma, a diminuio da ingesto protica bem como o comprometimento intestinal so fatores determinantes na reduo dos nveis sricos da albumina na cinomose. A elevao plasmtica das globulinas freqente em vrias reaes inflamatrias e, em particular, o componente alfa 2 aumenta significativamente nas infeces bacterianas e vricas, notadamente na cinomose. O lquido cefalorraquidiano (LCR) um fluido aquoso e incolor que ocupa o espao subaracnide, os ventrculos cerebrais e o canal central da medula. Possui funes de proteo do sistema nervoso contra agentes infecciosos, permitindo a distribuio de elementos de defesa como leuccitos e anticorpos, e auxilia na troca de metablitos entre o sangue e o crebro (FEITOSA et al., 1997a; GAMA et al., 2005). A anlise do LCR um dos melhores mtodos de diagnstico das afeces do encfalo e da medula espinhal. O exame do LCR est indicado em todo paciente com doena neurolgica, na qual no h diagnstico bvio, incluindo casos com suspeita de afeco intracraniana (PELLEGRINO et al., 2003). Segundo Gama et al. (2005), as caractersticas fsico-qumicas do lquor tais como, colorao, aspecto, densidade, pH e glicose, no foram capazes de contribuir para indicar qualquer anormalidade liqurica nas diferentes fases da cinomose. Por outro lado, o componente protico e a celularidade liqurica mostraram alteraes importantes na presena de sinais neurolgicos, porm na ausncia destes, no adicionam informaes capazes de levar a deteco precoce de leses do SNC em colaborao ao diagnstico da referida enfermidade. 47

A turbidez no lquor ocorre geralmente devido a um aumento na celularidade da amostra, com presena de 500 ou mais clulas/L. No entanto, como demonstrado no estudo de Feitosa et al. (1997b) a turbidez no pode ser creditada exclusivamente a esse aumento do nmero de clulas, j que algumas amostras de lquor lmpido apresentavam 380 leuccitos/L, enquanto outras, uma discreta turbidez com 400 leuccitos/L. Desta forma, afirmaram que o aspecto do lquor no um bom indicativo da sua normalidade. Feitosa et al. (1997a) constataram diferenas estatsticas significantes entre os nveis de CPK no lquor de ces saudveis e com cinomose. Segundo a literatura existente, leses no tecido nervoso podem levar a um aumento na concentrao liqurica de CPK, alm disso, a degenerao da bainha de mielina tambm pode ser responsvel por essa elevao. Foi observada correlao positiva entre os nveis de CPK no lquor e no soro, que pode estar relacionada com casos de convulses, quando ocorre aumento da atividade da CPK srica devido aos movimentos musculares intensos e pela liberao das enzimas contidas nos msculos esquelticos. No entanto, nem todos os animais manifestam episdios convulsivos, sugerindo que este aumento no se deva somente ocorrncia de movimentos musculares intensos, mas tambm a um decbito prolongado, decorrente de paresia de membros manifestada em muitos animais. Durante o estgio de desmielinizao aguda no ocorrem reaes inflamatrias, e consequentemente, as protenas e as clulas do lquor podem estar normais (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). No estgio crnico com a inflamao, ocorre aumento de protena (acima de 25 mg/dL), principalmente representado por IgG antivrus e aumento de clulas (mais que 10/l) com predomnio de linfcitos (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GREENE, 2006). O aumento dos anticorpos anti-vrus no lquor oferece evidncia da encefalite pela cinomose, pois estes anticorpos so produzidos no local, e o aumento no encontrado em animais vacinados ou na cinomose sistmica sem alteraes neurolgicas (GREENE, 2006).

12 Achados antomo-patolgicos
No sistema respiratrio, pode ser detectado um exsudato purulento ou catarral nas mucosas nasal e da faringe. Nas seces microscpicas, com freqncia so

48

observados corpsculos de incluso citoplasmticos e intranucleares nas clulas associadas ao exsudato (JONES, et al., 2000). No pulmo, as leses podem se manifestar por broncopneumonia purulenta onde brnquios e alvolos adjacentes apresentam-se repletos de neutrfilos, mucina, e debris teciduais. No primeiro estgio o exsudato pode conter sangue, neutrfilos e clulas mononucleares que revestem as paredes alveolares constituindo a nica evidncia da infeco. Em alguns casos formam clulas gigantes multinucleadas no revestimento brnquico, nos septos alveolares e livremente nos alvolos. So encontradas incluses citoplasmticas e, menos freqentemente, intranucleares nessas clulas gigantes, em clulas mononucleares e nas clulas epiteliais dos brnquios e bronquolos (JONES, et al., 2000). Segundo Damin et a. (2005), as leses no pulmo so caracterizadas por bronquiolite necrotizante, necrose em pneumcitos do tipo II, pneumonia intersticial e broncopenumonia supurativa. Entretanto, o vrus causa imunossupresso, permitindo a associao com outros vrus e com as bactrias, Bordetella bronchiseptica, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Klebsiella pneumonae e Escherichia coli. Na pele, particularmente no abdomen, pode ocorrer dermatite vesicular e pustular. As vesculas e pstulas esto confinadas camada de Malpighi da epiderme, mas comum alguma congesto da derme subjacente, e ocasionalmente ocorre infiltrao por linfcitos. Corpsculos de incluso nucleares ou citoplasmticos podem estar presentes no interior das clulas epiteliais, especialmente as das glndulas sebceas. Nos coxins plantares, a intensa proliferao da camada de queratina da epiderme resulta numa leso clinicamente identificvel e caracterstica (JONES, et al., 2000). O epitlio do trato urinrio, particularmente da pelve renal e bexiga, pode conter vasos congestos e corpsculos de incluso citoplasmticos ou intranucleares (JONES, et al., 2000). O estmago e intestinos podem conter grande nmero de incluses citoplasmticas e intranucleares no epitlio de revestimento. No intestino grosso, h excesso de exsudato mucoso, podendo demonstrar congesto e infiltrao de linfcitos na lmina prpria (JONES, et al., 2000). Em alguns casos, corpsculos de incluso podem ser observados no epitlio da conjuntiva (JONES, et al., 2000). A cinomose no causa leses significativas no fgado, embora incluses possam estar presentes no epitlio biliar (JONES, et al., 2000). 49

No SNC as leses podem ser detectadas somente por meios de estudos microscpicos. A substncia branca subcortical do crebro habitualmente poupada e as leses caracterizam-se por reas de destruio com ntida delimitao, particularmente nos tratos mielinizados. Grande nmero de micrglia, astrcitos e linfcitos so encontrados nos espaos de Virchow-Robin em torno dos vasos e esto associados ao aspecto esponjoso da camada branca. Ocasionalmente, clulas gitter esto reunidas em torno de reas de necrose na substncia branca. Estas grandes clulas fagocitrias so originadas da micrglia e possuem citoplasma distendido com grnulos de lipdios, caractersticas de algumas leses cerebrais. Incluses intranucleares no interior dos astrcitos multinucleados e micrglias constituem um achado caracterstico dessa leso. possvel observar incluses intranucleares no interior de astrcitos multinucleados e de micrglias, constituindo um achado caracterstico. No entanto, raramente podem ser detectados nos neurnios corpsculos de incluso citoplasmticos ou nucleares (SUMMERS et al., 1995; JONES et al., 2000). No crebro, a leso um tanto parecida, mas a caracterstica microscpica mais notvel o aparente aumento de capilares. Esse aspecto pode ser resultante da proliferao de capilares, ou mais provavelmente, da distenso e congesto de vasos sangneos e da perda do parnquima circundante, o que faz com que a vascularizao assuma um aspecto mais saliente. Em muitos casos, as leses se limitam s folhas cerebelares, ou vu medular anterior (VON MOLL et al., 1995; JONES, et al., 2000). Corpsculos de incluso viral intranucleares e intracitoplasmticos esto presentes em astrcitos e clulas da superfcie ependimal (SUMMERS et al., 1995; GEBARA et al., 2004). Nos achados de Liang et al. (2007), as leses no crebro de ces infectados so desmielinizao e infiltrado de clulas gliais no cerebelo, pednculos cerebelares e no tronco enceflico. O antgeno viral pode estar presente nas camadas cinzenta e branca e no canal central da medula espinhal. Foi encontrada uma alta porcentagem de corpsculos de incluso (87,5%) neste estudo, sendo que as incluses intranucleares foram mais comuns do que as intracitoplasmticas. Na cinomose aguda, leses na camada branca so caracterizadas por alteraes vacuolares, moderada microgliose e uma vasta inflamao mononuclear perivascular. As alteraes subagudas so caracterizadas pelo aparecimento, de moderada a severa desmielinizao, malcia com infiltrado de clulas gitter, com variadas hipertrofias e hiperplasias de astrcitos, com poucos astrcitos e gemistcitos multinucleados e um 50

mnimo a severo infiltrado linfoplasmtico nos espaos perivasculares. As leses crnicas so caracterizadas por uma ampla e densa proliferao de astrcitos e desmielinizao com ou sem infiltrado linfoplasmtico nos espaos perivasculares (LIANG et al., 2007). Por achados imunohistoqumicos de Von Moll et al. (1995), o antgeno viral foi encontrado predominantemente na camada cinzenta do cerebelo, menos freqente no crebro e na camada branca do cerebelo. O antgeno foi observado em astrcitos e neurnios. Contudo, tambm foi detectado no endotlio vascular, clulas da meninge e linfcitos. Tambm ocorrem alteraes degenerativas nos neurnios, aparentemente resultantes da invaso primria viral e de leses retrgradas secundrias leso axonal. Ocorre picnose, cromatlise, gliose, e neuronofagia. Raramente, podem ser detectados nos neurnios corpsculos de incluso citoplasmticos ou intranucleares. Na maioria dos casos pode estar presente uma leptomeningite, principalmente caracterizada pela infiltrao de linfcitos (JONES, et al., 2000). Na retina, ocorre congesto, edema, formao de manguitos perivasculares com linfcitos, degenerao de clulas ganglionares, e gliose. Tambm podem estar presentes neurite do nervo ptico acompanhada de desmielinizao e gliose. Esto presentes incluses intranucleares na glia da retina e do nervo ptico. As leses conduzem atrofia retinal de todas as camadas. Habitualmente, tambm ocorrem tumefao e proliferao do epitlio pigmentar da retina. Uma uvete anterior, caracterizada pela infiltrao de clulas mononucleares juntamente com clulas gigantes multinucleadas (JONES, et al., 2000). Na encefalite do co velho, a leso que mais chama ateno no SNC a significativa formao de manguitos perivasculares, quase que exclusivamente por populaes de linfcitos. Os manguitos, que so muito espessos, esto presentes tanto na substncia cinzenta, como na substncia branca. Pode ocorrer desmielinizao focal e necrose disseminada dos neurnios. So encontrados corpsculos de incluso intranucleares nas clulas gliais e nos neurnios (SUMMERS et al., 1995; JONES, et al., 2000). A presena de incluses intranucleares algo paradoxal, j que o vrus replica no citoplasma. Isto pode ser explicado por um estresse celular responsivo desencadeado pela infeco. A induo de choque de protenas comanda uma translocao da protena

51

NP viral para o interior do ncleo, onde fica associada com estruturas conhecidas como corpsculos nucleares (SUMMERS, et al., 1995).

13 Prognstico
O prognstico reservado na fase sistmica da enfermidade, pois pode progredir para a fase neurolgica. Nesta fase torna-se desfavorvel, pois a mesma comumente progressiva, raramente estacionando, levando morte em curso agudo ou crnico. Quando eventualmente o animal escape morte pode ficar com seqelas inabilitantes (CORRA & CORRA, 1992).

14 Diagnstico
Em alguns pases o principal diagnstico baseado nas manifestaes clnicas dos ces (LATHA et al., 2007). No entanto, a apresentao varivel da clnica da cinomose pode dificultar o diagnstico da doena (SHIN et al., 2004). Segundo Kim et al. (2006), em vrios casos a combinao de alguns principais sintomas como: inflamao conjuntival, secreo respiratria, diarria, doena com trs semanas ou mais e sinais nervosos sugerem um diagnstico presuntivo da cinomose. Vrios testes foram avaliados em todo mundo para o diagnstico do vrus da cinomose, como reao de imunofluorescncia indireta, isolamento viral, teste de soro neutralizao, reao em cadeia pela polimerase e ELISA. Os mtodos sorolgicos, que mensuram em amostras de soro IgG ou IgM especficos para o vrus, so importantes diagnsticos quando o animal est na fase aguda da doena (KIM et al., 2006; LATHA et al., 2007). No entanto, segundo Greene (2006), o aumento dos ttulos de IgM e de IgG no soro so ambguos e podem ambos indicar infeces passadas e presentes com ou sem vacinao para cinomose. A anlise dos nveis de IgG especfica no lquor pode ser usado para mensurar anticorpos na fase crnica da infeco do SNC. No intuito de criar novas tcnicas de diagnstico, Latha et al. (2007) identificaram a nucleoprotena como uma excelente escolha, j que ela aparece nos estgios iniciais da infeco nas clulas hospedeiras e em infeces naturais h produo de anticorpos diretos. Ento, o desenvolvimento de ELISA com nucleoprotena recombinante foi superior aos outros mtodos sorolgicos, oferecendo alta reprodutibilidade, ausncia de reao cruzada, facilidade de realizao em relao 52

deteco de anticorpos pela imunofluorescncia indireta, alm disso, esse mtodo no requer o cultivo viral. Pode ser utilizada para detectar o aumento do ttulo de IgG ou nveis de IgM especfico visando monitorar a eficcia do programa de vacinao. Incluses de Lentz representam o efeito citoptico do vrus sobre a clula e sua visualizao em hemcias ou leuccitos confere ao diagnstico um carter definitivo. Essas incluses so encontradas em aproximadamente 21% dos animais infectados, principalmente em neutrfilos, conforme o relato de Silva et al. (2005), com exceo de animais recentemente vacinados. No sistema nervoso central o vrus causa leses caracterizadas por reas de necrose bem delimitadas, desmielinizao e incluses intranucleares principalmente em astrcitos. A observao dessas leses em cortes histolgicos confirma o diagnstico da infeco pelo vrus (SUMMERS et al., 1995; JONES et al., 2000; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006). O estudo de Damin et al. (2005) mostrou que a imunohistoqumica mais sensvel que a deteco pela histopatologia de corpsculos de incluso, logo deve ser um complemento do diagnstico histopatolgico. A tcnica de isolamento viral em cultivo celular especfica, porm demorada e pode resultar em falso-negativo se o animal no estiver na fase aguda da doena. O isolamento viral difcil na rotina de cultura celular. O sucesso da replicao viral ocorre durante o cultivo direto de tecidos infectados do hospedeiro. Culturas de macrfagos detectam o vrus em 24 a 48 horas, porm foram substitudas pela cultura de linfcitos caninos para o isolamento do vrus. A formao de clulas gigantes, a caracterstica citoptica efetiva do vrus da cinomose em vrias culturas de tecido, detectada com dois a cinco dias, at que o mesmo possa ser isolado por outras clulas. Atualmente, a tcnica da reao em cadeia pela polimerase precedida de transcrio reversa (RT-PCR) vem sendo empregada com sucesso na deteco do vrus da cinomose em diferentes tipos de amostras biolgicas provenientes de ces com sinais clnicos sistmicos e neurolgicos (BARRETT, 1999; GEBARA et al., 2004). Segundo Gebara et al. (2004), possvel detectar o cido nuclico do vrus em urina de ces tanto com encefalite aguda quanto crnica, evidenciando a virria. Estes resultados demonstram que a tcnica de RT-PCR um mtodo eficiente para realizao do diagnstico rpido, precoce e in vivo (SAITO et al., 2005; ELIA et al., 2006; SAITO et al., 2006). Segundo Frisk et al., 1999, o RT-PCR um mtodo rpido, sensvel e especfico para o diagnstico da infeco pelo vrus da cinomose em ces. Nos seus resultados, foi 53

encontrado o RNA viral pelo RT-PCR em 86% das amostras de soro sangneo e 88% de sangue circulante e lquor de ces com cinomose confirmada pela imunohistoqumica. O RNA viral no foi encontrado na imunohistoqumica em animais antgeno-negativo ou em ces vacinados, sugerindo previamente que a vacinao no causa resultados falso-positivos. A degradao autoltica do RNA viral causada por RNAases endgenas deve ser considerada na possibilidade de resultado falso-negativo. No entanto, Saito et al. (2006) afirmam que o soro e o sangue perifrico no so amostras boas para a deteco do vrus da cinomose pelo RT-PCR quando o co apresentar apenas distrbios neurolgicos sem envolvimento sistmico da doena. A baixa celularidade do lquor pode ser insuficiente para a preparao da amostra, que pode causar um inadequado isolamento do RNA viral. A maior vantagem do PCR em tempo real a habilidade de quantificar partculas virais em amostras clnicas, ao contrrio do RT-PCR convencional que uma anlise qualitativa. Alta carga viral foi demonstrada em tecidos linfides, como tonsilas, bao, linfonodos mesentricos; em vsceras e na urina. No SNC, o lobo frontal foi encontrado uma alta concentrao viral, sugerindo ser a rea mais sensvel para diagnstico (ELIA et al., 2006). As vrias amostras incluindo sangue perifrico, swab conjuntival, secreo nasal, urina, lquor, e swab de vagina, tecidos pulmonares, estomacais, intestinal e urinrio podem ser utilizados para o diagnstico de cinomose pela tcnica RT-PCR. Entretanto, o swab conjuntival o mais apropriado para o diagnstico precoce da cinomose (KIM et al., 2006). Shin et al. (2004) levantaram a hiptese de utilizao do nested PCR para diagnstico da referida enfermidade. A efetividade da tcnica foi demonstrada em amostras clnicas incluindo sangue, urina, swab nasal e saliva. Sendo um mtodo ideal para deteco do vrus da cinomose em amostras clnicas, apresentou alta sensibilidade e consistncia no desempenho laboratorial. Comparativamente ao RT-PCR, mostrou positividade relevante em todas as amostras testadas (JZWIK & FRYMUS, 2005). Segundo Jzwik & Frymus (2005), o resultado de ambos RT-PCR e reao de imunofluorescncia direta foram positivos em animais poucos dias aps a vacinao e confirmou que ambos os mtodos podem levar a um diagnstico falso-positivo de cinomose em ces vacinados com vacina de vrus vivo modificado. Portanto, o tempo mnimo entre vacinao e o exame em ces doentes deve ser de seis semanas para excluir o resultado falso-positivo. Em seus resultados sugerem que a sensibilidade do 54

teste de imunofluorescncia 50% menor que o nested PCR. Contudo, RT-PCR combinado com o nested PCR mostrou-se mais especfico e sensvel mtodo para diagnstico ante-mortem da cinomose, especialmente nas formas subagudas e crnicas, quando o vrus no se encontra mais em mucosas e membranas e a reao de imunofluorescncia foi um resultado negativo. O diagnstico rotineiro do vrus da cinomose pela imunfluorescncia aplicado em vrias amostras, incluindo conjuntival, nasal e vaginal, usando anticorpos policlonais ou monoclonais. Este teste no sensitivo e s pode detectar antgeno viral somente em infeces com trs semanas, quando o vrus est presente em clulas epiteliais (ELIA et al., 2006 apud APPEL, 1987). O antgeno viral pode ser difcil de detectar em outros tecidos em casos de cinomose em fase nervosa sem sinais sistmicos, mas pode ser detectado nas clulas do lquor com o teste de anticorpos fluorescentes indiretos usando anticorpos anti-vrus (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006).

15 Tratamento
Infelizmente, ainda no existe uma terapia efetiva para a cinomose, apenas tratamento sintomtico, sendo assim, a cinomose pode ser considerada uma importante enfermidade na clnica veterinria (TIPOLD et al., 1992; CORRA & CORRA, 1992; KAJITA et al., 2006). Apesar de atualmente no existirem muitos trabalhos sobre o assunto, Corra & Corra (1992) propem a administrao de soro hiperimune especfico (gama globulinas especficas) de uma s vez, distribuindo-o em vrios locais por via subcutnea conforme o volume necessrio. Como norma, aplicar o soro hiperimune necessrio de uma s vez, pois sua ao fundamentalmente de soroneutralizao. Devemos de uma s vez obter a soroneutralizao de todos os vrus livres, e que se libertam eventualmente nos prximos dias. O soro homlogo permanece ativo no animal por 15 a 30 dias, baixando seu ttulo paulatinamente, seja por soroneutralizao, formando complexos antgeno anticorpo, com o vrus, seja por metabolizao e eliminao progressiva. Assim, deve-se estimar a dose para obter um possvel excesso de anticorpos soroneutralizantes e nunca falta dos mesmos. No entanto, quando h alteraes do sistema nervoso, o soro hiperimune pode no impedir o avano da doena, pois apenas neutraliza os vrus circulantes, no

55

atuando sobre as partculas virais que ultrapassaram a barreira hematoenceflica. Se o animal j foi vacinado pelo menos uma vez, no usar o soro, mas sim aplicar uma dose de vacina, que poder estimular clulas-memria e rapidamente produzir imunidade ativa (CORRA & CORRA, 1992). Animais com infeco no trato respiratrio superior ou pneumonia que freqentemente causada por complicaes bacterianas secundrias, geralmente por Bordetella bronchiseptica, deve-se tratar a pneumonia com antimicrobianos de amplo espectro, ativos principalmente contra Bordetella bronchiseptica, Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. Podem ser usados como antimicrobianos: ampicilina, cloranfenicol, florfenicol, ceftiofur, fluorquinolonas e aminoglicosdeos. A terapia antimicrobiana pode ser alterada quando realizado antibiograma de lavado transtraqueal ou quando no h resposta ao antimicrobiano de escolha. Devem ser utilizados tambm expectorantes ou nebulizao (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006). Nos casos de diarria grave usar antidiarricos complexos que contenham pectina, caolim ou outros adsorventes. Comida, gua e medicamentos orais devem ser suspensos caso haja vmito e diarria e antiemticos parenterais devem ser utilizados (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006). A hidratao pode ser necessria e preciso que seja realizada com soluo de Ringer, para hidratar e ao mesmo tempo manter o equilbrio eletroltico. A dose costuma ser equivalente a 5% do peso animal, a cada 12 horas, caso esteja muito desidratado. Pode-se adicionar 2,5 a 5% de glicose ao Ringer e administrar glicose como fonte energtica para animais anorxicos, fazendo glicose a 25% por via intravenosa, duas vezes ao dia (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006), na dose de 5 mg/Kg. Na encefalite multifocal progressiva causadora de tetraplegia, semicoma e incapacitao a eutansia recomendada. Anticonvulsionantes devem ser utilizados, como o fenobarbital na dose de 2 mg/Kg pelas vias intravenosa, intramuscular e oral, a cada 12 horas. Corticosterides, como a dexametasona na dose de 2,2 mg/Kg, por via intravenosa, podem ser utilizados por causa da base imunopatolgica das leses neuronais e para reduzir o edema cerebral, mantendo a terapia com doses antinflamatrias, posteriormente, reduzindo a dose at o final do tratamento. A imunossupresso causada pelos esterides a principal desvantagem, porque a resposta inflamatria responsvel pela retirada do vrus (TIPOLD, 1992; GREENE, 2006).

56

A terapia com glicocorticides com dosagens antinflamatrias pode ter algum sucesso no controle na dilatao pupilar causada pela neurite ptica ou de alguns sinais associados inflamao crnica da encefalite. A prednisolona comumente escolhida entre os glicocorticides na dose de 2 4 mg/Kg, a cada 24 horas, com administrao oral. A mioclonia normalmente intratvel e irreversvel (GREENE, 2006). Como os macrfagos e seus produtos, especialmente radicais livres de oxignio, so importantes na induo da destruio do tecido nervoso na cinomose, antioxidantes como vitamina E e vitamina C podem ser utilizados terapeuticamente (TIPOLD, 1992). Outras medidas teraputicas apropriadas podem ser recomendadas ou executadas, conforme a gravidade da doena: vitamina A para a proteo e regenerao de epitlios, vitamina C como fator trfico dos tecidos mesenquimais, do retculoendotlio e indiretamente do sistema imunopoitico, vitaminas do complexo B como tnicas e regeneradoras da fisiologia nervosa, para antilgia e mielopoiese e estimulantes de apetite (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006).

16 Profilaxia
Como no existem terapias antivirais comprovadamente eficazes a preveno a mais importante atividade veterinria. Segundo Vandevelde (2004), o desenvolvimento de estratgias teraputicas deve estar relacionado com a modulao imunolgica. Entretanto, enquanto a modificao da resposta inflamatria danosa pode ser vivel, o problema bsico relacionado presena do vrus no SNC no resolvido. Terapias antivirais especficas contra Morbilivirus no foram avaliadas ainda e por isso a mais importante interveno veterinria a preveno. Nos anos 1950 o vrus da cinomose foi cultivado pela primeira vez em clulas e foi atenuado como vrus vacinal para produo de vacinas com vrus vivo modificado (MOCHIZUKI et al., 2002). Vacinas produzidas com as amostras do vrus da cinomose, isoladas de ces naturalmente infectados, como as amostras Snyder Hill, Rockborn, Onderstepoort, adequadamente atenuadas em culturas de clulas, so eficientes em induzir o estado de imunidade dos animais vacinados, protegendo-os contra a infeco natural (BIAZZONO et al., 2001). Estas cepas, atualmente so consideradas velhas, chamadas de old CDV e as cepas novas, chamadas de new CDV de vrias partes do

57

mundo que possuem o gene e a protena H com caractersticas diferentes (MOCHIZUKI et al., 2002). A atual estratgia vacinal baseada em mltiplas doses de vacinas, administradas os intervalos de trs a quatro semanas, devido s dificuldades de mensurar os ttulos de anticorpos do filhote de forma rotineira. Aps a administrao da primeira dose de vacina, os ces j apresentam ttulos de anticorpos em nveis protetores e, aps a revacinao anual, os ttulos perduram por mais de 12 meses, no indicando a necessidade de reforo imediatamente aps um ano (BIAZZONO et al., 2001). Segundo Chappuis (1995) a via intravenosa no recomendada para a vacinao. O uso por esta via deve ser com vacinas que possuem apenas o antgeno de cinomose e possvel observar uma completa proteo aps 48 horas da aplicao, em relao a aplicao subcutnea que tem uma resposta com cinco dias aps a aplicao. Porm, a vacinao intravenosa pode ser necessria nos casos emergenciais, como a contaminao de um filhote antes da primeira dose de vacina. A epidemiologia molecular tem sido utilizada para traar a origem das cepas virais e investigar a dinmica de circulao das mesmas em animais susceptveis. Segundo Martella et al. (2007), a variao de aminocidos entre as linhagens do vrus da cinomose foi maior que 4 %, onde a maior variao (> 8 %) foi observada entre as cepas de Amrica-1, usadas no desenvolvimento de vacinas vivas modificadas atualmente comercializadas, e todos os outros genotipos do vrus da cinomose. A variao gentica e antignica na protena H entre as cepas novas e velhas, pode estar causando uma dvida na eficcia das vacinas atuais (IWATSUKI et al., 2000). A partir da demonstrao da variao antignica, pode-se questionar a efetividade das vacinas utilizadas nos ces, que so protetoras por uma forte e ativa resposta imune encontrada aps administraes repetidas. possvel, entretanto, que a substituio de aminocidos em certas pores da protena H de cepas circulantes pode permitir uma falha na resposta de anticorpos maternais em filhotes no vacinados (MARTELLA et al., 2007). Segundo Negro et al. (2006), falhas vacinais podem ser geradas por mltiplos fatores como interferncia de anticorpos passivos, falhas individuais na resposta imune, qualidade, conservao e variabilidade antignica do imungeno e infeco anterior vacinao.

58

No final dos anos 1990, epidemias de cinomose ocorreram em ces vacinados e a anlise molecular do vrus isolado destes ces mostrou-se diferente das cepas vacinais, como Onderstepoort e Convac (IWATSUKI et al., 1997). Estes achados sugerem a possibilidade da eficcia protetora das atuais vacinas contra o vrus da cinomose foram insuficientes. Recentemente, foram realizadas mudanas para desenvolvimento de novas estratgias vacinais contra esta infeco usando subunidades vacinais ou vacinas de DNA (CHERPILLOD et al., 2000). Entretanto, a evoluo da resposta por linfcitos T citotxicos pode ser indispensvel para confirmar a eficcia da vacina in vivo. A estratgia proposta por Hirama et al. (2003) a utilizao do mtodo de linfcitos T citotxicos de forma rotineira para avaliar a eficcia de novas vacinas em desenvolvimento e para determinar a funo destes em outras infeces caninas. O mtodo de neutralizao sem complemento foi capaz de distinguir duas cepas antigenicamente diferentes. Houve diferena na neutralizao dos antgenos entre as cepas distintas quando o complemento foi includo na reao. Este pode ser um mecanismo imune que explica porque as vacinas de cinomose com cepas velhas ainda so funcionais e suficientes para proteger contra a enfermidade (MOCHIZUKI et al., 2002). O estudo realizado por Dahl et al. (2004) foi o primeiro a demonstrar que a vacina de DNA pode induzir a produo de altos nveis de anticorpos neutralizantes e uma completa proteo contra o vrus da cinomose no hospedeiro natural. As vacinas de vrus vivo atenuado induzem boa resposta em ces, porm podem induzir infeco virulenta em outras espcies. Como gene da protena H, quando aplicado no msculo, pode produzir anticorpos IgG1 e, surpreendentemente, o DNA da protena F produz resposta de IgG1 e IgG2a, a vacina de DNA pode ser favorvel na estratgia vacinal de animais selvagens (SIXT et al., 1998). No entanto, Barrett (1999) relata que a maior desvantagem da vacina recombinante a sua pequena durao da sua imunidade quando comparada com a vacina de vrus vivo atenuado convencional. Em 1987, Max Appel descreveu a questo da erradicao da cinomose: a erradicao do vrus da cinomose, como vem sendo sugerido pelos relatos com o vrus do sarampo em humanos, pode ser desejvel, mas no ser possvel. Vrias espcies de carnvoros selvagens que so susceptveis ao vrus da cinomose representam uma constante fonte de infeco junto aos ces doentes que no foram apropriadamente vacinados. (CHAPPUIS, 1995). 59

17 Ribavirina frente aos Paramyxovirus

A ribavirina uma droga antiviral, anloga guanosina, inibidora da replicao in vitro de alguns RNA e DNA-vrus, incluindo Herpesvirus, Poxivirus, Influenza vrus, Parainfluenza vrus, Reovirus, Togavirus, Paramyxovirus e Tumor RNA-vrus. In vivo, o espectro antiviral restrito, com ao contra Herpesvirus, Influenza, Parainfluenza, Paramyxovirus do Sarampo e Adenovirus (HAYDEN & DOUGLAS, 1990). No grupo dos Paramyxovirus todos os componentes so sensveis a ribavirina, sendo o vrus do sarampo o mais sensvel (CHANG & HEEL, 1981). No estudo de Leyssen et al. (2005) foi evidenciado o mecanismo de ao da ribavirina frente aos Flavivirus e Paramyxovirus in vitro. O antiviral causa depleo intracelular dos reservatrios de guanosina tri-fosfato (GTP). A infeco do sarampo pode complicar-se por otite, diarria, pneumonia ou encefalite em 10% dos casos, e a infeco do sistema nervoso central muito difcil de ser tratada por causa da barreia hemato-enceflica (PARDRIDGE, 2003). Apenas um estudo revelou a passagem da ribavirina atravs da barreia hemato-enceflica aps administrao por aerosol em ratos (GILBERT & WYDE, 1988). A efetividade da ribavirina oral contra o sarampo foi reportada no Mxico, Brasil e nas Filipinas. Nestes relatos a dosagem diria usada foi de 10 mg/Kg de peso corporal, por cinco a sete dias. No foi encontrada anemia e nenhuma alterao clnica ou laboratorial, sugerindo que no houve evidncias de toxicidade. A ribavirina oral efetiva no tratamento da infeco aguda pelo vrus da hepatite A, sarampo e febre de Lassar (GILBERT & KNIGHT, 1986). Ainda no foi estabelecida nenhuma terapia especfica para a SSPE em humanos (TEKGL et al., 1999). Porm, a ribavirina tem sido testada nas infeces virais e mostra-se eficiente na estabilizao do quadro clnico neurolgico (TAKAHASHI et al., 1998; SOLOMON et al., 2002). Nos estudos realizados por Hosoya et al. (1989) foram descritas a eficincia da droga frente ao vrus da SSPE e a utilizao da ribavirina em concentraes baixas que no causam citotoxicidade. A ribavirina inibe a replicao de vrias cepas do vrus de SSPE in vitro e in vivo em animais experimentais, quando a sua concentrao liqurica atinge 7,5 g/mL (TAKAHASHI et al., 1998; GRANCHER et al., 2004). Concordando com estes autores, Wyde et al. (2000) demonstraram que a ribavirina foi eficaz contra o sarampo em ratos quando administrada por via parenteral. 60

No experimento de Elia et al. (2007) a ribavirina mostrou-se altamente efetiva na preveno da replicao do vrus da cinomose in vitro em baixas concentraes, aproximadamente 6,5-12,5 g/mL, concordando com os valores encontrados para a inibio do vrus do sarampo.

18 Mecanismo de ao
Segundo Gilbert & Knight (1986) existem trs possveis mecanismos de ao da ribavirina: a diminuio na concentrao intracelular de GTP por uma inibio competitiva da inosina-monofosfato desidrogenase e duas aes especficas de vrus: inibio da formao de mRNA e inibio da funo de codificao da RNA polimerase. A fosforilao intracelular, que forma derivados mono, di e trifosfatos, mediada por enzimas da clula hospedeira (adenosina-quinase). A ribavirina monofosfato compete inibindo inosina-monofosfato (IMP) desidrogenase e interfere com a sntese da GTP. Conseqentemente a composio do local do nucleotdeo marcadamente alterado, impedindo a sntese de cido nuclico. A queda da concentrao do competidor da guanosina pode potencializar outros efeitos antivirais (HAYDEN & DOUGLAS,1990; BEAN, 1992; WU et al., 2005). No entanto, quando aumenta a fosforilao ocorre uma leve diminuio na sua ao antiviral (CHANG & HEEL, 1981). A ribavirina pode agir como um vrus mutante por imitar os pares de bases adenosina e guanosina, que interagem com as duas timidina e citosina, no genoma viral. Por isso, a incorporao da ribavirina trifosfato no genoma viral pode induzir uma mutao e pode levar a um erro catastrfico no vrus. Contudo, como um anlogo do nucleotdeo de guanosina, a ribavirina trifosfato incorporada no lugar da guanosina monofosfato produzindo um defeito na estrutura para transcrio do RNA viral, contribuindo para a diminuio da translao do genoma viral (CROTTY, et al., 2001; WU et al., 2005). E segundo Crotty et al. (2001) o principal efeito antiviral da ribavirina a mutao letal no genoma viral. No entanto, a efetividade in vivo contra RNA vrus depende da acumulao da ribavirina e a ribavirina trifosfato em alguns tecidos. Segundo Bean (1992) a ribavirina inibe a formao do mRNA, como um passo importante na replicao de muitos vrus. Ela capaz de inibir diretamente vrus que so dependentes de RNA polimerase, como o Vrus da Influenza.

61

Entretanto, todos ou nenhum dos precedentes mecanismos de ao descritos podem estar acontecendo a qualquer momento, porm dependem do vrus infectante. Esse um potencial mecanismo para a melhor inibio e explicar a falha na deteco de resistncia viral (GILBERT & KNIGHT, 1986). Segundo Elia et al. (2007) a ribavirina causa mutaes no vrus da cinomose e estas acumuladas levam a um erro catastrfico no RNA do genoma viral. Pode ser especulado que a ribavirina interfere com a RNA polimerase pela competio com nucleosdeos naturais e produz erro na terminao da cadeia do vrus.

19 Propriedades da Ribavirina
Em 1972 a ribavirina foi sintetizada pela combinao qumica dos derivados carboxamide e ribofuranoside, e mostrou que poderia ser um promissor agente antiviral de amplo espectro. A atividade antiviral da ribavirina especificamente associada a sua estrutura. Alteraes na ribose ou na base resultam em perda significativa da atividade antiviral (GILBERT & KNIGHT, 1986). A ao antiviral in vivo depende de alguns fatores como a cepa e quantidade de vrus, a via de infeco, a idade e sexo dos animais e a freqncia e via de administrao da droga (CHANG & HEEL, 1981). A ribavirina comeou a ser comercializada em 1986 na forma de aerosol. As formas oral e intravenosa ainda esto sendo estudadas, mas a droga mostrou-se mais efetiva quando administrada pela forma de aerosol (BEAN, 1992). Na administrao oral, a biodisponibilidade de aproximadamente 33 a 45% em humanos. O pico plasmtico ocorre entre uma a duas horas aps doses nicas. At o momento, sabe-se que no lquor alcanado at 70% da concentrao do plasma e o pico plasmtico ocorre 30 minutos aps a administrao intravenosa (HAYDEN & DOUGLAS,1990; GRANCHER et al., 2004). Cerca de 40% da ribavirina excretada pelos rins aps 72 horas da administrao, e o metabolismo heptico uma rota importante para sua eliminao (HAYDEN & DOUGLAS, 1990). Quando administrada por via oral, o tempo de absoro da droga de aproximadamente duas horas, podendo chegar a 12 horas, desta forma, sugere-se que a absoro ocorra por toda a extenso do trato gastrointestinal. Um mecanismo para a absoro foi identificado e envolve os transportadores de nucleotdeos dependentes de sdio (PRESTON et al., 1999).

62

Contudo, pelo estudo de radioatividade de Lin et al. (2003), foi observado que a ribavirina excretada principalmente pela urina, pois a bile uma via insignificante e a excreo pelas fezes foi de 1,4% da dose intravenosa em ratos, e de 0,8% em macacos. A ribavirina excretada lentamente e retida em todos os tecidos, exceto o crebro. Aps a administrao oral a maior parte dos produtos excretados da ribavirina no possui base e ribose de sua estrutura. A estimada meia-vida da ribavirina na urina e eritrcitos aproximadamente 10 a 12 horas e 40 dias, respectivamente (GILBERT & KNIGHT, 1986). Em contraste com as clulas do sangue e do fgado, ocorre uma pequena acumulao da ribavirina no crebro de ratos e macacos. Esta informao sugere que a ribavirina capaz de ultrapassar a barreira hemato-enceflica (FERRARA et al., 1981). No estudo realizado por Bean (1992) a ribavirina ultrapassou bem a barreira hemato-enceflica, chegando concentrao no lquor de 50 a 100% da encontrada no soro. Estudos que utilizaram administrao de altas doses intravenosas de ribavirina, em pacientes com SSPE, mostraram concentraes liquricas aproximadamente 74% das encontradas no plasma (HAYDEN & DOUGLAS, 1990; HOSOYA et al., 2001), sendo eficientes no combate infeco. Segundo Hosoya et al. (2001), o nvel da ribavirina no lquor alcanou concentrao ideal de 7,5 g/mL pela administrao intravenosa na dose de 20 mg/Kg. No entanto, Jeulin et al. (2006) observaram que a ribavirina no foi capaz de impedir a morte de hamsters com encefalite pelo sarampo, quando administrada por via intraperitoneal na dose de 50 mg/Kg ao dia. A melhora da atividade da ribavirina pelas ciclodextrinas provavelmente relacionada ao destas em membranas biolgicas, facilitando sua passagem pela barreira hemato-enceflica. A meia-vida no plasma foi observada como sendo aproximadamente de 24 horas, mas uma pequena quantidade da droga persiste no plasma por mais de 16 dias (CHANG & HEEL, 1981). A ribavirina foi capaz de inibir a replicao do vrus da cinomose in vitro de forma dose e tempo-dependente. Ainda que a concentrao no citotxica da droga bloqueie completamente a replicao em 24 horas aps a exposio, a concentrao mantida at 72 horas. Desta forma, pode-se sugerir que a ribavirina afeta o vrus ainda no meio extracelular, de maneira precoce no seu ciclo de replicao. Aps 24 horas de

63

exposio, mesmo em baixa concentrao a ribavirina reduz o nmero de cpias de RNA (ELIA et al., 2007). Em 1978, Larsson et al. demonstraram em seus experimentos que a ribavirina possua um efeito forte na sntese de DNA e RNA de clulas no infectadas, sendo que a produo de DNA foi mais sensvel ao efeito da ribavirina. O efeito da ribavirina na replicao viral pode ser reversvel pela guanosina e que guanosina e xantosina causam uma reduo na proliferao celular. Concluram que a ribavirina possui um efeito reversvel aps um longo perodo de tratamento. Segundo Hosoya et al. (1989) a ribavirina no alterou a morfologia celular ou inibiu a sntese de protenas na concentrao de 200 g/mL, que alta em relao a concentrao necessria para inibir a sntese de DNA e RNA. No estudo realizado por Elia et al. (2007) a ribavirina demonstrou relativamente baixa toxicidade na cultura de clulas VERO; esta citotoxicidade s foi observada em concentraes 100 vezes maiores das necessrias para inibir a replicao do vrus da cinomose. A toxicidade em clulas VERO causada pela ribavirina pde ser verificada pela multiplicao celular. Nos relatos de Browne (1978) foi observado que o aumento da concentrao da ribavirina levou a um declnio na sntese de protenas virais e concomitantemente uma reintegrao da sntese de protenas da clula hospedeira. No entanto, possvel que a alta concentrao seja menos especfica na sua ao e cause alteraes no metabolismo do RNA, exceto a capacidade de inibir a IMP desidrogenase. Na busca de uma dose letal da droga, Jeulin et al. (2006) utilizaram em ratos a dose de 480 mg/Kg de ribavirina por via intraperitoneal, no perodo de 21 dias e no observaram nenhuma morte entre os animais. E no conseguiram chegar a uma dose letal devido ao volume da droga a ser injetada. 19.1 Viramidine: pr-droga da ribavirina Viramidine uma pr-droga, que d origem a ribavirina. Este pode ser ativado e convertido em ribavirina pela adenosina desaminase in vitro (WU et al., 2003). Anlises farmacocinticas indicam que essa pr-droga possui distribuio no fgado melhor do que a ribavirina com a reduo da propenso para entrar nos eritrcitos. Por isso, o viramidine o mais indicado para o tratamento crnico da Hepatite C (WU, et al., 2005).

64

Segundo Barnard (2002), o viramidine possui uma ao antiviral e imunomoduladora in vitro e in vivo, um potente inibidor da fosforilao de nucleotdeos de purina e capaz de previnir a fosforilao da ribavirina in vitro. Este causa uma estabilidade transitria na ribavirina (WU et al., 2004).

20 Ribavirina e o sistema imune

Mesmo em baixas concentraes, a ribavirina pode inibir de forma reversvel a sntese de macromolculas e a diviso rpida de clulas no infectadas. Este composto causa supresso da sntese de cido nuclico e estimula a mitose de linfcitos humanos in vitro, mas no afeta a funo de leuccitos polimorfonucleares. Tambm capaz de inibir a secreo de mastcitos. No entanto, tem efeito imunossupressivo em animais experimentais e mostra ao teraputica para vrus que induzem tumores transplantveis e doenas auto-imunes (HAYDEN & DOUGLAS,1990). A ribavirina possui efeitos imunoreguladores, pois capaz de inibir a sntese de macromolculas e a diviso celular, proliferao de linfcitos e a sntese de cido nuclico. s vezes, pode suprimir a produo de linfcitos B e consequentemente a formao de anticorpos (BEAN, 1992). Em humanos, a ribavirina administrada por via oral foi capaz de diminuir o nmero de clulas CD4 e a proliferao de linfcitos, principalmente em altas doses, sugerindo uma possvel toxicidade dos linfcitos (HEAGY et al., 1991). Segundo Tam et al. (1999), a ribavirina possui uma atividade imunoreguladora, sugerida por possuir uma funo imunomoduladora capaz de estimular a imunidade celular mediada por clulas T, favorecendo a eliminao de patgenos intracelulares virais. No entanto, Vollmer et al. (2004) afirmam que a ribavirina no possui efeito sobre as clulas B ou na secreo de citosinas, sugerindo que esta droga no apresenta efeito estimulante sozinha e diminui a secreo de IL-5.

21 Contra-indicaes e efeitos colaterais da ribavirina

A aplicao clnica da ribavirina mostra restries devido a alguns efeitos adversos, especialmente, induo de anemia hemoltica. O acumulo dos fosfatos da droga em eritrcitos leva a anemia, que pode ser causa para descontinuao do

65

tratamento (WU et al., 2005). A severidade da anemia mais grave em macacos, seguidos dos humanos, roedores e ces (LIN et al., 2003) Esse efeito relatado como uma habilidade de clulas vermelhas de primatas para acumular a ribavirina. A diferena entre espcies est relacionada com a variao da atividade enzimtica de nucleotdeos nos tecidos (FERRARA et al., 1981) Quando incorporada nos eritrcitos, a ribavirina convertida em metablitos fosforilados. Estes diminuem os nveis de ATP intracelular, resultando na reduo da integridade dos eritrcitos por uma desestabilizao da membrana e podendo chegar hemlise extravascular. A concentrao celular de ribavirina alcana nveis estveis em duas a trs semanas aps o incio do tratamento, quando ocorre a diminuio de hemoglobina. De forma interessante, as mudanas na concentrao de ribavirina celular so inversamente proporcionais s alteraes nos nveis de hemoglobina (INOUE et al., 2004). No experimento de Homma et al. (1999) por cromatografia lquida, foi demonstrado que a concentrao de ribavirina no eritrcito trs vezes maior que a concentrao no plasma. Sendo que 74% da ribavirina dos eritrcitos eram metablitos fosforilados, os quais no foram encontrados no plasma. A partir deste estudo, os autores sugeriram que a droga transportada para o interior dos eritrcitos por um transportador de nucleotdeos presente na membrana celular. A ribavirina administrada sistemicamente, em altas doses, pode causar efeitos indesejveis, como anemia por hemlise extravascular, supresso da medula ssea, aumento de bilirrubina, ferro e cido rico no soro, que so reversveis quando cessa a administrao da droga (BEAN, 1992; TAKAHASHI et al., 1998; HOSOYA et al., 2001). Ratas prenhes tratadas com ribavirina desenvolveram deformidades embrionrias no esqueleto, podendo levar at uma reabsoro fetal. Por isso, esta droga contra-indicada em mulheres grvidas (BEAN, 1992). A ribavirina oral foi observada por piorar as condies dos gatos experimentalmente infectados com calicivrus. Supresso da medula ssea, perda de peso, enzimas hepticas aumentadas e ictercia foram observadas. Porm, esses efeitos colaterais no foram observados em ces quando recebaram 60 mg/Kg durante duas semanas (PAPICH et al., 2003)

66

Outros efeitos foram reportados, como pruridos, erupo cutnea aguda, nuseas, depresso, tosse e sintomas respiratrios em humanos (HAYDEN & DOUGLAS,1990).

22 Dimetil Sulfxido como solvente de nucleotdeos

A solubilizao de nucleotdeos em solventes orgnicos importante para a entrada de drogas nucleotdeas em membranas celulares. Pelos estudos de West et al. (1994), a base guanosina hidrofbica e sua interao com DMSO pode torn-la permevel a substncias lipoflicas, indicando que este pode servir como veculo de transporte de drogas nucleotdeas por membranas celulares.

23 Propriedades do Dimetil Sulfxido

23.1 DMSO e membranas celulares Barreiras biolgicas como as membranas lipoproticas so altamente permeveis ao DMSO e no so alteradas e nem destrudas pela sua passagem. A droga pode penetrar em mucosas, ultrapassar a barreira hematoenceflica, membranas microbianas, clulas e membranas de organelas e, alm disso, pode facilitar a penetrao de vrias outras substncias atravs de membranas (BRAYTON, 1986; PAES, 1999). No experimento de Leekunjorn & Sum (2006) foi observado que a passagem do DMSO pela regio da interface da membrana um processo rpido e considerado passivo, por perspectiva macroscpica, e, entretanto, em perspectiva molecular foi encontrado processo ativo que requer energia. Essa energia obtida pelo destacamento da ligao de hidrognio da gua para o DMSO para a passagem deste pela regio interfacial. O grupo metil do DMSO, que hidrofbico, interage de forma favorvel nas camadas lipdicas. 23.2 Captura de radicais livres A partir de 1964, o DMSO passou a ser amplamente estudado e utilizado em uma gama imensa de pesquisas cientficas atravs das quais foram descobertas muitas das suas propriedades farmacolgicas, como a captura e remoo de radicais hidrxidos livres. Pela ao de seu metablito dimetil sulfide (DMS), o DMSO remove radicais livres de oxignio, o que explica suas propriedades protetoras como ao 67

antinflamatria, antiisqumica, crioproteo e radioproteo (BRAYTON, 1986; PAES, 1999; LIND et al., 2000; ALI, 2001; KISHIOKA et al., 2007). A propriedade antioxidante do DMSO pode auxiliar em casos de endotoxemia e choque sptico como confirmado no recente estudo realizado por Ali (2001), em que a efetividade do DMSO foi positiva na adeso intracelular de molculas e fatores nucleares em testes com ratos modelos de peritonite sptica. 23.3 Solvente orgnico Nos anos de 1980 foi demonstrado que enzimas quando associadas aos solventes orgnicos tinham uma melhora na sua eficincia (BRINK et al., 1988). As vantagens do uso de solventes incluem, por exemplo, aumento da solubilidade de substratos hidrofbicos e uma favorvel alterao no equilbrio da reao. Os solventes DMSO e Dimetil formamide (DMF) afetaram gravemente na atividade da catalase no estudo realizado por Rehan & Younus (2006). Neste mesmo estudo, mostraram que a interao antgeno-anticorpo foi mais forte em concentraes de 40% de glicerol, DMF e DMSO. Os efeitos dos solventes orgnicos dependem da conformao do antgeno e a ao da catalase nestes compostos. Este composto serve como veculo e/ou potencializador de antibiticos, antiprotozorios, antifngicos, antivirais e agentes quimioterpicos. O DMSO foi relatado por ter efeito sinrgico com esterides nas clulas (BRAYTON, 1986; SANTOS et al., 2002). Trata-se de um solvente altamente higroscpico, melhor que a gua para muitas substncias e ao ser hidratado h ocorrncia de reao exotrmica (BRAYTON, 1986; PAES, 1999; ALI, 2001). No estudo de Venkatesh et al. (2007) que testam a capacidade aumentar a permeabilidade de drogas como propanolol, afirmam os autores que o DMSO pode ser usado como co-solvente para determinar a permeabilidade de drogas pouco solveis e novos compostos qumicos, desta forma, sugerem uma classificao da droga no sistema de classificao biofarmacutica. Segundo Prez-Pastn et al. (2006) o DMSO um veculo comumente usado em estudos embriotxicos in vitro e sugere estudos que avaliam a modulao da formao de ROS, capaz de induzir a teratognese in vitro, pelo DMSO.

68

23.4 Protetor tecidual, antinflamatrio e antiisqumico O estudo realizado por Lind et al. (2000) utilizou o DMSO como hepatoprotetor, e este composto demonstrou efetividade frente ao txico utilizado, fazendo com que os valores de ALT voltassem ao normal mais rpido, com menor leso ao fgado, quando comparado ao grupo controle. Estes pesquisadores observaram que as leses no fgado eram acompanhadas de infiltrados inflamatrios e que podiam contribuir com a leso. No entanto, o DMSO foi capaz de diminuir esse recrutamento, a quimiotaxia e a ativao de clulas inflamatrias. Kishioka et al. (2007) demonstrou que o DMSO previne totalmente o estresse oxidativo causado pelo thioacetamine, resultando numa diminuio da necrose de clulas hepticas. DMSO tem mostrado ser protetor contra leses causadas por xenobiticos em vrios rgos e tecidos, incluindo fgado, corao, duodeno e pulmes, quando administrado antes ou simultaneamente com o txico. Possui uma ao protetora dos nefrons contra a ao nefrotxica da gentamicina, relatada em ratos (ALI, 2001). O estudo de Yoon et al. (2006) mostrou que o DMSO possui efeitos complexos no metabolismo de xenobiticos. Esta substncia possui efeitos variados na atividade de isoenzimas, sua presena nas reaes enzimticas produz efeitos inibitrios diretos no metabolismo mediado por estas. A afinidade relativa do DMSO com o substrato das enzimas pode ter um papel importante como conseqncia dessa interao. E neste estudo revelou que o DMSO diminui a hepatotoxicidade do acetaminofen, na dose de 0,4 mg/Kg, e inibiu a sua ativao metablica na concentrao 0,02% na reao. Considerando a variedade de uso dessa substncia em experimentos biolgicos, estes autores sugerem uma cuidadosa considerao nos efeitos do DMSO no metabolismo heptico, podendo ser utilizado com solvente. O DMSO tem sido utilizado com um crioprotetor de espermatozides, embries, plaquetas, outros componentes do sangue, clulas tumorais e clulas de cultura de tecidos. Em algumas situaes tem sido considerado superior a glicerina (BRAYTON, 1986). Da mesma forma, Prez-Pastn et al. (2006) demonstrou que o DMSO impede a formao de ROS e reduz as mal-formaes em embries induzidas por arsnio, mas no foi capaz de diminuir a incidncia de anormalidades.

69

Segundo Camici et al. (2006) o DMSO capaz de suprimir a atividade do fator tecidual e protege contra a ocluso trombtica in vivo. Este efeito do composto pode ser atribudo em parte a sua habilidade de impedir a aderncia e a agregao plaquetria e sugerem o composto como uma nova estratgia para o tratamento de sndromes coronarianas agudas. Nos relatos de Nagel et al. (2007) o DMSO demonstrou efeitos neuroprotetores em ratos em diferentes doses quando administrado antes e depois da isquemia permanente de 24 horas. Estes autores mostram que houve uma atenuao na destruio da barreira hemato-enceflica tambm. A ao ocorre frente a formao de ROS em locais sem fagocitose de forma que o DMSO diminui o estresse oxidativos dos tecidos infartados e os que esto ao redor. No estudo de Farkas et al. (2004) observou que o DMSO capaz de prevenir a produo de cicloxigenase-2 e a perda de neurnios. Alm disso, confirmaram outros estudos que o composto pode reduzir o tamanho do infarto em isquemias cerebrais focais. Segundo Amemori et al. (2006), a administrao oral do DMSO um tratamento para amiloidose secundria do trato gastro-intestinal com sintomas e pacientes no estgio inicial da amiloidose renal. Em situaes clnicas, benefcios antinflamatrios da terapia com DMSO so descritos em leses musculares agudas, em alteraes agudas, traumticas e inflamatrias do sistema nervoso central e em condies infecciosas ou spticas. Em inflamaes crnicas os resultados so menos consistentes, algum sucesso foi relatado em doenas reumticas, artrites crnicas e cistite intersticial. Este composto contribui na manuteno da microcirculao e reduz a destruio celular pela inflamao. Como mecanismo de ao foi observado que inibe a migrao de clulas inflamatrias, modula a resposta imuno-mediada, inibe a produo de anticorpos e inibe a proliferao de fibroblastos, que pode ser importante nas condies crnicas (BRAYTON, 1986). 23.5 Efeitos no Trato Gastro-intestinal Cochran et al. (1983) foi o primeiro a relatar que o DMSO pode proteger contra a ulcerao gstrica causada por estresse em ratos. O mecanismo dessa ao foi sugerido baseado na captura de radicais livres pelo DMSO. No entanto, foi comprovado

70

que este composto antagonista da depleo do GSH resultante de lceras causadas por estresse ou qumicos (ALI, 2001). 23.6 Antimicrobiano In vitro, em concentraes de 5-50%, apresenta atividade bacteriosttica ou bactericida contra vrias bactrias patognicas, incluindo M. tuberculosis, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Salmonella spp., Proteus spp. e E. coli. In vivo, o DMSO reduz a flora oral e a flora axilar normal. No mostrou nenhuma significncia em efeitos benficos ou deletrios na atividade antimicrobiana (BRAYTON, 1986). 23.7 Antifngico O DMSO na concentrao at 10% afetou significantemente o crescimento de dermatfitos in vitro testados no experimento de Randhawa (2006). Entretanto, na concentrao de 1% inibiu o crescimento de M. canis e T. mentagrophytes. possvel que iniba a formao de microfilamentos que so essenciais para o crescimento normal de hifas e pode potencializar os efeitos antimicticos de azoles, que interferem na formao de erdosterol na sntese de membranas fngicas. Na concentrao de 1% o DMSO no mostrou atividade antifngica in vitro, mas na concentrao de 5-45% efetivo contra a levedura Candida albicans (BRAYTON, 1986). 23.8 Indicaes aprovadas para uso Nos Estados Unidos, o DMSO foi aprovado apenas para o uso em cistite intersticial em humanos, tratamento de edemas e traumas em cavalos, e como aplicao ptica em ces (ALI, 2001). A despeito de todas as propriedades apresentadas pelo DMSO surpreendente o registro de poucos trabalhos orientados para seu uso em pesquisas cientficas como carreador de drogas. Coube a Paes (1999), lanar mo do DMSO objetivando aumentar o poder de penetrao da isoniazida em leses tuberculosas e, provavelmente, tambm para melhor penetrao atravs da espessa e complexa membrana celular do Mycobacterium bovis.

71

23.9 Efeitos no sistema nervoso O DMSO pode manifestar efeitos na funo neurocondutora e pode ser levado em conta quando usado como veculo para componentes neurotxicos (ALI, 2001). Este vem sendo usado em estudos de neurofisiologia com objetivo de aumentar a solubilidade de drogas insolveis gua (LU & MATTSON, 2001). No estudo de Tsvyetlynska et al. (2005) em medula espinhal, sugere que o DMSO age na transmisso sinptica do glutamato, ajudando na locomoo dos animais. No entanto, Rosenberg et al. (2007) demonstraram no seu estudo que o DMSO possui uma habilidade de controlar os danos na barreira hemato-enceflica. In vitro, na concentrao maior que 25% de DMSO, inibe a velocidade condutora de nervos que pode at ser completamente eliminada. O grande efeito analgsico do DMSO no sistema nervoso central relatado, porm os receptores de opides no esto envolvidos. Em situaes agudas, a captura de ROS pode prevenir a destruio de tecidos por radicais e a irritao local de nervos (BRAYTON, 1986). 23.10 Metabolismo e excreo Quanto metabolizao, o DMSO oxidado em DMSO2 (dimetil-sulfone) no sistema microssomal heptico na presena de NADPH2 e oxignio molecular (PAES, 1999). O DMSO excretado sob a forma de dois metablitos: DMS (dimetil-sulfide) e DMSO2 rpida e eficientemente, sendo os pulmes e rins os principais rgos envolvidos e sua excreo fecal irrisria. Quando cessa a exalao do produto, isto coincide com o desaparecimento dos metablitos na urina e indcio que o DMSO circulante foi inteiramente metabolizado (PAES, 1999). Sabe-se que aps 12 horas da administrao cerca de 25 a 27% da dose excretada na urina sem alteraes na forma (ALI, 2001).

24 Dimetil Sulfxido e os eritrcitos

Santos et al. (2002), chegaram ao resultado que o DMSO penetra pela membrana do eritrcito e causa um aumento da osmolaridade dentro e fora da clula, prevenindo hemlise devido ao gradiente osmtico. Alm disso, foi observado que os ndices de

72

agregao eritrocitria das amostras com DMSO foram significativamente menores do que os ndices de alquotas sem o referido composto.

25 Efeitos colaterais e contra-indicaes do Dimetil Sulfxido

Em humanos efeitos colaterais foram observados no estudo de Amemori et al. (2006) aps doses orais, como nuseas, vmito, anorexia, erupes de pele e bradiarritmia ou hipotenso. Porm, o efeito colateral significante foi o odor na respirao e o sabor na boca semelhante ao alho, devido excreo pulmonar de uma pequena porcentagem do DMSO como DMS. Este odor s vezes poder ser intenso e causar desconforto ao paciente, fazendo com que ele descontinue o tratamento (DAVIS et al., 1990; STRONCEK et al. 1991). O DMSO uma substncia relativamente txica e sua aplicao tpica pode causar uma dermatite irritante e uma reao urticariforme de contato que no mediada por reao imunolgica, sendo possvel liberao da histamina pela ativao de mastcitos (RANDHAWA, 2006). O DMSO bem tolerado em altas doses, no causando alteraes cardacas e no peso corporal (ALI, 2001). Em ces, elevadas doses, podem levar a halitose, anemia, hemoglobinria e aumento dos nveis de transaminase. E, precedendo a morte ocorre prostrao, convulso, dispnia, hipotenso, edema pulmonar e parada respiratria, porm sua DL 50 entre 2,5 a 8,9 g/Kg (BRAYTON, 1986; PAES, 1999). A terapia intravenosa cerca de 1 g/Kg, em soluo de 10-45%, administrado lentamente, em gatos, ces e cavalos (BRAYTON, 1986). Observaes clnicas e estudos em animais sugerem que o DMSO pode ser responsvel por uma neurotoxicidade aps a infuso de clulas tronco de sangue perifrico criopreservadas com o composto (CAVALETTI et al., 2000; TOPACOLGU et al., 2004). Os resultados de Muller et al. (2007) confirmaram algumas reaes adversas e a neurotoxicidade, em particular aps a infuso das clulas, ocorreu com baixa frequncia. Alm disso, nenhuma neurotoxicidade foi encontrada em pacientes com doena cerebral pr-existente. Protanto, estes autores sugerem que a neurotoxicidade fatal causada pelo DMSO representa um efeito colateral raro. Outros autores observaram que o DMSO pode afetar a irrigao do crebro por uma vasoconstrico, podendo causar uma alterao na funo neuronal (WEI et al., 1998).

73

No entanto, Ali (2001) sugere que o DMSO possui efeitos sobre a funo neurolgica e esta pode ter como causa a veiculao de drogas neurotxicas. Sugerindo, desta forma, que a toxicidade no deve ser induzida pelo DMSO, mas como conseqncia da capacidade de aumentar a permeabilidade membranas celulares tornando os tecidos mais vulnerveis para substncias txicas. Em altas concentraes de DMSO possvel observar efeitos txicos irremediveis tanto in vitro como in vivo. No estudo realizado por Aita et al. (2005), o grupo de ratos tratados com 8 g/Kg de DMSO manifestou efeitos txicos, no entanto, os grupos tratados com 2 ou 4 g/Kg no apresentaram alteraes. Foi sugerido que a apoptose de linfcitos no timo manifestada na dose de 8 g/Kg, resultante de um choque txico.

74

Objetivos
75

O presente trabalho tem por objetivos: 1. Testar a eficcia da ribavirina em ces acometidos de cinomose na fase neurolgica. 2. Testar a eficcia do DMSO como permeante de membranas biolgicas e atuando como vetor da ribavirina para o interior do sistema nervoso central (SNC). 3. Avaliar os efeitos colaterais e txicos da ribavirina nos ces atravs de monitoramento hematolgico e provas bioqumicas de funo heptica e renal. 4. Avaliar a resposta imunolgica no sistema nervoso central atravs do exame de lquor, colhido de forma seriada, com intervalo de 15 dias, antes e aps o tratamento com a ribavirina e sua associao com o DMSO. 5. Adaptar uma dose e via de administrao adequada da ribavirina em ces.

76

Materiais e Mtodos
77

1 Delineamento experimental O experimento foi composto com a formao aleatria de dois grupos de ces naturalmente infectados com o vrus da cinomose apresentando sinais neurolgicos. No houve critrio clnico para a diviso dos grupos, os animais foram includos pela ordem de atendimento. Aps o atendimento clnico, foi realizada a triagem, com a verificao da possibilidade de tratamento com a ribavirina, pois no entraram nos grupos animais que estavam sendo tratados com outros medicamentos ou com mais de 10 dias de sinais clnicos nervosos. Foram colhidas as amostras de sangue, urina e lquor dos animais. Estes receberam o tratamento sintomtico e a ribavirina e sua associao com o DMSO de acordo com os grupos durante 15 dias consecutivos. Neste perodo, os animais ficaram internados para melhor avaliao clnica diria, realizao de exames complementares e garantia de administrao das drogas.

2 Animais
A princpio foram selecionados 26 animais com sinais neurolgicos compatveis com cinomose, no entanto, seis destes animais vieram a bito em um curto perodo, com menos de sete dias e, por isso, no foram considerados na avaliao estatstica. Este critrio foi realizado por no termos informaes a respeito do tempo necessrio de administrao da ribavirina para inibir a replicao viral in vivo, ento o descarte teve como objetivo manter a fidelidade dos dados. Os 20 ces utilizados com sinais clnicos neurolgicos foram diagnosticados a partir do histrico de vacinao, desenvolvimento clnico da doena, exame fsico e pela reao de imunofluorescncia direta do sangue. Os animais com estratgia vacinal correta no foram includos no estudo. Para a incluso na pesquisa, alguns sinais neurolgicos caractersticos deveriam estar presentes, como: paresia, ataxia, mioclonias e/ou cegueira. Os animais que apresentavam convulses no foram includos na avaliao estatstica porque vieram a bito com menos de sete dias de tratamento. Com o intuito de diminuir a influncia da resposta imune da fase crnica nos resultados, inclumos apenas animais que apresentavam no mximo 10 dias de sinais neurolgicos.

78

Foram includos no estudo apenas animais de dois meses a seis anos de idade, com exceo de um com 13 anos de idade, que apresentou imunofluorescncia direta positiva no lquor, demonstrando que estava na fase aguda da enfermidade. No houve distino entre sexo e raa dos animais.

3 Grupos Experimentais
Os 20 animais foram divididos em dois grupos de 10, atendidos na Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da UNESP Botucatu, pelo servio de Enfermidades Infecciosas dos Animais, no perodo de maro a novembro de 2007. O grupo 1 (G1) foi composto por animais com sinais clnicos neurolgicos que receberam o antiviral (Ribavirina) durante 15 dias consecutivos e um tratamento de suporte e sintomtico, incluindo suplementao vitamnica (A, B, C, E) como imunoestimulantes, fluidoterapia nos casos de desidratao e, s vezes, combinada com glicose nos casos de anorexia, antimicrobianos no combate as infeces secundrias, protetores de mucosa, como a ranitidina e antiemticos, como metoclopramida. O grupo 2 (G2) foi formado pelos animais que tambm apresentaram sintomas neurolgicos e que receberam, alm do tratamento de suporte e sintomtico, a ribavirina em associao com o DMSO. O grupo controle (GC) foi composto por animais que foram tratados anteriormente pelo servio de Doenas Infecciosas dos Animais, porm sem o uso do antiviral. O levantamento destes animais foi realizado ao acaso, levando em considerao apenas os critrios utilizados nos outros dois grupos. Foram selecionados 10 animais pelo pronturio do Hospital Veterinrio onde foi possvel avaliar o tempo de evoluo da doena e a mortalidade neste grupo. Como no uma rotina o uso da imunofluorescncia direta nos diagnsticos de cinomose na Disciplina de Enfermidades Infecciosas dos Animais, todos os animais deste grupo no possuam o diagnstico laboratorial.

79

4 Doses e drogas experimentais

A Ribavirina2 foi administrada em altas doses por via oral com objetivo de atingir a concentrao adequada no lquor e interferir na replicao viral. A dosagem intravenosa adequada em humanos de 20 mg/Kg nos casos de panencefalite subaguda esclerosante, causada pelo vrus do sarampo, no entanto, a droga disponvel na forma injetvel no Brasil extremamente cara e inviabiliza sua utilizao em animais domsticos. A concentrao no lquor capaz de inibir a replicao viral deve ser alta, aproximadamente 7,5 g/mL, e considerando-se a sua prolongada eliminao do soro, foi administrada na dose de 30 mg/Kg, a cada 24 horas, durante 15 dias. Para melhor ajuste da dose, sem interferir na concentrao do medicamento, a ribavirina na forma de cpsulas foi diluda em gua destilada estril ou em Soluo Fisiolgica a 0,9%, na proporo de oito cpsulas de 250 mg do princpio ativo para 50 mL, armazenada em frascos estreis de cor mbar em geladeira. Sendo assim, a soluo obtida possua a concentrao de 40 mg/mL da ribavirina para ser administrada por via oral. A manipulao da droga foi realizada no Laboratrio de Diagnstico Microbiolgico da Disciplina de Enfermidades Infecciosas dos Animais Domsticos da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da UNESP-Botucatu/SP. Com objetivo de manter a estabilidade do medicamento, algumas medidas foram tomadas para evitar a contaminao da soluo antes e durante a manipulao. Para diminuir a carga microbiolgica do ambiente foi utilizada luz ultra-violeta durante 20 minutos e limpeza da bancada com lcool 70% antes do procedimento. No momento da diluio, foi utilizado bico de Bunsen ou capela de fluxo laminar, com objetivo de diminuir a contaminao do material. Alm do uso de luvas de estreis, os materiais como tesouras, pinas, tampas e lacres foram previamente esterelizados com luz utlravioleta e lcool 70%. O frasco para armazenamento da droga foi autoclavado aps a lavagem, em temperatura de 121C por 15 minutos. Aps a diluio, o frasco foi fechado com tampas de borracha, lacrado e armazenado em geladeira. Para a retirada da medicao foram utilizadas seringas e agulhas estreis para evitar a contaminao. O DMSO foi administrado por via intravenosa na dose de 20 mg/Kg de peso vivo, a cada 24 horas, no mesmo momento que o antiviral, no perodo de 15 dias. Para

Ribavirina: Ribaviron C BIOLUNIS Farmacutica Ltda.

80

evitar reaes medicao, o composto foi diludo na concentrao de 10 a 20% em gua destilada ou em Soluo Fisiolgica a 0,9% estreis.

5 Ambiente e alimentao dos ces

Os animais foram internados nos perodo de 15 dias para garantir que o medicamento fosse administrado corretamente, na dose e horrio determinados. Da mesma forma, foi realizada avaliao clnica diria dos animais e exames complementares rotineiramente. Os animais ficaram em canis de alvenaria, com grades de ao inox, em uma sala separada do prdio da Disciplina de Enfermidades Infecciosas dos Animais, do Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da UNESP-Botucatu/SP. A sala de internao dos animais possui telas em portas e janelas, com rea externa isolada, porm sem controle de temperatura e umidade. A higienizao do ambiente foi realizada todos os dias, com desinfetante (Hipoclorito de sdio) e gua. Os canis foram forrados com papel de jornal, que era trocados duas a trs vezes ao dia, evitando que os animais ficassem sobre as fezes e urina. A alimentao dos animais foi caseira, basicamente de arroz e carne, oferecida duas vezes ao dia, sem quantidade pr-determinada. A gua foi oferecida vontade e trocada duas vezes ao dia. Os animais que apresentavam anorexia e desidratao por no ingerir gua recebiam fluidoterapia, com reposio energtica de glicose na dose de 5 mg/Kg. Os animais que apresentavam vmito foram mantidos em jejum no perodo de 12 horas at no apresentarem mais os sinais clnicos e receberam fluidoterapia durante este perodo.

6 Exames Complementares
Todos os animais foram avaliados laboratorialmente, por meio de hemograma, anlises bioqumicas e exames de urina, com o objetivo de identificar os efeitos colaterais da droga e acompanhar a evoluo da doena. No perodo de 15 dias, referentes ao tempo de tratamento com a ribavirina, foram realizados hemogramas no 1, 4, 7, 10, 12 e 15 dias nos dois grupos. Os exames bioqumicos e de urina foram realizados nos dias 1, 5, 10 e 15 aps o atendimento dos animais no Hospital Veterinrio, UNESP Botucatu. A colheita de lquor foi realizada no momento em que o animal chegou ao Hospital Veterinrio e aps 15 dias de tratamento com ribavirina. 81

O sistema hepatobiliar foi avaliado a partir da atividade srica da alaninaaminotransferase (ALT), fosfatase alcalina (FA) e gama-glutamiltransferase (GGT), e da concentrao de albumina e bilirrubinas. O sistema renal foi avaliado pela mensurao dos resduos nitrogenados, uria e creatinina no soro, e pelo exame de urina tipo I. As amostras de sangue foram colhidas com seringas e agulhas estreis e descartveis, no volume de aproximadamente oito mL, sendo ento acondicionadas em tubos com EDTA e sem o anticoagulante. O local da puno foi a veia jugular e, aps a colheita, as amostras foram levadas diretamente ao Laboratrio Clnico Veterinrio, da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, UNESP Botucatu/SP, para o devido processamento. As amostras de urina foram colhidas com auxlio de sondas uretrais estreis e descartveis ou por cistocentese com seringas estreis e descartveis, tambm levadas imediatamente ao Laboratrio Clnico Veterinrio para a anlise. Para obteno do lquor foi utilizado o procedimento descrito por Pellegrino et al. (2003), o qual relatam que para maior segurana deve-se retirar de uma s vez, um mL de lquor para cada cinco quilos de peso corporal. Em nosso procedimento foram obtidas cerca de 20 gotas de lquor por animal. O material foi colhido em tubo esterilizado, sem adio de anticoagulantes. O lquor foi obtido da cisterna cerebelomedular, por ser mais indicativo de leses cerebrais. O animal foi posicionado em decbito lateral e o pescoo flexionado em 90 coluna, com o nariz mantido paralelo mesa. No local da puno, fez-se tricotomia e assepsia da pele e introduo de uma agulha descartvel e estril, na linha mdia, direcionada para o espao atlantoccipital. O fluido foi obtido por gotejamento e dividido no momento da colheita em trs tubos, para evitar contaminao pelo sangue durante o procedimento, por isso, preferencialmente, utilizou-se o terceiro tubo para a anlise. Para a colheita de lquor foi necessrio anestesiar todos os animais. O protocolo anestsico foi igual para todos, sendo a dose ajustada com relao s condies fsica e de conscincia. Utilizou-se como medicamento pr-anestsico a associao de acepromazina com o diazepam administrada por via intramuscular, na dose 0,05 mg/Kg e 0,2 mg/Kg, respectivamente. Aps 30 minutos, o tiopental foi administrado por via intravenosa, na dose mxima de 10 mg/Kg, com o objetivo de obteno do estado de hipnose dos animais. 82

6.1 Hemograma Para a realizao do hemograma as amostras de dois a quatro mL de sangue foram acondicionadas em tubos com EDTA a 7,5%2. Aps chegada ao laboratrio, foi confeccionada a lmina de esfregao sangneo e corada por corante a base de Romanowsky (Pantico rpido), para realizao da contagem diferencial de leuccitos, observao da morfologia das clulas e a realizao da estimativa do nmero de plaquetas. Parte da amostra foi colocada em tubos capilares e centrifugada em microcentrfugas por cinco minutos na rotao de 11.500 rpm e aps foi verificado o volume globular pelo carto de leitura de micro-hematcrito e a densidade plasmtica por refratometria, resultando no valor de protena total plasmtica. A contagem total de leuccitos e hemcias foi realizada em contador automtico3. Quando foi observada na lmina de esfregao sangneo uma pequena quantidade de plaquetas dificultando a estimativa, foi realizada a diluio do sangue com Lquido de Brecher (oxalato de amnio 1%) e feita a contagem manual das mesmas em hemocitmetro padro (Cmara de Neubauer). Para a determinao de hemoglobina, utilizou-se o hemoglominmetro4, considerado um mtodo colorimtrico. 6.2 Anlises Bioqumicas Para a realizao das provas bioqumicas as amostras foram acondicionadas em tubos sem anticoagulante, com gel ativador da coagulao, no volume de trs a quatro mL de sangue. Aps a coagulao do mesmo, as amostras foram centrifugadas na rotao de 3.000 rpm durante oito minutos, e o soro foi separado e transferido para tubos menores e processado em espectofotmetro5. Nestas anlises foram utilizados kits comerciais para determinao por mtodo cintico, da creatinina6, enzimticos da uria5, ALT5, FA5, GGT5, e colorimtricos da protena total srica7, albumina6 e bilirrubinas6.

Vacuetfe CELM CC510 4 CELM HB520 5 CELM SB190 6 Katal 7 Labtest

3

83

6.3 Urinlise As amostras de urina foram acondicionadas nas prprias seringas onde foram colhidas, com o objetivo de diminuir a contaminao, no volume aproximado de 10 mL. Da mesma forma, foram levadas e processadas imediatamente aps a colheita. Foi separado cinco mL da amostra em tubos e centrifugados na rotao de 1.500 rpm durante cinco minutos, permitindo desta forma, descartar o sobrenadante e o 0,5 mL restante foi utilizado para confeccionar lmina para a observao do sedimento urinrio em microscpio ptico, em aumento 40x. A outra parte da amostra foi utilizada para o exame fsico-qumico, sendo o exame fsico realizado pela observao, verificando cor e turbidez. Foram utilizadas tiras reagentes8 para a avaliao de pH, protenas, glicose, alterao de urobilinognio, presena de bilirrubina e sangue oculto. A densidade foi obtida por refratometria e para determinao de sais biliares foi utilizado o teste com sal de enxofre. 6.4 Anlise do lquor Devido rpida lise celular no ambiente de baixo teor protico do lquor, a contagem de clulas e as preparaes citolgicas do fluido foram realizadas dentro de 30 a 60 minutos aps a colheita. Foram avaliados o volume, cor, aspecto, densidade e a presena de cogulos na amostra. As alteraes registradas como partes do exame fsico foram classificadas como discretas, moderadas ou intensas. A mensurao da densidade foi realizada com uso do refratmetro. O exame qumico do lquor foi realizado com tiras reagentes8 e foram avaliados pH, estimativa de protenas, glicose e sangue oculto. A quantificao de protenas totais do lquor requer um mtodo bioqumico com a utilizao de espectrofotmetro, pois a tira reagente um mtodo semi-quantitativo. Tambm como parte do exame qumico, foi realizado um teste qualitativo de protenas ( Teste de Pandy), que detecta o aumento de globulinas. Para a realizao, utilizou-se uma gota da amostra em um mL do reativo de Pandy (soluo saturada de fenol), e a presena de turbidez da soluo foi considerada positiva e ento classificada em cruzes (+, ++ ou +++).

Combur Teste - Roch

84

Para contagens de hemcias e clulas nucleadas utilizou-se o hemocitmetro padro (Cmara de Neubauer). Para contagens de clulas nucleadas em lquor nodiludo, foram preenchidas ambas as cmaras do hemocitmetro. Todas as clulas nucleadas presentes na rea da cmara foram contadas para obteno de nmero total por microlitro. A contagem de hemcias foi realizada de modo semelhante. Como o lquor normalmente apresenta baixa celularidade, h a necessidade de concentrao destas clulas atravs da citocentrifugao, que foi realizada colocando-se a amostra em um citofunil acoplado a uma lmina de microscopia e cetrifugada a 800 rpm durante cinco minutos. As preparaes de citocentrifugao foram secas ao ar livre e coradas com o corante de base Romanowsky. Na objetiva de imerso do microscpio ptico, realizou-se a leitura da lmina preparada, visando contagem de no mnimo 50 clulas nucleadas.

7 Reao de Imunofluorescncia Direta

A tcnica de reao de imunofluorescncia direta foi realizada nas amostras de sangue de todos os animais. Para esta forma de diagnstico foi necessria pequena quantidade de sangue perifrico, colhido preferencialmente nas veias ceflicas e safenas, em seringas agulhadas estreis e imediatamente foram realizadas as lminas de esfregao sangneo. As lminas foram encaminhadas para o Laboratrio de Imunologia da Disciplina de Enfermidades Infecciosas da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da UNESP-Botucatu/SP. Aps secagem das lminas em temperatura ambiente por no mnimo 30 minutos, estas foram fixadas com soluo de acetona e metanol na proporo de 75/25 respectivamente. As lminas foram marcadas com esmalte em formatos de poos e nestes foram adicionados 50-70 L de conjungado comercial diludo nas propores de 1:5 de diluente PBS e foram incubadas por 30 minutos em cmara mida a 37C. Aps este perodo as lminas foram enxaguadas trs vezes com PBS a 8,5%, durante 3 minutos cada enxge, e posteriormente lavadas com gua destilada. As lminas foram secas nas extremidades e realizadas as montagens com glicerina e lamnula. A leitura foi realizada em microscpio de fluorescncia em aumento de 400x.

85

8 Anlise estatstica
Os grupos experimentais foram comparados entre si pelos testes: t de Student, U de Mann-Whitney, de 2 ou Exato de Fischer, segundo a caracterstica de distribuio das variveis, ou seja, se tinham distribuio Normal, Livre ou eram variveis categricas, respectivamente. A evoluo dos animais, bem como o aparecimento de efeitos colaterais foi comparado entre os grupos pelo teste de Log-Rank (mtodo de Collet). Para todas as anlises foi utilizado um nvel de confiana de 5% (TRIOLA, 2005).

86

Resultados
87

1 Animais
Foram selecionados para o estudo 26 animais que apresentavam sinal clnico neurolgico compatvel com cinomose, apresentando entre dois meses a seis anos de idade, exceto um animal com 13 anos que apresentava sinais nervosos, histrico de vacinao incompleta e imunofluorescncia direta do lquor positiva. Destes, apenas 20 animais compuseram o experimento, pois receberam a ribavirina por mais de sete dias. Os 20 animais foram divididos em dois grupos de 10, sendo o grupo 1 (G1) composto por animais que receberam apenas a ribavirina e o grupo 2 (G2) os animais que receberam o antiviral e sua associao com o DMSO. No G1 apenas trs animais apresentavam raa definida, enquanto no G2 apenas quatro possuam raa (Tabela 01). Os animais foram divididos aleatoriamente, sendo que o G1 foi composto por cinco fmeas e cinco machos e apenas trs animais apresentaram imunofluorescncia direta de sangue negativo. O G2 foi composto por quatro fmeas e seis machos e dois deles foram negativos na imunofluorescncia direta (Tabela 01). No levantamento dos animais do GC foram includas seis fmeas e quatro machos, porm nestes animais no foi realizado imunofluorescncia direta, pois so dados obtidos de pronturios anteriores ao experimento, no perodo de dezembro de 2006 a fevereiro de 2007. Porm, para incluso no grupo controle foi utilizado todas as outras caractesticas clnicas encontradas nos outros dois grupos experminetais. Este grupo serviu como parmetro de mortalidade dos animais com cinomose que receberam apenas o tratamento sintomtico.

88

TABELA 01 Relao de animais que compuseram os dois grupos experimentais, com idade, sexo, raa e resultado da reao de imunofluorescncia direta no esfregao sangneo. Grupo G1 G1 G1 G1 G1 G1 G1 G1 G1 G1 G2 G2 G2 G2 G2 G2 G2 G2 G2 G2 Animal Catita Bill Berbela Max Rananka Mel Titica Mico Fofinho Nick Sheik Preta Fil Princesa Nina Marlon Zubu Bethoven Kiko Skol Idade 8 meses 5 anos 2 anos 2 anos 3 anos 2 anos 3 anos 4 anos 2 anos 1 ano 4 anos 4 meses 13 anos 4 anos 1 ano 3 anos 10 meses 6 anos 2 anos 5 anos Sexo Fmea Macho Fmea Macho Fmea Fmea Fmea Macho Macho Macho Macho Fmea Fmea Fmea Fmea Macho Macho Macho Macho Macho Raa** SRD Poodle SRD SRD SRD Daschund SRD SRD Poodle SRD SRD SRD Waimaraner Poodle Border Colie SRD Pit Bull SRD SRD SRD IFD* + + + + + + + + + + + + + + + -

* IFD: imunofluorescncia direta ** SRD: sem raa definida +: animal positivo -: animal negativo

Com relao ao tempo de evoluo da doena, os animais, para serem includos nos experimento, deveriam apresentar no mximo 10 dias de sinais nervosos. Os animais do GC apresentaram mdia de seis dias de evoluo dos sinais neurolgicos quando foram atendidos no Hospital Veterinrio. Contudo, os animais do G1 apresentaram mdia de cinco dias de sinais nervosos para o incio do tratamento e o G2 apresentou mdia de seis dias de alterao neurolgica para o incio do tratamento (Tabela 02). 89

TABELA 02 Tempo de evoluo dos sinais neurolgicos entre os grupos. Grupo Controle G1 G2
* Tempo de evoluo em dias Estatstica: Anlise de Varincia (F=0,6559; p=0,5270)

Mdia desvio-padro* 6,40 3,06 5,00 3,20 6,20 2,57

Foi possvel observar que no houve diferena significativa (p=0,5270) entre os grupos, permitindo a melhor padronizao dos resultados frente ao estgio da enfermidade. Para auxiliar no diagnstico da cinomose foi utilizada a reao de imunofluorescncia direta e na Tabela 03 podemos observar a anlise destes dados. TABELA 03 Resultado da reao de imunofluorescncia direta de esfregao sangneo dos animais nos grupos 1 e 2. Grupo G1 G2
Estatstica: teste do 2 (2=0,2667; p=0,6056)

Positiva 7 (70%) 8 (80%)

Negativa 3 (30%) 2 (20%)

Esta anlise no apresentou diferena significativa entre os resultados positivos e negativos. Contudo, podemos observar que a maioria dos animais apresentou resultado positivo, permitindo o diagnstico final da enfermidade. Este resultado nos permite afirmar que 70% dos animais do G1 e 80% dos animais do G2 apresentavam viremia, uma vez que este mtodo identifica o antgeno viral na amostra de sangue, sugerindo que estavam na fase aguda da cinomose, na qual ocorre replicao viral intensa e, por isso, a fase ideal para a utilizao do antiviral.

2 Avaliao dos grupos experimentais

Os grupos 1 e 2 foram analisados frente ao grupo controle com relao ao ndice de mortalidade, como demonstra a Tabela 04.

90

TABELA 04 Evoluo da cinomose na fase neurolgica entre os grupos. Grupo Controle G1 G2

Estatstica: teste do 2 (2=2,100; p=0,3499). G1: grupo 1 G2: grupo 2

Melhora 5 (50%) 7 (70%) 8 (80%)

bito 5 (50%) 3 (30%) 2 (20%)

Apesar de no ocorrer diferena significativa (p=0,3499) entre os grupos, pdese observar uma queda no ndice de mortalidade com o tratamento, porm quando se utilizou a ribavirina associada ao DMSO (G2) esta queda se tornou mais evidente com apenas 20% de bitos. A partir da avaliao clnica diria dos animais foi criada uma representao grfica da evoluo da doena entre os grupos, demonstrando a ao da ribavirina e sua associao com o DMSO (Figura 01). Neste observamos a melhora clnica indicada no eixo y pelo nmero 1 e bito de todos os animais pelo zero. Tambm foi considerado os animais que vieram a bito no decorrer do tratamento. FIGURA 01 Representao grfica da avaliao clnica diria dos animais dos dois grupos experimentais.

1.00: melhora do quadro clnico 0.00: piora do quadro clnico G1: grupo 1 G2: grupo 2

Atravs do grfico podemos observar que os animais do G1 comearam a apresentar melhora clnica a partir do sexto dia da administrao da ribavirina, porm 91

no dcimo dia de tratamento a maior parte apresentou piora e variaes no estado clnico nos dias seguintes. Os animais do G2 apresentaram elevao na curva a partir do stimo dia de administrao das drogas, que foi mantida at o dcimo dia e aps este perodo demonstraram variao no estado clnico. Os resultados sugerem que a ao da ribavirina resulta em melhora clnica ao redor do stimo dia de administrao. Alm disso, a variao encontrada aps o dcimo dia pode sugerir uma ao do sistema imune no SNC, j que no foi utilizado nenhum antinflamatrio ou imunomodulador, porm esta informao ser verificada atravs do exame do lquor.

3 Evoluo da doena frente aos dados epidemiolgicos

O histrico vacinal foi considerado um critrio de seleo dos animais, por isso, animais que apresentavam histrico vacinal correto, no foi includo no experimento. TABELA 05 Relao entre a evoluo da doena com o histrico vacinal dos animais.
Histrico vacinal

GC Melhora
3 (75%) 2 (50%) 0 0

G1 bito
1 (25%) 2 (50%)

G2 bito
2 (40%) 1 (20%) 0 0

Melhora
3 (60%) 4 (80%) 0 0

Melhora
2 (100%) 4 (80%) 1 (100%) 1 (50%)

bito
0 1 (20%) 0 1 (50%)

No tica Sem vacina Desconhecido Incompleto

1 (100%) 1 (100%)

Estatstica: teste de 2 (2=2,348; p=0,5035) GC: grupo controle G1: grupo 1 G2: grupo 2 %: porcentagem

Este tipo de anlise de fundamental importncia com relao evoluo da doena e a presena de imunidade celular. Por isso, os animais agrupados com histrico de vacinao desconhecido esto em menor nmero, demonstrando que no nos oferece resultado significativo. Os animais foram encontrados na rua e posteriormente apresentaram sintomatologia neurolgica depois que chegaram ao domiclio. Dos trs animais agrupados com histrico vacinal incompleto, um foi contaminado quando filhote e no havia recebido a dose de reforo. Os outros dois pertencentes ao G2, eram adultos e no receberam a revacinao anual.

92

Os resultados no apresentaram nvel de significncia estatstica. No entanto, possvel verificar que os ndices de melhora clnica ou bito no variaram percentualmente entre os grupos quando os animais receberam esquema vacinal incorreto, agrupados na Tabela 05 como animais com histrico de vacinao no tica. Os animais que no foram vacinados demonstraram aumento na porcentagem de melhora clnica quando receberam o tratamento experimental. Neste grupo houve boa resposta teraputica, embora os animais no apresentassem memria imunolgica, como pode ocorrer com aqueles que receberam vacina no tica. Ao analisarmos animais com relao ao sexo e raa frente evoluo da doena, observamos que no houve diferenas significativas. TABELA 06 Relao entre a evoluo da doena frente ao tempo de desenvolvimento dos sinais neurolgicos at o incio do tratamento.
Tempo de evoluo 0 a 7 dias 7 a 10 dias GC Melhora
3 (42,9%) 2 (66,6%)
2

G1 bito Melhora
5 (71,4%) 2 (66,6%)

G2 bito
2 (28,6%) 1 (33,3%)

Melhora
5 (71,4%) 3 (100,0%)

bito
2 (28,6%) 0

4 (57,1%) 1 (33,3%)

Estatstica: teste de , sendo que no houve diferena significativa p>0,05 GC: grupo controle G1: grupo 1 G2: grupo 2 %: porcentagem

A anlise do tempo de evoluo dos sinais neurolgicos frente a melhora clnica dos animais no demonstrou diferena significativa entre os grupos. Nos intervalos criados no vimos correlao ao momento em que se iniciou o tratamento, com o desfecho da doena, porm, assim como em outros tratamentos, sabemos que o ideal iniciar a utilizao das drogas o mais rpido possvel. Com estes resultados, observamos apenas que o tempo para o incio do tratamento de at 10 dias de sinais neurolgicos no alterou a eficcia da droga.

4 Evoluo da doena frente aos sinais clnicos e as leses neurolgicas

Os principais sinais neurolgicos encontrados no GC foram mioclonias (60%), ataxia (40%) e paralisia de membros (30%), sendo que outros sinais como choro noturno, tremores e nistagmo (20%), convulses, fraqueza muscular, andar em crculos e sialorria (10%) tambm foram encontrados (Tabela 07).

93

No grupo que recebeu apenas a ribavirina (G1) os principais sinais foram ataxia e dficits de locomoo (80%), sendo que neste ltimo foram agrupadas alteraes na propriocepo e sensibilidade superficial e profunda dos membros, em seguida encontramos mioclonias, alteraes em nervos cranianos, paresia de membros, tremores, desvio de cabea e hipermetria (40%), ataxia (30%), com menor freqncia nistagmo e espasticidade de membros (20%) e outros sinais como giro ortotnico do pescoo, atrofia muscular, choro noturno, estrabismo e balanar de cabea (10%), relacionados na Tabela 07. O grupo que recebeu a associao da ribavirina com DMSO (G2) apresentou sinais como ataxia, tremores e alteraes em nervos cranianos (80%), mioclonias (70%), hipermetria, desvio de cabea, paresia de membros, dficits de locomoo e espasticidade (30%), nistagmo, andar em crculos e balanar de cabea (20%), e opisttono, giro ortotnico do pescoo, hiperexcitabilidade e estrabismo (10%), que tambm foram relacionados na Tabela 07.

94

TABELA 07 Relao dos sinais clnicos neurolgicos encontrados nos diferentes grupos, no momento que foram atendidos no Hospital Veterinrio. Sinais Ataxia
Alteraes em nervos cranianos

GC 4 (40%) 1 (10%)

G1 8 (80%) 4 (40%) 3 (30%) 1 (10%) 1 (10%)

G2 8 (80%) 8 (80%) 2 (20%)

Andar em crculos Apatia Atrofia muscular Balanar de cabea Choro noturno Convulses Dficits de locomoo Desvio de cabea Espasticidade de membros Estrabismo Fraqueza muscular Giro ortotnico do pescoo Hipermetria Hiperexcitabilidade Mioclonias Nistagmo Opisttono Paresia de membros Tremores Sialorria
GC: grupo controle G1: grupo 1 G2: grupo 2 %: porcentagem

2 (20%)

2 (20%) 1 (10%)

1 (10%) 8 (80%) 4 (40%) 2 (20%) 1 (10%) 3 (30%) 3 (30%) 3 (30%) 1 (10%) 1 (10%) 3 (30%) 1 (10%) 7 (70%) 2 (20%) 1 (10%) 3 (30%) 8 (80%)

1 (10%) 1 (10%) 4 (40%) 6 (60%) 2 (20%) 3 (30%) 2 (20%) 1 (10%) 4 (40%) 2 (20%) 4 (40%) 4 (40%)

Com objetivo de identificar o quadro clnico favorvel utilizao da ribavirina, localizamos a leso nervosa atravs dos sinais presentes e comparamos a evoluo da enfermidade para melhora clnica ou bito pela Tabela 08.

95

TABELA 08 Relao das leses neurolgicas nos grupos e a evoluo da doena.

GC Estrutura* Cerebelo Com leso Sem leso Substncia branca Com leso Sem leso Encfalo Com leso Sem leso Medula espinhal Com leso Sem leso Nervo perifrico Com leso Sem leso Ncleo de nervo Com leso Sem leso Par NC II Com leso Sem leso Par NC III Com leso Sem leso Par NC IX Com leso Sem leso Par NC V Com leso Sem leso Par NC VIII Com leso Sem leso Par NC X Com leso Sem leso Par NC XI Com leso Sem leso Par NC XII Com leso Sem leso Sistema Vestibular Com leso Sem leso Tronco enceflico Com leso Sem leso Melhora 0 5 (62,5%) 0 5 (55,6%) 3 (100,0%) 2 (28,6%) 3 (75,0%) 2 (33,3%) 1 (100,0%) 4 (44,4%) 3(50,0%) 2 (50,0%) 0 5 (50,0%) 0 5 (50,0%) 0 5 (50,0%) 0 5 (55,6%) 0 5 (55,6%) 0 5 (50,0%) 0 5 (50%) 0 5 (50,0%) 0 5 (55,6%) 1 (100,0%) 4 (44,4%) bito 2 (100,0%) 3 (37,5%) 1 (100,0%) 4 (44,4%) 0 5 (71,4%) 1 (25,0%) 4 (66,7%) 0 5 (55,6%) 3 (50,0%) 2 (50,0%) 0 5 (50,0%) 0 5 (50,0%) 0 5 (50,0%) 1 (100,0%) 4 (44,4%) 1 (100,0%) 4 (44,4%) 0 5 (50,0%) 0 5 (50%) 0 5 (50,0%) 1 (100,0%) 4 (44,4%) 0 5 (55,6%) Melhora 7 (70,0%) 0 7 (70,0%) 0 4 (57,1%) 3 (100,0%) 3 (60,0%) 4 (80,0%) 2 (66,7%) 5 (71,4%) 2 (50,0%) 5 (83,3%) 1 (100,0%) 6 (66,7%) 1 (100%) 6 (66,7%) 0 7 (87,5%) 7 (70,0%) 0 1 (100,0%) 6 (66,7%) 0 7 (87,5%) 7 (70,0%) 0 1 (100,0%) 6 (66,7%) 3 (75,0%) 4 (66,7%) 2 (40,0%) 5 (100,0%) G1 bito 3 (30,0%) 0 3 (30,0%) 0 3 (42,9%) 0 2 (40,0%) 1 (20,0%) 1 (33,3%) 2 (28,6%) 2 (50,0%) 1 (16,7%) 0 3 (33,3%) 0 3 (33,3%) 2 (100,0%) 1 (12,5%) 3 (30,0%) 0 0 3 (33,3%) 2 (100,0%) 1 (12,5%) 3 (30,0%) 0 0 3 (33,3%) 1 (25,0%) 2 (33,3%) 3 (60,0%) 0 Melhora 7 (87,5%) 1 (50,0%) 0 8 (88,9%) 6 (75,0%) 2 (100,0%) 1 (100,0%) 7 (77,8%) 2 (100,0%) 6 (75,0%) 5 (83,3%) 3 (75,0%) 1 (100,0%) 8 (80,0%) 2 (66,7%) 6 (85,7%) 0 8 (80,0%) 0 8 (80,0%) 0 8 (80,0%) 0 8 (80,0%) 1 (50,0%) 7 (87,5%) 0 8 (80,0%) 3 (75,0%) 5 (83,3%) 5 (71,4%) 3 (100,0%) G2 bito 1 (12,5%) 1 (50,0%) 1 (100,0%) 1 (11,1%) 2 (25,0%) 0 0 2 (22,2%) 0 2 (25,0%) 1 (16,7%) 1 (25,0%) 0 2 (20,0%) 1 (33,3%) 1 (14,3%) 0 2 (20,0%) 0 2 (20,0%) 0 2 (20,0%) 0 2 (20,0%) 1 (50,0%) 1 (12,5%) 0 2 (20,0%) 1 (25,0%) 1 (16,7%) 2 (28,6%) 0

Estatstica: teste de 2, no houve diferena significativa (p>0,05); *Estrutura: localizao clnica da leso neurolgica GC: grupo controle; G1: grupo 1; G2: grupo 2 %: porcentagem

96

Os resultados comparativos das leses no SNC frente evoluo da enfermidade no foram estatisticamente significativos, porm algumas anlises clnicas puderam ser realizadas. A partir destes dados, podemos observar que no GC apenas dois animais apresentavam leses cerebelares, ao contrrio do que foi encontrado nos outros dois grupos, porm acima de 70% dos animais que apresentavam esta leso chegaram melhora clnica com o uso da ribavirina e sua associao com o DMSO. As leses na substncia branca so difceis de serem distinguidas quando associadas s outras leses, por isso foram identificadas por tremores em animais que no apresentavam sinais de acometimento do cerebelo e/ou do sistema vestibular. Contudo, poucos animais foram identificados apresentando estas leses, apesar da cinomose ser considerada uma enfermidade desmielinizante. No caso de animais com leso enceflica foram considerados os sinais referentes ao nvel de conscincia, alteraes na viso, convulses, andar em crculos e algumas alteraes na locomoo, como a diminuio da propriocepo. Nos dois grupos tratados, verificamos que os animais sem leses enceflicas tiveram favorvel ndice de melhora, porm mesmo sendo uma leso grave, os animais destes grupos com alteraes enceflicas mostraram um melhor resultado frente ao tratamento da enfermidade. As leses de medula espinhal tambm foram pouco comuns e so referentes aos sinais clnicos de paresia de membros e diminuio de sensibilidade, j que as mioclonias foram separadas no grupo de leses em ncleo de nervos. A associao de sinais nervoso na cabea com dficits de locomoo tambm foram considerados neste grupo, j que pode haver um comprometimento de medula espinhal cervical. Contudo, os dados entre os trs grupos mostraram uma semelhana no ndice de melhora clnica, independente do tratamento utilizado. Com relao aos dados referentes s leses de nervos perifricos, os sinais como ataxia, diminuio de propriocepo e dficits de locomoo foram considerados, apesar destes sinais caracterizarem melhor a leso em outras regies. Estes dados possuem pouco valor clnico, j que a cinomose uma enfermidade de acomete principalmente SNC. A mioclonia foi considerada uma leso em ncleo de nervos medulares e cranianos. Sendo este sinal considerado caracterstico da cinomose, observamos que no houve diferena percentual nos dados dos grupos controle e de animais tratados com a 97

ribavirina. A partir destes resultados podemos sugerir que o DMSO aumentou o poder de difuso da ribavirina pelo SNC, proporcionando uma melhor ao local nestas leses. Alm disso, foi possvel verificar na avaliao clnica diria que estes animais do G2, alm da melhora clnica, tiveram tambm uma atenuao destes sinais no perodo de tratamento. As alteraes em nervos cranianos foram pouco encontradas nos animais do grupo controle, e nos grupos tratados estas foram caracterizadas por sinais como cegueira, diminuio de reflexos pupilares, estrabismo, diminuio de sensibilidade de face, desvio de cabea, nistagmo, dificuldade de deglutio, atrofia dos msculos do pescoo e ptoses palpebral, labial e auricular. Nos casos de nistagmo, foram separados os animais que apresentavam o nistagmo vertical ou posicional, quando os sinais se associavam presena de sndromes vestibulares ou cerebelares. No G1 encontramos com mais freqncia alteraes nos pares de nervos cranianos V e XI, referentes aos sinais de reflexo palpebral, sensibilidade de face e atrofia da musculatura de pescoo, respectivamente, sendo que 70% dos animais que apresentavam estes sinais obtiveram melhora clnica. As leses no sistema vestibular foram observadas em quatro animais nos dois grupos tratados, sendo que trs deles evoluram para a melhora clnica. Estas leses foram caracterizadas por ataxia, andar em crculos, desvio lateral da cabea, em alguns casos nistagmo horizontal, vertical, rotacional e posicional, dificuldade de manter-se em estao e diminuio da propulso extensora. No entanto, as leses em tronco enceflico mostraram uma relevncia, j que no G1 60% dos animais foram a bito e apresentavam sinais como associao de leses pupilares com outras alteraes em pares de nervos cranianos, ataxia com diminuio de propriocepo, incordenao e paresias. Entretanto, no G2 observamos que 71,4% destes animais sobreviveram com melhora clnica.

5 Exames complementares
Os exames hematolgicos e bioqumicos foram analisados atravs do teste t de Student e a diferena significativa considerada entre os grupos 1 e 2 foi de p < 0,05. Os hemogramas foram colhidos nos dias 1, 4, 7, 10, 12 e 15 do tratamento, foi feita a mdia para cada dia de forma que podemos avaliar efeitos colaterais da ribavirina e sua associao com o DMSO sobre as hemcias e sugerir alteraes na medula ssea de

98

ces. As anlises bioqumicas foram avaliadas da mesma forma, porm foram realizadas quatro colheitas nos dias 1, 5, 10 e 15. Estes dados esto relacionados na tabelas seguintes. TABELA 09 Mdia, desvio padro e nvel de significncia da contagem de hemcias. G1 Dias 1 4 7 10 12 15 Mdia* 4.791.000 5.152.000 4.884.000 4.708.888 4.943.333 4.052.500 Desvio padro 857586,41 1436259,03 993570,44 641588,74 1095935,67 1209530,61 4.448.333 6.034.000 5.529.000 5.637.777 5.377.500 4.592.057 Mdia* G2 Desvio padro 1221428,62 994877,99 1289508,52 517536,90 1371253,34 807881,34 0,4008 0,1277 0,2262 0,0038 0,4795 0,3118 Estatstica Valor de p

Estatstica: teste t de Student, sendo que valores de p<0,05 indicam diferena significativa entre os grupos *Mdia da contagem de clulas/L G1: grupo 1; G2: grupo 2

FIGURA 02 Representao grfica da variao das mdias da contagem de hemcias entre os dois grupos.
7

Milhes Hemcias/microlitro

G1 G2

3 1 4 7 Dias 10 12 15

* Mdia da contagem de clulas/L G1: grupo 1; G2: grupo 2

99

Atravs destes dados podemos observar que os animais do G1 mantiveram mdia baixa na contagem de hemcias, demonstrando um quadro de anemia durante quase todo o perodo de tratamento. No entanto, os animais do G2 tiveram resposta frente infeco viral resultando em aumento na contagem de hemcias no quarto dia de tratamento. Contudo, apenas no dcimo dia observamos diferena significativa (p=0,0038) na contagem de hemcias entre os dois grupos evidenciando a atividade antiviral da ribavirina com associao ao DMSO em resposta a anemia, conseqente ao estresse causado pelo vrus da cinomose. A partir do 12 dia verificamos queda nesta contagem que foi avaliada junto a outros dados, podendo sugerir alterao na medula ssea pela ao da ribavirina. Foi possvel considerar tambm que o DMSO potencializou a ao da ribavirina ou minimizou possveis danos na medula ssea nos animais do G2, j que as mdias da contagem de hemcias mantiveram mdias superiores a partir do quarto dia de administrao das drogas. TABELA 10 Mdia, desvio padro e nvel de significncia da concentrao de hemoglobina. G1 Dias 1 4 7 10 12 15 Mdia* 10,38 11,28 11,06 10,51 10,78 8,65 Desvio padro 1,83 2,89 2,27 1,67 2,58 2,62 10,29 13,07 12,61 11,92 11,64 10,83 Mdia* G2 Desvio padro 2,61 2,56 2,51 1,89 2,44 1,14 0,8620 0,1599 0,1650 0,1129 0,4931 0,0489 Estatstica Valor de p

Estatstica: teste t de Student, sendo que valores de p<0,05 indicam diferena significativa entre os grupos. *Mdia da concentrao de hemoglobina em g/dL G1: grupo 1 G2: grupo 2

Desta forma podemos observar que os resultados da dosagem de hemoglobina foram compatveis com a contagem de hemcias, demonstrando que a anemia encontrada no causada por hemlise, para confirmao deste resultado podemos avaliar a dosagem de bilirrubina indireta. No entanto, foi encontrada uma diferena

100

significativa no 15 dia entre os dois grupos, a qual resultante de uma queda acentuada na concentrao globular de hemoglobina no G1. TABELA 11 Mdia, desvio padro e nvel de significncia do volume globular. G1 Dias 1 4 7 10 12 15 Mdia* 30,80 33,10 32,10 30,67 32,22 24,25 Desvio padro 5,37 8,25 5,88 5,12 7,82 5,63 31,58 39,10 37,50 36,33 36,00 29,63 Mdia* G2 Desvio padro 7,45 7,17 7,17 4,18 6,76 4,60 0,8270 0,0998 0,0820 0,0205 0,3060 0,0551 Estatstica Valor de p

Estatstica: teste t de Student, sendo que valores de p<0,05 indicam diferena significativa entre os grupos * Mdia do volume globular % G1: grupo 1 G2: grupo 2

Estes resultados confimram os resultados da contagem de hemcias e a dosagem de hemoglobina, demonstrando que no quarto dia de tratamento os animais do G2 no demonstravam mais o quadro de anemia. E concordando com os dados anteriores, obtivemos uma diferena significativa no dcimo dia de tratamento entre os dois grupos, demonstrando estatsticamente que a resposta dos animais que receberam a associao da ribavirina com o DMSO teve uma resposta favorvel ao combate da infeco pelo vrus da cinomose.

101

TABELA 12 Mdia, desvio padro e nvel de significncia na contagem de plaquetas. G1 Dias 1 4 7 10 12 15 Mdia* 174.730 220.115 242.332 313.494 207.991 193.428 Desvio padro 80763,67 112382,90 144493,25 182334,32 82347,40 88530,21 172.450 253.187 266.170 235.216 210.028 179.481 Mdia* G2 Desvio padro 83599,74 79573,41 114242,02 64305,58 117202,94 48739,08 0,8241 0,4574 0,6872 0,2421 0,9672 0,7022 Estatstica Valor de p

Estatstica: teste t de Student, sendo que valores de p<0,05 indicam diferena significativa entre os grupos * Mdia da contagem de plaquetas/L G1: grupo 1 G2: grupo 2

A mdia da contagem de plaquetas revela uma leve trombocitopenia no primeiro dia, no qual os animais ainda no haviam recebido o tratamento. E no ltimo dia de tratamento o G2 revelou uma mdia mais baixa com relao ao G1, porm nenhuma das comparaes entre os grupos mostrou nvel de significncia. TABELA 13 Mdia, desvio padro e nvel de significncia entre os grupos com relao contagem de total de leuccitos. G1 Dias 1 4 7 10 12 15 Mdia* 8.530 7.865 7.271 6.252 8.536 5.291 Desvio padro 3984,43 3212,48 2834,43 2875,65 4257,72 3097,44 7.690 13.116 11.622 12.433 9.388 7.079 Mdia* G2 Desvio padro 5421,89 7035,61 7732,06 8405,21 3735,03 2614,01 0,8657 0,0457 0,1120 0,0532 0,6693 0,2328 Estatstica Valor de p

Estatstica: teste t de Student, sendo que valores de p<0,05 indicam diferena significativa entre os grupos. * Mdia da contagem de clulas/L G1: grupo 1 G2: grupo 2

102

FIGURA 03 Representao grfica da variao das mdias da contagem total de leuccitos entre os dois grupos.
Milhares

16

14

Leuccitos/microlitro

12

10

G1 G2

4 1 4 7 Dias 10 12 15

*Mdia da contagem de clulas/L G1: grupo 1 G2: grupo 2

Com relao srie branca, os resultados demonstraram que no houve leucopenia na mdia da contagem total de leuccitos no primeiro dia. Porm no quarto dia de administrao da droga houve uma diferena significativa entre os resultados do G1 e G2, mostrando que o grupo que recebeu a ribavirina associada com o DMSO obteve uma resposta imunolgica melhor do que os animais do G1. Esta diferena na resposta imunolgica, apesar de no apresentar nvel de significncia estatstica, foi considervel at o dcimo dia de tratamento. No 15 dia as contagens de leuccitos caram nos dois grupos, sendo que o G1 apresentou leucopenia, que pode ser responsiva ao uso da ribavirina conforme a literatura. Estes resultados nos permitem afirmar que o DMSO melhorou a ao da ribavirina sobre o vrus, que ficou evidenciado pela resposta imune. A anlise feita com as mdias de neutrfilos no mostrou nvel de significncia entre os grupos, em nenhum momento do tratamento, e a partir destas no foram observadas neutrofilia ou neutropenia.

103

TABELA 14 - Mdia, desvio padro e nvel de significncia entre os grupos com relao contagem de linfcitos. G1 Dias 1 4 7 10 12 15 Mdia 712 450 775 281 359 188 Desvio padro 439,07 277,64 1259,92 210,28 346,42 160,55 866 1.439 1.024 1.071 1.367 687 Mdia G2 Desvio padro 822,60 2274,59 1564,99 1885,21 2493,28 997,64 0,6029 0,1891 0,6998 0,2296 0,2460 0,1840 Estatstica p

Estatstica: teste t de Student, sendo que valores de p<0,05 indicam diferena significativa entre os grupos. * Mdia da contagem de clulas/L G1: grupo 1 G2: grupo 2

FIGURA 04 Representao grfica da variao das mdias da contagem linfcitos entre os dois grupos.
Milhares

Linfcitos/microlitro

G1 G2

0 1 4 7 Dias 10 12 15

* Mdia da contagem de clulas/L G1: grupo 1 G2: grupo 2

104

Foi observado que a linfopenia encontrada na primeira colheita no apresentou diferena significativa entre os grupos e os valores mdios semelhantes indicam uma alterao encontrada comumente em animais com cinomose. No entanto, podemos observar que a linfopenia no G1 foi persistente em todos os momentos, ao contrrio da encontrada no G2, apesar de no apresentar resultados com significncia estatstica. Contudo, o aumento no nmero de linfcitos na referida enfermidade clinicamente significante com relao melhora dos animais, demonstrando novamente que a associao da ribavirina com o DMSO foi mais eficaz na melhora clnica e hematolgica destes animais. O resultado deste experimento demonstra uma sensibilidade dos linfcitos ao tratamento com a ribavirina, j que no 15 dia todos os animais apresentaram uma linfopenia, sendo que a mdia do G1 mostrou-se extremamente baixa e a mdia do G2 caiu drasticamente. Em nossas anlises no observamos nenhuma alterao significativa no nmero de eosinfilos nos dois grupos. No entanto, houve variao na quantidade de moncitos demonstrada na tabela 15. TABELA 15 Mdia, desvio padro e nvel de significncia na contagem de moncitos. G1 Dias 1 4 7 10 12 15 Mdia* 579 682 819 676 643 439 Desvio padro 386,25 402,03 328,20 276,53 290,08 514,74 653 1.717 1.201 1.663 1.022 818 Mdia* G2 Desvio padro 490,59 1140,57 1072,80 2118,97 393,02 665,41 0,7060 0,0145 0,2954 0,1847 0,0377 0,2236 Estatstica Valor de p

Estatstica: teste t de Student, sendo que valores de p<0,05 indicam diferena significativa entre os grupos. *Mdia da contagem de clulas/L G1: grupo 1 G2: grupo 2

Os valores mdios da contagem de moncitos estiveram aumentados com relao aos valores de referncia apenas no grupo que recebeu a ribavirina associada ao DMSO. Este aumento pode ser observado no quarto dia aps a administrao das

105

drogas e apresentou significncia frente ao G1. No dcimo dia este aumento no teve significncia estatstica, porm frente aos valores normais destas clulas, apresenta uma alterao e esta monocitose pode ser considerada uma resposta da medula ssea frente infeco, quando comparamos com as informaes anteriores. No foram encontros corpsculos de incluso que caracterizavam a infeco pelo vrus da cinomose nas amostras obtidas dos animais que compuseram os grupos experimentais. Os testes bioqumicos no apresentaram resultados estatisticamente significantes, porm alguns dados podem ser discutidos clinicamente. TABELA 16 Mdia e desvio padro dos valores encontrados nos dois grupos na dosagem de uria no soro. G1 Dias 1 5 10 15 Mdia* 35,30 39,14 37,88 29,11 Desvio padro 16,51 25,79 16,81 7,02 Mdia* 32,92 30,43 35,22 27,69 G2 Desvio padro 9,02 9,60 11,79 7,38

Estatstica: teste t de Student, sendo que no houve diferena significativa entre os grupos. *Mdia da dosagem em mg/dL G1: grupo 1 G2: grupo 2

Os dados referentes aos valores mdios da dosagem de uria no soro sangneo foram levemente aumentados, podendo identificar um grau de desidratao no incio e durante o tratamento. Porm, no 15 dia todos os animais apresentam estes valores normalizados, demonstrando melhora clnica compatvel com o que foi verificado nas avaliaes dirias, pois a maior parte dos animais quando se iniciou o tratamento ingeriam pouca quantidade de gua e ao final deste j tinham normalizado esta ingesto. Alm disso, muitos animais chegaram desidratados por apresentarem sintomas sistmicos simultaneamente, como diarria ou vmito, que cessaram durante o tratamento. As dosagens de creatinina, ALT e FA no soro sangneo mantiveram suas mdias dentro dos valores de referncia normais, no apresentando nenhum valor clnico e estatstico, o que demonstra que a ribavirina no exerceu efeitos hepatotxicos.

106

No entanto, encontramos algumas alteraes nos valores mdios de GGT, porm quando comparados estatisticamente no apresentaram significncia. A dosagem de gama-glutamiltransferase (GGT) do soro sangneo mostrou valores mdios altos a partir do quinto dia de administrao da ribavirina associada com o DMSO, no entanto dois fatores podem ter lavado a esse aumento, tanto a associao das duas drogas ou a ao do antibitico escolhido com mais freqncia no grupo, como o cloranfenicol, que pode ter sido potencializado pelo DMSO. FIGURA 05 Grfico representando as variaes das mdias de protena, albumina e globulina do soro dos dois grupos.

10 9 8 7 6 g/dL 5 4 3 2 1 0 1 5 Dias 10 15
G1-ptn G2-ptn G1-alb G2-alb G1-glo G2-glo

*Mdia da dosagem de protenas, albumina e globulina em g/dL G1: grupo 1 G2: grupo 2

Atravs do grfico podemos avaliar as duas fraes medidas frente aos valores da protena total srica. As curvas apresentam uma semelhana justificada por no haver diferena significativa entre as mdias dos dois grupos. Para o nosso estudo importante verificarmos a queda nos valores de globulina no decorrer do tratamento, principalmente a partir do dcimo dia de administrao das drogas. Esta queda est 107

diretamente relacionada resposta do sistema imune por uma diminuio do antgeno viral, que resulta na queda de protenas totais. A queda simultnea da frao de albumina pode ser justificada por uma resposta do organismo em manter a osmolaridade sangnea aos altos valores de globulina. Da mesma forma que as outras anlises bioqumicas, a bilirrubina total srica e suas fraes no demonstraram resultados significativos em suas mdias quando comparadas entre os dois grupos. Alm disso, estas no apresentaram mdias alteradas com relao aos padres estabelecidos para ces, no demonstrando significncia clnica em seus resultados. No entanto, este resultado negativo para a dosagem de bilirrubinas foi um achado importante considerando que um dos efeitos colaterais mais freqente da ribavirina em humanos a hemlise extravascular e conseqente aumento na dosagem de bilirrubinas. As amostras de urina foram colhidas em quatro momentos durante o tratamento dos animais do grupo 1 e 2, nos dias 1, 5, 10 e 15. Quando se analisou o aspecto da urina, no foi encontrado resultado significativo entre as amostras, porm observamos que na primeira colheita dois animais apresentavam a urina discretamente turva e dois animais apresentavam a urina turva, sendo que apenas um animal pertencia ao G2. Desta forma, quando analisamos os resultados da presena de bactria na urina encontramos um resultado significativo (p=0,0232) entre os grupos, demonstrando que trs animais do G1 apresentavam cistite na primeira colheita. Para sugerirmos este achado clnico verificamos tambm a presena de leuccitos e hemcias, porm no apresentaram resultado significativo na primeira colheita, nem mesmo encontramos alteraes clnicas significantes nestas amostras. As amostras mantiveram-se lmpidas e com baixa quantidade de bactrias em sua maioria por todo o experimento e desta forma podemos afirmar que a colheita seriada, preferencialmente por cistocentese, no causou infeco urinria nos ces, mesmo naqueles que apresentavam imunossupresso, e o uso de antimicrobianos curou a cistite inicial. Os resultados da densidade urinria no apresentaram significncia estatstica e clinica, considerando os valores de referncia para ces. Da mesma forma, os valores de pH urinrio tambm no apresentaram alteraes significativas.

108

TABELA 17 Representao mdia dos valores de protena na urina entre os dois grupos e nvel de significncia. Dais 1 5 10 15 G1* 0 30 30 0 G2** < 30 30 30 > 30 Valor de p 0,6305 0,1333 0,9626 0,0541

Estatstica: teste no paramtrico de Mann-Witney, sendo que valores de p<0,05 indicam diferena significativa entre os grupos. *Mdia da dosagem de protena na urina dos animais do grupo 1, em mg/dL **Mdia da doagem de protena na urina dos animais do grupo 2, em mg/dL

Estes resultados no apresentaram nvel de significncia quando comparados os grupos. Os valores de protena na urina no foram relevantes clinicamente, j que o animal pode excretar alguma protena na urina sem que haja uma leso glomerular ou infeco de alguma parte do trato urinrio ou em trato genital. No entanto, os valores de protena na colheita do 15 dia de tratamento foram mais altos e significativos clinicamente no G2. Este leve aumento no est relacionado com outras alteraes encontradas na urinlise destes animais, portanto podemos sugerir que a ribavirina quando associada ao DMSO pode causar uma sobrecarga renal. As alteraes na concentrao de glicose na urina no foram significativas estatstica e clinicamente. Esta dosagem sofreu influncia da fluidoterapia aplicada nos animais no 1 e 15 dias, sendo que alguns animais receberam soluo de glicose a 5% quando anestesiados. Os nveis de acetona e alterao do urobilinognio no mostraram resultado significativo estatisticamente e clinicamente. Da mesma forma, a dosagem de bilirrubina no mostrou significncia entre os grupos, porm no G1 observamos a mdia do 10 dia de tratamento indicando presena de bilirrubina na urina, que clinicamente possui importncia, sugerindo uma leso heptica concordando com os dados bioqumicos de GGT no soro sanguneo. Os dados de sangue oculto tambm no apresentaram significado estatstico, porm observamos que a partir da terceira colheita os valores aumentaram no G2. No entanto, devemos levar em considerao a alta sensibilidade das tiras reagentes e a ausncia de outros sinais associados, podendo sugerir uma contaminao das amostras no momento da puno. Da mesma forma, verificamos um aumento no nmero de

109

hemcias no sedimento urinrio de animais do G2 no dcimo dia de tratamento (Tabela 18). TABELA 18 Relao do nmero de hemcias no sedimento urinrio nos dois grupos e nvel de significncia. Dias 1 Caracterstica* 1-3 8-12 Raras Ausentes 5 50-60 15-20 5-10 Raras Ausentes 10 80-100 20-25 8-12 3-6 Raras Ausentes 15 50-55 10-12 6-10 Raras Ausentes G1 1 1 3 5 1 2 1 4 1 0 0 2 0 4 3 0 0 1 4 2 G2 1 0 2 7 0 0 0 3 5 1 1 0 1 1 4 1 1 0 1 5 0,1957 0,2276 0,1483 Valor de p 0,6746

Estatstica: teste do Qui-quadrado, sendo que valores de p<0,05 indicam diferena significativa entre os grupos. *Contagem de hemcias por campo no aumento de 40x G1: grupo 1 G2: grupo 2

110

TABELA 19 Relao do nmero de leuccitos no sedimento urinrio nos dois grupos e nvel de significncia. Dias 1 Caracterstica* 5-7 2-4 Raras Ausentes 5 3-5 Raras Ausentes 10 1-3 1 Raras Ausentes 15 15-18 Raras Ausentes G1 0 1 3 6 0 6 4 1 0 4 4 0 3 4 G2 1 0 4 5 1 5 2 0 1 2 5 1 3 4 0,6258 0,4354 0,4597 Valor de p 0,5253

Estatstica: teste de Qui-quadrado, sendo que valores de p<0,05 indicam diferena significativa entre os grupos. *Contagem de hemcias por campo no aumento de 40x G1: grupo 1 G2: grupo 2

Atravs dos dados referentes contagem de leuccitos no sedimento urinrio, podemos afirmar que a infeco do trato urinrio no foi um achado clnico relevante. Na anlise dos sedimentos urinrios no foi encontrado alterao com significncia estatstica, porm quando analisamos os dados separadamente verificamos que dois animais do G1 apresentaram cilindros hialinos na urina durante o tratamento. Esses cilindros ocorrem por um aumento na permeabilidade do glomrulo e precipitao de protenas nos tbulos renais, contudo foram encontrados em pouca quantidade e podem ser considerados referentes a alguma mudana na temperatura dos animais, como a febre, e por no estarem associados a outros achados clnicos no apresentam relevncia. Ainda na anlise do sedimento, observamos que dois animais do G1 e trs animais do G2 apresentaram cilindros granulosos na urina. Estes cilindros possuem significado clnico na identificao de leses renais, porm estas estruturas foram observadas em momentos diferentes do tratamento. Apenas um animal apresentou estes 111

cilindros no primeiro dia, demonstrando que apresentava leso renal e obteve melhora, no sendo mais identificado em outros exames e sem mais outros sinais associados. Um animal do G1 apresentou estes em dois momentos, no 5 e 10 dias de tratamento, porm no ltimo dia no foi mais identificada a estrutura. Ao mesmo tempo, um animal do G1 e um do G2 apresentaram os cilindros no 10 dia, sendo que no exame seguinte no apresentavam mais. E somente um animal do G2 apresentou os cilindros no ltimo dia de tratamento. Com estes dados podemos sugerir que a ribavirina por ser eliminada pelo rim pode levar a alterao no rgo. A presena de cristais est associada alterao no pH da urina e observamos que alguns animais apresentaram a formao de cristais em alguns momentos. Dois animais do G2 apresentaram a formao de cristais de fosfato triplo, um no 5 dia e outro no 10 dia, e esto relacionados com a alcalinizao da urina. Esta alcalinizao pode estar relacionada com a alimentao dos animais, que foi basicamente composta por arroz e carne, ou seja, no balanceada. Os cristais de oxalato de clcio, urato amorfo e de bilirrubina tambm foram observados, porm com menor incidncia. As colheitas de lquor foram realizadas em dois momentos, no primeiro dia que os animais chegaram ao Hospital Veterinrio e aps 15 dias de tratamento com a ribavirina e sua associao com DMSO. Quando analisamos as caractersticas do lquor podemos observar que apenas um animal do G1 no primeiro momento apresentou cor avermelhada do lquor, demonstrando que no houve diferena significativa entre os grupos e, a partir desse dados, podemos afirmar que no houve contaminao significativa das amostras no primeiro dia de colheita. J no segundo momento, aps 15 dias de tratamento, trs animais do G1 e um animal do G2 apresentaram mudanas na colorao, porm esses resultados no demonstraram nveis de significncia. A turbidez do lquor pode ser atribuda ao aumento da celularidade, geralmente com contagem superior a 500 clulas/L e ao aumento da protena. Na primeira colheita observamos que apenas um animal do G1 apresentou turbidez da amostra. E na segunda colheita, quatro animais apresentaram o lquor discretamente turvo, sendo que apenas um animal compe o G2. No entanto, estes resultados no apresentaram nvel de significncia. A densidade liqurica nas duas colheitas de todos os animais se manteve dentro dos padres normais e no apresentou diferena significativa. Da mesma forma, no

112

foram observadas alteraes no pH liqurico, que deve ser um valor prximo ao pH sanguneo, e estes variaram de 8 a 9, mantendo-se dentro dos valores normais. TABELA 20 Mdia, desvio padro e nvel de significncia dos valores de protena no lquor dos dois grupos. G1 Amostra 1 2 Mdia* 44,85 45,35 Desvio padro 27,66 25,92 Mdia* 40,09 40,98 G2 Desvio padro 26,25 24,55 Valor de p 0,6978 0,7512

Estatstica: teste t de Student, sendo que valores de p<0,05 indicam diferena significativa entre os grupos. *Dosagem mdia de protenas no lquor, em mg/dL Amostra 1: antes do tratamento Amostra 2: aps 15 dias de tratamento G1: grupo 1 G2: grupo 2

O resultado da dosagem de protena no lquor nos permite afirmar que os animais do G1 apresentavam valores mais altos, superiores aos valores normais. Estes resultados no apresentaram nvel de significncia, porm quando comparamos com os resultados de turbidez verificamos que os trs animais do G1, que apresentaram mudanas no aspecto do lquor, possuem aumento da dosagem de protena acima de 40 mg/dl. No entanto, o animal do G2 que apresentou turbidez do lquor obteve uma dosagem de 30 mg/dl de protena. Da mesma forma, observamos que animais que apresentavam nveis proteicos superiores a 40 mg/dl, no mostraram alteraes no aspecto do lquor, demonstrando que no h relao entre a dosagem de protena e a turbidez da amostra. Os nveis de glicose no lquor devem ser semelhantes, cerca de 70%, aos nveis encontrados no sangue. Os animais includos no experimento apresentaram dosagem normal entre 40 mg/dl e 80 mg/dl, e estes resultados no apresentaram diferenas significativas. O teste de Pandy um mtodo semi-quantitativo para detectar a presena de globulinas no lquor. Na primeira colheita apenas quatro animais apresentaram positividade neste teste, sendo trs animais do G1 e 1 do G2. Dos trs animais do G1 apenas um manteve a positividade deste teste na segunda colheita, porm como o teste medido por cruzes, observamos que este animal teve uma diminuio da turbidez produzida pelo reagente, o nmero de cruzes no primeiro momento era de trs e se reduziu para uma cruz na segunda amostra. 113

No G2 observamos que o animal que apresentava positividade na primeira amostra passou a no apresentar mais na segunda. No entanto, verificamos que outro animal apresentou positividade na segunda colheita. A contagem de hemcias no apresentou resultado significativo e clinicamente no apresenta importncia na referida enfermidade. A presena de hemcias no lquor pode ser considerada uma forma de contaminao da amostra no momento da colheita, da mesma forma que a colorao avermelhada observada. Entretanto, a contagem de clulas nucleadas de extremo valor para nosso estudo. Os nossos resultados no apresentaram diferenas significativas entre os dois grupos, porm observamos um aumento dessa contagem em todos os animais e nos dois momentos da anlise (Tabela 20). TABELA 21 Mdia, desvio padro e nvel de significncia da contagem de clulas nucleadas no lquor dos animais dos dois grupos. G1 Amostra 1 2 Mdia* 65,80 37,86 Desvio padro 62,71 36,13 Mdia* 65,00 19,00 G2 Desvio padro 87,51 20,76 Valor de p 0,9815 0,9999

Estatstica: teste t de Student, sendo que valores de p<0,05 indicam diferena significativa entre os grupos. *Media da contagem de clulas nucleadas/L Amostra 1: antes do tratamento Amostra 2: aps 15 dias de tratamento G1: grupo 1 G2: grupo 2

114

FIGURA 06 Representao grfica da contagem de clulas nucleadas no lquor nos dois grupos.

70

60 Clulas nucleadas/microlitro

50

40
G1 G2

30

20

10

0 1 Dias 15

*Media da contagem de clulas nucleadas/L G1: grupo 1 G2: grupo 2

A partir dos dados relacionados acima podemos observar que houve uma queda na contagem de clulas nucleadas entre a primeira e a segunda colheita, sendo que nos animais tratados com ribavirina em associao com o DMSO a diferena da contagem foi claramente evidente em relao ao G1, aps os 15 dias de tratamento. Apesar de encontrarmos turbidez no lquor de alguns animais, no foi encontrada nenhuma amostra com mais de 500 clulas/L que possa explicar a alterao no aspecto do fluido. Aps a contagem diferencial destas clulas nucleadas, verificamos que todos os animais apresentavam pleocitose linfoctica, sendo este um achado clnico caracterstico de doenas causadas por vrus, como a cinomose.

115

TABELA 22 Mdia, desvio padro e nvel de significncia da porcentagem de linfcitos no lquor dos animais dos dois grupos. G1 Amostra 1 2 Mdia* 69,20 82,57 Desvio padro 28,66 19,76 Mdia* 69,90 91,00 G2 Desvio padro 34,69 10,85 Valor de p 0,9613 0,3157

Estatstica: teste t de Student, sendo que valores de p<0,05 indicam diferena significativa entre os grupos. *Media da porcentagem de linfcitos em 50 clulas Amostra 1: antes do tratamento Amostra 2: aps 15 dias de tratamento G1: grupo 1 G2: grupo 2

FIGURA 07 Representao grfica da porcentagem de linfcitos no lquor nos dois grupos.

100

90 % linfcitos/50 clulas

80
G1 G2

70

60

50 1 Dias 15

*Media da porcentagem de linfcitos em 50 clulas G1: grupo 1 G2: grupo 2

Ao contrrio do que observamos com as clulas nucleadas, a porcentagem de linfcitos aumentou aps o tratamento com a ribavirina em associao com o DMSO. Apesar de no apresentar resultado estatstico significativo, a contagem de linfcitos 116

nos revelou que o processo imunolgico desencadeado pelo vrus da cinomose no cessou com a utilizao das drogas, como podemos verificar na Tabela 23. TABELA 23 Mediana e nvel de significncia da contagem diferencial de linfcitos no lquor dos animais dos dois grupos, nos diferentes momentos. Amostra 1 G1 Mediana* G2 Mediana* 31,42 22,54 Amostra 2 28,57 8,65 Valor de p 0,0313 0,3125

Estatstica: teste t de Student, sendo que valores de p<0,05 indicam diferena significativa entre os grupos. *Mediana da contagem diferencial de linfcitos em 50 clulas Amostra 1: antes do tratamento Amostra 2: aps 15 dias de tratamento G1: grupo 1 G2: grupo 2

Quando calculamos os valores absolutos dos linfcitos no lquor observamos que os dois grupos apresentaram uma queda nesta contagem. Apesar de encontrarmos uma diferena significativa no G1 (p=0,0313) entre as medianas desta contagem, observando os valores do G2 verificamos que esta queda foi mais acentudada. Da mesma forma que a contagem total de clulas nucleadas, as clulas mononucleares acompanharam essa queda aps o tratamento. No houve diferena significativa entre os grupos nos dois momentos de colheita.

6 Efeitos Colaterais
A partir das avaliaes clnicas dirias e os exames complementares verificamos algumas alteraes que sugerem efeitos colaterais do uso da ribavirina. No incio do tratamento observamos que os animais comearam a apresentar hiporexia ou anorexia durante o perodo de administrao da droga e alguns animais apresentaram vmitos espordicos. Estes sinais associados sensibilidade abdominal demonstraram que alguns animais desenvolveram uma gastrite com a administrao oral da ribavirina. No entanto, aps as nossas primeiras observaes frente a esses sinais, todos os animais que iniciavam o tratamento recebiam protetores de mucosa, como a ranitidina, diariamente at cessar a administrao da droga. Verificamos, desta forma, uma suavizao destes sinais de irritao gstrica.

117

Como foi relatado anteriormente, observamos uma queda de leuccitos acentuada prximo do 15 dia de administrao da droga. Essa imunossupresso foi comparada entre os grupos e no apresentou um nvel de significncia (p=0,5436). Com relao aos efeitos na medula ssea, utilizamos os dados dos hemogramas e foram analisados todos os tipos celulares, hemcias, plaquetas e leuccitos. Foi sugerido a partir da queda simultnea destas clulas que poderia haver comprometimento de medula ssea em um grau que no exerceu efeitos colaterais sobre a mesma e no comprometeu a sobrevida dos animais, mostrando ser uma ao transitria.

118

Discusso
119

Para compor os grupos experimentais, no houve distino de sexo e raa entre os animais selecionados. Os resultados de Headley & Graa (2000) demonstraram que no h diferena de susceptibilidade infeco pelo vrus da cinomose entre machos e fmeas. Da mesma forma, Corra & Corra (1992) afirma que a enfermidade no tem predileo por sexo ou raa. No entanto, alguns autores afirmam que raas braquioceflias apresentam menor prevalncia da doena, de mortalidade e de seqelas comparadas com as raas dolicoceflicas (HEADLEY & GRAA, 2000; GREENE, 2006). Com relao idade dos animais, alguns autores afirmam que a maior incidncia da cinomose coincide com a poca da diminuio da taxa de anticorpos maternos, entre 60 e 90 dias de idade (CORRA & CORRA, 1992). No entanto, Greene (2006) relata que animais com trs a seis meses de idade so mais susceptveis e Headley & Graa (2000) afirmam que a susceptibilidade maior em animais neonatos e jovens, porm todos os autores concordam com a maior incidncia quando h uma queda nos ttulos de anticorpos maternos. Por isso, somente inclumos no estudo animais com mais de dois meses de idade. Headley e Graa (2000) encontraram nos seus resultados 63% dos casos de encefalite pela cinomose em animais com menos de um ano e meio, sugerindo que os maiores ndices de mortalidade nesta forma acontece ao redor de um ano de idade. Concordando com esses dados, Silva et al. (2007) encontraram uma taxa de 49,5% dos casos com alteraes neurolgicas em animais com menos de um ano de idade, sendo que 48% dos animais com estes sinais estavam na faixa etria de um a nove anos de idade e 2,5% possuam mais de 10 anos. Em nossos resultados registrados na Tabela 01, os animais selecionados se encontravam dentro da faixa etria de maior incidncia da fase neurolgica citada pelos autores. Contudo, Corra & Corra (1992) quando descrevem as apresentaes clnicas da cinomose, afirmam que a encefalite do co velho comumente observada em animais com mais de seis anos de idade. No entanto, Greene (2006) relata que uma enfermidade rara, crnica, resultante da persistncia viral no SNC, acometendo apenas animais imunocompetentes. Por isso, no foram includos animais com mais de seis anos de idade no estudo. Atravs do estudo da patogenia da doena, verificamos que a infeco do tecido epitelial e SNC ocorrem no perodo de oito a nove dias ps-infeco e que no perodo de nove a 14 dias aps a disseminao nestes tecidos h produo de anticorpos contra o 120

vrus (GREENE, 2006). No entanto, Vandevelde & Zurbriggen (2005) afirmam que quando uma efetiva resposta imune antiviral neutralizante ausente na fase aguda da cinomose, anticorpos IgM anti-vrus aparecem nas duas primeiras semanas da infeco. Alm disso, alguns autores relatam que os anticorpos contra o vrus interagem com macrfagos infectados em leses no SNC, causando sua ativao com liberao de ROS. Esta atividade por sua vez pode levar destruio de oligodendrcitos e bainha de mielina (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006; STEIN et al., 2006). Portanto, no utilizamos animais com evoluo clnica neurolgica muito avanada com objetivo de minimizar esta influncia do sistema imune na progresso da enfermidade. Assim os animais foram selecionados no mximo com 10 dias de evoluo dos sinais nervosos, sendo que as mdias nos grupos foram de seis dias, sugerindo que os animais estavam na fase aguda da enfermidade. Para o diagnstico da cinomose podem ser empregadas as tcnicas de ELISA (LATHA et al., 2007), imunofluorescncia (MEGID et al, 2000) e RT-PCR (SAITO et al, 2000; GEBARA et al., 2004). Em virtude do custo, essas tcnicas so pouco utilizadas e chega-se na suspeita clnica baseando-se na histria, sintomatologia e achado hematolgico (SLVA et al., 2005; GREENE, 2006). Do mesmo modo descrito na literatura, os animais do experimento foram selecionados a partir de suspeitas clnicas. Todos os animais apresentavam histrico de contato com outros animais doentes, ou que tinham acesso rua, ou enfermidades com carter imunossupressor anteriormente. A maior parte dos animais, antes de chegar ao Hospital Veterinrio com sintomatologia neurolgica, apresentou sinais sistmicos da enfermidade. Alm da verificao do histrico clnico, foram avaliados com relao ao histrico vacinal, pois animais com vacinao correta no foram includos. Aps anlise dos sinais clnicos, somente foram includos os animais com sintomatologia nervosa, pois encontramos na literatura, que em regies endmicas, a principal suspeita para estes sinais deve ser cinomose (SAITO et al., 2005; MORETTI, et al., 2006; SILVA et al., 2007). Alm disso, utilizamos a reao de imunofluorescncia direta de esfregao sangneo como diagnstico final. Segundo Tipold et al. (1992), para um diagnstico conclusivo de cinomose, a imunofluorescncia direta de esfregaos e fludos corporais rotineiramente utilizada. Infelizmente, este mtodo s confirma cinomose at trs semanas aps a infeco, porque depois desse tempo o vrus desaparece dos tecidos epiteliais (JZWIK & FRYMUS, 2005). No entanto, Greene (2006) descreve que a tcnica requer equipamentos especiais e segundo o autor, o antgeno primeiramente 121

encontrado no sangue no perodo de dois a cinco dias aps a infeco e a tcnica de imunofluorescncia direta utilizando as amostras de esfregao conjuntival, lquor, ou sangue til no diagnstico na fase aguda da doena. Em nossos resultados pudemos observar que animais com tempo maior que cinco dias aps a infeco apresentaram resultados positivos na imunofluorescncia direta de esfregao sangneo. Verificamos que 70% dos animais do G1 e 80% dos animais do G2 apresentaram positividade neste mtodo, demonstrando que estavam na fase aguda da enfermidade e, provavelmente os animais negativos haviam ultrapassado esta fase, j que os sinais clnicos da doena eram patentes. Segundo alguns autores, a fase aguda da cinomose caracterizada por replicao viral intensa, causando os danos no SNC e no sistema imune (SUMMERS et al., 1995; MORO & VASCONCELOS, 1998; KUMAGAI et al., 2004; GREENE, 2006). No entanto, a imunofluorescncia direta de esfregao sangneo no deve ser considerada um mtodo de diagnstico ideal para este estudo, j que todos os animais apresentavam a fase neurolgica da cinomose e a amostra utilizada na reao foi o sangue. Todos os animais que mostraram negatividade no exame foram includos no experimento, j que apresentavam um histrico clnico e alteraes neurolgicas compatveis com cinomose. Segundo Elia et al. (2007) a ribavirina causa mutaes no vrus da cinomose que levam a um erro catastrfico na formao do genoma viral. Pode ser especulado que a ribavirina interfere com a RNA polimerase pela competio com nucleosdeos naturais e produz erro na terminao da cadeia de RNA do vrus. Alm disso, a ribavirina afeta o vrus ainda no meio extracelular, de maneira precoce no seu ciclo de replicao. Por isso, tentamos fazer com que a maior parte dos animais fosse includa nos grupos experimentais no momento ideal para a ao da droga. Quando correlacionamos os dados de animais que apresentam viremia, identificados pela imunofluorescncia direta (Tabela 03), e os dados de melhora clnica frente aos grupos experimentais (Tabela 04) observamos uma semelhana nos resultados, j que 70% dos animais do G1 e 80% dos animais do G2 alcanaram uma melhora clnica. Podemos sugerir que a ribavirina foi capaz de impedir a replicao viral no somente no SNC, mas tambm nas partculas virais encontradas ainda na circulao sangnea, impedindo a progresso da doena. No estudo de Elia et al. (2007) foi observado que a relao entre o efeito da droga e o tempo de exposio mostrou que a atividade antiviral em altas concentraes 122

ocorre no perodo de 24 horas. Entretanto, em baixas concentraes a eficcia da droga foi obtida aps 48 horas de exposio. Porm, este estudo refere-se eficcia da ribavirina frente ao vrus da cinomose in vitro. Quando analisamos a eficcia da ribavirina em animais naturalmente infectados com o vrus da cinomose, observamos uma melhora dos sinais na maior parte dos mesmos a partir do stimo dia de administrao da droga. Em nosso estudo foi realizada uma avaliao clnica diria permitindo identificar uma variao do estado clnico destes animais a partir do dcimo dia de administrao. Atravs destes dados podemos sugerir que o sistema imune pode influenciar no quadro geral do animal, com relao produo de ROS, citocinas e anticorpos anti-mielina conseqente ao viral, que tem incio ao redor de trs semanas ps-infeco (BRGE et al., 1989; TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; WNSCHMANN et al., 1999; GRNE et al., 2000; MARKUS et al., 2002; STEIN et al., 2004; GREENE, 2006; STEIN et al., 2006). Todos os vrus isolados pertencem a um mesmo sorotipo e as vrias amostras isoladas produzem enfermidades com durao e sinais clnicos distintos; algumas causam enfermidade de mediana patogenicidade, enquanto outras causam enfermidade aguda, altamente letal, com ou sem encefalite aguda, e outras, ainda, levam a encefalite tardia, aps uma enfermidade branda, ou mesmo aps a recuperao da fase aguda (CORRA & CORRA, 1992). Como em nosso estudo no foram identificadas as cepas virais e conhecendo as suas diferenas de patogenicidade, podemos sugerir que alguns animais no sobreviveram infeco, no por uma falha da ribavirina e sua associao com o DMSO, mas pela gravidade da enfermidade. Segundo Biazzono et al. (2001) vrios fatores interferem na qualidade e durao da resposta imune vacinao, como a amostra viral utilizada, a massa antignica ou o ttulo vacinal e o grau de atenuao do antgeno viral. Existem tambm os fatores relacionados ao prprio hospedeiro, como a variao individual na capacidade de resposta a uma mesma vacina, o estado nutricional, parasitismo, os estados de imunodeficincia de causa gentica ou no e fatores relacionados s condies ambientais. Concordando com os dados descritos pelos autores animais que receberam a vacina de forma correta no foram includos no nosso estudo, pois segundo eles as vacinas atuais so eficientes em induzir o estado de imunidade dos animais, protegendoos contra a infeco natural. 123

Contudo, em nosso estudo verificamos que no houve diferena entre os grupos tratados e o grupo controle com relao ao histrico vacinal e, no entanto, animais que no foram vacinados apresentaram ndices melhores de recuperao no tratamento experimental. Segundo Corra & Corra (1992), a cinomose na fase neurolgica progressiva, raramente estacionando, levando morte em curso agudo ou crnico, e sempre deixando seqelas que podem ser inabilitantes, quando eventualmente o animal sobreviva. Observamos em nosso estudo que a eficcia da ribavirina no foi influenciada pelo perodo de evoluo apresentado pelos animais ao incio do tratamento. Podemos sugerir que a ribavirina como forma de tratamento na fase neurolgica da cinomose, torna o prognstico da enfermidade mais favorvel. Tambm verificamos que nenhum dos animais tratados, cuja melhora do estado clnico foi evidente, apresentou seqelas incompatveis com a vida normal. No estudo de Silva et al. (2007) com 620 casos, a forma neurolgica da cinomose foi caracterizada por uma grande variedade de sinais, nas quais os ces apresentavam um nico sinal clnico ou uma combinao deles, sendo que este levantamento tambm foi realizado no atual estudo, concordando com estes dados. No entanto, os autores relataram que a mioclonia foi o achado mais comum em 38,4% dos animais, j em nosso experimento verificamos que no GC este sinal foi observado em 60% dos animais e em 70% dos animais do G2, porm em apenas 40% dos animais do G1. Com relao ao estudo de Silva et al. (2007) foram encontrados 2,1% dos casos com opisttono e 1,9% com tremores, entretanto, em nosso estudo verificamos que apenas um animal (10%) apresentava opisttono no G2 e que os tremores apresentaram maior relevncia, ocorrendo em 20% dos animais no GC, 40% no G1 e 80% no G2. Esta discrepncia de valores percentuais nos dois trabalhos pode ser explicada pelo tamanho amostral dos dois grupos experimentais. As disfunes motoras e posturais observadas por Silva et al. (2007) foram ataxia em 25%, paresias em 20,5% e desvio lateral da cabea em 1,9% dos animais. No nosso estudo, verificamos que 40% dos animais do GC apresentavam ataxia e 30% apresentaram paresias de membros. J nos grupos tratados observamos que 30% dos animais do G1 e 80% dos animais do G2 apresentaram ataxia, as paresias foram encontradas em 40% no G1 e 30% no G2, sendo que estes resultados no mostram discrepncia com relao ao estudo anterior. No caso de animais com desvio lateral de cabea, verificamos que no GC no foram includos animais com este sinal e no G1 e no 124

G2 encontramos 40% e 30%, respectivamente. Da mesma forma, sugerimos que as alteraes nos valores percentuais se do pela diferena no tamanho da amostra. Nos relatos de Silva et al. (2007) foram listadas outras manifestaes clnicas encontradas como ambulao ou andar em crculos, sonolncia, vocalizao, agressividade, inquietao, incapacidade de reconhecer os proprietrios, automutilao, sialorria, trismo mandibular, reteno ou incontinncia urinria, rigidez e atrofia musculares, presso da cabea contra objetos e disfagia. Em nossos resultados encontramos alguns sinais semelhantes aos citados pelos autores como andar em crculos, choro noturno, hiperexcitabilidade, sialorria, espasticidade e atrofia muscular. Outros sinais que no foram citados pelo referidos autores foram encontrados em nossos animais como alteraes em nervos cranianos, apatia, balano ou tremores de cabea, dficits de locomoo, estrabismo, fraqueza muscular, giro ortotnico do pescoo, hipermetria e nistagmo, sendo que estes sinais tambm foram relatados por outros autores (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Apesar da literatura descrever alteraes oculares e no trato ptico, observamos em nosso estudo uma baixa incidncia destas leses e sinais clnicos destas alteraes. Apenas dois animais dos grupos tratados apresentaram sinais de cegueira ou alteraes pupilares, como midrase, porm nestes casos observamos uma melhora no quadro clnico independente da associao com o DMSO, sendo que estes sinais estacionaram com o tratamento e os animais apresentaram seqelas. No que se refere s alteraes hematolgicas, a anemia pode ser atribuda ao aumento da destruio dos eritrcitos ou pela diminuio de sua produo. A destruio determinada pela presena do vrus no eritrcito ou pela deposio de imunocomplexos na membrana desta clula. A queda da produo pode ser atribuda falncia da medula ssea devido ao estresse desencadeado pela doena. Na maioria dos casos, os eritrcitos apresentam-se normocticos e normocrmicos e no h sinais de regenerao medular, como hemcias nucleadas, policromasia, anisocitose ou corpsculos de Howell-Jolly (SILVA et al., 2005). Silva et al. (2005) encontraram um ndice de 61% de casos com anemia. No entanto, Amude et al. (2007) observaram que apenas 12,5% dos animais com cinomose tinham anemia. Nos 20 animais includos em nossos estudos, 17 (85%) apresentavam um quadro de anemia. Concordando com os achados de Silva et al. (2005), os eritrcitos apresentaram-se normocticos e normocrmicos e no houve sinais de regenerao

125

medular, conclumos que nossos animais apresentavam uma alterao na medula ssea devido ao estresse desencadeado pela doena. Entretanto, verificamos que houve uma resposta ao incio do tratamento nos dois grupos no quarto dia de administrao da droga, porm os animais do G1 mantiveram uma mdia baixa da contagem de hemcias, demonstrando um quadro de anemia durante todo o perodo de tratamento. No G2 esta mdia mostrou-se melhor do quarto ao dcimo dia de tratamento, o que nos permite sugerir que o DMSO potencializou a ao da ribavirina ou minimizou possveis danos na medula ssea destes animais e nas membranas das hemcias. Segundo os autores, Hayden & Douglas (1990), a ribavirina sistmica causa uma anemia relacionada com a dose, por hemlise extravascular e, em altas doses, causa supresso de medula ssea com diminuio de elementos eritrides. Podemos sugerir a partir de nossos resultados que a ribavirina na dose de 30 mg/Kg, a cada 24 horas no perodo de 15 dias foi levemente txica medula de ces, porm sabemos que estes efeitos so reversveis quando cessa a administrao da droga. No entanto, Papich et al. (2003) afirmam no ter encontrado efeitos colaterais da ribavirina em ces, na dose de 60 mg/Kg durante duas semanas. Nestes achados hematolgicos podemos evidenciar duas caractersticas do DMSO. O composto potencializou a ao da ribavirina pela observao da suavizao do estresse da medula ssea no quarto dia de tratamento por uma diminuio do antgeno viral no organismo. O DMSO tem efeito sobre as membranas de hemcias como foi descrito por Santos et al. (2002), pois uma grande quantidade da droga dissolvida na membrana, direcionando as alteraes nas suas propriedades. Podemos afirmar tambm que este composto pode ter preservado os precursores eritrides amenizando os efeitos da ribavirina na medula ssea e levando os ndices menores de anemia no G2. Os resultados da dosagem de hemoglobina so compatveis com os achados de outros autores, quando afirmam que as hemcias de ces so mais resistentes a hemlise causada pela ribavirina. No nosso estudo a dosagem no decorrer do tratamento foi compatvel com os achados encontrados na contagem de hemcias, demonstrando que a anemia no causada por hemlise. A concentrao celular de ribavirina alcana nveis estveis em duas a trs semanas aps o incio do tratamento, quando ocorre a diminuio de hemoglobina. De forma interessante, as mudanas na concentrao de ribavirina celular so inversamente 126

proporcionais s alteraes nos nveis de hemoglobina (INOUE et al., 2004). Da mesma forma que observamos em nossos resultados, no 15 dia de administrao foi encontrada uma diferena significativa entre os dois grupos, a qual foi resultante de uma queda acentuada na concentrao globular de hemoglobina no G1. No entanto, podemos sugerir que o DMSO pode ter ajudado a diminuir essa alterao causada pela ribavirina no G2. possvel que este composto diminua a degradao da ribavirina pela adenosina-quinase dentro dos eritrcitos, impedindo o seu acmulo e posterior perda da hemoglobina. Esta sugesto pode ser feita a partir do estudo de Yoon et al. (2006), que mostrou que o DMSO possui efeitos variados na atividade de isoenzimas, sua presena nas reaes enzimticas produz efeitos inibitrios diretos no metabolismo mediado por estas. A afinidade relativa do DMSO com o substrato das enzimas pode ter um papel importante como conseqncia dessa interao. A mdia da contagem de plaquetas revelou uma leve trombocitopenia no primeiro dia, quando os animais ainda no haviam recebido o tratamento. Tipold et al. (1992) afirmam que a trombocitopenia um achado raro na cinomose e no estudo de Amude et al. (2007) no foram encontrados animais com esta alterao e, no entanto, Silva et al. (2005) afirmam que a trombocitopenia um achado freqente. Sabe-se, apenas, que para o gnero Morbillivirus j se observou aumento de anticorpos antiplaquetas. A trombocitopenia provavelmente do tipo imunomediada com remoo das plaquetas pelo sistema reticulo endotelial. Esta explicao tambm citada nos estudos de Rima & Duprex (2006) e concluiram que um achado transitrio que desaparece com trs a quatro semanas aps a infeco por Morbillivirus. Durante o perodo de tratamento no houve alteraes significativas na contagem de plaquetas, porm no ltimo dia de tratamento, o G2 revelou uma mdia mais baixa em relao ao G1, sendo que os dois grupos apresentaram uma leve trombocitopenia de significado irrelevante. O leucograma a caracterstica mais varivel com as contagens abrangendo leucopenia a leucocitose. Infeces bacterianas oportunistas no trato digestivo e respiratrio podem ser observadas e isso justifica a leucocitose por neutrofilia e o desvio a esquerda e neste mesmo estudo, os autores encontraram 46% de leucopenia, 8% de leucocitose por neutrofilia 54% de desvio a esquerda (SILVA et al., 2005). Em nossos resultados observamos que a mdia da contagem de leuccitos estavam dentro dos padres normais. Dos 20 animais includos no experimento, apenas 127

cinco (25%) deles apresentavam leucopenia, um (5%) apresentou leucocitose e 70% dos animais apresentavam valores normais na contagem de leuccitos. Desta forma, verificamos que os nossos resultados no eram concordes com os autores citados. Segundo Moro & Vasconcellos (1998) a infeco resulta em leucopenia devido linfopenia que se inicia uma semana aps a infeco e que pode persistir at a convalescncia. O animal com infeco persistente permanece com baixa contagem de leuccitos. A replicao do vrus nas clulas linfides seguida por um extenso perodo de imunossupresso e segundo Schobesberger et al. (2005) a queda significativa de linfcitos foi observada no perodo de trs dias aps a infeco, antes da viremia. Esta imunossupresso e funo imune anormal aumentam a susceptibilidade s infeces secundrias, que podem influenciar na letalidade da doena (HASS & BARRETT, 1996; KAJITA et al., 2006). No entanto, os resultados da mdia da contagem de leuccitos se mantiveram dentro dos valores normais durante o perodo de tratamento, contudo com uma queda no ltimo dia. Porm, no quarto dia de administrao da ribavirina verificamos uma diferena significativa entre os resultados do G1 e G2, mostrando que o grupo que recebeu a ribavirina associada com o DMSO obteve uma resposta imunolgica melhor do que os animais do G1, demonstrando potencializao da ao da ribavirina sobre o vrus. No estudo de Silva et al. (2005), em 85% dos casos de cinomose foi encontrada linfopenia. J no experimento de Amude et al. (2007) a alterao na contagem de linfcitos foi de 37,5% dos casos. Em nossos animais encontramos um ndice de 75% de linfopenia, concordando com os valores dos primeiros autores. Outros autores afirmam que a ribavirina tem efeito supressor de linfcitos e sugerem uma possvel toxicidade nestas clulas, principalmente em altas doses por via oral (HEAGY et al., 1991; BEAN, 1992). Em nosso estudo verificamos que a contagem total de leuccitos teve uma queda, que foi acompanhada de uma linfopenia acentuada no ltimo dia de administrao, concordando com Heagy et al. (1991) e Bean (1992), desta forma, podemos concluir que a dose da ribavirina foi alta o suficiente para causar uma possvel toxicidade nos linfcitos. Contudo, sabemos que os efeitos colaterais da droga so reversveis e mesmo no tendo acompanhado os animais aps este perodo, com base nos trabalhos existentes, aps cessar a administrao espera-se que a contagem destas clulas retorne 128

aos valores normais. Desta forma, sugerimos novos estudos que acompanhem os animais que receberam a ribavirina e apresentaram leucopenia com linfopenia por um perodo mais longo, aps cessar a administrao da droga. No entanto, podemos observar que a linfopenia no G1 foi persitente em todos os momentos, ao contrrio da encontrada no G2. Segundo Moro & Vasconcellos (1998) a linfopenia encontrada na cinomose causada por uma destruio de linfcitos devido replicao vrica no tecido linfide, o que tambm pode prejudicar a funo dos linfcitos ou de subpopulaes dos mesmos. Sendo este quadro importante na infeco pelo vrus da cinomose, observado linfopenia prolongada e depleo linfide sistmica. Desta forma, podemos concluir que a ribavirina quando associada ao DMSO apresentou melhor ao sobre o vrus, fazendo com que o organismo do animal responda na produo de resposta imune. Podemos sugerir que o DMSO seja responsvel por difundir a droga nos rgos linfides, impedindo a replicao viral e a depleo dos mesmos (Tabela 14). Nos estudos de Silva et al. (2005) foram encontrados 8% de animais que apresentavam leucocitose por neutrofilia. E Amude et al. (2007) verificou o ndice de 12,5% de neutrofilia. Em nosso estudo observamos uma freqncia de 10% de neutrofilia nos 20 animais, concordando com os dados dos dois autores. Quando observamos os dados de Amude et al. (2007) com relao ao ndice de neutropenia (12,5%), verificamos que a nossa incidncia foi maior com 20% dos casos. A anlise feita com as mdias de neutrfilos no mostrou nvel de significncia entre os grupos e a partir destas no foi observado neutrofilia ou neutropenia com base na estatstica. Porm, o que indica que a ribavirina no causou alteraes em neutrfilos. Da mesma forma, no observamos alteraes significativas no nmero de eosinfilos nos dois grupos. No entanto, encontramos valores mdios da contagem de moncitos aumentados com relao aos valores de referncia apenas no grupo que recebeu a ribavirina associada ao DMSO. Este aumento pode ser observado no quarto dia aps a administrao das drogas e se manteve at o dcimo dia. Sugere-se que esta monocitose pode ser considerada uma resposta da medula ssea, quando comparamos com as informaes anteriores, j que no h relatos de literatura sobre alteraes nestas clulas referente cinomose, ribavirina e DMSO.

129

No exame bioqumico de funo heptica e renal, os achados no so especficos para a infeco (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). E no nosso estudo no foram encontrados resultados com diferena estatstica entre os grupos experimentais. Os dados referentes aos valores mdios da dosagem de uria no soro sangneo foram levemente aumentados, podendo identificar um grau de desidratao no incio do tratamento. Porm, no 15 dia todos os animais apresentaram estes valores normalizados, demonstrando uma melhora clnica compatvel com o que foi verificado nas avaliaes dirias. As dosagens de creatinina mantiveram suas mdias dentro dos valores de referncia normais. Quando associamos estes dados bioqumicos com os dados da urinlise, em que observamos a presena de cilindros granulosos no sedimento urinrio e um aumento na dosagem de protena na urina, principalmente em animais do G2 e no 15 dia de tratamento, podemos afirmar que houve uma leve alterao renal sem maior importncia. Da mesma forma, as dosagens bioqumicas de funo heptica (ALT, FA e GGT) no apresentaram diferena estatstica entre os grupos, mantendo suas mdias dentro dos padres de referncia para ces, o que demonstra que a ribavirina e o DMSO no exerceram efeitos hepatotxicos, apesar de sabermos que a metabolizao destas ocorre no fgado, como descrito por Hayden & Douglas (1990) e Paes (1999), respectivamente. Apesar de encontrarmos valores alterados na dosagem de gamaglutamiltransferase (GGT) a partir do quinto dia de administrao das drogas no G2, podemos identificar fatores responsveis por este aumento, como a utilizao de anitimicrobianos. Neste grupo o medicamento mais utilizado foi o cloranfenicol que tambm possui metabolizao heptica. No entanto, estas alteres na funo heptica no mostraram significncia na clnica dos animais. Segundo Greene (2006), a elevao plasmtica das globulinas freqente em vrias reaes inflamatrias e, em particular, o componente alfa 2 aumenta significativamente nas infeces bacterianas e vricas, notadamente na cinomose. Os nossos resultados concordam com as informaes citadas pelo autor. Foi observado que houve uma queda nos valores de globulina no decorrer do tratamento, principalmente a partir do dcimo dia de administrao das drogas. Esta queda pode estar relacionada resposta do sistema imune por uma diminuio do antgeno viral,

130

identificando novamente a eficcia da ribavirina sobre a replicao do vrus da cinomose. A ribavirina administrada sistemicamente, em altas doses, pode causar efeitos indesejveis, como anemia por hemlise extravascular e aumento de bilirrubina no soro, os quais so reversveis quando cessada a administrao da droga (BEAN, 1992; TAKAHASHI et al., 1998; HOSOYA et al., 2001). Verificamos, em nosso estudo, que a bilirrubina total srica e suas fraes no apresentaram mdias alteradas com relao aos padres estabelecidos para ces, sendo este um achado importante que discorda da literatura existente, que se refere, principalmente, a utilizao da droga em humanos. Quando avaliamos os dados da urinlise associados s dosagens bioqumicas de bilirrubina, podemos afirmar que a ribavirina no causou hemlise extravascular em hemcias caninas, mesmo quando usamos a dose de 30 mg/Kg, a cada 24 horas durante um perodo de 15 dias. Contudo, as hemcias caninas demonstraram maior resistncia ao da ribavirina. Em relao aos dados de exames de lquor, a turbidez do mesmo ocorre geralmente devido a um aumento na celularidade da amostra, com presena de 500 ou mais clulas/L (FEITOSA et al., 1997b). Porm, segundo Cook & Denicola (1988), a mesma j pode ser observada em amostras contendo mais de 200 leuccitos/L. No estudo de Feitosa et al., (1997b) foram observadas duas amostras do grupo de animais com cinomose que possuam lquor discretamente turvo, sendo que um deles apresentava 400 leuccitos/L. Apesar de haver uma pleocitose no lquor dos dois animais, a turbidez no pode ser creditada exclusivamente a esse nmero de clulas, j que outros ces do mesmo grupo apresentavam amostras de lquor lmpido, com at 380 leuccitos/L. No nosso estudo observamos que apenas um animal do G1 apresentou turbidez da amostra e apresentava acima de 200 clulas/L. E na segunda colheita, quatro animais apresentaram o lquor discretamente turvo, sendo que apenas um animal compe o G2. Porm estes quatro animais no apresentaram celularidade acima de 100 leuccitos/L, concordando com os achados referentes a celularidade nos estudos de Feitosa et al. (1997b). Sendo que esta turbidez pode estar associada com a presena de hemcias, como foi encontrado em nosso estudo. Os quatro animais que apresentaram turbidez na segunda colheita, encontramos contagem de hemcias acima de 2.000 clulas/L. 131

De acordo com os resultados de Gama et al. (2005), no encontramos alteraes significativas em colorao, aspecto, densidade, pH e glicose. Entretanto, Feitosa et al. (1997b) afirmam que houve elevao da densidade do lquor em casos de pleocitose e de aumento dos nveis proticos, porm a avaliao da mesma insuficiente por si s para estabelecer o diagnstico de uma anormalidade. Segundo Greene (2006) a encefalomielite desmielinizante aguda e no inflamatria no causa alteraes no lquor de animais com cinomose. O aumento da protena e na celularidade so caractersticas das fases subagudas e crnicas. No entanto, o componente protico e a celularidade liqurica mostraram alteraes importantes na presena de sinais neurolgicos no estudo realizado por Gama et al. (2005). Feitosa et al. (1997b) concluiram em seus estudos que os altos nveis de protena (acima de 200 mg/dL) so encontrados em animais com uma porcentagem maior de plasmcitos no lquor, uma vez que todos os estudados se encontravam com alteraes neurolgicas h mais de 10 dias e sugerem que, alm da produo de anticorpos contra o vrus, a desmielinizao j estivesse ocorrendo por uma resposta imune e no por uma ao viral direta, levando tambm produo de anticorpos contra a bainha de mielina. Em funo dos resultados encontrados por eles, um lquor normal pode apresentar at 65 mg/dL de protenas. Entretanto, no nosso estudo foram includos animais com no mximo 10 dias de alteraes neurolgicas, discordando dos dados dos autores acima. No estudo observouse que poucos animais apresentaram taxas de protena acima de 65 mg/dL, fazendo com que as mdias destas dosagens ficassem abaixo deste valor. Contudo, alguns autores afirmam que no estgio crnico, com a inflamao ocorre aumento de protena (acima de 25 mg/dL), principalmente representado por IgG antivrus da cinomose (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GREENE, 2006). No estudo de Feitosa et al. (1997) tambm foi realizado o teste de Pandy, com objetivo de identificar a quantidade de globulinas, sendo que todos os animais portadores de cinomose apresentaram positividade neste teste, sendo possvel constatar que aqueles animais com nveis proticos totais elevados apresentavam tambm maior turbidez no teste e uma maior porcentagem de plasmcitos, sugerindo que o aumento dos nveis proticos ocorreu por uma produo local de anticorpos e no por uma leso na barreira hemato-enceflica. 132

Em nossos resultados podemos observar que houve um aumento da protena no lquor dos animais, porm apenas quatro animais apresentaram positividade neste teste, demonstrando que este aumento de protena acima de 25 mg/dL pode ter sido causado pela produo local de anticorpos conforme a literatura. Porm 10 animais apresentavam o aumento na dosagem de protena total, apresentando negatividade no teste de Pandy, demonstrando que pode haver um aumento sem que haja produo de anticorpos locais. Esta diferena encontrada no teste de Pandy pode estar relacionada com o tempo de evoluo, j que nossos animais apresentavam o tempo mximo de 10 dias de evoluo da doena, sendo a fase aguda da enfermidade, que ainda no h produo de anticorpos locais. No entanto, dos trs animais do G1, apenas um manteve a positividade na segunda colheita, sendo que houve diminuio da turbidez da reao, nos permitindo afirmar que houve diminuio da produo de anticorpos aps o incio do tratamento, com intervalo de 15 dias entre as colheitas. No G2 observamos que o animal que apresentava positividade na primeira amostra passou a no apresentar mais na segunda. E verificamos ainda que outro animal, mesmo recebendo a ribavirina associada com o DMSO, apresentou positividade na segunda colheita, desta forma, podemos afirmar que houve produo de anticorpos, nesse caso. A contagem de clulas nucleadas de extremo valor para nosso estudo. Os resultados no apresentaram diferenas significativas entre os dois grupos, porm observamos uma diminuio dessa contagem em todos os animais e nos dois momentos da anlise. Estes valores mdios da contagem de leuccitos foram comparados com os achados de Feitosa et al. (1997b), que afirmam a ocorrncia de pleocitose em amostras com mais de oito clulas/L. Estes autores encontraram no grupo de ces com cinomose uma pleocitose variando de 19 a 400 clulas/L. Em nosso estudo encontramos uma variao de duas a 265 clulas/L na primeira colheita, porm na segunda amostra verificamos uma variao de duas a 100 clulas/L. Nos relatos de Gama et al. (2005) foi observado que 50% dos animais infectados e com sintomatologia neurolgica apresentavam pleocitose, com mais de oito clulas/L. A ausncia de clulas no lquor, em ces com cinomose e sinais nervosos, est associada a estgios iniciais e agudos desta fase da referida enfermidade. Em nosso estudo encontramos 30% dos animais com valores normais desta contagem, porm verificando-se as mdias encontradas em cada grupo, podemos afirmar que os animais apresentavam pleocitose. 133

No entanto, quando avaliamos as amostras dos dois grupos, percebemos que houve uma queda nos valores mdios da contagem de clulas nucleadas entre a primeira e a segunda colheita, confirmando a diminuio da resposta imune no local, concordando com os dados do teste de Pandy com relao eficcia da ribavirina frente ao vrus da cinomose. Portanto, podemos afirmar tambm que o DMSO potencializou a penetrao do antiviral no SNC atravs dos resultados obtidos na anlise da contagem de clulas nucleadas, j que a diminuio desta foi claramente evidente quando analisamos graficamente (Figura 06). Em casos de cinomose a pleocitose ocorre predominantemente por um aumento de linfcitos, havendo tambm a presena de moncitos, macrfagos e raros neutrfilos (FEITOSA et al., 1997b). Concordando com os dados obtidos por estes autores, verificamos que todos os animais apresentavam pleocitose linfoctica, sendo que em nosso estudo comparamos os outros tipos celulares de forma agrupada. Ao contrrio do que encontramos nas clulas nucleadas, o percentual de linfcitos aumentou e, podemos afirmar que o ndice percentual das outras clulas mononucleares, conforme citadas na literatura, diminuiu. Segundo Feitosa et al. (1997b), no lquor de animais com cinomose foi possvel observar uma relao direta entre o nmero de plasmcitos e os nveis proticos. Esta relao tambm foi encontrada em nossos estudos quando comparamos a queda nos valores de clulas mononucleares, o componente protico e o teste de Pandy, sugerindo, desta forma que a produo local de anticorpos diminuiu aps o tratamento, sendo que a associao da ribavirina com o DMSO foi mais eficaz em impedir a replicao viral no SNC. Apesar da ausncia de manguitos perivasculares, numerosas clulas CD8+ so encontradas nas leses agudas desmielinizantes e tambm distribudas difusamente no parnquima cerebral, correlacionado de forma desigual com reas de infeco viral. No lquor destes animais altos ttulos de IL-8 foram encontrados, isto sugere que a ativao inicial das clulas da micrglia serve como uma alavanca para a invaso de clulas T no SNC (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). A partir destes relatos podemos afirmar que a presena de linfcitos no lquor, mesmo aps o tratamento, pode significar uma resposta a essa produo de citocinas, desencadeada na presena do antgeno viral, que induzem a migrao de mais clulas e podem manter a inflamao no SNC, resultando em resposta imuno-mediada, conforme descrito por Wnschmann et al. (1999) e Markus et al. (2002). Estas complicaes

134

imunolgicas podem ser responsveis pelo bito de alguns animais que no chegaram ao final do tratamento. No entanto, quando analisamos os valores absolutos de linfcitos, verificamos que houve uma diminuio desta contagem, porm no houve normalidade nestes valores. Estatisticamente, o G1 apresentou significncia entre as medianas, contudo o G2 demonstrou uma queda mais acentuda destes valores. O fato de no encontrarmos resultados estatsticos no grupo que recebeu a ribavirina associada ao DMSO pode ser referente a variabilidade de resultados encontrados neste grupo, j que utilizamos testes no paramtricos nesta anlise. Desta forma, podemos afirmar que a eficcia da ribavirina pode ter sido prejudicada pela ao do sistema imune e sugerimos novos estudos que utilizem a associao do antiviral com imunomoduladores, com objetivo de minimizar os efeitos deletrios do sistema imune no SNC. Alm dos efeitos colaterais encontrados nos exames hematolgicos, observamos atravs das avaliaes clnicas dirias que os animais comearam a apresentar hiporexia ou anorexia durante o perodo de administrao da droga e alguns animais apresentaram vmitos espordicos. Estes sinais demonstraram que a administrao oral da ribavirina pode levar a um quadro de irritao gstrica, podendo evoluir para gastrite. Segundo Hayden & Douglas (1990) outros efeitos colaterais podem ser encontrados, como pruridos, erupo cutnea aguda, nuseas, depresso, tosse e sintomas respiratrios em humanos. No entanto, em nosso estudo experimental, no observamos nenhum destes efeitos indesejveis relatados.

135

Concluses
136

Os resultados do presente estudo permitem concluir que: 1. A ribavirina demonstrou atividade efeitva contra o vrus da cinomose em animais na fase neurolgica, com melhora sensvel do quadro clnico. 2. O DMSO mostrou-se capaz de potencializar a ao antiviral da ribavirina, aumentando o seu poder de difuso tecidual, tornando sua ao mais eficaz frente ao vrus da cinomose. 3. Os efeitos colaterais encontrados pela utilizao da ribavirina foram: leve alterao em medula ssea observada pela anemia, imunossupresso expressa por linfopenia, branda leso renal e gastrite. 4. A ribavirina foi capaz de diminuir a expresso do antgeno viral com conseqente diminuio da produo de anticorpos no SNC, porm manteve uma pleocitose linfoctica no lquor. 5. A dose de 30 mg/Kg por via oral, a cada 24 horas, durante 15 dias foi eficaz contra a infeco viral. O monitoramento atravs de exames complementares deve ser realizado rotineiramente com intuito de acompanhar o surgimento de efeitos colaterais, mesmo que estes sejam reversveis com a suspenso do tratamento.

137

Referncias Bibliogrficas
138

AITA, K.; IRIE, H.; TANUMA, Y.; TOIDA, S.; OKUMA, Y.; MORI, S.; SHIGA, J. Apoptosis in murine lymphoid organs following intraperitoneal administration of dimethyl sulfoxide (DMSO). Experimental and Molecular Pathology, v. 79, p. 265-271, set. 2005. ALI, B. H. Dimethyl Sulfoxide: Recent pharmalogical and toxicological research. Veterinary and Human Toxicology, v. 43, n. 4, p. 228-231, ago. 2001. ALVES, C. M.; VASCONCELOS, A. C.; MARTINS, A. S.; PUERTO, H. L.; SANTOS, F. G. A.; NUNES, J. E. S.; CAMPOS, P. P.; MORO, L. Morphometric analysis of the thymus of pupies infected with the Snyder Hill strain of canine distemper virus. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia, v. 58, n. 4, p. 472-479, 2006. AMEMORI, S.; IWAKIRI, R.; ENDO, H.; OOTANI, A.; OGATA, S.; NODA, T.; TSUNADA, S.; SAKATA, H.; MATSUNAGA, H.; MIZUGUCHI, M.; IKEDA, Y. Oral dimethyl sulfoxide for systemic amyloidosis complication in chronic inflammatory disease: a retrospective patient chart review. Journal of Gastroenterology, v. 41, p. 444449, 2006. AMUDE, A. M.; ALFIERI, A. A.; ALFIERI, A. F. Clinicopathological findings in dogs with distemper encephalomyelitis presented without characteristic sings of the disease. Research in Veterinary Science, v. 82, p. 416-422, 2007. APPEL, M. J. G.; SUMMERS, B. A. Patogenicity of Morbilliviruses for terrestrial carnivores. Veterinary Microbiology, v. 44, p. 187-191, 1995. APPEL, M. J. G.; SUMMERS, B. A. Canine Distemper: Current Status. Disponvel em: www.ivis.org. 23/11/1999. BARRETT, T. Morbillivirus infections, with special emphasis on Morbillivirus of carnivores. Veterinary Microbiology, v. 69, p. 3-13, 1999. BAUMGRTNER, W.; BOYCE, R. W.; ALLDINGER, S.; AXTHELM, M. K.; WEISBRODE, S. E.; KRAKOWKA, S.; GAEDKE, K. Metaphyseal bone lesions in young dogs with systemic canine distemper virus infection. Veterinary Microbiology, v. 44, p. 201-209, 1995. BEAN, B. Antiviral therapy: current concepts and practices. Clinical Microbiology Reviews, v. 5, n. 2, p. 146-182, abr. 1992. BELLINI, W. J.; ENGLUND, G.; RICHARDSON, C. D.; ROZENBLATT, S.; LAZZARINI, R. A. Matrix genes of measles virus and canine distemper virus: cloning,

139

nucleotide sequences, and deduced amino acid sequences. Journal of Virology, v. 58, n. 2, p. 408-416, mai. 1986. BENGSTON, J. L.; BOVENG, P.; FRANZEN, U.; HAVE, P.; HEIDE JORGENSEN, M. P.; HRKNEN, T. J. Antibodies to canine distemper virus in Antartic seals. Marine mammal science, v. 71, p. 85-87, 1991. BERNARD, D. Viramidine (Ribapharm). Current Opinion in Investigational Drugs, v. 3, p. 1585-1589, 2002. BIAZZONO, L.; HAGIWARA, M. K.; CORRA, A. R. Avaliao da resposta imune humoral em ces jovens imunizados contra a cinomose com vacina de vrus atenuado. Brazilian journal of veterinary research and animal science, v. 38, n. 5, p. 245-250, 2001. BEAN, B. Antiviral therapy: current concepts and practices. Clinical Microbiology Reviews, v. 5, n. 2, p. 146-182, abr. 1992. BHM, M. et al. Serum antibody titers to canine parvovirus, adenovirus and distemper virus in dog in the UK wich had not been vaccinated for at least three years. Veterinary Record, v. 154, p. 457-463, 2004. BRAYTON, C. F. Dimethyl Sulfoxide (DMSO): A Review. Cornell veterinarian, v. 76, p. 61-90, 1986. BINK, L. E. S.; TRAMPER, J.; LUYBEN, K. Ch. A. M.; VANT RIET, K. Biocatalysis in organic media. Enzyme and Microbial Technology, v. 10, n. 12, p. 736-743, 1988. BROWNE, M. J. Mechanism and specificity of action of ribavirin. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 15, n. 6, p. 747-753, jun. 1978. BRGE, T.; GRIOT, C.; VANDEVELDE, M.; PETERHANS, E. Antiviral antibodies stimulate production of reactive oxygen species in cultured canine brain cells infected with canine distemper virus. Journal of Virology, v. 63, n. 6, p. 2790-2797, jun. 1989. CASTILHO, J. G.; BRANDO, P. E.; CARNIELI JR., P.; OLIVEIRA, R. N.; MACEDO, C. I.; PEIXOTO, Z. M. P.; CARRIERI, M. L.; KOTAIT, I. Molecular analysis of the N gene of canine distemper virus in dogs in Brazil. Arquivo brasileiro de medicina veterinaria e zootecnia, v. 59, n. 3, p. 654-659, 2007. CAMICI, G. G.; STEFFEL, J.; AKHMEDOV, A.; SCHAFER, N.; BALDINGER, J.; SCHULZ, U.; SHOJAATI, K.; MATTER, C. M.; YANG, Z.; LSCHER, T. F.; TANNER, F. C. Dimethyl Sulfoxide Inhibits Tissue Factor Expression, thrombus formation, and vascular smooth muscle cell activation: a potential treatment strategy for drug-eluting stents. Circulation, v. 114, p. 1512-1521, 2006. 140

CAVALETTI, G.; OGGIONI, N.; SALA, F.; PEZZONI, G.; CAVALETTI, E.; MARMIROLI, P.; PETRUCCIOLI, M. G.; FRATTOLA, L.; TREDICI, G. Effect on the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathologycal study. Toxicology Letters, v. 118, p. 103-107, 2000. CHANG, T.; HEEL, R. C. Ribavirin and Inosiplex: A review of their present status in viral diseases. Drug, v. 22, p. 111-128, 1981. CHAPPUIS, G. Control of canine distemper. Veterinary Microbiology, v. 44, p. 351358, 1995. CHERPILLOD, P.; TIPOLD, A.; GRIOT-WENK, M.; CARDOZO, C.; SCHMID, I.; FATZER, R.; SCHOBESBERGER, M.; ZURBRIGGEN, R.; BRUKNER, L.; ROCH, F.; VANDEVELDE, M.; WITTEK, R.; ZURBRIGGEN, A. DNA vaccine encoding nucleocapsid and surface proteins of wild type canine distemper virus protects its natural host against distemper. Vaccine, v. 18, n. 26, p. 2927-2936, jul. 2000. CHO, H. S.; PARK, N. Y. Detection of canine distemper virus in blood samples by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of veterinary medicine, v. 52, p. 410-413, 2005. COCHRAN, T.; STEFANKO, J.; MOORE, C. et al. Dimethyl Sulfoxide protection against gastric stress ulceration. Current Surgery, v. 40, p. 435-437, 1983. COOK, J. R.; DENICOLA, D. B. Cerebrospinal fluid. Veterinary Clinics of North Amrica Small Animal Pratice, v. 18, n. 3, p. 475-499, 1988. CORRA, C. N. M. Cinomose. In: CORRA, W. M.; CORRA, C. N. M. (Eds). Enfermidades Infecciosas dos Mamferos Domsticos. Rio de Janeiro: Medsi, 1992. p. 655-670. CROTTY, S.; CAMERON, C. E.; ANDINO, R. RNA virus error catastrophe: direct molecular test by using ribavirin. PNAS, v. 98, n. 12, p. 6895-6900, jun. 2001. DAHL, L.; JENSEN, T. H.; GOTTSCHALCK, E.; KARLSKOV-MORTENSEN, P.; JENSEN, T. D.; NIELSEN L.; ANDERSEN, M. K.; BUCKLAND, R.; WILD, T. F.; BLIXENKRONE-MOLLER, M. Immunization with plasmid DNA encoding the hemagglutinin and the nucleoprotein confers robust protection against a lethal canine distemper virus challenge. Vaccine, v. 22, p. 3642-3648, 2004. DAMIN, M.; MORALES, E.; SALAS, G.; TRIGO, F. J. Immunohistochemical detection of antigens of distemper, adenovirus and parainfluenza viruses in domestic dogs with pneumonia. Journal of comparative pathology, v. 133, p. 289-293, 2005. 141

DAVIS, J.; ROWLEY, S. D.; SANTOS, G. M. Toxicity of autologus bone marrow graft infusion. Progress in Clinical and Biological Research, v. 333, p. 531-540, 1991. ELIA, G.; BELLOLI, C.; CIRONE, F.; LUCENTE, M. S.; CARUSO, M.; MARTELLA, V.; DECARO, N.; BUONAVOGLIA, C.; ORMAS, P. In vitro efficacy of ribavirin against canine distemper virus. Antiviral Research, 2007. Disponvel em: < http://www.siencedirect.com.html >. Acesso em: dezembro, 2007. FEITOSA, M. M.; FEITOSA, F. L. F.; KOHAYAGAWA, A.; CURI, P. R.; MOGAMI, S. R. K. Avaliao fsica, citolgica, contedo de protenas e determinao qualitativa de globulinas do lquor de ces normais e de ces com encefalite por cinomose. Brazilian journal of veterinary research and animal science, v. 34, n. 3, p. 147-151, 1997b. FEITOSA, M. M.; KOHAYAGAWA, A.; FEITOSA, F. L. F.; CURI, P. R.; MOGAMI, S. R. K. Avaliao bioqumica do lquido cefalorraquidiano de ces normais e de ces jovens portadores de encefalite por cinomose. Brazilian journal of veterinary research and animal science, v. 34, n. 2, p. 99-102, 1997a. FARKAS, E.; INSTITRIS, A.; DOMOKI, F.; MIHLY, A.; LUITEN, P. G. M.; BARI, F. Diazoxide and dimethyl sulphoxide prevent cerebral hypoperfusion-related learning dysfunction and brain damage after carotid artery occlusion. Brain Research, v. 1008, p. 252-260, 2004. FERRARA, E. A.; OISHI, J. S.; WANNEMACHER, R. W.; STEPHEN, E. L. Plasma disappearance, urine excretion, and tissue distribuition of ribavirin in rats and rhesus monkeys. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 19, n. 6, p. 1042-1049, jun. 1981. FORSYTH, M.; KENNEDY, S.; WILSON, S.; EYBATOV, T.; BARRETT, T. Canine distemper in Capsian seal. Veterinary Record, 1998. FRISK, A. L.; KNIG, M.; MORITZ, A.; BAUMGRTNER, W. Detection of canine distemper virus nucleoprotein RNA by reverse transcription-PCR using serum, whole blood, and cerebrospinal fluid from dogs with distemper. Journal of Clinical Microbiology, v. 37, n. 11, p. 3634-3643, nov. 1999. GAMA, F. G. V.; NISHIMORI, C. T.; SOBREIRA, M. R.; SANTANA, A. E. Caracteres fsico-qumicos e citolgicos do lquor de ces em diferentes fases da cinomose. Cincia Rural, v. 35, n. 3, p. 596-601, mai./jun. 2005. GEBARA, C. M. S.; WOSIACKI, S. R.; NEGRO, F. J.; ALFIERI, A. A.; ALFIERI, A. F. Leses histolgicas no sistema nervoso central de ces com encefalite e

142

diagnstico molecular da infeco pelo vrus da cinomose canina. Arquivo brasileiro de medicina veterinaria e zootecnia, v. 56, n. 2, p. 168-174, 2004. GILBERT, B. E.; KNIGHT, V. Biochemistry and clinical applications of ribavirin. Animicrobial agents and chemotherapy, v. 30, n. 2, p. 201-205, ago. 1986. GILBERT, B. E.; WYDE, P. R. Pharmacokinetics of ribavirina aerosol in mice. Antimicrobial Agents and Chemoterapy, v. 32, n. 2, p. 117-121, 1988. GRACHEV, M. A.; KUMAREV, V. P.; MAMEV, L. V.; ZORIN, V. L.; BARANOVA, L. V.; DENIKINA, N. N.; BELIKOV, S. I.; PETROV, S. I.; PETROV, E. A.; KOLESNIK, V. S.; KOLESNIK, R. S.; DOREFUV, V. M.; BEIM, A. M.; KUDELIN, V. N.; MAGIEVA, F. G.; SIDOROV, V. N. Distemper vrus in Baikal seals. Nature, v. 338, p. 209, 1989. GRANCHER, N.; VERNARD, V.; KEDZIEREWICZ, F.; AMMERLAAN, W.; FINANCE, C.; MULLER, C. P.; FAOU, A. Le. Improved antiviral activity in vitro of ribavirin against measles virus after complexation with cyclodexins. Antiviral Research, v. 62, p. 135-137, 2004. GREENE, C. E.; APPEL, M. J. Canine Distemper. In: GREENE, C. E. (Eds.) Infectious Disease of the Dog and Cat. Philadelphia: Saunders, 2006. p. 25-41. GRNE, A.; ALLDINGER, S.; BAUMGRTNER, W. Interleukin-1, -6, -12 and tumor necrosis factor- expression in brains of dogs with canine distemper virus infection. Journal of Neuroimmunology, v. 110, p. 20-30, 2000. HAAS, L.; BARRETT, T. Rinderpest and other animal morbilivirus infections: comparative aspects and recent developments. Journal of veterinary medicine, v. 43, p. 411-420, 1996. HEAGY, W.; CRUMPACKER, C.; LOPEZ, P. A.; FINBERG,R. W. Inhibition of immune functions by antiviral drugs. Journal of clinical investigation, v. 87, p. 19161924, jun. 1991. HAYDEN, F. G.; DOUGLAS, R. G. JR. Antiviral Agents. In: MANDELL, G. L.; DOUGLAS, R. G. JR; BENNETT, J. E. (Eds). Principles and Pratice of Infectious Disease. New York: Churchill Livingestone, 1990. p. 370-393. HEADLEY, S. A.; GRAA, D. L. Canine distemper: epidemiological findings of 250 cases. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 37, n. 2, 2000. HIRAMA, K.; TOGASHI, K.; WAKASA, C.; YONEDA, M.; NISHI, T.; ENDO, Y.; MIURA, R.; TSUKIYAMA-KOHARA, K.; KAI, C. Cytotoxic T-lymphocyte activity

143

specif for hemagglutinin (H) protein of canine distemper vrus in dogs. The Journal of veterinary medical science, v. 65, n. 1, p. 109-112, 2003. HOMMA, M.; JAYEWARDENE, A. L.; GAMBERTOGLIO, J.; AWEEKA, F. Highperformance liquid chromatographic determination of ribavirin in whole blood to assess disposition in erytrocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 43, n. 11, p. 2716-2719, nov. 1999. HOSOYA, M.; SHIGETA, S.; NAKAMURA, K.; CLERCQ, E. De. Inhibitory effect of selected antiviral compounds on measles (SSPE) virus replication in vitro. Antiviral Research, v. 12, p. 87-97, 1989. HOSOYA, M.; SHIGETA, S.; MORI, S.; TOMODA, A.; SHIRAISHI, S.; MIIKE, T.; SUZUKI, H. High-dose intravenous ribavirin therapy for subacute sclerosing panencephalitis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 45, n. 3, p. 943-945, mar. 2001. IMAGAWA, D. T.; GORET, P.; ADAMS, J. M. Immunological relationships of measles, distemper, and rinderpest viruses. Pathology, v. 46, p. 1119-1123, jun. 1960. IMHOFF, H.; VON MESSLING, V.; HERRLER, G.; HAAS, L. Canine distemper virus infection requires cholesterol in the viral envelope. Journal of Virology, v. 81, n. 8, p. 4158-4165, abr. 2007. INOUE, Y.; HOMMA, M.; MATSUZAKI, Y.; SHIBATA, M.; MATSUMURA, T.; ITO, T.; MITAMURA, K.; TANAKA, N.; KOHDA, Y. Liquid Chromatography assay for routine monitoring of cellular ribavirin levels in blood. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 48, n. 10, p. 3813-3816, out. 2004. IWATSUKI, K.; MIYASHITA, N.; YOSHIDA, E.; GEMMA, T.; SHIN, Y. S.; HIRAYAMA, N.; KAI, C.; MIKAMI, T. Molecular and phylogenetic analyses of the haemagglutinin (H) proteins of field isolates of canine distemper virus from naturally infected dogs. Journal of general virology, v. 78, p. 373-380, fev. 1997. IWATSUKI, K.; TOKIYOSHI, S.; HIRAYAMA, N.; NAKAMURA, K.; OHASHI, K.; WAKASA, C.; MIKAMI, T.; KAI, C. Antigenic differences in the H proteins of canine distemper virus. Veterinary Microbiology, v. 71, p. 281-286, 2000. JEULIN, H.; GRANCHER, N.; KEDZIEREWICZ, F.; FAOU, A. E.; VENARD, V. Evaluation by Q-RTPCR of the efficacy of ribavirin complexed with beta-cyclodexin against measles virus in a mouse encephalitis model. Pathologie Biologie, v. 54, p. 541544, 2006.

144

JONES, T. C., HUNT, R. D., KING, N. W. Patologia Veterinria. So Paulo: Manole, 2000. p. 1415. JZWIK, A.; FRYMUS, T. Comparison of the immunofluorescence assay with RTPCR and Nested PCR in the diagnosis of canine distemper. Veterinary Research Communications, v. 29, p. 347-359, 2005. LAN, N. T.; YAMAGUCHI, R.; INOMATA, A.; FURUYA, Y.; UCHIDA, K.; SUGANO, S.; TATEYAMA, S. Comparative analyses of canine distemper viral isolates from clinical cases of canine distemper in vaccinated dogs. Veterinary Microbiology, v. 115, p. 32-42, 2006. LARSSON, A.; STENBERG, K.; BERG, B. Reversible Inhibition of cellular metabolism by ribavirin. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 13, n. 2, p. 154158, fev. 1978. LATHA, D.; GEETHA, M.; RAMADASS, P.; NARAYANAN, R. B. Development of recombinant nucleocapsid protein based IgM-ElISA for the early detection of distemper infections in dogs. Veterinary Immunology and Immunopathology, v. 119, p. 278-286, 2007. LEEKUMJORN, S.; SUM, A. K. Molecular study of the diffusional process of DMSO in double lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1758, p. 1751-1758, 2006. LEYSSEN, P.; BALZARINI, J.; CLERCQ, E.; NEYTS, J. The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flavivirus and paramyxovirus is mediated by inhibition of IMP deydrogenase. Journal of Virology, v. 79, n. 3, p. 1943-1947, fev. 2005. LIANG, C. T.; CHUEH, L. L.; PANG, V. F.; ZHUO, Y. X.; LIANG, S. C.; YU, C. K.; CHIANG, H.; LEE, C. C.; LIU, C. H. A non-biotin polymerized Horseradishperoxidase method for the immunohistochemical diagnosis of canine distemper. Journal of comparative pathology, v. 136, p. 57-64, 2007. LIN, C.; YEH, L.; LUU, T.; LOURENCO, D.; LAU, J. Y. N. Pharmacokinetics and metabolism of [14C] ribavirin in rats and Cynomologus monkeys. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 47, n. 4, p. 1395-1398, abr. 2003. LIND, R. C.; BEGAY, C. K.; GANDOLFI, J. Hepatoprotection by Dimethyl Sulfoxide. Toxicology and Apllied Pharmacology, v. 166, p. 145-150, 2000. LU, D.; MATTSON, M. P. Dimethyl sulfoxide suppresses NMDA- and AMPAinduced ion currents and calcium influx and protects against excitotoxic death in hippocampal neurons. Experimental neurology, v. 170, p. 180-185, 2001. 145

LYONS, C.; WELSH, M. J.; THORSEN, J.; RONAL, K.; RIMA, B. K. Canine distemper virus isolated from a captive seal. Veterinary record, v. 132, p. 487-488, 1993. KAJITA, M.; KATAYAMA, H.; MURATA, T.; KAI, C.; HORI, M.; OZAKI, H. Canine distemper virus induce apoptosis through caspase-3 and -8 activation in vero cells. Journal of veterinary medicine, v. 53, p. 273-277, 2006. KIM, D.; JEOUNG, S. Y.; AHN, S. J.; LEE, J. H.; PAK, S.; KWON, H. M. Comparison of tissue and fluid samples for the early detection of canine distemper virus in experimentally infected dogs. The Journal of veterinary medical science, v. 68, n. 8, p. 877-879, 2006. KISHIOKA, T.; IIDA, C.; FUJII, K.; NAGAE, R.; ONISHI, Y.; ICHI, I.; KOJO, S. Effect of dimethyl sulphoxide on oxidative stress, activation of mitogen actived protein kinase and necrosis caused by thioacetamide in the rat liver. European Journal of Pharmacology, v. 564, p. 190-195, 2007. KRAKOWAKA, S.; McCULLOUGH, B.; KOESTNER, A.; OLSEN, R. Myelinspecific autoantibodies associated with central nervous system demyelination in canine distemper virus infection. Infection and immunity, v. 8, n. 5, p. 819-827, nov. 1973. KUMAGAI, K.; YAMAGUCHI, R.; UCHIDA, K.; TATEYAMA, S. Lymphoid apoptosis in acute canine distemper. The Journal of veterinary medical science, v. 66, n. 2, p. 175-181, 2004. KHUTH, S.; AKAOKA, H.; PAGENSTECHER, A.; VERLAETEN, O.; BELIN, M., GIRAUDON, P.; BERNARD, A. Morbillivirus infections of the mouse central nervous system induces region-specific upregulation of MMPs and TIMPs correlated to inflammatory cytokine expression. Journal of Virology, v. 75, n. 17, p. 8268-8282, set. 2001. MARKUS, S.; FAILING, K.; BAUMGRTNER, W. Increase expression of proinflammatory cytokines and lack of up-regulation of anti-inflammatory cytokines in early distemper CNS lesions. Journal of Neuroimmunology, v. 125, p. 30-41, 2002. MARTELLA, V.; ELIA, G.; LUCENTE, M. S.; DECARO, N.; LORUSSO, E.; BANYAI, K.; MOLLER, M. B.; LAN, N. T.; YAMAGUCHI, R.; CIRONE, F.; CARMICHAEL, L. E.; BUONAVOGLIA, C. Genotyping canine distemper virus (CDV) by a hemi-nested multiplex PCR provides a rapid approach for investigation of CDV outbreaks. Veterinary Microbiology, v. 122, p. 32-42, 2007.

146

MEERTENS,

N.;

STOFFEL,

M.

H.;

CHERPILLOD,

P.;

WITTEK,

R.;

VANDEVELDE, M.; ZURBRIGGEN, A. Mechanism of reduction of virus release and cell-cell fusion in persistent canine distemper virus infection. Acta Neuropathologica, v. 106, p. 303-310, 2003. MEGID, J.; NOZAKI, C. N.; FILHO, O. A.; et al. Positividade a imunofluorescncia direta (IFD) em diferentes tecidos de ces clinicamente suspeitos de cinomose. Revista Brasileira de Cincia Veterinria, v. 7, p. 114, 2000. MIAO, Q.; BAUMGRTNER, W.; FAILING, K.; ALLDINGER, S. Phase-dependent expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in demyelinating canine distemper encephalitis. Acta Neuropathologica, v. 106, p. 486-494, 2003. MOCHIZUKI, M.; MOTOYOSHI, M.; MAEDA, K.; KAI, K. Complement-mediated neutralization of canine distemper virus in vitro: cross-reaction between vaccine Onderstepoort jul. 2002. MORETTI, L. A.; DA SILVA, A. V.; RIBEIRO, M. G.; PAES, A. C.; LANGONI, H. Toxoplasma gondii genotyping in a dog co-infected with distemper virus and ehrlichiosis rickettsia. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, v. 48, n. 6, p. 359-363, nov./dez. 2006. MORO, L.; MARTINS, A. S.; ALVES, C. M.; SANTOS, F. G. A.; DEL PUERTO, H. L.; VASCONCELOS, A. C. Apoptosis in the Cerebellum of dogs with distemper. Journal of veterinary medicine, v. 50, p. 221-225, 2003. MORO, L.; VASCONCELOS, A. C. Patogenia da imunossupresso na cinomose canina. A Hora Veterinria, v. 17 n. 102, p. 53-57, mar./abr. 1998. MUELLER, L. P.; THEURICH, S.; CHRISTOPEIT, M.; GROTHE, W.; MUETHERIG, A.; WEBER, T.; GUENTHER, S.; BEHRE, G. Neurotoxicity upon infusion of dimethylsulfoxide-cryopreserved peripheral blood stem cells in patients with and without pre-existing cerebral disease. Journal Compilation, v. 78, p. 527-531, 2007. MYERS, D. L.; ZURBRIGGEN, A.; LUTZ, H.; POSPISHIL, A. Distemper: not a new disease in lions and tigres. Clinical and diagnostic laboratory immunology., v. 4, p. 180-184, 1997. NAGEL, S.; GENIUS, J.; HEILAND, S.; HORSTMANN, S.; GARDNER, H.; WAGNER, S. Diphenyleneiodonium and dimethylsulfoxide for treatment of and field KDK-1 strains with different hemagglutinin gene characteristics. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, v. 9, n. 4, p. 921-924,

147

reperfusion injury in cerebral ischemia of the rat. Brain Research, v. 1132, p. 210-217, 2007. NEGRO, F. J.; WOSIACKI, S. H.; ALFIERI, A. A.; ALFIERI, A. F. Perfil de restrio de um fragmento do gene da hemagglutinina amplificado pela RT-PCR a partir de estripes vacinais e selvagens do vrus da cinomose canina. Arquivo brasileiro de medicina veterinaria e zootecnia, v. 58, n. 6, p. 1099-1106, 2006. NEUWLT, E. A.; BARNETT, P.; BARRANGER, J.; McCORMICK, C.; PAGEL, M.; FRENKEL, E. Inability of dimethyl sulfoxide and 5-fluorouracil to open the bloodbrain barrier. Neurosurgery, v. 12, p. 29-34, 1983. PAES, A. C. Estudo da Potencializao da Ao Teraputica da Isoniazida pelo Dimetil-Sulfxido (DMSO) no Tratamento de Hamsters (Mesocricetus auratus) Experimentalmente Infectados com Mycobacterium bovis (Cepa AN5). 1999. Dissertao (Doutorado) Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade de So Paulo. PAPICH, M. G., HEIT, M. C., RIVIERE, J. E. Frmacos Antifngicos e Antivirais. In: ADAMS, H. R. (8 Eds). Farmacologia e Teraputica em Veterinria. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan S.A., 2003. p. 767-790. PARDRIDGE, W. M. Blood-brain barrier drug targeting: the future of brain drug development. Molecular Interventions, v. 3, n. 2, p. 90-105, 2003. PASTN, R. P.; GALERO, E. M.; SICILIANO, L. G.; LARA, I. C.; CEVALLOS, G. C. Effects of dimethylsulphoxide on mice arsenite-induced dysmorphogenesis in embryo culture and cytotoxicity in embryo cells. Toxicology Letters, v. 161, p. 167-173, 2006. PELLEGRINO, F. C.; SURANITI, A.; GARIBALDI, L. Sndromes Neurolgicas em ces e gatos. So Caetano do Sul: Interbooks, 2003. p. 376. PLATTET, P.; RIVALS, J. P.; ZUBER, B.; BRUNNER, J. M.; ZURBRIGGEN, A.; WITTEK, R. The fusion protein of wild-type canine distemper virus is a major determinant of persistent infection. Virology, v. 337, p. 312-326, mai. 2005. PRESTON, S. L.; DRUSANO, G. L.; GLUE, P.; NASH, J.;GUPTA, S. K.; McNAMARA, P. Pharmacokinects and absolute bioavailability of ribavirin in healthy volunteers as determined by stable-isotope methodology. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 43, n. 10, p. 2451-2456, out. 1999. RANDHAWA, M. A. The effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the growth of dermatophytes. Japonese Journal of Medical Mycology, v. 47, p. 313-318, 2006. 148

REHAN, M.; YOUNUS, H. Effects of organic solvents on the conformation and interaction of catalase and anticatalase antibodies. International Journal of Biological Macromolecules, v. 38, p. 289-295, 2006. RIMA, B. K.; DUPREX, W. P. Morbilivirus and human disease. Journal of Pathology, v. 208, p. 199-214, 2006. ROSENBERG, G. A.; ESTRADA, E. Y.; MOBASHERY, S. Effect of synthetic matrix metalloproteinase inhibitors on lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier opening in rodents: differences in response based on strains and solvents. Brain Research, v. 1133, p. 186-192, 2007. RUDD, P. A.; CATTANEO, R.; VON MESSLING, V. Canine distemper virus uses both the anterograde and the hematogenous pathway for neuroinvasion. Journal of Virology, v. 80, n. 19, p. 9361-9370, out. 2006. SAITO, H.; MASUDA, M.; MIURA, R.; YONEDA, M.; KAI, C. Morbillivirus nucleoprotein possesses a novel nuclear localization signal and a CRM1-independent nuclear export signal. Virology, v. 352, p. 121-130, 2006. SAITO, T. B.; ALFIERI, A. A.; WOSIACKI, S. R.; NEGRO, F. J.; MORAIS, H. S. A.; ALFIERI, A. F. Detection of canine distemper virus by reverse transcriptasepolymerase chain reaction in the urine of dogs with clinical signs of distemper encephalitis. Research in Veterinary Science, 2005. Disponvel em:<http://www.sciencedirect.com.html>. Acesso em: dezembro 2007. SANTOS, N. C.; FIGUEIRA-COELHO, J.; SALDANHA, C.; MARTINS-SILVA, J. Biochemical, biophysical and haemorheological effects of dimethylsulphoxide on human erythrocyte calcium loading. Cell Calcium, v. 31, n. 4, p. 183-188, 2002. SCHOBESBERGER, M.; SUMMERFIELD, A.; DOHERR, M. G.; ZURBRIGGEN, A.; GRIOT, C. Canine distemper virus-induced depletion of uninfected lymphocytes is associated with apoptosis. Veterinary Immunology and Immunopathology, v. 104, p. 3344, 2005. SHIN, Y. J.; CHO, K. O.; CHO, H. S.; KANG, S. K.; KIM, H. J.; KIM, Y. H.; PARK, H. S.; PARK, N. Y. Comparison of one-step RT-PCR and nested PCR for the detection of canine distemper virus in clinical samples. Australian Veterinary Journal, v. 82, n. 1-2, p. 83-86, jan./fev. 2004. SILVA, I. N. G.; GUEDES, M. I. F.; ROCHA, M. F. G.; MEDEIROS, C. M. O.; OLIVEIRA, L. C.; MOREIRA, O. C.; TEIXEIRA, M. F. S. Perfil hematolgico e

149

avaliao eletrofortica das protenas sricas de ces com cinomose. Arquivo brasileiro de medicina veterinaria e zootecnia, v. 57, n. 1, p. 136-139, 2005. SILVA, L. H.Q.; MORINISHI, C. K.; NUNES, C. M. Diagnstico diferencial entre raiva e a cinomose em amostras de crebro de ces examinadas no perodo de 1998 a 2001 na regio de Araatuba, SP, Brasil. Arquivos do Instituto Biolgico, v. 71, n. 3, p. 317-321, jul./set. 2004. SILVA, M. C.; FIGHERA, R. A.; BRUM, J. S.; GRAA, D. L.; KOMMERS, G. D.; IRIGOYEN, L. F.; BARROS, C. S. L. Aspectos clinicopatolgicos de 620 casos neurolgicos de cinomose em ces. Pesquisa veterinaria brasileira, v. 27, n. 5, p. 215220, mai. 2007. SIXT, N.; CARDOSO, A.; VALLIER, A.; FAYOLLE, J.; BUCKLAND, R.; WILD, T. F. Canine distemper virus DNA vaccination induces humoral and cellular immunity and protects against a lethal intracerebral challenge. Journal of Virology, v. 72, n. 11, p. 8472-8476, nov. 1998. SOLOMON, T.; HART, C. A.; VINJAMURI, S.; BEECHING, N. J.; MALUCCI, C.; HUMPHREY, P. Treatment of subacute sclerosing panencephalitis with interferon-, ribavirin, and inosiplex. Journal of child neurology, v. 17, p. 703-705, 2002. STEPHENSON, J. R.; MEULEN, V. TER. Antigenic relationships between measles and canine distemper viruses: comparison of immune response in animals and humans to individual virus-specific polypeptides. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 76, n. 12, p. 6601-6605, dez. 1979. STEIN, V. M.; BAUMGRTNER, W.; KREIENBROCK, L.; ZURBRIGGEN, A.; VANDEVELDE, M.; TIPOLD, A. Canine microglial cells: stereotypy in immunophenotype and specificity in function? Veterinary Immunology and

Immunopathology, v. 113, p. 277-287, 2006. STEIN, V. M.; CZUB, M.; SCHREINER, N.; MOORE, P. F.; VANDEVELDE, M.; ZURBRIGGEN, A.; TIPOLD, A. Microglial cell activation in demyelinating canine distemper lesions. Journal of Neuroimmunology, v. 153, p. 122-131, 2004. STERN, L. B.; GREENBERG, M.; GERSHONI, J. M.; ROZENBLATT, S. The hemagglutinin envelope protein of canine distemper virus (CDV) confers cell tropism as illustrated by CDV and measles virus complemention analysis. Journal of Virology, v. 69, n. 3, p. 1661-1668, mar. 1995.

150

STRONCEK, D. J.; FAUTSH, S. K.; LASKY, L. C.; HURD, D. D.; RAMSAY, N. K.; McCOLLOUGH, J. Adverse reactions in patients transfused with cryopreserved marrow. Transfusion, v. 31, p. 521-526, 1991. SUMMERS, B. A.; CUMMINGS, J. F.; LAHUNTA, A. Veterinary Neuropathology. Mosby, 1995, p. 102-110. TAKAHASHI, T.; HOSOYA, M.; KIMURA, K.; OHNO, K.; MORI, S.; TAKAHASHI, K.; SHIGETA, S. The cooperative effect of interferon- and ribavirin on subacute sclerosing panencephalitis (SSPE) virus infections, in vitro and in vivo. Antiviral Research, v. 37, p. 29-35, 1998. TAM, R. C.; PAI, B.; BARD, J.; LIM, C.; AVERETT, D. R.; PHAM, U. T.; MILOVANOVIC, T. Ribavirin polarizes human T cell reponses towards a tipe I cytokine profiles. Journal of hepatology, v. 30, p. 376-382, 1999. TEKGL, H.; TUTUNCUOGLU, S.; KUTUKULER, N.; DIZDARER, G.;HUSEYINOV, A. Lymphocyte subsets and inflammatory mediators in patients with subacute sclerosing panencephalitis. Journal of child neurology, v. 14, p. 418-421, 1999. TIPOLD, A.; VANDEVELDE, M.; JAGGY, A. Neurological manifestations of canine distemper virus infection. Journal of Small Animal Practice, v. 33, p. 466-470, 1992. TOPACOGLU, A.; KARCIOGLU, O.; OZSARC, M.; ORAY, D.; NIYAZI, A.; OZUCELIK, D.; TUNCOK, Y. Massive intracranial hemorrhage associated with the ingestion o dimethyl sulfoxide. Veterinary and human toxicology, v. 46, p. 138-140, 2004. TRIOLA, M.F. Introduo estatstica. So Paulo: LTC. 2005. VANDEVELDE, M. The pathogenesis of nervous distemper. In: WORLD CONGRESS OF THE WORLD SMALL ANIMAL VETERINARY ASSOCIATION, 29, 2004, Rhodes. ProceedingsGreece: Rhodes, 2004. VANDEVELDE, M.; ZURBRIGGEN, A. The neurobiology of canine distemper virus infection. Veterinary Microbiology, v. 44, p. 271-280, 1995. VANDEVELDE, M.; ZURBRIGGEN, A. Demyelination in canine distemper virus infection: a review. Acta Neuropathologica, v. 109, p. 56-68, 2005. VAN MOLL, P.; ALLDINGER, S.; BAUMGRTNER, W.; ADAMI, M. Distemper in wild carnivores: an epidemiological, histological and immunocytochemical study. Veterinary Microbiology, v. 44, p. 193-199, 1995.

151

VENKATESH, G.; RAMANATHAN, S.; NAIR, N. K.; MANSOR, S. M.; SATTAR, M. A.; KHAN, A. H.; NAVARATNAM, V. Permeability of atenolol and propanolol in the presence of dimethyl sulfoxide in rat single-pass intestinal perfusion assay with liquid chromatography/UV detection. Biomedical Chromatography, v. 21, p. 484-490, fev. 2007. VITE, C. H. Inflammatory Disease of the Central Nervous System. In: VITE, C. H. Braunds Clinical Neurology in Small Animals: Localization, Diagnosis and Treatment (Eds.) New York: International Veterinary Information Service (www.ivis.org), fev. 2005. VOLLMER, J.; RANKIN, R.; HARTMANN, H.; JURK, M.; SAMULOWITZ, U.; WADER, T.; JANOSCH, A.; SCHETTER, C.; KRIEG A. M. Immunopharmacology of CpG oligodeoxynucleotides and ribavirin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 48, n. 6, p. 2314-2317, jun. 2004. WEI, E. P.; KONTOS, A. A.; NECKMAN, J. S. Antioxidants inhibit ATP sensitive potassium channels in cerebral arterioles. Stroke : journal of cerebral circulation, v. 29, p. 817-822, 1998. VON MESSLING, V. ZIMMER, G.; HERRLER, G.; HAAS, L.; CATTANEO, R. The hemagglutinin of canine distemper virus determines tropism and cytopathogenicity. Journal of Virology, v. 75, n. 14, p. 6418-6427, jul. 2001. VON MESSLING, V.; CATTANEO, R. Amino-terminal precursor sequence modulates canine distemper virus fusion protein function. Journal of Virology, v. 76, n. 9, p. 41724180, mai. 2002. VON MESSLING, V.; MILOSEVIC, D.; CATTANEO, R. Tropism illuminated: Lymphocyte-based pathways blazed by lethal morbilivirus through the host immune system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 101, n. 39, p. 14216-14221, set. 2004b. VON MESSLING, V.; OEZGUEN, N.; ZHENG, Q.; VONGPUNSAWAD, S.; BRAUN, W.; CATTANEO, R. Nearby clusters of hemagglutinin residues sustain SLAM-Dependent canine distemper virus entry in peripheral blood mononuclear cells. Journal of Virology, v. 79, n. 9, p. 5857-5862, mai. 2005. VON MESSLING, V.; SVITEK, N.; CATTANEO, R. Receptor (SLAM [CD150]) recognition and the V protein sustain swift lymphocyte-based invasion of mucosal tissue and lymphatic organs by a Morbillivirus. Journal of Virology, v. 80, n. 12, p. 6084-6092, jun. 2006. 152

YOON, M. Y.; KIM, S. J.; LEE, B. H.; CHUNG, J. H.; KIM, Y. C. Effects of dimethylsulfoxide on metabolism and toxicity of acetaminophen in mice. Biological and pharmaceutical bulletin, v. 29, n. 8, p. 1618-1624, 2006. WEST, R. T.; GARZA, L. A.; WINCHESTER, W. R.; WALMSLEY, J. A. Conformation, hydrogen bonding and aggregate formation of guanosine 5monophosphate and guanosine in dimetylsulfoxide. Nucleic Acids Research, v. 22, n. 23, p. 5128-5134, 1994. WILD, T. F.; NANICHE D.; RABOURDIN-COMBE, C.; GERLIER, D.; MALVOSIN, E.; LECOUTURIER, V.; BUCKLAND, R. Mode of entry of morbilivirus. Veterinary Microbiology, v. 44, p. 267-270, 1995. WU, J. Z.; LARSON, G.; HONG, Z. Dual-action mechanism of viramidine functioning as a prodrug and as a catabolic inhibitor for ribavirin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 48, n. 10, p. 4006-4008, out. 2004. WU, J. Z.; LARSON, G.; WALKER, H.; SHIM, J. H.; HONG, Z. Phosphorylation of ribavirin and viramidine by adenosine kinase and cytosolic 5-Nucleotidase II: implications for ribavirin metabolism in erythrocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 49, n. 6, p. 2164-2171, jun. 2005. WU, J. Z.; WALKER, H.; LAU, J. Y. N.; HONG, Z. Activation and deactivation of a broad-spectrum antiviral drug by a single enzyme: adenosine deaminase catalyzes two consecutive deamination reactions. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 47, n. 1, p. 426-431, jan. 2003. WNCHMANN, A.; ALLDINGER, S.; KREMMER, E.; BAUMGRTNER, W. Identification of CD4+ and CD8+ T cell subsets and B cells in the brain of dogs with spontaneous acute, subacute-, and chronic-demyelinating distemper encephalitis. Veterinary Immunology and Immunopathology, v. 67, p. 101-116, 1999. ZURBRIGGEN, A.; GRABER, H. U.; VANDEVELDE, M. Selective spread and reduced virus release leads to canine distemper virus persistence in the nervous system. Veterinary Microbiology, v. 44, p. 281-288, 1995a. ZURBRIGGEN, A.; GRABER, H. U.; WAGNER, A.; VANDEVELDE, M. Canine distemper virus persistence in the nervous system is associated with noncytolytic selective virus spread. Journal of Virology, v. 69, n. 3, p. 1678-1686, mar. 1995b. YANAGI, Y.; TAKEDA, M.; OHNO, S.; SEKI, F. Measles virus receptors and tropism. Japanese journal of infectious diseases, v. 59, p. 1-5, 2006.

153

Trabalho enviado e aceito na Revista Veterinria e Zootecnia: Neuropatologia da Cinomose Canine Distemper Neuropathology Neuropatologa del moquillo canino

Simone Henriques Mangia1, Antonio Carlos Paes2

Endereo para correspondncia: Nome: Prof. Ass. Dr. Antonio Carlos Paes Endereo: Distrito de Rubio Jnior, s/n Botucatu SP CEP: 18600-000 Departamento de Higiene Veterinria e Sade Pblica Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia Universidade Estadual Paulista Campus Botucatu Telefone: (14) 3811-6270 ramal 31 Fax: (14) 3811-6075 E-mail: simangia@hotmail.com paesacmi@unesp.br

154

Neuropatologia da Cinomose Resumo A cinomose uma enfermidade infecto-contagiosa, que afeta naturalmente os ces, causada um Paramyxovirus, do gnero Morbilivirus, de apresentao clnica aguda, subaguda e crnica. De ocorrncia mundial, sem sazonalidade, sem predileo de sexo ou raa, apresenta maior incidncia em animais jovens, podendo acometer todas as idades. A transmisso ocorre principalmente por aerossis e gotculas contaminados. Aps o contato do vrus com o epitlio do hospedeiro ocorre replicao viral nos macrfagos e disseminao. Entre quatro e seis dias ocorre nova replicao causando aumento inicial na temperatura corporal e leucopenia. No perodo de 8 a 10 dias, ocorre disseminao viral nos epitlios e no sistema nervoso central. A encefalite aguda acomete animais jovens ou imunossuprimidos e caracterizada por leso viral direta. A encefalite multifocal em adultos acomete freqentemente animais entre quatro a seis anos, apresentando curso crnico. A encefalite do co velho, comum em ces com mais de seis anos, caracteriza-se por panencefalite e uma forma rara, resultante da persistncia viral nos neurnios. As leses desmielinizantes clssicas iniciam trs semanas ps-infeco e durante perodo de intensa imunossupresso, sendo conseqncia da replicao viral no interior de oligodentrcitos. A desmielinizao na fase crnica coincide com a recuperao do sistema imune, caracterizada pela reduo ou perda das protenas virais, com aumento da regulao do complexo de histocompatibilidade maior e infiltrao de clulas inflamatrias. O curso clnico e o padro neurolgico da encefalomielite variam de acordo com a cepa viral e a idade que o animal foi infectado. O lquor pode indicar anormalidades na fase crnica com aumento de protenas, principalmente por IgG antivrus e aumento do nmero de clulas, com predomnio de linfcitos. Em cortes histolgicos possvel confirmar a infeco com a observao de leses caracterizadas por reas de necrose bem delimitadas, desmielinizao e corpsculos de incluso. O isolamento viral em cultivo celular especfica, demorado e pode resultar em falso-negativo, exceto na fase aguda. A tcnica da reao em cadeia pela polimerase, precedida de transcrio reversa vem sendo empregada com sucesso na deteco viral. O diagnstico pode ser confirmado pela tcnica de imunofluorescncia direta em fludos corporais, porm o aumento dos ttulos de IgM e IgG no soro ambguo e pode indicar infeces passadas e presentes com ou sem vacinao. Ces infectados podem apresentar imunossupresso, permitindo

155

a infeco por agentes oportunistas, como o Toxoplasma gondii. Vacinas produzidas com as amostras virais adequadamente atenuadas so eficientes em proteger os animais contra a infeco natural. PALAVRAS-CHAVE: desmielinizao. Cinomose, Morbilivirus, neuropatologia, encefalite,

156

Canine Distemper Neuropathology Abstract Canine Distemper, is an infectious disease of acute, subacute, and chronic clinical appearance, caused by a Morbilivirus, family Paramyxovirydae. Of worldwide distribution, no seasonal occurrence, susceptibility between males and females, or racial preference has been described. Young dogs are generally more susceptible to infection, demonstrating a relationship between susceptibility and age. Canine Distemper virus is generally transmitted as an aerosol infection to the upper respiratory tract. After entering of the virus and invasion of epithelial tissues, viral replication into macrophages and spreading occur. Four to six days after initial infection, a new replication starts, causing a rise in body temperature and leucopenia. Eight to ten days after inoculation the virus invades various epithelial tissues and the central nervous system. Acute encephalitis, which occurs early in the course of infection in young or immunosuppressed animals, is characterized by direct viral injury. Multifocal encephalitis of chronic evolution often occurs in adult dogs between four to six years old. The old-dog encephalitis is a rare form of the disease characterized by panencephalitis that may be a persistent infection with a defective virus, usually present in animals older than six years. Characteristic demyelinating lesions are observed around three weeks post infection, during a period of massive virus-induced immunosuppression, as a consequence of viral replication inside oligodendrocites. The chronic demyelination coincides with the recovery of the immune system, characterized by reduction or lost of viral proteins, followed by upregulation of the major histocompatibility complex and inflammatory cells infiltration. The clinical course and neurological pattern of the encephalomyelitis varies depending on the virulence of the virus strain, and host age. Abnormalities like increases in protein, because elevated IgG levels, and cell count, with a predominance of lymphocytes, are detectable in cerebrospinal fluid in dogs suffering the chronic stage of the disease. It is possible to confirm infection on histologic examination by the observation of well delimited necrotic areas, demyelination and inclusion bodies. Isolation technique of virulent canine distemper virus in cell cultures is very specific and false-negative results will occur if the animal is not entere the acute phase. The reverse transcription polymerase chain reaction has shown to be useful for viral detection. A final diagnosis is based on the demonstration of viral antigens in scrapings and body fluids by immunofluorescence

157

test. Augment in titles of IgM and IgG in serum is ambiguous because it just indicates previous and/or present infections, even in vaccinated animals. Immunosupression induced by canine distemper virus probably collaborates with varieties of opportunistic agents, i.e. Toxoplasma gondii. Live attenuated vaccines have been used successfully for many years to control wild-type morbilivirus infection.

KEY WORDS: Canine Distemper, Morbilivirus, neuropathology, encephalitis, demyelinating.

158

Neuropatologa del moquillo canino Resumen El moquillo canino es una enfermedad infecto-contagiosa, de curso clnico agudo, causada por un Morbilivirus de la familia Paramyxoviridae. Tiene presentacin mundial, sin estacionalidad, sin predileccin por sexo o raza, se presenta con mayor incidencia en animales jvenes, pero puede atacar animales de cualquier edad. La transmisin ocurre principalmente por aerosoles y gotas contaminadas. Una vez que el virus entra en contacto con el epitelio del husped, ocurre replicacin dentro de los macrfagos y ulterior diseminacin. Despus de cuatro a seis das se presenta una nueva replicacin que causa aumento inicial en la temperatura corporal y leucopenia. Dentro de un perodo de 8 a 10 das, ocurre diseminacin viral en los epitelios y en el sistema nervioso central. La encefalitis aguda se manifiesta en animales jvenes o inmunosuprimidos y se caracteriza por lesin viral directa. La encefalitis multifocal en los adultos ataca frecuentemente animales entre los cuatro y los seis aos, y tiene un carcter crnico. La encefalitis del perro viejo, comn en animales mayores de 6 aos, se caracteriza por la presencia de panencefalitis, la cual es una forma rara que resulta de la persistencia viral en las neuronas. Las lesiones desmielinizantes clsicas comienzan tres semanas despus de la infeccin durante periodos de inmunosupresin intensa, como consecuencia de la replicacin viral dentro de los oligodendrocitos. La desmielinizacin en la fase crnica coincide con la recuperacin del sistema inmune, caracterizada por la reduccin o prdida de las protenas virales, con aumento de la regulacin del complejo mayor de histocompatibilidad e infiltracin de clulas inflamatorias. El curso clnico y el patrn neurolgico de la encefalomielitis son variables dependiendo de la cepa viral y de la edad en la cual el animal fue infectado. El lquido cefalorraqudeo indica anormalidades en la fase crnica con aumento de protenas, principalmente de IgG antivirus y aumento del nmero de clulas, con predominio de linfocitos. En los cortes histolgicos es posible confirmar la infeccin con la observacin de lesiones caracterizadas por reas de necrosis bien delimitadas, desmielinizacin y cuerpos de inclusin. La tcnica de aislamiento viral en cultivo celular es especfica, lenta y puede resultar en falso-negativo si el animal no se encuentra en la fase aguda. La tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa por trascripcin reversa ha sido empleada con xito en la deteccin viral. El diagnstico puede ser realizado por medio de la tcnica de inmunofluorescencia directa en fluidos

159

corporales. El aumento de los ttulos de IgM e IgG en el suero es ambiguo y puede indicar infecciones anteriores y actuales con o sin vacuna. Los perros infectados pueden presentar inmunosupresin, lo que permite la infeccin por agentes oportunistas, como Toxoplasma gondii. Las vacunas producidas con muestras virales atenuadas adecuadamente, son eficientes para proteger a los animales contra la infeccin natural.

PALABRAS-CLAVE: Moquillo canino, Morbilivirus, neuropatologa, encefalitis, desmielinizacin.

160

1. Introduo 1.1 Aspectos etio-epidemiolgicos A cinomose uma doena infecto-contagiosa, causada por um RNA-vrus da famlia Paramyxoviridae, gnero Morbilivirus. Enfermidade que possui trs formas de apresentao clnica: aguda, subaguda e crnica, com manifestaes gastroentricas, respiratrias e neurolgicas. Foram descritas trs formas de encefalite causada pelo vrus da cinomose: encefalite dos ces jovens, encefalite em ces adultos e encefalite do co velho (CORRA & CORRA, 1992). O vrus possui simetria helicoidal, pleomorfismo e muitos so aproximadamente esfricos medindo ao redor de 100-250 nm de dimetro (GREENE, 2006). A sua estrutura formada por um nucleocapsdeo contendo o genoma viral, que consiste na nucleoprotena (NP) e no complexo polimerase incluindo protenas P e L. Exibe duas glicoprotenas no envelope viral: a maior, hemaglutinina (HA), possui atividade de hemoaglutinao, fixao do vrus na clula hospedeira e responsvel pelo tropismo celular; a protena de fuso (F) proporciona a ligao entre a membrana celular e o envelope viral e a formao sinccial (STERN et al., 1995; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Enfermidade de ocorrncia mundial afeta animais das famlias Canidae, Mustelidae, Procyonidae, Viverridae, Felidae, Ursidae e mamferos aquticos. Porm, o mais importante agente infeccioso que acomete a populao canina (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; HEADLEY & GRAA, 2000; GEBARA et al., 2004). O vrus da cinomose pantrpico, apresenta diversas cepas, sendo algumas mais neurotrpicas e mais virulentas. Esta enfermidade pode ocorrer em qualquer poca do

161

ano, mas acomete os ces principalmente no inverno, sem predileo de sexo ou raa (CORRA & CORRA, 1992). A taxa de infeco maior do que o nmero dos animais que manifestam a enfermidade, estimando-se em at 75% de ces suscetveis que eliminam o vrus, sem qualquer sinal clnico da doena (CORRA & CORRA, 1992; GEBARA et al., 2004). A transmisso ocorre principalmente por aerossis e gotculas contaminadas, de secrees respiratrias, fezes e urina (CORRA & CORRA, 1992). 2. Desenvolvimento 2.1 Patologia A quebra e a ativao das glicoprotenas, em alguns Paramyxovirus e Ortomyxovirus, dependem de proteases tissulares especficas, que determinam o tropismo, restringindo a fuso para tecidos selecionados. O processo de fuso inicia com o contato do receptor celular com a protena HA, que muda sua conformao, transmitindo lateralmente um sinal para a protena F, que sofre quebra e ativao (Von MESSLING et al., 2001; Von MESSLING et al., 2004). Durante a exposio natural, o vrus da cinomose se propaga por gotas de aerossis e entra em contato com o epitlio do trato respiratrio superior. Em 24 horas, as partculas virais se replicam nos macrfagos e se disseminam pela via linftica local, para tonsilas e linfonodos brnquicos (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; GREENE, 2006). Aps dois a quatro dias ps-infeco, o nmero de partculas virais nas tonsilas, linfonodos retrofarngeos e bronquiais aumenta, porm uma quantidade pequena de clulas mononucleares infectadas encontrada em outros rgos linfides. No perodo

162

de quatro a seis dias ocorre a replicao viral no sistema linfide, medula ssea, timo, bao, linfonodos mesentricos, placas de Payer, clulas estomacais, clulas de Kpffer e clulas mononucleares ao redor dos vasos pulmonares e bronquiais. A ampla proliferao viral nos rgos linfides induz um aumento inicial na temperatura corporal, entre o segundo e o sexto dia, ocorrendo leucopenia, causada por danos virais nas clulas linfides (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Ocorre disseminao do vrus no epitlio e nos tecidos do sistema nervoso central (SNC) no perodo de 8 a 10 dias ps-infeco, por via hematgena ou pelo lquor, aps viremia (JONES et al., 2000; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005; GREENE, 2006). No co com nveis intermedirios de resposta imune mediada por clulas e com ttulos de anticorpos que aparecem tardiamente, aps 9 a 14 dias, o vrus se dissemina pelos tecidos. Os sinais clnicos podem desaparecer com o aumento da titulao de anticorpos e o vrus eliminado da maioria dos tecidos assim que este ttulo aumentar, podendo persistir por longos perodos em tecidos uveais, neurnios e tegumentos, como nos coxins plantares. A recuperao da infeco est associada com a imunidade a longo prazo e interrupo da replicao viral. A proteo pode ser comprometida se o co for exposto a uma cepa altamente virulenta, a dose infectante elevada ou sofrer imunossupresso (CORRA & CORRA, 1992; GREENE, 2006). 2.2 Patologia do Sistema Nervoso Central Alguns estudos sugerem que a infeco do sistema nervoso central (SNC) ocorre precocemente, na fase sistmica da doena. Neste caso, a cinomose progride da forma sistmica para a neurolgica, aparentemente por falha do sistema imune.

163

Alm da resposta imune sistmica do hospedeiro, a presena de anticorpos antivirais e deposio de imunocomplexos podem facilitar a sua difuso no endotlio vascular do SNC. O vrus livre ou associado s plaquetas ou linfcitos penetra nas clulas endoteliais vasculares das meninges, nas clulas do plexo coride do quarto ventrculo e nas clulas ependimrias lineares do sistema ventricular (GREENE, 2006). A freqente ocorrncia de leses periventriculares e subpiais, e o fato do vrus ser encontrado facilmente nas clulas do plexo coride e do epndima, sugerem que penetre nos tecidos cerebrais atravs do lquor, onde o agente pode ser encontrado em clulas monucleares fundidas com clulas ependimrias (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995). A infeco do epitlio do plexo coride produtiva atravs de todo o curso de infeco com o vrus continuamente sendo produzido. A propagao do vrus atravs das vias do SNC explica a distribuio de leses em crtex cerebral, trato ptico e nervos, vu medular rostral, pednculos cerebelares e medula espinhal (GREENE, 2006). Apesar da ausncia de manguitos perivasculares, numerosas clulas CD8+ so encontradas nas leses agudas desmielinizantes e tambm distribudas difusamente no parnquima cerebral, correlacionado de forma desigual com reas de infeco viral. No lquor destes animais altos ttulos de interleucina 8 (IL-8) foram encontrados, sugerindo que a ativao inicial das clulas da micrglia serve como uma alavanca para a invaso de clulas T no SNC (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). A IL-1 importante na patognese de todos os tipos de leses causadas pelo vrus da cinomose e responsvel por estimular a proliferao de astrcitos, que pode significar o incio das leses, como as encontradas na cinomose no inflamatria subaguda, que evidenciam frequentemente astrogliose reativa. Encontrada

164

principalmente nos espaos perivasculares da inflamao subaguda e nas leses crnicas, a IL-1 age de forma importante na propagao da doena (GRNE et al., 2000). A encefalite aguda, que ocorre inicialmente no curso da infeco em animais jovens ou imunossuprimidos, caracterizada por leso viral direta (SUMMERS et al., 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006). O vrus causa leso multifocal nas substncias cinzenta e branca. As leses na substncia cinzenta so resultados de infeco neuronal e necrose, e podem levar a uma poliencefalomalcea. Leses na substncia branca so caracterizadas por danos mielnicos e esto associados com replicao viral nas clulas da glia. Mudanas inflamatrias so mnimas devido imunodeficincia resultante de imaturidade fisiolgica do sistema imune e/ou decorrente da imunossupresso viral induzida (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006). No aspecto microscpico possvel observar incluses intranucleares no interior de astrcitos multinucleados e de certas micrglias. No entanto, raramente podem ser detectados nos neurnios corpsculos de incluso citoplasmticos ou nucleares (SUMMERS et al., 1995; JONES et al., 2000). Durante a fase inicial da encefalite a expresso do RNA mensageiro (mRNA) e da protena viral alta nas reas afetadas e uma possvel conseqncia o aumento da produo do Fator de Necrose Tumoral (TNF) pelas clulas, como astrcitos. A sua importncia na progresso das leses cerebrais tambm sustentada pela abundncia do vrus na forma imunorreativa presente nas leses no inflamatrias, que se caracterizam pela desmielinizao. O TNF tem sido evidenciado como causa da destruio de oligodendrcitos e perda de mielina (GRNE et al., 2000).

165

A encefalite multifocal em ces adultos acomete freqentemente animais entre os quatro e seis anos, com curso crnico. Esta enfermidade no precedida nem coincidente com os sinais sistmicos (CORRA & CORRA, 1992). O antgeno do vrus fica restrito a poucos astrcitos e a expresso do Complexo de

Histocompatibilidade Maior (MHC) proeminente em todas as clulas da micrglia, sendo responsvel pela desmielinizao contnua e disseminada infiltrao mononuclear perivascular. As alteraes tem incio com hiperplasia dos astrcitos e proliferao microglial em estruturas subpiais e subependimrias na substncia branca. Esta forma tambm est associada com a alta concentrao de anticorpos antimielnicos, podendo ser uma reao secundria ao processo inflamatrio. Anticorpos contra o vrus interagem com macrfagos infectados em leses no SNC, causando sua ativao com liberao de radicais livres de oxignio. Esta atividade por sua vez pode levar destruio de oligodendrcitos e bainha de mielina (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006). Corpsculos de incluso viral intranucleares e intracitoplasmticos esto presentes em astrcitos e clulas da superfcie ependimal (SUMMERS et al., 1995; GEBARA et al., 2004). Na retina ocorre congesto e edema. Tambm pode estar presente uma imflamao do nervo ptico acompanhada de alteraes microscpicas como a formao de manguitos perivasculares com linfcitos, degenerao de clulas ganglionares, desmielinizao e gliose. As incluses intranucleares podem ser encontradas na glia da retina e do nervo ptico (JONES, et al., 2000). Os estudos de Brge et al. (1989) demonstraram que os anticorpos antivirais estimulam a produo de radicais livres de oxignio (ROS) em culturas cerebrais de ces infectadas com o vrus da cinomose. Os ROS fazem degradao de fosfolipdios na

166

parte cortical do crebro, destruindo protenas da bainha de mielina e interferindo na produo da mielina. Nesta fase da doena, nos infiltrados perivasculares encontram-se CD8+, CD4+ e linfcitos B, e citocinas pro-inflamatrias, IL-1, IL-6 e IL-12, indicando uma resposta imune-mediada (WNSCHMANN et al., 1999; MARKUS et al., 2002). A produo de TNF e tambm de IL-1 e IL-6 pelas clulas locais importante na induo de molculas de adeso endotelial como pr-requisito para a migrao de clulas inflamatrias para o SNC e a progresso das leses no estgio crnico, caracterizadas por inflamao severa. Alm disso, a produo de TNF por clulas inflamatrias no responsvel apenas pelo processo de desmielinizao pela destruio direta de oligodendrcitos, mas pode levar a mobilizao de mais leuccitos (GRNE et al., 2000). Os estudos realizados por Vandevelde & Zurbriggen (1995) mostraram que o vrus persiste em reas na substncia branca que no apresentam leses inflamatrias desmielinizantes, ou perifericamente a estas. Isto acontece no desenvolvimento progressivo da doena crnica se a resposta imune for mais lenta do que a replicao viral. A persistncia viral a chave para a patognese das leses crnicas (ZURBRIGGEN et al., 1995a; ZURBRIGGEN et al., 1995b; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). possvel que o vrus reduza sua expresso nestas reas do SNC, em analogia a panencefalite subaguda esclerosante em humanos. A persistncia est associada com a diminuio da regulao dos genes que codificam protenas de membrana e superfcie. Estas clulas persistentemente infectadas podem continuar a sobreviver, pois a infeco restrita e a difuso viral no provoca lise celular.

167

Sugere-se que a infeco de astrcitos pelo vrus da cinomose no inicie uma reao inflamatria, por uma ao viral em limitar o seu desenvolvimento com a diminuio da destruio celular, impedindo a exposio de protenas virais e debris celulares no meio extracelular. A persistncia do vrus favorecida pela estratgia do mesmo, que se dissemina sem ser detectado pelo sistema imune (ZURBRIGGEN et al., 1995a; ZURBRIGGEN et al., 1995b; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). A encefalite do co velho comumente observada em ces com mais de seis anos, porm j foi encontrada em animais mais novos. Caracteriza-se por ser principalmente uma panencefalite e uma forma rara, crnica, de carter inflamatrio progressivo na camada cinzenta dos hemisfrios cerebrais e do tronco enceflico, resultante da persistncia viral nos neurnios aps infeco aguda pelo vrus da cinomose. Esta enfermidade acomete animais que so imunocompetentes e que apresentam a persistncia viral no SNC, com leses caracterizadas por infiltrao perivascular disseminada com linfcitos (clulas T) e plasmcitos, proliferao difusa da micrglia, astrogliose, degenerao neuronal, neuronofagia e a resposta imune caracterizada por um aumento da expresso do MHC. Estas leses esto em todo crtex cerebral e tambm no ncleo basal, tlamo e hipotlamo (SUMMERS et al., 1995; GREENE, 2006). Geralmente o cerebelo no acometido nesta forma (CORRA & CORRA, 1992). Podem ser encontrados corpsculos de incluso intranucleares nas clulas gliais e nos neurnios (JONES, et al., 2000). 2.3 Desmielinizao O incio das leses desmielinizantes ocorre aproximadamente trs semanas psinfeco e durante o perodo de intensa imunossupresso e ausncia de inflamao. Coincide com a replicao viral nas clulas da glia, com predileo por algumas regies

168

como cerebelo, sistema ptico e medula espinhal (TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; VANDEVELDE, 2004; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). O sistema matrix metaloproteases (MMP) est envolvido na patognese da desmielinizao, por abrir a barreira hemato-enceflica pela quebra de componentes da membrana basal, favorecendo a migrao de clulas inflamatrias para o interior do SNC, desencadeando a liberao de TNF-, que desintegra a bainha de mielina (MIAO et al., 2003; VANDEVELDE, 2004). No estudo realizado por Khuth et al. (2001) foi possvel observar o aumento da expresso de MMP e seus inibidores tissulares (TIMP) em locais especficos, principalmente na regio rostral do crebro, crtex, hipocampo e hipotlamo. Concomitantemente h um aumento da regulao ou induo de citocinas proinflamtrias, havendo uma relao entre a replicao viral no SNC, a produo citocinas inflamatrias e esse aumento da quantidade de MMP e TIMP. Sugere-se que a induo de citocinas inflamatrias causada pela replicao viral, sendo estas responsveis em parte pela regulao de MMP e TIMP. - Desmielinizao aguda - leso induzida pelo vrus O exato mecanismo do incio das leses da mielina no estgio agudo imunossupressor da cinomose ainda incerto (STEIN et al., 2004; VANDEVELDE, 2004; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Segundo Grne et al. (2000), as reas com desmielinizao aguda e sem inflamao so consideradas uma conseqncia da replicao viral no interior de oligodentrcitos levando a destruio celular e a perda de habilidade para manter a bainha de mielina (MIAO et al., 2003; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). A explicao segundo Vandevelde & Zurbriggen (1995) para o fenmeno de desmielinizao similar, porm o estudo em microscopia ptica mostra que a maioria

169

das clulas infectadas so astrcitos. A microscopia eletrnica revela que a infeco de oligodentrcitos rara na cinomose, e concluem em seus estudos que o vrus causa uma infeco restrita nos oligodentrcitos, que mesmo assim pode ser responsvel pelo fenmeno de desmielinizao. Em estudo utraestrutural foi constatado microvacuolizao e perda de organelas por degenerao de oligodentrcitos. As mudanas morfolgicas so precedidas por disfunes metablicas nestas clulas, com a diminuio drstica da atividade da cerebrosdeo sulfo-transferase (enzima especfica de oligodentrcitos) aps infeco viral. possvel que a transcrio do vrus interfira nas funes especializadas destas clulas, que so necessrias para manuteno das membranas mielnicas

(VANDEVELDE, 2004; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Nos achados de Stein et al. (2004), o vrus induziu a ativao das clulas da micrglia, que podem ter um importante impacto na patognese de desmielinizao aguda da cinomose, devido a um difuso aumento da regulao do MHC na camada branca. A ativao de tais clulas libera fatores txicos que podem induzir a destruio da mielina (MIAO et al., 2003; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). - Desmielinizao crnica - complicaes imunolgicas Coincidente com a recuperao do sistema imune seis a sete semanas psinfeco, manguitos perivasculares com linfcitos, clulas plasmticas e moncitos ocorrem inicialmente nas leses induzidas pelo vrus no crebro. A reao inflamatria nas leses desmielinizantes pode levar a progresso da destruio do tecido e possvel que astrcitos, o primeiro alvo do vrus, participem da amplificao desta resposta imune (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005).

170

Leses crnicas desmielinizantes so caracterizadas pela reduo ou possvel perda das protenas virais, com aumento da regulao do MCH e infiltrao massiva de CD8+, CD4+ e clulas B (MIAO et al., 2003; VANDEVELDE, 2004). A inflamao est associada com a sntese de anticorpos citotxicosdependentes, que podem induzir a desmielinizao por ao dos anticorpos anti-mielina. Vandevelde & Zurbriggen (1995) concluram que as reaes auto-imunes na cinomose so provavelmente um epifenmeno e que no so primrias no processo crnico de desmielinizao (TIPOLD et al., 1992; VANDEVELDE, 2004). O experimento realizado por Krakowka et al. (1973) descreve a presena de anticorpos anti-mielina no soro de ces infectados apresentando encefalomielite desmielinizante. A demonstrao de imunoglobulinas nas leses desmielinizantes no SNC de ces infectados uma tentativa de provar que estas possuem um papel ativo na progresso da doena. Os autores concluram que estes anticorpos so fatores que contribuem na patognese da desmielinizao e funcionam amplificando as leses bsicas no inflamatrias induzidas pelo vrus no crebro. Anticorpos anti-mielina so produzidos no local das leses cerebrais inflamatrias e podem ser encontrados no lquor de ces infectados. Resposta mediada por clulas contra a protena bsica da mielina foi encontrada em ces experimentalmente infectados. Entretanto, nem anticorpos anti-mielina ou reaes mediadas por clulas esto relacionados com o curso da doena (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). No entanto, Summers et al. (1995), descreve que fragmentos de mielina so fagocitados, principalmente por clulas da micrglia, menos por astrcitos e raramente por oligodentrcitos, induzindo a retirada pelos macrfagos.

171

Macrfagos, que esto em grande nmero nas leses de cinomose, possuem um papel importante. A interao dos anticorpos antivirais e dos macrfagos resulta na produo de radicais livres de oxignio que podem ser responsveis pela destruio de oligodentrcitos e compartimentos de mielina. Quimicamente a produo de radicais livres de oxignio no sistema xantina/xantina-oxidase, seletivamente destri culturas de oligodentrcitos, que so ricos em compostos ferrosos (VANDEVELDE, 2004; VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 2005). Existem algumas evidncias experimentais que o vrus induz alteraes nas funes de macrfagos. A produo de IL-1 por macrfagos in vitro pode diminuir e de prostaglandina E aumentar como resultado da infeco viral. A fagocitose, dependente ou independente de receptores Fc, assim como a habilidade de liberar radicais livres de oxignio e a atividade procoagulante dos macrfagos tambm alterada aps a infeco. Considerando a relao entre o sistema de coagulao e funes inflamatrias, essas observaes mostram que a infeco pelo vrus da cinomose pode desencadear uma atividade destrutiva dos macrfagos e possvel sugerir a hiptese que a desmielinizao espectadora ocorra na cinomose crnica (VANDEVELDE & ZURBRIGGEN, 1995).

2.4 Sinais clnicos da doena neurolgica O vrus da cinomose causa doena multissistmica freqentemente com sinais neurolgicos. Estes sinais podem apresentar-se tardiamente, semanas, meses ou anos aps a recuperao de infeces inaparentes, ou aps a recuperao da fase sistmica da cinomose aguda (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Os sinais neurolgicos so mltiplos e refletem a distribuio do vrus e as leses no SNC. Experimentalmente, o curso clnico e o padro neurolgico da

172

encefalomielite podem mostrar-se variveis com a cepa viral e com a idade que o animal foi infectado. Hiperestesia, rigidez cervical e para-espinhal podem ser encontrados em ces como resultado de inflamao das meninges, entretanto, sinais de leses no parnquima so predominantes em relao aos sinais meningeais (GREENE, 2006). Quando h acometimento da medula espinhal sinais, como paresia e incordenao de membros so os nicos achados neurolgicos. A doena vestibular pode levar a presena de sinais como movimento de cabea, nistagmo, dficits em outros nervos cranianos e da propriocepo, e a doena cerebelar se manifesta por ataxia, hipermetria e balanar de cabea. Cegueira uni ou bilateral, s vezes com midrase, ocorrem devido o freqente envolvimento do trato e nervo ptico. Atrofia muscular generalizada rara como apresentao clnica de leso focal no crtex (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Podem ocorrer convulses parciais ou generalizadas. Porm, a convulso do tipo goma de mascar frequentemente ocorre em ces que desenvolvem

poliencefalomalcea nos lobos temporais (GREENE, 2006). As mioclonias so os sinais mais comuns da cinomose e podem estar presentes na ausncia de outros sinais neurolgicos. Acometem um nico msculo ou um grupo de msculos, como auriculares, temporais, reto abdominal e flexores dos membros (CORRA & CORRA, 1992; SUMMERS et al., 1995; GREENE, 2006). O mecanismo neural para as mioclonias origina-se com irritao local pela presena do vrus em neurnios motores inferiores da medula espinhal ou do ncleo do nervo craniano (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Na encefalite do co velho, o sinal neurolgico mais comum a diminuio visual. A enfermidade progressiva e acompanhada pelo desenvolvimento de depresso

173

mental, andar compulsivo em crculos, mioclonias, hipercinesia e presso de cabea contra paredes ou objetos. Sinais de envolvimento do tronco cerebral so raros (CORRA & CORRA, 1992; SUMMERS et al., 1995; VITE, 2005). 2.5 Patologia clnica - Exame do lquor Segundo Gama et al. (2005), as caractersticas fsico-qumicas do lquor tais como, colorao, aspecto, densidade, pH e nveis de glicose, no so capazes de contribuir para indicar qualquer anormalidade, nas diferentes fases da cinomose. Por outro lado, o componente protico e a celularidade mostraram alteraes importantes na presena de sinais neurolgicos. Durante o estgio de desmielinizao aguda, no ocorrem reaes inflamatrias e as protenas e as clulas do lquor podem estar normais (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). No estgio crnico, com a inflamao pode ocorrer aumento de protena (acima de 25 mg/dl), principalmente representado por IgG antivrus e aumento do nmero de clulas (mais que 10/l) com predomnio de linfcitos (CORRA & CORRA, 1992; TIPOLD et al., 1992; SUMMERS et al., 1995; GREENE, 2006). O aumento dos anticorpos anti-vrus no lquor oferece uma evidncia definitiva da encefalite pela cinomose, porque estes anticorpos so produzidos no local, e este aumento no encontrado em animais vacinados ou na cinomose sistmica sem alteraes neurolgicas (GREENE, 2006).

174

2.6 Prognstico O prognstico reservado na fase sistmica da enfermidade, pois pode progredir para a fase neurolgica. Torna-se desfavorvel nesta fase, pois a mesma comumente progressiva, raramente estacionando, ou levando morte de forma aguda ou crnica. Caso isso no ocorra, o animal pode ficar com seqelas que sejam incapacitantes ou incompatveis com a vida (CORRA & CORRA, 1992). 2.7 Diagnstico No sistema nervoso central o vrus causa leses caracterizadas por reas de necrose bem delimitadas, desmielinizao e incluses intranucleares principalmente em astrcitos. A observao dessas leses em cortes histolgicos confirma o diagnstico da infeco pelo vrus (SUMMERS et al., 1995; JONES et al., 2000; GEBARA et al., 2004; GREENE, 2006). A tcnica de isolamento viral em cultivo celular especfica, porm demorada e difcil, podendo resultar em falso-negativo se o animal no estiver na fase aguda da doena. A formao de clulas gigantes a caracterstica citoptica efetiva do vrus da cinomose em vrias culturas de tecido e pode ser detectada dois a cinco dias aps a infeco. Atualmente, a tcnica da reao em cadeia pela polimerase precedida de transcrio reversa (RT-PCR) vem sendo empregada com sucesso na deteco do vrus em diferentes tipos de amostras biolgicas provenientes de ces com sinais clnicos sistmicos e neurolgicos. Segundo Gebara et al. (2004), possvel detectar o cido nuclico do vrus em urina de ces tanto com encefalite aguda quanto crnica, evidenciando a virria. Estes resultados demonstram que a tcnica de RT-PCR um

175

mtodo eficiente para realizao do diagnstico rpido, precoce e in vivo (GEBARA et al., 2004; SATIO et al., 2005). O diagnstico final, na fase aguda, baseado na demonstrao de antgenos virais em esfregaos sangneos e fludo corporais como raspado de conjuntiva, lavado traqueal, sedimento urinrio, clulas do lquor e medula ssea. O antgeno viral pode ser difcil de achar em outros tecidos em casos de cinomose neurolgica sem sinais sistmicos. O mesmo pode ser detectado nas clulas do lquor com o teste de anticorpos fluorescentes indiretos usando anticorpos anti-vrus (TIPOLD et al., 1992; GREENE, 2006). Na pele, tecido uveal, coxins plantares e sistema nervoso central o vrus pode ser encontrado atravs de fluorescncia direta em um perodo de 60 dias aps a infeco (GREENE, 2006). O aumento de ttulos de anticorpos neutralizantes no soro pode ser mensurado em ces que sobreviveram fase aguda de infeco, no entanto, a presena de IgM especfica para infeces recentes ou aps vacinao. O aumento dos ttulos de IgM e de IgG no soro ambguo e podem ambos indicar infeces passadas e presentes com ou sem vacinao para cinomose. A anlise dos nveis de IgG especfica no lquor pode ser usada para mensurar anticorpos na fase crnica da infeco do SNC (GREENE, 2006). 2.8 Co-infeco com Toxoplasmose Ces enfermos podem apresentar imunossupresso, permitindo a infeco por agentes oportunistas, como o Toxoplasma gondii. No Brasil, a cinomose considerada enzotica em algumas regies e pode estar associada com co-infeco por toxoplasmose (MORETTI et al., 2006).

176

A toxoplasmose considerada uma enfermidade oportunista, caracterizada por sinais neuromusculares, respiratrios e gastroentricos, ou por infeces generalizadas associada com sintomatologia neurolgica (CORRA & CORRA, 1992; MORETTI et al., 2006). A sorologia de toxoplasmose rotineiramente requisitada em animais com sintomatologia neurolgica e a obteno de ttulo igual a 1024 sugere que Toxoplasma gondii um importante agente no processo da doena neurolgica (MORETTI et al., 2006). Segundo Brito et al. (2002), no possvel ter certeza que todos os casos de doena neurolgica sejam toxoplasmose clnica, quando h sintomatologia neurolgica a suspeita direcionada para outras infeces, como a cinomose, podendo, desta forma, a toxoplasmose se tornar um risco para sade pblica. A infeco por Neospora caninum descrita em animais com toxoplasmose. Tipold et al. (1992) relatam a infeco combinada de cinomose com Toxoplasma gondii e Neospora caninum (MORETTI et al., 2006). 2.9 Tratamento e preveno A falta de um tratamento antiviral para a infeco do vrus da cinomose requer um tratamento suporte e sintomtico (TIPOLD et al., 1992; CORRA & CORRA, 1992). Na encefalite multifocal progressiva causadora de tetraplegia, semicoma e incapacitao a eutansia recomendada. Nos casos de animais com convulso os anticonvulsionantes podem ser utilizados, como o fenobarbital na dose de 2 mg/Kg pelas vias intravenosa, intramuscular e oral, a cada 12 horas. Corticosterides, como a

177

dexametasona na dose de 2,2 mg/Kg, por via intravenosa, podem ser utilizados por causa da imunopatologia das leses neuronais e para reduzir o edema cerebral, mantendo a terapia com doses antinflamatrias e posteriormente reduzindo a dose at o final do tratamento. A imunossupresso causada pelos esterides a principal desvantagem, porque a resposta inflamatria responsvel pela retirada do vrus do organismo. A terapia com glicocorticides com dosagens antinflamatrias pode ter algum sucesso no controle na dilatao pupilar causada pela neurite ptica ou de alguns sinais associados inflamao crnica da encefalite. A prednisolona comumente escolhida entre os glicocorticides na dose de 2 4 mg/Kg, a cada 24 horas, por via oral. A mioclonia normalmente intratvel e irreversvel (TIPOLD, 1992; GREENE, 2006). Como os macrfagos e seus produtos so importantes na induo da destruio do tecido nervoso, antioxidantes como vitamina E e vitamina C podem ser utilizados terapeuticamente (TIPOLD, 1992). Segundo Vandevelde (2004), o desenvolvimento de estratgias teraputicas deve estar relacionado com a modulao imunolgica. Terapias antivirais especficas contra Morbilivirus no foram avaliadas ainda. Por isso a mais importante interveno veterinria a preveno. Vacinas produzidas com as amostras do vrus da cinomose isoladas de ces naturalmente infectados, adequadamente atenuadas em culturas de clulas, so eficientes em induzir o estado de imunidade dos animais protegendo-os contra a infeco natural. O co deve ser vacinado quando se tornar soronegativo dos anticorpos maternos, assegurando-se a mxima resposta sorolgica ps-vacinal. Recomendam-se vrias aplicaes de vacinas, administradas a intervalos de trs a quatro semanas, devido as

178

dificuldades de mensurar os ttulos de anticorpos do filhote de forma rotineira. Aps a administrao da primeira dose de vacina, os ces j apresentam ttulos de anticorpos em nveis protetores e, aps a revacinao anual, os ttulos perduram por mais de 12 meses (BIAZZONO et al., 2001).

3 Consideraes finais Embora, a cinomose seja uma enfermidade muito estudada, no existem pesquisas sobre tratamento antiviral especfico. Atualmente, o tratamento basicamente de suporte e sintomtico, dependendo diretamente da imunidade do animal. A utilizao de soro hiperimune est restrita fase virmica da doena, onde ainda existem vrus livres e uma conduta bastante discutvel. Muitos estudos priorizam a preveno da doena, considerando que as vacinas podem reduzir bastante incidncia da mesma. Recentemente, a pesquisa de vacinas com seqncia de DNA est sendo desenvolvida com objetivo de minimizar os problemas ps-vacinais, como a encefalite causada pelo vrus vacinal pouco atenuado. O uso das vacinas est diretamente relacionada com a conscientizao e condio econmica da populao. A produo de novas vacinas mais seguras e eficientes, as tornam cada vez menos acessveis populao de baixa renda, sendo observado um aumento da incidncia da enfermidade nos animais por ela mantidos. Os objetivos dos estudos sobre cinomose realizados no Brasil deveriam priorizar o estabelecimento de protocolos teraputicos, para evitar a alta taxa de mortalidade; ao mesmo tempo cuidar da conscientizao da populao e na busca de vacinas ainda mais efetivas.

179

4. Bibliografia BIAZZONO, L.; HAGIWARA, M. K.; CORRA, A. R. Avaliao da resposta imune humoral em ces jovens imunizados contra a cinomose com vacina de vrus atenuado. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 38, n. 5, p. 245250, 2001. BRITO, A. F. et al. Epidemiological and serological aspects in canine toxoplasmosis in animals with nervous symptoms. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 97, n. 1, p. 31-5, jan. 2002. BRGE, T. et al. Antiviral Antibodies Stimulate Production of Reactive Oxygen Species in Cultured Canine Brain Cells Infected with Canine Distemper Virus. Journal of Virology, v. 63, n. 6, p 2790-2797, jun. 1989. CORRA, C. N. M. Cinomose. In: CORRA, W. M.; CORRA, C. N. M. (Eds). Enfermidades Infecciosas dos Mamferos Domsticos. Rio de Janeiro: Medsi, 1992. p. 655-670. GAMA, F. G. V. et al. Caracteres fsico-qumicos e citolgicos do lquor de ces em diferentes fases da cinomose. Cincia Rural, v.35, n. 3, p. 596-601, mai./jun. 2005. GEBARA, C. M. S., et al. Leses histolgicas no sistema nervoso central de ces com encefalite e diagnstico molecular da infeco pelo vrus da cinomose canina. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia, v. 56, n. 2, p 168-174, abr. 2004. GREENE, C. E.; APPEL, M. J. Canine Distemper In: GREENE, C. E. (Eds). Infectious Diseases of the Dog and Cat. Philadelphia: Elsevier, 2006. p 25-41. GRNE, A.; ALLDINGER, S.; BAUMGRTNER, W. Interleukin-1, -6, -12 and tumor necrosis factor- expression in brains of dogs with canine distemper virus infection. Journal of Neuroimmunology, v. 110, p 20-30, 2000.

180

HEADLEY, S. A., GRAA, D. L. Canine distemper: epidemiological findings of 250 cases. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 37, p. 136140, 2000. JONES, T. C., HUNT, R. D., KING, N. W. Patologia Veterinria. So Paulo: Manole, 2000. p. 1415. KHUTH, S. T., et al. Morbilivirus Infection of the Mouse Central Nervous System Induces Region-Specific Upregulation of MMPs and TIMPs Correlated to Inflamatory Cytokine Expression. Journal of Virology, v. 75, n. 17, p. 8268-8282, set. 2001. KRAKOWKA, S. et al. Myelin-Specific Autoantibodies Associated with Central Nervous System Demyelination in Canine Distemper Virus Infection. Infection and Immunity, v. 8, n. 5, p 819-827, nov. 1973. MARKUS, S., FAILING, K., BAUMGRRTNER, W. Increased expression of proinflammatory cytokines and lack of up-regulation of anti-inflammatory cytokines in early distemper CNS lesions. Journal of Neuroimmunology, v. 125, p 30-41, 2002. MIAO, Q. et al. Phase-dependent expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in demyelinating canine distemper encephalitis. Acta Neuropathologica, v. 106, p 486-494, ago. 2003. MORETTI, L. D. et al. Toxomplasma gondii genotyping in a dog co-infected with distemper virus and ehrlichiosis Rickettsia. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, v. 48, n. 6, p. 359-363, nov/dez. 2006. MORO, L.; VASCONCELOS, A. C. Patogenia da imunossupresso na cinomose canina. A Hora Veterinria, v. 17, n. 102, p. 53-7, mar/abr. 1998.

181

SATIO, T. B. et al. Detection of canine distemper virus by reverse transcriptasepolymerase chain reaction in the urine of dogs with clinical signs of distemper encephalitis. Disponvel em: www.sciencedirect.com mar. 2005. STEIN, V. M. et al. A. Microglial cell activation in demyelinating canine distemper lesions. Journal of Neuroimmunology, v. 153, p. 122-131, mai. 2004. STERN, L. B. L. et al. The Hemagglutinin Envelope Protein of Canine Distemper Virus (CDV) Confers Cell Tropism as Illustrated by CDV and Measles Virus Complementation Analysis. Journal of Virology, v. 69, n. 3, p 1661-1668, mar. 1995. SUMMERS, B. A., CUMMINGS, J. F., LAHUNTA, A. Veterinary Neuropathology. Mosby, 1995, p. 102-110. TIPOLD, A., VANDEVELDE, M., JAGGY, A. Neurological manifestations of canine distemper virus infection. Journal of Small Animal Pratice, v. 33, n. 10, p. 466-470, 1992. VANDEVELDE, M. The Pathogenesis of Nervous Distemper. Disponvel em: www.vin.com/proceedeings/proceedings.plx?CID=WSAVA&PID out, 2004, acesso em 15/01/2007. VANDEVELDE, M., ZURBRIGGEN, A. The neurobiology of canine distemper virus infection. Veterinary Microbiology, v. 44, n. 2-4, p 271-280, jan. 1995. VANDEVELDE, M.; ZURBRIGGEN, A. Demyelination in canine distemper virus infection: a review. Acta Neuropathologica, v. 109, p 56-68, jan. 2005. VITE, C. H. Inflammatory Disease of the Central Nervous System. In: VITE, C. H. Braunds Clinical Neurology in Small Animals: Localization, Diagnosis and Treatment (Eds.) New York: International Veterinary Information Service

(www.ivis.org), fev. 2005.

182

Von MESSLING, V. et al. The hemagglutinin of Canine Distemper Virus Determines Tropism and Cytopathogenicity. Journal of Virology, v. 75, n. 14, p 6418-6427, jul. 2001. Von MESSLING, V. et al. Canine Distemper Virus and Measles Virus Fusion Glycoprotein Trimers: Partial Membrane-Proximal Ectodomain Cleavage Enhances Function. Journal of Virology, v. 78, n. 15, ago. 2004. WNSCHMANN, A. et al. Indentification of CD4+ and CD8+ T cell subsets and B cell in the brain of dogs with spontaneous acute, subacute-, and chronic-demyelinating distemper encephalitis. Veterinary Immunology and Immunopathology, v. 67, p 101116, 1999. ZURBRIGGEN, A. et al. Canine Distemper Virus Persistence in the Nervous System Is Associated with Noncytolytic Selective Virus Spread. Journal of Virology, v. 69, n. 3, p. 1678-1686, mar. 1995a. ZURBRIGGEN, A. et al. Selective spread and reduced virus release leads to canine distemper virus persistence in the nervous system. Veterinary Microbiology, v. 44, p 281-288, 1995b.

183

Normas da Revista Veterinria e Zootecnia: INSTRUES AOS AUTORES Devem ser estruturados de acordo com os seguintes itens: 1. Pgina de rosto, com: Ttulo do trabalho em portugus, em ingls e em espanhol, fonte Times New Roman, tamanho 12, com espaamento simples, em negrito e centralizado, no qual somente a primeira letra de cada palavra deve ser maiscula. Quando necessrio, indicar a entidade financiadora da pesquisa, como primeira chamada de rodap; Nomes completos dos autores, em que somente a primeira letra de cada nome deve ser maiscula, centralizado e em negrito. Digit-los, separados por vrgulas, com chamadas de rodap numeradas e em sobrescrito, que indicaro o cargo e o endereo profissional dos autores (inclusive endereo eletrnico), seguidos da instituio onde o trabalho foi desenvolvido ou s quais esto vinculados; Nome, endereo, telefone, fax e correio eletrnico, para correspondncia; Em caso de envolvimento de seres humanos ou animais de experimentao, encaminhar o parecer da Comisso de tica ou equivalente, assinalando, no trabalho, antes das referncias, a data de aprovao. 2. Pgina com resumo, abstract e resumen Tanto o resumo, como o abstract e o resumen devem ser seguidos do ttulo do trabalho, no respectivo idioma, e conter no mximo 400 palavras cada um, com informaes referentes introduo, metodologia, resultados e concluses. O texto deve ser justificado e digitado em pargrafo nico e espao 1,5, comeando por RESUMO. O abstract, e o resumen, devem ser traduo fiel do resumo. Se for apresentado em ingls, deve conter tambm, resumos em portugus e espanhol; se for em espanhol, resumos em portugus e ingls. Devem conter, no mximo, cinco palavras-chave, key words, e palabras-clave que identifiquem o contedo do texto. 3. A estrutura do artigo dever conter: Introduo: Deve ser clara, objetiva e relacionada ao problema investigado e literatura pertinente, bem como aos objetivos da pesquisa. A introduo estabelece os objetivos do trabalho.

184

Material e Mtodos: Deve oferecer informaes de reprodutibilidade da pesquisa, de forma clara e concisa, como variveis, populao, amostra, equipamentos e mtodos utilizados, inclusive os estatsticos. Resultados: Apresentao dos resultados obtidos, que devem ser descritos sem interpretaes e comparaes. Poder ser sob a forma de tabelas, em folha parte, no mximo de cinco, ordenadas em algarismos arbicos e encabeadas pelo ttulo, de acordo com as normas de apresentao tabular da ABNT/WBR 6023/2000 da Associao Brasileira de Normas Tcnicas, identificadas no texto como Tabela; sob a forma de figuras, nos casos de grficos, fotografias, desenhos, mapas, etc., ordenadas em algarismos arbicos, at no mximo de seis, e citadas no texto como Figura. Devem ser identificadas em folha parte, onde deve constar o ttulo do artigo. Fotografias podem ser em preto e branco ou coloridas, identificadas com o(s) nome(s) do(s) autor(es) no verso. No caso de desenhos originais, a impresso deve ser em papel adequado, de qualidade. Se o trabalho for apresentado na lngua portuguesa ou espanhola, os enunciados das tabelas e figuras bem como das variveis apresentadas devero estar tambm escritos em ingls. Discusso: Deve ser entendida como a interpretao dos resultados, confrontando com a literatura pertinente, apresentada na introduo. Se julgar conveniente, os resultados e a discusso podero ser apresentados conjuntamente. Concluses: a sntese final, fundamentada nos resultados e na discusso. Referncias: Devem ser apresentadas de acordo com as normas da ABNT, e o arranjo deve ser em ordem alfabtica por sobrenome do autor. Devero ser editorados em Microsoft Word for Windows, para edio de textos, Excel (qualquer verso) para grficos, formato JPEG ou GIF (imagem) para fotografias, desenhos e mapas, em trs vias (uma original e duas cpias) impressas, formato A4 (21,0 x 29,7 cm), em espao duplo, mantendo margens de 2,5 cm, nas laterais, no topo e p de cada pgina, fonte Times New Roman, tamanho 12 e numerao consecutiva das pginas em algarismos arbicos, a partir da folha de identificao. Ilustraes e legendas devem ser apresentadas em folhas separadas. Encaminhar cpia em disquete 3 de alta densidade ou CD, identificado com ttulo do artigo e nome dos autores. Nas duas cpias deve(m) ser omitido(s) o(s) nome(s) do(s) autor(es), o local onde se realizou o trabalho, bem como o rodap. No sero fornecidas separatas. Os artigos estaro disponveis no formato PDF no endereo eletrnico da revista. Para as demais sees da revista so vlidas as normas 185

anteriores. No devem exceder a 15 pginas. Abreviaturas no usuais devem ser empregadas aps escritas por extenso na primeira utilizao. ARTIGOS DE REVISO BIBLIOGRFICA Os artigos de reviso bibliogrfica sero publicados nas lnguas portuguesa, inglesa e espanhola, quando o autor apresentar contribuio cientfica, relevante na rea especfica do assunto abordado, a convite dos editores. Devero conter: Ttulo (portugus, ingls e espanhol), resumo, palavraschave, abstract, key words, resumen, palabras-clave, introduo, desenvolvimento do assunto, concluso e referncias. Devero conter no mximo 20 pginas com 60 referncias.

186