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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS RUMINAIS POR

METABARCODING EM BOVINOS

Laís Gabrielly Freitas Lima

Orientador (a): Profa. Dra. Eliane Sayuri Miyagi Okada
 ii

GOIÂNIA
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LAÍS GABRIELLY FREITAS LIMA

IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS RUMINAIS POR

METABARCODING EM BOVINOS

Dissertação apresentada para obtenção do título de

Mestre em Zootecnia junto à Escola de Veterinária e
Zootecnia da Universidade Federal de Goiás.

Área de concentração:
Produção Animal

Orientador:
Profa. Dra. Eliane Sayuri Miyagi Okada – EVZ-UFG

Comitê de Orientação:
Profª. Dra. Cintia Pelegrineti T. de A. Brito-ICB-UFG
Prof. Dr. Reginaldo Nassar Ferreira – ICB-UFG

GOIÂNIA
2020
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v
 vi

Aos meus pais Ana Clesia e Luciano, pelo

amor, pela confiança e por sempre
acreditarem em mim.

DEDICO.
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AGRADECIMENTOS

À Deus, por guiar-me com sabedoria em meio a tantos obstáculos, para que pudesse
chegar à conclusão de mais uma etapa em minha vida profissional.
Ao INCT em Ecologia, Evolução e Conservação da Biodiversidade (EECBio); Ao
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq; A Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás – FAPEG, por disponibilizarem recursos para a
execução deste experimento e, a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior – CAPES, pela concessão da bolsa de estudos.
Às empresas Koneksi e Primasea, por viabilizarem recursos financeiros para tornar
o experimento possível.
À Universidade Federal de Goiás e ao Programa de Pós-graduação em Zootecnia,
pelo respaldo físico e pessoal, representado pelas estruturas anexas e funcionários de excelência
sempre a prontidão ao cumprimento de nossas demandas.
Em especial aos meus pais Ana Clesia Freitas da Silva e Luciano Alasmar, pelo
apoio incondicional aos meus objetivos, por tanto amor e compreensão, por serem a minha fonte
de inspiração e amparo.
Aos meus avós, Odete de Freitas e Gentil Honório e, Antônio Carlos Croce e Ruth
Maria Croce que me transbordaram de carinho e amor sempre.
A minha irmã Anna Rita Freitas Alasmar, pelo carinho retribuído, puxões de orelha
nos momentos de petulância e pelo companheirismo no momento de estudo.
Ao meu irmão Thiago Freitas Croce, pelas meias palavras que dizem tudo,
mensagens que me encorajam, e que independe da distância me motiva a seguir seus passos.
A minha cunhada Jessica França, por ser tão querida quanto uma irmã.
Ao meu companheiro de vida Fernando Dias, que me deu força nos momentos de
tormenta, conselhos nos momentos de fraqueza além de, muita compreensão e carinho em todos
os momentos.
Aos meus familiares, que por tanto tempo me ausentei, e me fizeram sempre
presente.
Em especial, ao meu tio tão querido Gesvaldo Pinto Brasileiro, que sem dúvida
alguma estaria presente na minha defesa, aplaudindo mais uma conquista da sua filha postiça,
in memoriam.
 viii

À minha orientadora, Dra. Eliane Sayuri Miyagi, pela compreensão e positividade

nos momentos em que não acreditava ser possível, e por me mostrar com tanta força que carrega
dentro de sí, que o mundo vai além da universidade.
Ao meu co-orientador tão querido Dr. Reginaldo Nassar Ferreira, pela acolhida
quando eu mais precisei, e por ser um entusiasta do meu futuro acadêmico, pessoas como o
senhor me fazem acreditar no profissionalismo. Estendo os meus agradecimentos a Maristela
sua esposa, principalmente por me fazer enxergar o quanto eu estava precisando de ajuda.
À Dra. Mariana Pires de Campos Telles, pela oportunidade em participar da sua
equipe fantástica, por acreditar no meu potencial e pelas valiosas contribuições como membro
da banca.
Em especial, a minha coorientadora e amiga, Cíntia Pelegrineti Targueta de
Azevedo Brito, por todas as palavras incentivo, apoio, paciência ao me ensinar e explicar por
varias vezes alguma etapa, por se preocupar comigo e dividir momentos de risadas,
preocupações e muita felicidade. Obrigada por ter tornado meus dias com a genética mais leves
e felizes, me inspirando a ser uma profissional ética e extremamente competente, como também,
uma supermãe. Obrigada de coração Cíntia.
Ao querido prof. Dr. Diogo Alves da Costa Ferro, por me acompanhar desde o iníco
da minha vida acadêmica, seu reflexo como profissional e como pessoa me ajudaram a trilhar
meu caminho até aqui.
Ao Rhewter Nunes, por auxiliar nas análises de bioinformática, como também por
todos os puxões de orelha quando eu mereci, e por me ensinar que o conhecimento é adquirido
quando realmente nos esforçamos e buscamos por ele.
À minha querida amiga Amanda Martins Apolinário, por ter segurado as minhas
mãos e tornado tudo bem mais fácil. Obrigada pela amizade e companheirismo durante essa
caminhada.
Ao meu amiguinho Juliano Silva, que desde o primeiro dia de aula se fez especial,
compartilhando momentos únicos de questionamentos, desespero, mas também de muitas
risadas e cumplicidade.
À minha amiga de longa data Raiany Soares, pelas palavras de incentivo, força,
motivação e por me trazer tanta calmaria quando eu so enxergava a tempestade. Obrigada por
ser tanto.
À minha querida Ludmilla Brunes, pela amizade ímpar, pelos conselhos, pelo
exemplo de bondade e ser de luz. Obrigada por ser meu referencial quanto pessoa e profissional.
 ix

À Marielly Durães, por todo incentivo na área acadêmica, por me entender e me

ajudar a superar os obstáculos da vida. Obrigada por ser essa grande amiga, que tornou os meus
dias mais alegres e felizes.
Aos meus amiguinhos Ana Lúcia, Sarah, Anderson, Priscila, Ronaildo e Danilo
Tomazello, por todos os momentos de questionamento, esclarecimentos, risadas e superação,
obrigada pela leveza que me transmitiram durante essa caminhada
Aos colegas de Pós-graduação do Departamento de Zootecnia, Deibity, Lorena,
Cibelle, Daiana, Luan, Angélica, Regina, Júlio, Geovane, Bruna, Fabiana, Taynara, Carol,
Kaique, Hélder, Adalto, Júlia e Melody, obrigada pelos momentos de convivência e
positividade.
Aos professores dos cursos de Pós-graduação da Escola de Veterinária e Zootecnia:
Maurícia Brandão, Heloisa Helena, Cristiano Prado, Victor Rezende e Emmanuel Arnhold,
pelas oportunidades ofertadas e por cada palavra de incentivo que me motivaram a seguir em
frente com persistência e foco.
Aos colegas do Laboratório de Genética & Biodiversidade (LGBio), Sarah
Romana, Amanda Melo, Ariany, Laís, Ramila, Andrezza, Larissa e Vitória, obrigada pelo
conhecimento compartilhado.
Aos colegas de equipe ruminantes, Débora, Luís Fernando, Luís Caixeta, Fernando,
Gabriela, Renata e Rodrigo, o meu muito obrigada por tornarem a execução do experimento
possível, os finais de semana mais alegres, e as coletas únicas.
Aos meus amigos de longa data, Patrícia, Lainny, Lídia, Nikoly e ao Lucas
Matheus, por todo carinho, conselhos, paciência e colaboração no momento de execução deste
trabalho, vocês foram essenciais para que pudesse concluir mais esta etapa profissional.
À professora Karine Borges Machado, pelo valioso auxílio com os dados rarefeitos.
A todos aqueles que contribuíram de forma direta e indiretamente para a realização
deste trabalho.
 x

“Viver é sempre dizer aos outros que eles são

importantes. Que nós os amamos, porque um
dia eles se vão e ficaremos com a impressão de
que não os amamos o suficiente”.

Chico Xavier
 xi

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................xiii

LISTA DE TABELAS ............................................................................................................ xiv

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS .............................................................................. xv

RESUMO ............................................................................................................................... xvii

ABSTRACT ..........................................................................................................................xviii

CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES INICIAIS .................................................................... 1

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 1

2. REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................................. 3

2.1. Caracterização do microbioma ruminal ........................................................................................... 3

2.2. Efeitos da relação volumoso:concentrado sobre características fermentativas do rúmen ................ 6

2.3. Aditivos tamponantes ....................................................................................................................... 8

2.3.1. Alga marinha: Lithothamnium calcareum..................................................................................... 9

2.4. Sequenciamento de Nova Geração e identificação de microrganismos ......................................... 10

3. Objetivo Geral ...................................................................................................................... 14

3.1 Objetivos específicos....................................................................................................................... 14

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 15

CAPÍTULO 2 – Verificação dos parâmetros séricos, metabólicos e do microbioma

ruminal por metabarcoding em bovinos Nelores suplementados com Lithothamnium
calcareum ................................................................................................................................. 20

Resumo ..................................................................................................................................... 20

1. Introdução ............................................................................................................................ 21

2. Material e métodos............................................................................................................... 22

2.1 Delineamento experimental ........................................................................................................... 22

2.2 DNA Metabarcoding ..................................................................................................................... 23

2.3 Análise estatística................................................................................................................24

3. Resultados ............................................................................................................................ 25
 xii

3.1 Efeito da suplementação com aditivo tamponante sobre os parâmetros ruminais ........................ 25

3.2 Sequenciamento do gene 16S rRNA e Identificação das bactérias ruminais por metabarcoding . 26

4. Discussão ............................................................................................................................. 27

4.1 Variações nos parâmetros ruminais e bioquímicos em função da alimentação ............................. 27

4.2 Metabarcoding: Principais filos e gêneros .................................................................................... 30

5. Conclusão............................................................................................................................. 32

6. Contribuições do Autor ........................................................................................................ 32

7. Declaração de conflito de interesse ..................................................................................... 32

8. Agradecimentos ................................................................................................................... 32

9. Referências........................................................................................................................... 33

ANEXO A - APROVAÇÃO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS ........... 38

Figuras e Tabelas suplementares .............................................................................................. 39

CAPÍTULO 3 - CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................... 46

 xiii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Variação do pH ruminal ao longo do dia em uma dieta rica em concentrado, em

função do uso de aditivos .............................................................................. 43
FIGURA 2 - Curva de rarefação das OTUs identificadas. Apresentando o número de OTUs,
considerando a uma identidade de 97% com base nas sequencias do gene 16S
rRNA da digesta do rúmen de bovinos Nelore, alimentados com uma dieta de
alto concentrado e com a inclusão de aditivos tamponantes................................ 43
FIGURA 3 - Distribuição taxonômica a nível de filo bacteriano do metagenoma total do
conteúdo ruminal de bovinos da raça Nelore, por meio da ferramenta de
metabarcoding 16S............................................................................................... 44
FIGURA 4 - Riqueza de espécies a nível de gênero dos sete principais filos bacterianos, a
partir das sequencias do gene 16S rRNA do conteúdo ruminal de bovinos
Nelore, através da plataforma Illumina Miseq...................................................... 44
FIGURA 5 - Abundância dos principais gêneros bacterianos identificados com base nas
sequencias do gene 16S rRNA do conteúdo ruminal de bovinos Nelore, através da
plataforma Illumina Miseq............................................................................... 45
FIGURA 6 - Diversidade dos principais gêneros bacterianos com base nas sequencias do
gene 16S rRNA do conteúdo ruminal de bovinos Nelore, através da plataforma
Illumina Miseq...................................................................................................... 45
 xiv

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Efeitos da alga marinha Lithothamnium calcareum e do bicarbonato de

sódio no pH ruminal de bovinos Nelore em uma dieta de alto
concentrado............................................................................................ 39
TABELA 2 - Concentração de ácidos graxos de cadeia curta do liquido ruminal de
bovinos Nelore sob inclusão de aditivos tamponantes em uma dieta de alto
concentrado, avaliados no período que antecede e pós alimentação .......... 39
TABELA 3 - Proporção molar de ácidos graxos de cadeia curta do liquido ruminal de
bovinos Nelore sob inclusão de aditivos tamponantes em uma dieta de alto
concentrado, avaliados no período que antecede e pós alimentação ............ 40
TABELA 4 - Parâmetros sanguíneos de bovinos Nelore sob inclusão de aditivos
tamponantes em uma dieta de alto concentrado..................................... 40
TABELA 5 - Abundância bacteriana ruminal a nível de gênero de bovinos Nelore sob
inclusão de aditivos tamponantes em uma dieta de alto concentrado,
utilizando a ferramenta metabarcoding 16S rRNA.................................... 41
TABELA 6 - Diversidade bacteriana ruminal a nível de gênero de bovinos Nelore sob
inclusão de aditivos tamponantes em uma dieta de alto concentrado,
utilizando a ferramenta metabarcoding 16S rRNA................................ 42
 xv

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

< - menor
> - maior
ABIEC - Associação Brasileira das Industrias Exportadoras de Carne
°C - graus celsius
A:P - relação acetato propionato
AGCC - Ácidos Graxos de Cadeia Curta
BIC - bicarbonato de sódio
CEUA - Comitê de Ética no Uso de Animais
CNF - carboidrato não fibroso
CO2 - dióxido de carbono
CON - controle
CONCEA - Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal
DNA - ácidos desoxirribonucléicos
EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético
FA - fosfatase alcalina
FDR - taxa de falsa descoberta
g - gramas
g/dL - gramas por decilitro
Gb - gigabases
GLI - glicose
h - horas
H+ - hidrogênio livre
H2 - hidrogênio
HTS - Sequenciamento em Alta Perfomance
kg - quilogramas
kg/hab/ano - quilogramas por habitante por ano
L - litros
L45 - lithothamnium calcareum 45g
L90 - lithothamnium calcareum 90g
LGBio - Laboratório de Genética e Biodiversidade
LS - lactato plasmatico
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MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

mg/dL - miligramas por decilitro
mg/L - miligramas por litro
mmol/L - milimol por litro
MS/dia - matéria seca por dia
ng/mL - nanogramas por mililitro
NGS - Sequenciamento de Nova Geração
nM - nanomolar
N-NH3 - nitrogênio amoniacal
OTUs - Unidade Taxonomica Operacional
pb - pares de bases
PCR - reação em cadeia da polimerase
pH - potencial hidrogeniônico
pKa - constante da acidez
primers - segmentos de ácidos nucleicos
PT - proteinas totais
reads - leituras
rRNA - ácido ribonucléico ribossómico
SARA - ácidose subaguda
sp - espécies
SP - São Paulo
T1 - tratamento 1
T2 - tratamento 2
T3 - tratamento 3
T4 - tratamento 4
TRI - triglicerídeos
U/L - unidades por litro
V:C - relação volumoso concentrado
 xvii

RESUMO

O aumento da eficiência alimentar é o objetivo-chave para a ciência dos ruminantes, onde

requer uma melhor compreensão sobre composição da comunidade microbiana ruminal.
Partindo do contexto de que a maior parte da digestão da dieta dos ruminantes é realizada pela
comunidade microbiana, objetivou-se utilizar a estratégia de DNA metabarcoding para
identificar as bactérias presentes no líquido ruminal de bovinos Nelores alimentados com dietas
ricas em concentrado, em resposta ao efeito modulatório dos aditivos tamponantes alga marinha
calcária (lithothamnium calcareum) e bicarbonato de sódio. Buscou-se caracterizar os índices
de riqueza e diversidade da comunidade bacteriana ruminal, além de investigar o impacto da
dieta potencialmente acidótica sobre o pH ruminal, parâmetros sanguíneos e perfil de ácidos
graxos de cadeia curta. Para tanto, foram utilizados quatro bovinos Nelore distribuídos em
quadrado latino 4 x 4 (quatro tratamentos e quatro períodos). Os tratamentos foram compostos
pela mesma dieta basal altamente concentrada, sendo: T1- sem aditivo (CON); T2- inclusão de
90 g de bicarbonato de sódio (BIC); T3- inclusão de 90 g de Lithothamnium calcareum (L90);
e T4- inclusão de 45 g Lithothamnium calcareum (L45). Para a construção da biblioteca 16S
DNA, o DNA total de amostras de líquido ruminal foi extraído e utilizado para amplificação do
gene de interesse por meio do uso de primers específicos. As bibliotecas foram sequenciadas
em plataforma de Sequenciamento Miseq, Illumina. As predições das unidades taxonômicas
operacionais (OTUs) foram feitas no programa UPARSE e a atribuição das sequências no banco
de dados RDP usando o percentual de identidade de 97%. Os dados foram analisados no
programa estatístico R, onde a diversidade e abundância a nível de gênero foram analisadas
pela ANOVA, utilizando o método não paramétrico, adotando o teste de Freedman com as
médias ajustadas pela correção de FDR. Já a análise do pH, parâmetros bioquímicos e AGCC
foram analisados pelo método paramétrico, utilizando o teste de Scott-Knott. Para ambos os
testes, as médias foram avaliadas a 10% de significância (p<0,10). Um total de mil quatrocentos
e setenta e quatro OTUs pertencentes a 52 gêneros e dezesseis filos do domínio Bactéria foram
identificadas. Os resultados revelaram que a microbiota bacteriana era dominada pelos filos
Firmicutes (44,12%), Bacteroidetes (28,29%) e Proteobactéria (5,88%). Animais alimentados
com L90 apresentaram uma maior abundância e diversidade ruminal para as bactérias do gênero
Prevotella (p<0,06% e p<0,09%), respectivamente. Bovinos suplementados com L45,
resultaram numa maior diversidade do gênero Fibrobacter (p<0,05). Houve uma diferença na
proporção molar para os ácidos acético (p<0,07%) e valérico (p<0,03%) no momento que
antecede a alimentação. Concentrações mais elevadas de lactato sanguíneo foram observados
nos animais sem a inclusão de aditivos (p<0,06%). Mais pesquisas acerca da comunidade
microbiana associadas ao perfil metabólico devem ser realizadas, principalmente em resposta
às diferentes dietas, afim de otimizar o sistema de produção animal.

Palavras-Chave: Bicarbonato de sódio; diversidade bacteriana; illumina miseq; lithothamnium

calcareum; microbiota; rúmen; sequenciamento de alta performance.
 xviii

ABSTRACT

Increasing feed efficiency is a key objective for ruminant science, where it requires a better
understanding of the composition of the rumen microbial community. Starting from the context
that most of the digestion of the ruminant diet is carried out by the microbial community, the
objective was to use the DNA metabarcoding strategy to identify the bacteria present in the
rumen liquid of Nelores cattle fed diets rich in concentrate, in response to modulatory effect of
buffering additives limestone kelp (lithothamnium calcareum) and sodium bicarbonate. We
sought to characterize the richness and diversity indexes of the ruminal bacterial community,
as well as to investigate the impact of the potentially acidic diet on ruminal pH, blood
parameters and short-chain fatty acid profile. For that, four Nellore cattle were used, distributed
in a 4 x 4 Latin square (four treatments and four periods). The treatments were composed by
the same highly concentrated basal diet, being: T1- without additive (CON); T2- inclusion of
90 g of sodium bicarbonate (BIC); T3- inclusion of 90 g of Lithothamnium calcareum (L90);
and T4- inclusion of 45 g Lithothamnium calcareum (L45). For the construction of the 16S
DNA library, the total DNA from ruminal fluid samples was extracted and used to amplify the
gene of interest through the use of specific primers. The libraries were sequenced on the Miseq
Sequencing platform, Illumina. The predictions of the operational taxonomic units (OTUs)
were made in the UPARSE program and the assignment of the sequences in the RDP database
using the 97% identity percentage. The data were analyzed using the statistical program R,
where diversity and abundance at the gender level were analyzed by ANOVA, using the non-
parametric method, adopting the Freedman test with the means adjusted by the FDR correction.
The analysis of pH, biochemical parameters and AGCC were analyzed by the parametric
method, using the Scott-Knott test. For both tests, the averages were assessed at 10%
significance (p<0.10). A total of one thousand four hundred and seventy-four OTUs belonging
to 52 genera and sixteen phyla from the Bacteria domain were identified. The results revealed
that the bacterial microbiota was dominated by the phyla Firmicutes (44.12%), Bacteroidetes
(28.29%) and Proteobacteria (5.88%). Animals fed with L90 showed a greater abundance and
ruminal diversity for bacteria of the genus Prevotella (p<0.06% and p<0.09%), respectively.
Cattle supplemented with L45, resulted in greater diversity of the genus Fibrobacter (p<0.05).
There was a difference in the molar ratio for acetic (p<0.07%) and valeric (p<0.03%) acids in
the moment before feeding. Higher blood lactate concentrations were observed in the animals
without the addition of additives (p<0.06%). More research on the microbial community
associated with the metabolic profile should be carried out, mainly in response to different diets,
in order to optimize the animal production system.

Keywords: Sodium bicarbonate; bacterial diversity; illumina miseq; lithothamnium calcareum;

microbiota; rumen; high performance sequencing.
 1

CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES INICIAIS

1. INTRODUÇÃO

A bovinocultura de corte é considerada uma atividade econômica consolidada em

todos os estados brasileiros, tendo sua importância mensurada em relatórios de estatísticas de
produção e consumo como a Associação Brasileira das Indústrias Exportadoras de Carne
(ABIEC). A ABIEC atribuiu ao Brasil no ano de 2018 o ranking de maior exportador mundial
de carne bovina com 2.2015,2 milhões de toneladas equivalente carcaça, apresentando-o como
o segundo maior produtor de carne bovina e detentor do maior rebanho comercial bovino com
aproximadamente 214,7 milhões de cabeças. Sendo também relatado um consumo per capita
de 42,12 kg/hab/ano, refletindo uma movimentação total atribuída a pecuária de 597,22 bilhões
de reais1.
Nesse contexto, visando atender a alta demanda mundial por proteína animal tem-
se requerido do setor pecuário altos índices de produtividade, se fazendo necessário maximizar
o sistema de produção animal através de novas tecnologias e alternativas de manejo nutricional,
como as dietas sem volumoso e de alto concentrado. Dessa forma, espera-se suprir o principal
gargalo da produção de carne no país, tido como a estacionalidade da produção de forrageiras2.
Entre as tecnologias adotadas, destaca-se o confinamento, um sistema de produção
intensiva que visa fornecer aos animais uma dieta altamente energética baseada em grãos, visto
que a produção brasileira deste componente é considerada elevada, o que contribui para que ela
seja utilizada na alimentação animal. Assim, a oferta do produto é considerada aporte para a
intensificação dos sistemas de produção em confinamentos que utilizam dietas com alta
densidade energética e sem volumoso, as quais possibilitaram o aumento da eficiência
alimentar, além de promoverem a antecipação da época do abate, como também proporcionam
um melhor acabamento e uniformidade da carcaça2.
Os custos com a alimentação continuam sendo os mais onerosos em um sistema de
produção. Entretanto, a otimização da eficiência alimentar dos bovinos abrange um esforço
relacionando à genética, manejo e dieta dos hospedeiros. A partir de então, revela-se que
possíveis alterações microbianas no hospedeiro podem influenciar uma infinidade de processos
relacionados aos processos de digestão, como também ao trato gastro intestinal. Populações
microbianas variáveis têm habilidades diferenciais para degradar os alimentos no rúmen em
nutrientes disponíveis para absorção, sendo então considerado uma rota possível para impactar
a eficiência no uso de alimentos3.
 2

Aumentar a produtividade pecuária com adoção de tecnologias que fazem uso de

dietas com baixa fibra é considerado o fator chave e de grande impacto para a ciência que estuda
a nutrição de ruminantes, uma vez que a dieta é tida como o principal determinante da
composição microbiana ruminal4. Todavia, esse tipo de alimentação com pouca fibra, pode
acarretar alguns distúrbios metabólicos como a acidose ruminal, se fazendo necessário a
utilização de aditivos que tem como princípio a melhoraria na eficiência da utilização dos
nutrientes, bem como estimular o crescimento ou beneficiar a saúde e o metabolismo dos
animais, atuando como principal mecanismo na limitação da queda do pH a fim de assegurar a
estabilidade do ambiente ruminal como também garantir o processo fermentativo5.
Partindo deste pressuposto, esforços contínuos para explorar a diversidade
microbiana do rúmen podem ser considerados como fontes valiosas para a pecuária moderna,
uma vez que poderiam auxiliar no conhecimento das vias metabólicas para a obtenção de
melhorias consistentes na eficiência alimentar ruminal6. Assim, se faz necessário caracterizar a
biodiversidade do ambiente ruminal com intuito de elevar a compreensão sobre a complexidade
da microbiota e a relação simbiótica entre microrganismos e hospedeiro, principalmente em
função da inclusão de dietas cada vez mais desafiadoras na alimentação do animal7.
Recentes avanços das técnicas moleculares, como a ferramenta Metabarcoding,
possibilitaram à identificação em larga escala da comunidade presente em uma amostra
ambiental, através da extração do DNA total, amplificação e sequenciamento de regiões
específicas do genoma dos organismos ali presentes8. Nesta técnica, o DNA genômico extraído
das amostras ambientais é utilizado para amplificação de genes conservados utilizando primers
universais e sequenciados com tecnologias de sequenciamento de alto desempenho, sendo
considerada mais rápida e eficiente para identificação da biodiversidade em comparação aos
métodos tradicionais. Deste modo, comportam uma melhor cobertura para identificação da
comunidade e, como também, de táxons raros9.
Diante do exposto, objetivou-se utilizar a estratégia de DNA metabarcoding para
identificar as bactérias presentes no líquido ruminal de bovinos Nelores alimentados com dietas
ricas em concentrado, em resposta ao efeito modulatório dos aditivos tamponantes alga marinha
calcária (lithothamnium calcareum) e bicarbonato de sódio. Além de caracterizar os índices de
riqueza e diversidade da comunidade bacteriana ruminal, como também investigar o impacto
da dieta potencialmente acidótica sobre o pH ruminal, parâmetros sanguíneos e perfil de ácidos
graxos de cadeia curta.
Diante do exposto, objetiva-se identificar as bactérias ruminais de bovinos Nelores
arraçoados com dietas ricas em concentrado, por meio da estratégia de DNA metabarcoding
 3

por sequenciamento parcial do gene 16S rRNA; bem como, avaliar a resposta dos aditivos
tamponantes bicarbonato de sódio e a alga marinha calcaria (lithothamnium calcareum) sob os
índices de riqueza e diversidade, pH ruminal, parâmetros sanguíneos e concentração de ácidos
graxos de cadeia curta (AGCC).

2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Caracterização do microbioma ruminal

Os ruminantes são definidos pelo seu modo em que digerem o alimento vegetal.
Possuem o estômago dividido em quatro cavidades: rúmen, retículo, omaso e abomaso. Dentre
eles, o rúmen é considerado uma cavidade especial, sendo um órgão que permite a digestão
 4

microbiana parcial do alimento antes de entrar no estômago verdadeiro. Todavia, os próprios

ruminantes não produzem enzimas necessárias para degradar a maioria dos polissacarídeos
vegetais complexos, sendo o rúmen responsável por fornecer um ambiente para um rico e denso
consórcio de microrganismos anaeróbicos que executam esse papel metabólico4.
Entre as particularidades do rúmen, evidencia-se o seu sistema isotérmico de 38 e
42º C, o qual é regulado pelo metabolismo homeotérmico do animal hospedeiro, além do pH
constante compreendendo a faixa de 6,0 e 7,0 para assegurar a homeostase dos microrganismos.
Essa faixa de pH é mantida, principalmente, em virtude da remoção de alguns ácidos pelo
processo fermentativo, que são absorvidos e neutralizados pela ação tamponante da saliva
animal e a baixa quantidade de oxigênio presente no rúmen, fato este que contribui para o
desenvolvimento e manutenção de microrganismos anaeróbios10.
O ecossistema microbiano do rúmen é caracterizado pela alta densidade
populacional compreendida por microrganismos procarióticos (bactérias e archaea) e
eucarióticos (protozoários e fungos) que são altamente especializados na degradação da
biomassa lignocelulósica. Portanto, o hospedeiro ruminante depende da matriz de enzimas
produzidas pela comunidade microbiana para converter substratos fibrosos complexos de sua
alimentação em sacarídeos fermentáveis. Os açúcares liberados do material vegetal passam a
ser fermentados pelas bactérias do rúmen, sendo convertidos em produtos finais de fermentação
como ácidos graxos de cadeia curta (AGCC): acetato, propionato e butirato. Esses AGCC,
juntamente com a proteína microbiana11 permitem que os ruminantes obtenham
aproximadamente 70% de sua energia metabólica como fonte para manutenção, crescimento,
lactação e produtividade do animal4,12,13,14,15.
Dentre o total de domínios presentes no ecossistema ruminal, as bactérias são
consideradas os organismos mais abundantes e diversos, apresentando aproximadamente 95%
da microbiota total16. A classificação destas bactérias é realizada pelo tipo de substrato utilizado
e os produtos oriundos do seu processo fermentativo. Portanto, o conhecimento sobre as
comunidades é de extrema importância para compreender as transformações ruminais do
material vegetal4. Assim, as bactérias em questão podem ser classificadas em bactérias
fermentadoras de carboidratos fibrosos, fermentadoras de carboidratos não fibrosos,
proteolíticas (aminolíticas), láticas, pectinolíticas, lipolíticas, ureolíticas e metanógenas10.
As bactérias fermentadoras de carboidratos fibrosos associam-se às fibras dos
alimentos e degradam componentes da parede celular dos vegetais, particularmente celulose e
hemicelulose. Os principais representantes são: Ruminococcus albus, Ruminococcus
flavefaciens, Fibrobacter succinogenes 17, 10.
 5

As bactérias fermentadoras de carboidratos não fibrosos são caracterizadas por se

associarem às partículas de grãos de cereais ou grânulos de amido, degradando carboidratos de
natureza não estrutural como amido, assim como, outros tipos de carboidratos presentes no
rúmen, como dextrinas, açúcares e frutosanas. A taxa de crescimento desse grupo é
relativamente mais alta, podendo utilizar amônia, aminoácidos ou peptídeos para a síntese de
suas proteínas. Os principais representantes são: Streptococcus bovis, Ruminobacter
amylophilus, Lactobacillus sp. e Prevotella sp 10.
As bactérias proteolíticas comportam, em sua maioria, bactérias degradadoras de
proteínas. No entanto, existem algumas poucas espécies que utilizam principalmente
aminoácidos como substratos energéticos e possuem uma atividade proteolítica bem mais
intensa que as demais. Nesse grupo destacam-se as bactérias Peptotreotococci sp. e Clostridium
sp 10.
Dentre o grupo das bactérias láticas, destacam-se Megasphaera elsdenii e
Selenomonas ruminantium, as quais tem a função de utilizarem ácido lático como substrato
energético. As bactérias pectinolíticas exercem a função de fermentarem a pectina. Embora a
pectina seja um polímero de natureza estrutural, sua fermentação, assim como as características
das bactérias que a utilizam, é semelhante àquelas que utilizam carboidratos não estruturais,
tendo como principal representante a bactéria Succinivibrio dextrinosolvens10.
As lipolíticas, assumem o papel de hidrolisarem triglicerídeos em glicerol e ácidos
graxos, sendo representado, principalmente, pela bactéria Anaerovibrio lipolytica. As bactérias
ureolíticas apresentam-se aderidas ao epitélio ruminal e hidrolisam uréia, liberando amônia no
rúmen, como Enterococcus faecium. E por fim, as metanógenas, que são classificadas como
archaebacterias, e se diferenciam das demais bactérias pela estrutura da parede celular bem
como por serem quimotróficas. Elas são tidas como as mais estritamente anaeróbicas do rúmen
e produzem metano a partir de CO2 e H2. Os principais representantes são: Methanobacterium
sp. e Methanobrevibacter sp.10.
A microbiota ruminal é dominada por bactérias pertencentes, principalmente, aos
filos Bacteroidetes e Firmicutes, representando quase 80% da população bacteriana dependendo
da composição da dieta, idade e espécie de ruminante18, 19. Estes dois filos possuem espécies
bacterianas especialistas na degradação de biomassa vegetal20. As Bacteroidetes estão
diretamente relacionadas com a produção de AGCC21 em dietas ricas em concentrado pois este
filo utiliza basicamente o amido como fonte de energia22. Já o filo Firmicutes é encontrado em
abundância no rúmen quando o mesmo se encontra sob alta concentração de fibras na dieta23.
 6

Diversos trabalhos veem identificando os principais filos e o número de espécies de

microrganismos do rúmen de bovinos baseados por técnicas clássicas de cultivo. Essas técnicas
compreendem: isolamento, caracterização nutricional e enumeração celular. No entanto,
permitem um acesso limitado à diversidade de microrganismos. Estima-se que apenas 10-20%
da população de microrganismos do rúmen foram identificados24. Essa subestimação é devido
às dificuldades de cultivo dos microrganismos que impediram por muitos anos a compreensão
da estrutura da comunidade microbiana, principalmente em termos de espécie na maioria dos
ecossistemas.

2.2. Efeitos da relação volumoso:concentrado sobre características fermentativas do

rúmen

As dietas no sistema de bovinos confinados incluem basicamente alimentos

volumosos e concentrados. Alimentos volumosos são aqueles que possuem teor de fibra bruta
superior a 18% na matéria seca, como capins verdes, silagens, fenos, palhadas, etc. Já alimentos
concentrados, são aqueles com menos de 18% de fibra bruta na matéria seca, podendo ser
classificados como protéicos (quando possui mais de 20% de proteína na matéria seca) como o
caso das tortas de algodão e soja; ou energéticos (quando possui menos de 20% de proteína na
matéria seca) como o milho e farelo de arroz25.
O balanceamento e a relação volumoso:concentrado (V:C) da dieta de bovinos de
corte é dependente da qualidade do volumoso e da ração concentrada, como também da
necessidade de ganho de peso diário para os animais26. Em ruminantes, vários parâmetros
nutricionais podem ser influenciados pela relação do alimento (V:C) nas dietas, destacando as
características de fermentação ruminal, tais como o pH, concentração de nitrogênio amoniacal
(N-NH3) e produção de ácidos graxos de cadeia curta, como também o impacto sobre a
população de microrganismos ruminais27.
Os AGCC são considerados a principal fonte de energia para os ruminantes. Eles
são produzidos pelo processo de fermentação microbiana de carboidratos em função do
substrato, tendo como principais produtos o ácido acético, propiônico e butírico28. Estudos
realizados indicam que as proporções molares de acetato:propionato:butirato são consideradas
variáveis, podendo ser encontrados valores de 75:15:10 em dietas ricas em carboidratos
fibrosos, e de até 40:40:20 em dietas ricas em carboidratos não fibrosos (CNF)29.
A relação da proporção de V:C nas dietas dos bovinos influenciam a atividade e o
crescimento de bactérias específicas que atuam no processo de degradação no rúmen. Assim
 7

dietas ricas em volumosos tendem a selecionar bactérias celulolíticas e dietas ricas em

concentrado selecionam bactérias amilolíticas, refletindo também na abundância e diversidade
dos microrganismos ali existentes.
Visando ofertar aos animais dietas altamente concentradas, deve-se levar em
consideração que o crescimento microbiano está associado ao aumento da disponibilidade de
carboidratos fermentáveis na dieta. Todavia, dietas com essas características, tendem a impactar
diretamente em um baixo pH ruminal (<6,0), propiciando o crescimento de bactérias produtoras
de lactato, por meio da proliferação de bactéria Streptococcus bovis. Essa produção de lactato
pode desencadear a acidose ruminal30, 31, 32, 33.
Como estratégia para assegurar o fornecimento constante de carne e leite de
ruminantes aos consumidores, se faz necessário adotar sistemas intensificados de produção que
contam com a incorporação de dietas altamente digeríveis contendo grandes quantidades de
carboidratos prontamente fermentáveis na alimentação dos bovinos34.
Entretanto, a quebra de uma grande quantidade de materiais facilmente
fermentáveis pode conduzir a um aumento na produção de ácidos graxos voláteis e nos níveis
de ácido lático levando a um rompimento dos mecanismos fisiológicos de homeostase. Em
decorrência, ocorre uma redução do pH ruminal, alteração da ecologia microbiana do rúmen,
fazendo com que o animal fique mais suscetível a doenças metabólicas e infecciosas35,36. A
perda da homeostase pode se agravar em casos de ruminite, permitindo a passagem de bactérias
e toxinas do rúmen para a corrente sanguínea, e favorecendo o desenvolvimento de doenças
ainda mais graves como laminite e acidose subaguda (SARA), podendo levar o animal a
morte37.
O pH ruminal é tido como um fator crítico na função normal e estável do rúmen,
principalmente em relação ao seu impacto nas populações microbianas, nos produtos de
fermentação e nas funções biológicas do rúmen, como a motilidade e a função de absorção33.
Deste modo, quando se oferta ao animal dietas ricas em grãos, ou quando o
volumoso disponibilizado possui tamanho de partículas inadequadas, diminui-se a atividade e
efetividade da fibra, que refletem na diminuição da capacidade de tamponamento do rúmen. A
redução da eficiência de tamponamento é resultante da limitação que o animal possui em
secretar saliva de maneira satisfatória33, sendo necessário a inclusão de aditivos na dieta38.
Nesse contexto, avanços científicos sobre as exigências dos animais e dos valores
nutritivos dos alimentos propiciam a descoberta de compostos que aumentam o desempenho
dos animais por promover uma melhor eficiência da utilização da dieta, controlando o processo
 8

fermentativo e mantendo a estabilidade do pH ruminal. Essas novas classes de substâncias são

denominadas como aditivos alimentares39,40.

2.3. Aditivos tamponantes

Considerando que a alimentação nos sistemas de produção animal podem

representar 70% do custo de produção41, maximizar o aproveitamento da dieta torna-se de
extrema relevância, visto que novas tecnologias nutricionais surgem como ferramentas para
auxiliar todo este processo.
Os aditivos alimentares são amplamente utilizados para melhorar a eficiência da
utilização da dieta42, sendo salientado que mais de 90% dos nutricionistas utilizam algum tipo
de aditivo para maximizar o desempenho dos animais. Os aditivos mais usados no sistema de
produção animal são os ionóforos, seguido pelos tamponantes, probióticos, leveduras e
antibióticos não ionóforos43.
O ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) define aditivo
como quaisquer substâncias, microrganismos ou produtos formulados, ao qual são adicionados
intencionalmente aos produtos, que não são utilizados como ingredientes, possua ou não valor
nutritivo, e que acima de tudo melhore as características dos produtos destinados à alimentação
animal, melhorando também o desempenho de animais saudáveis ou que atenda às necessidades
nutricionais44.
A utilização de aditivos tamponantes é considerada uma prática consolidada na
nutrição de ruminantes, uma vez que essas substâncias são amplamente utilizadas em dietas
ricas em concentrado para prevenir distúrbios metabólicos42. O termo tampão tem sido
empregado tanto para tampões quanto para substâncias alcalinizantes, entretanto, exitem
diferenças entre elas.
As substâncias tamponantes são caracterizadas por ajudarem a promover a
resistência à variação do pH, atuando como um estabilizante. Assim, ela reage com íons H+
livres em solução, mantendo o pH do meio próximo ao pKa do sistema tampão, ou seja, pH em
que espécies protonadas e desprotonadas estão presentes em mesma concentração45. Deste
modo, a substância tampão atua como uma reserva de hidrogênio, e, quando há excesso de
hidrogênio na solução, isto é, pH baixo, o tampão atua no processo de captação dos H+. Em
contrapartida, substâncias alcalinizantes além de atuarem no processo de captação do
hidrogênio, promovem o aumento do pH da solução em questão46.
 9

O bicarbonato de sódio tem sido utilizado como o tampão dietético mais popular
nos últimos anos47, justamente por ser considerado eficaz ao neutralizar a acidez e assegurar a
estabilidade do pH do rúmen48 a fim de garantir o processo fermentativo42. Além disso, melhora
a eficiência da digestão das fibras e contribui para uma melhoria na síntese de proteína
microbiana49. Entretanto, como tampão solúvel, o bicarbonato possui uma curta duração no
rúmen, não podendo tamponar a produção contínua de ácidos no ambiente ruminal de maneira
satisfatória50.

2.3.1. Alga marinha: Lithothamnium calcareum

A substituição do tamponante bicarbonato de sódio que é produzido quimicamente,

por alcalinizantes oriundos de fontes naturais renováveis como a farinha de algas na dieta para
bovinos, surge como uma forte tendência naturalista do mercado consumidor de produtos de
origem animal46.
As algas marinhas calcárias estão inseridas no reino Plantae, que por sua vez divide-
se em três sub-reinos, sendo um deles o sub-reino Rhodoplantae, com divisões em Cynidiophyta
e rhodophyta. Rhodophytas são popularmentes denominadas de algas vermelhas e possuem
como principal representante a alga Lithothamnium calcareum51.
A atribuição do nome Litothamnium é originário do grego litho (que significa
pedra) e thamnium (que significa árvore pequena). São classificadas como algas vermelhas não
articuladas ou incrustadas, pertencentes da ordem Carallinales e da família Corallinaceae. Uma
característica evidente desta família é a deposição de carbonato de cálcio e magnésio em sua
parede celular46,52.
O Lithothamnium calcareum é formado em várias regiões oceânicas, sendo
caracterizada como um dos primordiais constituintes dos recifes e corais marinhos53, o que
qualifica o Brasil a ser detentor de uma das maiores reservas mundiais desta fonte mineral
renovável54.
A alga marinha vem sendo considerada uma das principais espécies utilizadas na
elaboração de farinhas e ração voltadas para produção animal. Em alguns países europeus a
utilização dessas algas na alimentação animal é adotada há mais de 200 anos como suplemento
mineral52. Entretanto, no Brasil, estudos que avaliem sua eficácia na nutrição animal quanto
regulador de pH ainda estão em fase de desenvolvimento, apresentando, até o momento, apenas
pesquisas relacionadas à alternativa de cálcio para animais como as codornas52, frangos de corte
e postura55, coelhos, ovinos, vacas leiteiras, entre outros.
 10

As algas marinhas voltadas para nutrição animal são consideradas como fonte
alternativa de cálcio52, tornando o seu uso como “tendência” por ser advindo de fontes
biológicas marinhas e mais facilmente absorvidos do que os de origem geológica, o que garante
um fator ambiental positivo56. Elas são compostas basicamente por carbonato de cálcio e
mangnésio, além de conter mais de 20 oligoelementos, os quais estão presentes em quantidades
variáveis, tais como ferro, manganês, boro, níquel, cobre, zinco, molibdênio, selênio e
estrôncio.
As principais características que potencializam a atuação das algas marinhas como
reguladores do pH ruminal estão atribuídas à maior disponibilidade dos micronutrientes que se
encontram adsorvidos nas paredes celulares. Deste modo, eles são facilmente assimiláveis pelas
plantas e animais, tendo como principal atributo a capacidade de liberação lenta dos minerais
em ambientes ácidos como o rúmen52, 50.
Em pesquisas recentes, Lithothamnium calcareum vem sendo estudado na nutrição
animal como aditivo tamponante, principalmente por apresentar potencial regulador de pH e
parâmetros ruminais. A incorporação de lithothamnium calcareum em dietas com altos níveis
de concentrado promoveu uma elevação no pH ruminal, atribuindo a alga marinha uma função
tamponante57. Além disso, os pesquisadores avaliaram o efeito tamponante das algas marinhas
calcárias em relação ao bicarbonato de sódio e constataram que as algas propiciaram um maior
efeito de pH no rúmen, como também relataram um aumento na produção e composição do
leite50.

2.4. Sequenciamento de Nova Geração e identificação de microrganismos

A maior parte do conhecimento em relação as bactérias do rúmen surgiu de métodos

microbiológicos tradicionais que envolvem o isolamento e o cultivo de cepas e espécies puras58.
Os estudos da microbiologia ruminal, relatam que o rúmen comporta uma diversidade rica de
microrganismos como mencionado nos itens anteriores, que foram descritos e identificados a
partir do isolamento e análise de suas morfologias59. No entanto, a grande maioria foi
caracterizada com base no seu metabolismo e provável papel funcional no ambiente ruminal58.
Com o passar dos anos, o conhecimento a respeito da diversidade bacteriana do
rúmen expandiu-se à medida que outros gêneros de bactérias foram descobertos. Assim,
passaram a revelar uma comunidade bacteriana que inclui espécies tanto generalistas quanto
especialistas, capazes de converter grandes polímeros vegetais em uma gama de compostos
orgânicos menores58.
 11

Em função deste progresso, as técnicas usuais passaram a ser complementadas por

técnicas moleculares, que fundamentam seu uso por serem consideradas mais acuradas e
demandarem um menor tempo para as análises, além de promoverem informações precisas
sobre o potencial genético e biotecnológico de um determinado ambiente60,61.
As tecnologias de Sequenciamento de Nova Geração (NGS) revolucionaram a
pesquisa genômica e genética, permitindo a geração rápida e mais econômica de dados de
sequência de DNA com excelente resolução e precisão14. A partir de então, crescentes avanços
tecnológicos liderados por instituições acadêmicas e empresas privadas ampliaram as
aplicações do NGS, tanto em pesquisas básicas quanto à estudos clínicos14. O uso dessa técnica
para estudos de comunidades bacterianas possibilita uma maior compreensão sobre a riqueza
de espécies em diversos ambiente, inclusive do ambiente ruminal.
O surgimento de pesquisas que busquem identificar e caracterizar microrganismos
ruminais por meio do NGS62 tem sido apresentados como um marco evolutivo e que tem
impulsionado extensos esforços para ciência que estuda nutrição de ruminantes. O
conhecimento minucioso a cerca deste sistema tão complexo contribui significativamente para
o desenvolvimento de estratégias preventivas e diagnósticas relacionadas ao sistema de
produção animal, as quais possibilitarão o uso do animal com maior eficiência visando o
processo produtivo.
Dentre os métodos de NGS que potencializam o conhecimento dos microrganismos
no rúmen, destaca-se a ferramenta de identificação de espécies por sequenciamento de DNA
em um ambiente, denominado como metabarcoding. Ele estende a identificação de espécies
baseadas em DNA para comunidades de indivíduos pertencentes a várias espécies com papéis
distintos no ecossistema, utilizando o sequenciamento para obter “códigos de barras” referentes
à espécies específicas. Deste modo, as informações obtidas permitem descrever a
biodiversidade em um determinado ambiente. A técnica é então caracterizada por combinar
duas tecnologias: o sequenciamento de nova geração (NGS) e a identificação taxonômica de
organismos baseadas no DNA63.
Para tanto, a ferramenta metabarcoding passou a ser utilizada para identificar
espécies, por meio da extração do DNA total de uma amostra ambiental e sequenciamento de
genes específicos, e no uso das plataformas de NGS atrelados às análises de bioinformática.
Desta forma, algumas limitações tecnológicas foram superadas pela crescente disponibilidade
de novas metodologias de sequenciamento, permitindo avaliações abrangentes de
biodiversidade e monitoramento viáveis em larga escala64.
 12

O sistema de sequenciamento Illumina é uma metodologia bastante utilizada nos

dias atuais, sendo caracterizado por empregar uma tecnologia de sequenciamento por síntese
baseada em matriz com química de terminador reversível65. A plataforma NGS Illumina fornece
sequenciamento em maior profundidade, e tem sido utilizada em estudos de comunidades
ambientais, inclusive, voltadas à comunidade bacteriana do líquido ruminal66, promovendo uma
maior compreensão a respeito do sistemas de produção animal por disponibilizarem
ferramentas capazes de avaliar a dieta fornecida baseada na análise do DNA67.
Para a identificação das unidades taxonômicas, são sequenciados genes específicos,
como por exemplo os genes ribossomais66. Os RNAs ribossomais (rRNA) estão entre as
macromoléculas mais conservadas evolutivamente em todos os seres vivos e, por esta razão, os
genes ribossomais são bastante conservados e têm grande poder para ser utilizado como
discriminador de espécies. A partir de então, a comparação entre sequências do gene que
codificam para o 16S rRNA passaram a ser utilizadas para a identificação, classificação
filogenética e inferências evolutivas de espécies, gêneros e famílias de microrganismos68,66.
A caracterização das espécies em ambientes ricos em microrganismos por meio do
gene 16S rRNA permitem estimar a riqueza e a classificação taxonômica da comunidade de
organismos ainda não cultiváveis69. Os métodos de biologia molecular voltados a análise de
sequências do gene 16S rRNA apontaram nos últimos anos um elevado número de
microrganismos, muitos deles desconhecidos ou ainda não cultivados70.
A diversidade microbiológica passou a ser acessada pelas técnicas de NGS em
diversos estudos. Uma vez que é válido respaldar que não somente a inclusão de um
determinado alimento ou nutriente determinam quais comunidades bacterianas serão
encontradas em uma amostra ambiental, mas também, os métodos de preservação, extração e
sequenciamento impactam no resultado final das análises de metabarcoding.
Dentre essas pesquisas, destaca-se a de Fliegerova et al.66, onde ao explorarem a
diversidade bacteriana por metabarcoding do líquido ruminal em função do perfil bacteriano
sob diferentes condições da preservação das amostras, constataram que os métodos de extração,
centrifugação, filtragem do fluido, uso de tampão e armazenamento, impactaram entre os perfis
bacterianos das amostras, sendo necessário um cuidado especial para que não haja subestimação
e superestimação das unidades taxonômicas operacionais (OTUs).
Em um estudo recente, De-Mulder et al.62 análisaram minuciosamente diferenças
no microbioma ruminal e na produção de metano entérico entre duas raças bovinas submetidas
as mesmas condições dietéticas por meio da ferramenta de metabarcoding. Nessa pesquisa,
embora ambas as raças acomodassem um núcleo comum de grupos taxonômicos, as
 13

comunidades bacterianas apresentaram composições específicas entre as raças, devido à

abundância diferencial de espécies observadas. Assim, os resultados do estudo apontam que à
raça influencia a comunidade bacteriana, enquanto que a variação nos níveis de emissão de
metano poderia estar atribuída ao consumo de ração dos animais.
Em outra pesquisa, Wang et al.71 avaliaram o estabelecimento inicial de bactérias
metabolicamente ativas e a evolução dessas bactérias em várias frações, em função do desmame
precoce com a suplementação do pó de raiz de ruibarbo em diferentes faixas etárias durante o
desenvolvimento do rúmen. Concluíram nesse estudo que o microbioma bacteriano é dominado
pelos filos Proteobactéria, Firmicutes e Bacteroidetes, independente da idade. E, a abundância
de Proteobactérias foi reduzida de acordo com a idade dos animais, e observaram aumento na
abundância de Firmicutes e Bacteroidetes; como também constataram que a suplementação
com ruibarbo afetou a abundância relativa de vários gêneros de bactérias.
Por outro lado, Sun et al.72 ao avaliarem a composição do bacterioma ruminal de
334 vacas em lactação, observaram que a produção e a composição do leite são afetadas pela
população bacteriana presente no rúmen, principalmente em função da obtenção de energia
destinada a produção estar diretamente relacionada a alimentação dos animais.
Desta forma, estudos como estes ressaltam a importância que a adoção de
tecnologias moleculares possui sobre o conhecimento do microbioma ruminal, promovendo
uma maior compreensão acerca dos principais microrganismos que compõe esse ecossistema
tão complexo denominado rúmen.
 14

3. Objetivo Geral

Objetiva-se caracterizar e verificar a influência dos aditivos tamponantes sobre a

população de bactérias do rúmen.

3.1 Objetivos específicos

Objetiva-se testar a influência dos aditivos tamponantes sobre os índices de riqueza

e diversidade da comunidade bacteriana ruminal. Além de investigar o impacto das condições
biológicas expressas pelo animal em decorrência da dieta potencialmente acidótica, por meio
da avaliação do pH ruminal; perfil de ácidos graxos de cadeia curta gerados; e, o perfil
bioquímico dos animais como lactato sanguíneo, fosfatase alcalina, proteína total, triglicérides
e glicose.
 15

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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 20
1 Artigo científico redigido conforme normas da Frontiers in Microbiology

2 CAPÍTULO 2 – Verificação dos parâmetros séricos, metabólicos e do

3 microbioma ruminal por metabarcoding em bovinos Nelores
4 suplementados com Lithothamnium calcareum

5 Laís Gabrielly Freitas Lima1, Cíntia Pelegrineti Targueta3, Mariana Pires de Campos
6 Telles4, Rhewter Nunes3, Amanda Martins Apolinário1, Emmanuel Arnhold1, Renata
7 Rodrigues Gomes1, Luis Fernando de Sousa Caixeta2, Eliane Sayuri Miyagi1, Reginaldo
8 Nassar Ferreira2*
1
9 Departamento de Zootecnia, Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade
10 Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil
2
11 Laboratório de Fisiologia da Digestão, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal
12 de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil
3
13 Laboratório de Genética & Biodiversdade, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade
14 Federal de Goiás, Goiás, Brasil
4
15 Escola de Ciências Agrárias e Biológicas, Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Goiânia,
16 Goiás, Brasil

17 *Correspondence:
18 Reginaldo Nassar Ferreira
19 reginaldonassar@gmail.com
20 Palavras-Chave: Bicarbonato de sódio1; diversidade bacteriana2; illumina miseq3;
21 Lithothamnium calcareum4; microbiota5; Nelore6; rúmen7; sequenciamento de alta
22 perfomance8.

23 Resumo
24 Neste estudo, usamos uma estratégia DNA metacarcoding para sequenciar a região 16S rRNA
25 de amostras do líquido ruminal de bovinos Nelores alimentados com dietas ricas em
26 concentrado, em resposta ao efeito modulatório dos aditivos tamponantes alga marinha calcarea
27 (Lithothamnium calcareum) e bicarbonato de sódio. Além de caracterizar os índices de riqueza
28 e diversidade da comunidade bacteriana do rúmen, como investigar o impacto da dieta
29 potencialmente acidotica no pH do rúmen, parâmetros sanguíneos e no perfil de ácidos graxos
30 de cadeia curta (AGCC). Foram utilizados quatro bovinos Nelores machos, distribuídos em um
31 quadrado latino 4 x 4 (quatro tratamentos e quatro períodos). Os tratamentos consistiram na
32 mesma dieta basal altamente concentrada: T1 - sem aditivo (CON); T2- inclusão de 90 g de
33 bicarbonato de sódio (BIC); T3 - inclusão de 90 g de Lithothamnium calcareum (L90); e T4 -
34 inclusão de 45 g de Lithothamnium calcareum (L45). Os dados foram analisados no programa
35 estatístico R, onde a diversidade e abundância em nível de gênero foram analisadas pelo teste
36 de Freedman, com as médias ajustadas pela correção de FDR. As análises de pH, parâmetros
37 bioquímicos e AGCC foram analisadas pelo teste de Scott-Knott. Para ambos, as médias foram
38 avaliadas com nível de significância de 10% (p<0,10). Foram identificadas 1.474 unidades
39 taxonômicas operacionais (OTUs) pertencentes a 52 gêneros e dezesseis filos do domínio
 21

40 Bactéria. Os resultados revelaram que a microbiota bacteriana foi dominada pelos filos
41 Firmicutes (44,12%), Bacteroidetes (28,29%) e Proteobacteria (5,88%). Os animais
42 alimentados com L90 apresentaram maior abundância e diversidade ruminal para bactérias do
43 gênero Prevotella (p<0,07% e p<0,09%), respectivamente. Os bovinos suplementados com L45
44 resultaram em maior diversidade do gênero Fibrobacter (p<0,05). Houve diferença na
45 proporção molar para os ácidos acético (p<0,07%) e valérico (p<0,03%) no período antes da
46 alimentação. Maiores concentrações de lactato sanguíneo foram observadas em animais
47 suplementados com L45 (p<0,06%). Mais pesquisas sobre a comunidade microbiana associada
48 ao perfil metabólico devem ser realizadas, principalmente em resposta a diferentes dietas, a fim
49 de otimizar o sistema de produção animal.

50 1. Introdução

51 Estima-se que a população mundial atinja 9,15 bilhões no ano de 2050 (Opio et al. 2013). Isso
52 implicará em demandas crescentes em sistemas de produção de alimentos, exigindo uma
53 disponibilidade adicional de colheitas voltadas para a alimentação animal, a fim de atender à
54 crescente necessidade humana pela produção de carne e leite (Alexandratos and Bruinsma,
55 2012).
56 Uma vez que a alimentação é responsável pelo maior custo nos sistemas de produção de
57 ruminantes (Finneran et al. 2010), o interesse global concentrou-se em compreender uma das
58 comunidades microbianas mais complexas conhecidas pelo homem, o rúmen. Caracterizar,
59 quantificar e entender o papel do microbioma ruminal é de grande interesse científico,
60 econômico e ambiental (John Wallace et al. 2019).
61 O rúmen é caracterizado por sua alta densidade populacional, diversidade e complexidade de
62 interações, tendo os microrganismos procarióticos (bactérias e arquéias) e eucarióticos
63 (protozoários e fungos) como componentes deste ecossistema. As bactérias são os
64 microrganismos mais abundantes no rúmen, sendo responsáveis por converter simbioticamente
65 alimentos ingeridos em biomassa microbiana e produtos finais de fermentação como os ácidos
66 graxos de cadeia curta (AGCC), os quais fornecem mais de 70% da energia necessária para o
67 animal (Sun et al. 2019; Wang et al. 2017).
68 Durante as últimas décadas, grandes esforços têm sido realizados para explorar a comunidade
69 do rúmen. Com o desenvolvimento e a melhoria contínua das plataformas de sequenciamento
70 de alto rendimento, tornou-se possível acessar as comunidades microbianas complexas,
71 atribuindo tais descobertas como “peça chave” para a ciência que estuda nutrição de ruminantes
72 (Pollock et al. 2018).
73 Para caracterizar a comunidade ruminal é utilizado a ferramenta de metabarcoding, a qual
74 consiste em um método de identificação de espécies baseadas em sequências de DNA extraídos
75 de comunidades ambientais. Dessa forma, identifica-se várias espécies com papéis distintos no
76 ecossistema, utilizando o sequenciamento para obter “códigos de barras” e acessar com sucesso
77 a biodiversidade de um ambiente. Desta forma, o metabarcoding combina duas tecnologias: o
78 sequenciamento de alta performance (HTS) e a identificação taxonômica de organismos
79 baseadas no DNA para a identificação das espécies (Taberlet et al. 2012).
80 Nos últimos anos, a plataforma de sequenciamento mais popular para estudar a composição da
81 comunidade microbiana é a tecnologia Illumina (D’Amore et al. 2016), tendo como alvo o
82 metabolismo do gene 16S rRNA, onde esses genes taxonomicamente informativos são
83 amplificados e sequenciados, fornecendo uma gama de dados qualitativos e quantitativos
84 (Pollock et al. 2018). A análise desses genes, permite a detecção de microrganismos não
85 cultivados, como também são amplamente utilizados para identificar microrganismos
 22

86 associados a diferenças em resposta à alterações na dieta (Henderson et al. 2015), eficiência na

87 conversão de alimentos (Carberry et al. 2012), emissão de metano (Kittelmann et al. 2014) e
88 composição do leite (Jami et al. 2014).
89 Diante do exposto, objetivou-se caracterizar e verificar influência dos aditivos tamponantes
90 sobre a população de bactérias do rúmen, bem como revelar os índices de riqueza e diversidade
91 da comunidade bacteriana ruminal. Além de investigar o impacto das condições biológicas
92 expressas pelo animal em decorrência da dieta potencialmente acidótica, como a avaliação do
93 pH ruminal; perfil de ácidos graxos de cadeia curta gerados; e, o perfil bioquímico dos bovinos
94 como lactato sanguíneo, fosfatase alcalina, proteína total, triglicérides e glicose.

95 2. Material e métodos

96 Os procedimentos experimentais deste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso
97 de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Goiás, e estavam de acordo com o Conselho
98 Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA), (CEUA; protocolo número
99 079/19). O experimento foi realizado no setor de campo do Laboratório de Fisiologia da
100 Digestão da Universidade Federal de Goiás, por um período de 60 dias. Após a execução da
101 parte de campo, as análises laboratoriais foram realizadas no Laboratório de Genética e
102 Biodiversidade (LGBio) do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás
103 (ICB – UFG).

104 2.1 Delineamento experimental

105 Com objetivo de verificar a influência dos aditivos tamponantes sobre a população de bactérias
106 do rúmen, foram utilizados quatro bovinos machos adultos da raça Nelore, castrados, fistulados
107 no rúmen, com idade aproximada de 18 meses e peso médio de 520 kg. Inicialmente, os animais
108 foram pesados, identificados com brincos e submetidos ao controle de endo e ectoparasitas,
109 logo, foram mantidos em baias individuais providas de comedouro e bebedouro, recebendo uma
110 dieta com alta participação de concentrado e a água oferecida ad libitum.
111 A dieta basal foi formulada para ser potencialmente acidótica na tentativa de induzir a acidose
112 subaguda (SARA). O fornecimento da dieta foi realizado duas vezes ao dia, às 07:00 h (50%
113 da dose diária) e às 15:00 h (50% da dose diária), de forma a manter as sobras em torno de 5%
114 do fornecido, em base de matéria seca, compreendendo um consumo entre 2,0 e 2,2% do peso
115 vivo ao dia. Sua composição foi dada pela mistura do: Milho Moído (47,47%); Casca de Soja
116 (43,00%); Farelo de Soja (6,53%); Optigen (1,00%); Calcário (0,85%); Cloreto de Sódio
117 (0,45%); Fosfato Bicálcico (0,35%) e Premix Mineral (0,35%), sendo expressos com base na
118 matéria seca. Os níveis dos nutrientes fornecidos na dieta de alto concentrado comportaram:
119 74,0% de NDT; 3,0% de Extrato Etéreo; 13,6% de Proteína Bruta e 15,5% de Fibra Efetiva.
120 A adaptação dos animais foi realizada por 20 dias, com a substituição gradativa do volumoso
121 pela mistura de concentrado e a incorporação do aditivo de acordo com o tratamento.
122 Eles foram distribuídos em um delineamento experimental do tipo quadrado latino 4 x 4 (quatro
123 tratamentos e quatro períodos) e, compreendendo um período experimental segmentado em
124 quatro subperíodos de 10 dias, sendo os 8 primeiros dias destinados ao processo de eliminação
125 de resíduos do tratamento anterior, dois dias destinado à coleta das amostras de líquido ruminal
126 e sangue. Todos os animais receberam os quatro tratamentos durante o experimento. As
127 diferenças entre os tratamentos foram atribuídas à inclusão dos aditivos tamponantes na dieta
128 dos animais. O aditivo foi incorporado e homogeneizado à dieta rica em concentrado no
129 momento do fornecimento do trato aos ruminantes, com intuito de promover um consumo mais
130 uniforme e evitando a seleção do alimento. Foram utilizados neste estudo as algas marinhas
 23

131 calcárias (Lithothamnium calcareum) e bicarbonato de sódio.

132 Os tratamentos aos quais os animais foram submetidos foram compostos por: T1 – dieta de alto
133 concentrado sem aditivo (CON); T2 – dieta de alto concentrado com a inclusão de 90 g de
134 bicarbonato de sódio (BIC); T3 – dieta de alto concentrado com a inclusão de 90 g de
135 Lithothamnium calcareum (L90); e T4 – dieta de alto concentrado com a inclusão de 45 g
136 Lithothamnium calcareum (L45).

137 As amostras de digesta ruminal foram coletadas via fístula ruminal em quatro regiões (dorsal
138 anterior, ventral anterior, dorsal posterior e ventral posterior) no interior do rúmen-retículo.
139 Para coleta foi utilizado um béquer esterilizado, onde foi obtido cerca de 200 g de conteúdo
140 ruminal, que compreende tanto a parte líquida quanto a sólida. As amostras foram bem
141 misturadas e filtradas em duas camadas de gaze, visando à obtenção de aproximadamente 100
142 ml de líquido ruminal. Elas foram colhidas imediatamente antes da primeira refeição
143 (correspondente à hora zero), e as demais nos tempos 1; 3; 6; 9; 12; 18 e 24 horas após a
144 alimentação.

145 Ressalta-se que as amostras foram coletadas o mais próximo possível entre os animais nos seus
146 respectivos tempos, e que este período foi dependente do comportamento inerente a cada
147 animal, que por sua vez, não excedeu o período de 10 minutos entre as coletas do mesmo
148 tempo.

149 Imediatamente após a coleta do líquido ruminal, 50 ml de fluído foram utilizados para
150 determinação do pH em potenciômetro manual de mesa. No tempo 12 horas (após a alimentação
151 dos animais), foi coletado líquido ruminal em maior quantidade, o qual foi destinado para a
152 determinação de AGCC e extração de DNA para análises por metabarcoding.
153 Em seguida, as amostras foram transportadas em caixas isotérmicas e armazenadas por no
154 máximo uma hora em tubos de ensaio vedados e estéreis e foram armazenadas a -80ºC.
155 As amostras destinadas a determinação AGCC foram previamente preparadas. Sendo
156 adicionados 8 mL de ácido fosfórico para cada 40 mL de líquido ruminal. As amostras foram
157 imediatamente congeladas após o preparo, e enviadas a Escola Superior de Agricultura Luiz de
158 Queiroz, Piracicaba, SP. A determinação foi realizada de acordo com os protocolos internos do
159 laboratório.
160 Para as análises hematológicas, foram coletadas duas amostras de sangue em tubos com vácuo
161 mediante punção da veia jugular, sendo um tubo com fluoreto de sódio/ EDTA para
162 determinação da glicose (GLI) e lactato plasmáticos (LS), e um tubo siliconizado para obtenção
163 do soro para determinação dos triglicerídeos (TRI), proteína total sérica (PT) e fosfatase alcalina
164 (FA). Os parâmetros séricos foram dosados por testes colorimétricos no Laboratório de
165 Análises Clínicas e Ensino em Saúde da UFG (LACES – UFG), com leitura em
166 espectrofotômetro automático.

167 2.2 DNA Metabarcoding

168 Para as extrações de DNA, foram utilizadas as amostras mantidas a -80ºC. Para tanto, foi
169 utilizado cerca de 3 mL de fluido ruminal de cada tratamento para 3 extrações independentes
170 de DNA utilizando o kit de extração QIAamp® Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia,
171 CA, EUA), seguindo instruções do fabricante. A integridade do DNA foi verificada em gel de
172 agarose e corado com brometo de etídio (1,5 μg/mL).
 24

173 O DNA total extraído foi utilizado para a amplificação da região hipervariável V5-V6 do gene
174 ribossomal 16S rDNA por meio da técnica de PCR. Foram usados os primers V5-BacTB-F:
175 5'AAC RGG ATT AGA TAC CC-3' e V6R-BacTB-R: 5' CGA CRR CCA TGC ANC ACC T-
176 3' (Fliegerova et al. 2014). Foi adicionado ao terminal 5' dos primers um adaptador-Illumina:
177 F- 5’ TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG 3’, e: R- 5’ GTC TCG
178 TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA G 3’ para serem utilizados no momento de
179 preparação das bibliotecas para sequenciamento.
180 A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada utilizando 20 ng de DNA total em uma
181 reação com os reagentes Kapa Taq Hotstat PCR Kit (Roche). Foram realizadas 3 replicatas de
182 PCR para cada amostra extraída. As reações foram submetidas a seguintes termociclagens: 1
183 minuto a 80ºC e 5 minutos a 94ºC para desnaturação inicial, seguido por 25 ciclos de 94ºC
184 durante 1 minuto, 55ºC por dois minutos e 72ºC por 2 minutos, os dois últimos ciclos foram de
185 72ºC durante 10 minutos para extensão final e 4ºC por 15 minutos. As amostras amplificadas
186 foram quantificadas utilizando o fluorômetro Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific Inc.,
187 Waltham, EUA). As triplicatas da reação de PCR foram agrupadas e foram purificadas usando
188 o AMPure XP Beads e utilizadas para preparação das bibliotecas.

189 A construção das bibliotecas contendo os fragmentos de 16S rDNA foram preparadas de acordo
190 com o protocolo 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Illumina)(Illumina 2013)
191 de acordo com as recomendações do fabricante. Para cada amostra, foi inserido os index de
192 acordo com o kit Nextera XT Index 2. As amostras foram, novamente, purificadas utilizando
193 AMPure XP Beads. As bibliotecas indexadas foram quantificadas por Real Time PCR com o
194 Kapa Library Quantification kit (Roche) e validadas pelo sistema Agilent Bioanalyzer 2100
195 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, EUA) com o kit High Sensitivity DNA (Agilent). As
196 bibliotecas de amplicons foram diluídas a 4nM e combinadas. Ao pool de bibliotecas foi
197 adicionado PhiX a 20%. As bibliotecas foram desnaturadas e logo foram submetidas ao
198 sequenciamento. O sequenciamento foi realizado utilizando a plataforma MiSeq (Illumina, Inc.,
199 San Diego, EUA), para isso foi utilizado o Kit Miseq v2 500 ciclos com sequenciamento bi-
200 direcional (2 x 250pb).
201 Após o sequenciamento foram realizadas análises de qualidade das sequências obtidas
202 utilizando o software FastQC (http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc). Cortes
203 de qualidade e retirada dos adaptadores foram feitos pelo software Trimmomatic v0.33 (Bolger,
204 Lohse, and Usadel 2014). Para obter leituras de alta qualidade, foram removidas as bases com
205 phred<20 e reads menores que 100 pb.
206 As predições das OTU’s foram realizadas no programa UPARSE
207 (http://drive5.com/usearch/manual/uparse_pipeline.html). A predição taxonômica foi realizada
208 pela atribuição das sequências representativas das OTUs contra o banco de dados RDP
209 (https://rdp.cme.msu.edu/) usando o percentual de identidade de 97%. As sequências mais
210 abundantes em cada OTU foram definidas como sequências representativas, e foram utilizadas
211 para anotação taxonômica em cada nível (filo, classe, ordem, família, gênero e espécie).
212 Em função de se normalizar os dados do presente estudo, a curva de rarefação foi construída
213 com intuito de revelar a eficácia da amostragem e do sequenciamento quanto à cobertura de
214 espécies que compõe o ambiente ruminal.

215 2.3 Análise estatística

216 Antes da análise dos dados de abundância relativa no nível de filo e gênero, a conformidade
217 dos dados com as premissas de normalidade e homogeneidade das variações foram examinadas
 25

218 considerando as condições aplicadas na análise de rarefação atribuída ao programa R

219 (http://cran.r-project.org/) usando as funções dentro do pacote Vegan v. 2.3-5 (http://cran.r-
220 project.org/web/packages / vegan).
221 Para avaliar o efeito dos tratamentos sobre o microbioma ruminal foi utilizado o programa R
222 (R, Development Core Team, 2014). Os dados das métricas de diversidade alfa e abundância
223 relativa a nível de gênero foram analisadas pela ANOVA, utilizando o método não paramétrico,
224 adotando o teste de Freedman com as médias ajustadas pela correção de FDR. A análise do pH,
225 parâmetros bioquímicos e AGCC foram analisados pela ANOVA com o método paramétrico,
226 utilizando o teste de Scott-Knott. Para ambos os testes, as médias foram avaliadas a 10% de
227 significância (p<0,10).

228 3 Resultados
229 3.1 Efeito da suplementação com aditivo tamponante sobre os parâmetros ruminais

230 Os efeitos dos tratamentos nos valores de pH do rúmen são apresentados na Tabela 1. Os
231 tratamentos não apresentaram diferença significativa (p>0,05) para valores de pH. Entretanto,
232 na presente condição da pesquisa, observou-se que ao desafiar as moléculas potencialmente
233 tamponantes em um ambiente extremante ácido com a inclusão de 15,5% de Fibra Efetiva, os
234 animais apresentaram um quadro de acidose sub-clínica em resposta as baixas concentrações
235 de pH ruminal. No entanto, do ponto de vista biológico, flutuações de pH indicam que a
236 presença do aditivo tampontante promoveu uma maior concentração do pH quando comparado
237 ao tratamento CON, ou seja, conseguiram estabilizar o pH mantendo a ação tamponante no
238 rúmen, tendo maiores níveis observados nos animais suplementados com BIC.
239 O efeito dos tratamentos nos padrões de pH do rúmen durante todo período diurno é
240 representado na Figura 1. O pH do rúmen tendeu a diminuir em todos os tratamentos após a
241 alimentação matinal. Deste modo, embora os aditivos tenham apresentado uma redução do pH
242 após a primeira alimentação, a redução foi mais evidente nos animais que receberam o
243 tratamento CON. O efeito do tratamento sobre a acidez foi claramente visível, especialmente
244 no período entre 10 h às 19 h, quando o pH do rúmen permaneceu com níveis bem baixos, em
245 torno de 5,0 por um longo período de tempo (13 h). No entanto, pH do rúmen não foi superior
246 a 6,0, independentemente do tratamento. O tempo em que o pH ruminal permaneceu abaixo de
247 5,5 continuamente, durante um período de 24 horas, não diferiu entre os tratamentos, sendo
248 assim, durante todo o experimento ele se manteve em níveis baixos.
249 Os resultados referentes a concentração de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) durante o
250 período antes e após a alimentação estão representados na Tabela 2. Os dados revelaram uma
251 diferença significativa para a concentração molar de ácido valérico (p<0,08) no período que
252 antecede a alimentação, correspondendo à hora zero.
253 A proporção molar de ácidos graxos de cadeia curta está representada na Tabela 3. A proporção
254 molar de acetato seguiu o mesmo padrão que os dados referentes a concentração, ou seja,
255 maiores níveis de acetato, seguidos por propionato e butirato.
256 Ressalta-se que as proporções molares do ácido valérico durante o período que antecede a
257 alimentação, diferiram-se entre os tratamentos avaliados, especialmente para o ácido acético
258 (p<0,07) e valérico (p<0,03). No entanto, a dieta altamente concentrada com a inclusão do
259 aditivo tamponante não influenciou as demais concentrações e proporções de AGCC no rúmen,
260 assim, não apontou diferenças significativas para os ácidos graxos (p>0,10).
261 Para os parâmetros bioquímicos, foram observados maiores níveis de lactato sanguíneo (LS)
262 nos animais suplementados L45 durante o período que antecede a alimentação, apresentando
 26

263 diferença significativa (p<0,06). Já para os demais parâmetros sanguíneos como triglicerídeos,
264 glicose, fosfatase alcalina e proteínas totais não diferiram estatisticamente entre os tratamentos
265 avaliados (p>0,10), conforme apresentado na Tabela 4.
266 Entretanto, do ponto de vista biológico, níveis de triglicerídeos (TRI) mais elevados foram
267 observados nos animais que receberam a suplementação com o aditivo L45, seguidos pelo
268 tratamento BIC, L90 e sem suplementação CON. As proteínas totais (PT) encontradas no
269 presente estudo, refletem maiores concentrações nos bovinos que foram alimentados com o
270 tratamento BIC quando comparada aos demais tratamentos, apresentaram 8,09 g/dL e 7,98 g/dL
271 para coletas referentes ao período antes da alimentação (hora zero) e após a alimentação (hora
272 doze).
273 Os resultados encontrados para o parâmetro sanguíneo fosfatase alcalina (FA) mostraram níveis
274 mais elevados para animais que tiveram inclusão do aditivo BIC, apresentando um valor médio
275 de 158,50 U/L. Os animais suplementados com a alga marinha calcária, apresentaram maiores
276 concentrações de glicose plasmática (GLI), com valores médios de 77,75 e 78,28 mg/dL para
277 as diferentes dosagens de 45 e 90 gramas.
278
279 3.2 Sequenciamento do gene 16S rRNA e Identificação das bactérias ruminais por
280 metabarcoding

281 O DNA obtido para as amostras de líquido ruminal apresentaram cerca de 100 ng/µl. Após
282 amplificação por PCR, os amplicons obtidos apresentaram o comprimento de aproximadamente
283 250 pb, como esperado para a região amplificada.
284 O sequenciamento de amplicons Illumina Miseq geraram um total de 2.519.335 reads totais do
285 fragmento amplificado, em um total de 2,5 Gb de dados. Evidencia-se que 96,3% das
286 sequências geradas passaram pelo controle de qualidade. Após o sequenciamento e
287 processamento de dados, foi alcançado um número total de 1.474 unidades taxonômicas
288 operacionais (OTUs).
289 Entre o total de filos encontrados, apenas 10% das OTUs não foram identificadas, ou ainda não
290 haviam sido descritas para o ambiente ruminal, visto que suas funções podem ser tão
291 importantes quanto os filos identificados.
292 Os resultados apontaram uma variação entre a riqueza observada de 181 a 757 OTUs para as
293 amostras de líquido ruminal para os diferentes tratamentos. A curva de rarefação apontou que
294 as 255.824 sequências não estavam muito próximas de atingirem a compleição total da
295 comunidade avaliada, ficando distante de atingir uma estabilidade na curva, conforme
296 apresentado na Figura 2. Deste modo, a amostragem não foi suficiente segundo a rarefação e,
297 portanto, mais análises são consideradas necessárias para identificar novos táxons. Apesar
298 disso, ressalta-se que os resultados quanto a diversidade de OTUs presente no rúmen é bastante
299 consistente.
300 Após a realização da rarefação dos dados, foi obtido um total de 1.276 OTUs, representados na
301 Figura 3. Dezesseis filos foram classificados no rúmen de bovinos Nelore. Dentre os filos há
302 uma predominância dos Firmicutes (44,12%), Bacteroidetes (28,29%) e Proteobactéria
303 (5,88%), seguidas por Spirochaetes (5,17%) e Tenericutes (1,65%), os quais representam
304 85,11% dos filos identificados na comunidade bacteriana do rúmen.
305 Entretanto, os outros filos encontrados [Actinobacteria (0,86%); Elusimicrobia (0,78%);
306 Synergistetes (0,55%); Fibrobacteres (0,47%); Planctomycetes (0,47%); Verrumicrobia
 27

307 (0,31%); Lentisphaerae (0,16%); SR1 (0,16%); Armatimonadetes (0,08%) e Fusobacteria

308 (0,08%)] representam uma menor porcentagem.
309 De acordo com a atribuição taxonômica, foram identificados 52 gêneros bacterianos. A riqueza
310 de gêneros dos 7 principais filos bacterianos presente no conteúdo ruminal, podem ser
311 observadas na Figura 4. Evidencia-se os gêneros mais abundantes dentro de cada filo, sendo 7
312 gêneros para Firmicutes, 2 gêneros para Bacteroidetes, 3 gêneros para Proteobactéria e para
313 Fibrobacteres, Elusimicrobia, Spirochaetes e Tenericutes apenas um gênero para cada filo.
314 Ao avaliar a diversidade bacteriana do rúmen à nível de gênero, os resultados apontam que a
315 diversidade apresentou flutuações quanto aos tratamentos, conforme apresentado na Tabela 5.
316 Uma maior diversidade de espécies foi atribuída ao tratamento suplementado com L90
317 (26,95%, 407 OTUs), seguidas pelo tratamento CON (25,76%, 389 OTUs), tratamento BIC
318 (25,63%, 387 OTUs) e por fim, L45 (21,66%, 327 OTUs). No entanto, os resultados apontam
319 que a diversidade variou entre os tratamentos (p<0,05), somente para os gêneros Fibrobacter e
320 Prevotella (p<0,09). Já os demais gêneros, foram considerados igualmente diversos entre os
321 tratamentos avaliados, não sendo então detectada diferença significativa quanto à composição
322 da comunidade bacteriana (p>0,10).
323 Em relação à estrutura da comunidade microbiana quanto a composição da diversidade dos
324 principais gêneros, estão retratadas na Figura 5. No geral, uma maior diversidade foi observada
325 para as espécies pertentes ao gênero Prevotella (48%, 723 OTUs) seguidas por Treponema
326 (20%, 300 OTUs%), Fibrobacter (4%, 55 OTUs), Butyrivibrio (4%, 54 OTUs), Anaeroplasma
327 (3%, 48 OTUs) e Ruminococcus (3%, 44 OTUs).

328 Os gêneros mais abundantes compreendem todos os dados da sequência bacteriana, sendo
329 detectados em todos os tratamentos avaliados como L45, L90, BIC e CON; podendo ser
330 considerados as bactérias ruminais “dominantes”. Eles foram Prevotella (77,84%), Fibrobacter
331 (11,37%), Treponema (4,68%), Rumunobacter (1,26%), Alistipes (1,09%), Elusimicrobium
332 (0,83%), Ruminococcus (0,67%) e Anaeroplasma (0,65%), sendo observadas na Figura 6.

333 Conforme apresentado na Tabela 6, a comunidade bacteriana dos bovinos foi avaliada quanto
334 a abundância de espécies entre os tratamentos ofertados.
335 Os animais que receberam uma a inclusão do aditivo BIC, apresentaram uma maior abundância
336 de bactérias ruminais, (26,27%, 23.742 OTUs), seguidas por L90 (25,94%, 23.451 OTUs),
337 CON (24,37%, 22.033 OTUs) e L45 (23,42%, 21.166 OTUs).
338 Ressalta-se que ao desafiar as moléculas potencialmente tamponantes no rúmen, a
339 suplementação com o aditivo com L90 apresentou uma riqueza total de espécies superior para
340 o gênero Prevotella em comparação aos demais tratamentos (p<0,07), apontando que ele
341 promoveu um maior controle do ambiente ácido nas presentes condições. A quantidade de
342 bactérias do gênero Fibrobacter apresentou um aumento nos tratamentos que tiveram a inclusão
343 dos aditivos. Por outro lado, quando o pH está controlado com a presença dos aditivos, tem-se
344 uma redução na abundância bacteriana pertencentes ao gênero Ruminobacter e Oscillibacter.
345 No entanto, esses grupos bacterianos foram considerados igualmente abundantes em todos os
346 tratamentos avaliados (p>0,10).
347 4 Discussão
348 4.1 Variações nos parâmetros ruminais e bioquímicos em função da alimentação

349 No presente estudo, avaliou-se as condições dos bovinos Nelores quanto a alimentação rica em
350 concentrado associada ao uso de aditivos tamponantes, como a alga marinha calcaria
 28

351 (Lithothamnium calcareum) e o bicarbonato de sódio, frente ao perfil metabólico e a

352 comunidade bacteriana. Apesar da diferença entre os tratamentos, não foi possível identificar
353 variações significativas das análises estudadas (p>0,10), apenas variações biológicas.
354 De acordo com McDonald e colaboradores (McDonald et al. 2002), um pH fisiológico aceitável
355 para manter uma população do rúmen bem equilibrada, se encontra na faixa de 5,8 e 6,4. No
356 entanto, animais alimentados com alto teor de amido, podem reduzir o pH ruminal para níveis
357 bem inferiores à 5,8. Embora o pH varie consideravelmente dentro de 24 horas, os animais
358 possuem um sistema altamente desenvolvido para manter o pH ruminal dentro de um intervalo
359 fisiológico. Entretanto, se a produção de ácido da fermentação for maior do que o sistema pode
360 amortecer, a compensação do pH ruminal falha, podendo cair drasticamente. Assim, quando o
361 pH do rúmen permanece moderadamente deprimido entre 5,0 e 5,5 por períodos prolongados,
362 é desencadeado um quadro de ácidose subaguda (SARA)(Krause and Oetzel 2006).
363 Desta forma, os resultados obtidos demonstraram valores médios variando entre 4,8 a 5,59,
364 níveis esses considerados bem abaixo do ideal. Por outro lado, aceitáveis, visto que a
365 alimentação rica em concentrado pode ser o fator desencadeante destes resultados. Todavia,
366 observou-se que durante a inclusão do aditivo tamponante BIC, os níveis de pH apresentaram-
367 se mais elevados que os demais tratamentos, fato este que pode estar diretamente relacionado à
368 maior solubilidade do aditivo em questão quando comparado as algas marinhas calcárias.
369 Em uma pesquisa realizada por Calitz (Calitz 2009), ao avaliar a capacidade tamponante das
370 algas marinhas em líquido ruminal in vitro, observou que o aditivo promoveu um aumento no
371 pH em comparação ao tratamento controle, sendo atribuída a diferença estatisticamente
372 significativa somente quando o tratamento controle passou a atingir níveis inferiores a 5,5 de
373 pH ruminal. Ou seja, a alga marinha tem o poder de ação tamponante quando atinge níveis
374 extremamente baixos.
375 Os diferentes autores consentem que as algas marinhas calcárias são alcalinizantes de liberação
376 lenta, portanto não seria esperado grandes aumentos do pH, mas sim, um aumento de tempo no
377 qual o pH permanece acima do pH do tratamento sem a presença do aditivo (Calitz 2009;
378 Cruywagen et al. 2015).
379 Por outro lado, Cruywagen e colaboradores (2015), ao avaliarem o efeito tamponante de algas
380 marinhas calcárias e bicarbonato de sódio em uma dieta altamente energética para vacas
381 leiteiras, relata que a alga marinha a um nível de 0,4% da MS/dia, apresentaram um efeito maior
382 no pH do rúmen quando comparada a inclusão de bicarbonato de sódio a um nível de 0,8% da
383 MS/dia (Cruywagen et al. 2015). Corroborando com os resultados, Rossi e colaboradores (Rossi
384 et al. 2019) ao analisarem a substituição do bicarbonato de sódio pela metade da quantidade de
385 algas marinhas na dieta de bovinos de corte, constatou que os animais submetidos ao tratamento
386 com a alga tiveram um maior pH ruminal in vitro e apresentaram um menor tempo com o pH
387 abaixo de 5,6%.
388 A alta abundância das bactérias pertencentes aos gêneros Prevotella e Proteobactérias no
389 presente estudo sugerem que esses grupos bacterianos estejam produzindo concentrações
390 relativamente altas de propionato. O que são considerados válidos, pois as bactérias
391 pertencentes aos gêneros Prevotella e Proteobactérias são tidas como as mais abundantes no
392 rúmen de bovinos alimentados com dietas altamente energéticas (Henderson et al. 2015). Essas
393 bactérias são classificadas como as principais produtoras de propionato e succinato no ambiente
394 ruminal (Chen et al. 2017; Murphy et al. 1982). No entanto, o succinato não se acumula no
395 rúmen, sendo rapidamente convertido em propionato que, quando transportado para fora da
396 parede do rúmen é transformado em glicose pela via da gliconeogênese (Suen et al. 2011;
397 McDonald, et al. 2002).
 29

398 As concentrações e proporções molares dos AGCC, seguiram o mesmo padrão quanto aos
399 tratamentos, entre 60:30:10. Da mesma forma, Cruywagem e colaboradores (Cruywagen et al.
400 2015) ao avaliarem o efeito da alga marinha e do bicarbonato de sódio, observaram que seus
401 resultados seguiram o mesmo padrão, tanto para concentração quanto para proporção deste
402 ácido no ambiente ruminal.
403 Ao ofertar aos animais suplementação tamponante a base de alga marinha e bicarbonato de
404 sódio, observou-se uma redução na concentração de ácido acético no rúmen, resultando em
405 concentrações maiores aos animais sem a inclusão do aditivo na alimentação. Fato este
406 contrário ao encontrado por um grupo de pesquisadores ao fornecer aditivos tamponantes aos
407 bovinos, onde houve um incremento nos níveis de ácido acético no ambiente ruminal
408 (Cruywagen et al. 2015; Khorasani and Kennelly 2001; Xu et al. 1994),
409 Concentrações maiores de ácido propiônico foram identificadas antes da alimentação para
410 animais suplementados com a alga marinha calcaria L90. Já referente ao período pós
411 alimentação, concentrações maiores foram observadas para animais alimentados com
412 tratamento CON. Da mesma forma, Cruywagen e colaboradores (Cruywagen et al. 2015)
413 observaram que a concentração de propionato foi maior para o tratamento CON quando
414 comparado a suplementação com alga marinha e bicarbonato de sódio.
415 Menores concentrações de propionato no rúmen de animais alimentados com dietas de alto
416 concentrado sugerem que do ponto de vista biológico pode estar ocorrendo modificações nos
417 padrões fermentativos ou até mesmo de absorção entre os animais (McGovern et al. 2018). Foi
418 sugerido que, essas variações podem estar relacionadas à utilização de aditivos tamponantes,
419 uma vez que são responsáveis por modificar a fermentação do alimento no ambiente ruminal.
420 Os achados do presente estudo, apontam que maiores concentrações do ácido butírico foi
421 observada no tratamento L90 no período que antecede a alimentação, e durante a avalição
422 vespertina, o tratamento que apresentou um maior nível deste ácido foi BIC. Uma vez que,
423 biologicamente, o aumento do butirato em animais ruminantes tem sido associado a uma maior
424 eficiência alimentar (Shabat et al. 2016).
425 Em relação aos níveis séricos sanguíneos, observou-se que os animais submetidos aos
426 tratamentos CON e L45 apresentaram maiores níveis de lactato sanguíneo, apontando uma
427 diferença significativa entre todos os tratamentos avaliados no período que antecede a
428 alimentação (p<0,06).
429 Desta forma, os níveis de lactato sanguíneo compreendendo a faixa de 5,13 a 14,50 mg/dL no
430 presente estudo, indicam que os animais não se encontravam em um quadro de acidose ruminal,
431 visto que a acidose lática é caracterizada quando o nível de lactato sanguíneo excede a 5
432 mmol/L, ou seja, 90 mg/dL. Uma vez que, nos ruminantes, a acidose lática é observada quando
433 uma dieta básica de forragem é subitamente modificada para carboidratos facilmente
434 fermentáveis (concentrados), sem que se tenha realizado um período prévio de adaptação.
435 Valores ideais de lactato sanguíneo para as diferentes espécies, em geral, se encontram em torno
436 de 20 mg/dL (González 2000). Desta forma, nossos achados revelam que os bovinos
437 mantiveram sua atividade microbiana normal, sem apresentarem quadros clínicos de acidose
438 ruminal.
439 Os demais parâmetros avaliados como triglicerídeos, proteínas totais, fosfatase alcalina e
440 glicose, foram considerados estatisticamente iguais (p>0,10). Por outro lado, ao avaliar os
441 parâmetros bioquímicos do ponto de vista biológico, a literatura apresenta uma amplitude em
442 relação aos níveis de triglicerídeos em bovinos Nelore, pois resultados foram considerados
443 adequados por González e Scheffer quando se encontraram acima de 100 mg/dL (González and
444 Scheffer 2003). Por outro lado, Kaneko e colaboradores sugerem que os níveis ideais deste
 30

445 parâmetro compreendem a faixa entre 0 a 14 mg/dL (Kaneko et al. 1997). Resultados estes que
446 corroboram com o presente estudo, pois os níveis de triglicerídeos variaram entre 13,50 a 16,63
447 mg/dL.
448 As proteínas totais observadas no perfil sanguíneo dos animais submetidos a suplementação
449 com aditivos tamponantes, apontam valores médios de 7,82 g/dL para todos os tratamentos
450 avaliados, atribuindo maiores concentrações aos animais alimentados com o aditivo BIC.
451 Valores de referência em soro sanguíneo de bovinos para proteínas totais situam-se entre 60 a
452 85 g/L (Lindsey 1996). Paiva e colaboradores (Paiva et al. 2013) observaram em sua pesquisa,
453 variações de proteína totais para machos e fêmeas entre 8,94 e 8,76g/dL, respectivamente. Por
454 outro lado, Prado (Prado 2018) observou uma variação entre 7,3 g/dL para animais da raça
455 Nelore e 6,8 g/dL para bovinos cruzados.
456 Níveis de fosfatase alcalina considerados ideais são atribuídos a valores de até 490 U/L
457 (Veterinária 2016). Corroborando com esses índices, Kaneko e colaboradores estabelecem que
458 níveis ótimos para esta enzima variam de 0 a 488 U/L (Kaneko et al. 2008). Desta forma, nossos
459 resultados revelam que animais submetidos a suplementação com o aditivo BIC apresentaram
460 níveis mais elevados de 159,88 U/L que os demais tratamentos, consequentemente uma maior
461 atividade enzimática, sendo considerados dentro do padrão aceitável.
462 A exigência de glicose para animais ruminantes é praticamente a mesma exigência de outras
463 espécies, apresentando seu nível sanguíneo em torno de 40 a 60 mg/dL (Fraser 1993). Kaneko
464 e colaboradores (Kaneko et al. 2008) relatam que a variação de glicose em animais sadios
465 compreende a faixa entre 50 a 80 mg/dL. Por outro lado, Gonzáles e Sheffer (González and
466 Scheffer 2003) atribuem valores referências para glicose inferiores a 40 mg/dL. Assim, os
467 resultados obtidos apontam concentrações acima de 70 mg/dL para todos os tratamentos, tendo
468 maiores valores para L45 e L90, seguidos pelo tratamento CON e BIC.
469
470 4.2 Metabarcoding: Principais filos e gêneros

471 A partir dos dados rarefeitos, foi possível identificar as OTUs na comunidade ruminal em
472 função da dieta fornecida. Os resultados obtidos quanto à abundância de espécies e a
473 diversidade, demonstraram que a microbiota bacteriana ruminal é bastante rica e diversa.
474 Um alto nível de biodiversidade na comunidade bacteriana do rúmen foi revelado neste estudo.
475 No total, 1.276 OTUs foram identificadas no rúmen de animais alimentados com dieta de alto
476 concentrado, com inclusão da alga marinha calcária (Lithothamnium calcareum) e bicarbonato
477 de sódio como aditivos tamponantes. Dentre as OTUs identificadas, 90% (1.148 OTUs)
478 compreendem bactérias já conhecidas, e apenas 10% (128 OTUs) não apresentam sequências
479 disponíveis no banco de dados utilizado.
480 Foi possível identificar no conteúdo ruminal bovino 16 filos distintos, número este menor do
481 que o verificado por McGovern e colaboradores (McGovern et al. 2018), Wang e colaboradores
482 (Wang et al. 2017) que encontraram 19 e 32 filos respectivamente, utilizando as mesmas
483 técnicas de sequenciamento. Apesar das diferenças nas quantidades de filos encontradas por
484 diversos autores, os filos mais dominantes identificados em grande parte dos trabalhos na
485 literatura, se assemelham aos obtidos no presente estudo, uma vez que se alternam entre os
486 principais filos Firmicutes, Bacteroidetes e Proteobactéria (Sun et al. 2019; McGovern et al.
487 2018; Wang et al. 2017).
488 Dentre os filos mais abundantes, Firmicutes se destacou por estar presente em 44,12% do total
489 de táxons analisados. Resultados próximos foram encontrados por Sun(Sun et al. 2019), onde
490 para o mesmo filo foram identificados 50,29% das OTUs. Neste filo, os autores destacaram o
 31

491 gênero com maior expressão, como Ruminococcus. Este gênero apresenta como espécies
492 Ruminococcus flavefaciens, que, juntamente com Ruminococcus albus são consideradas
493 altamente celulolíticas, essenciais para degradação microbiana da celulose no rúmen (Præsteng
494 et al. 2013). Ambas espécies possuem capacidade de aderir rapidamente à superfície dos
495 vegetais ingeridos pelo hospedeiro para digerir celulose, sendo nomeadas como bactérias
496 aderentes (Brulc et al. 2009; Koike et al. 2003) .
497 Outro importante gênero pertencente a este filo, é o Butyrivibrio, cujas espécies estão
498 diretamente associadas à fermentação de carboidratos solúveis, estruturais e desempenham um
499 papel de extrema importância na degradação do amido (McAllister et al. 1990). Henderson
500 apresentou em sua pesquisa que este gênero era mais abundante no rúmen de bovinos e bison
501 alimentados com misturas de forragem e concentrado quando comparados a dietas à base de
502 forragem (Henderson et al. 2015). Outro gênero como Eubacterium, possui espécies que atuam
503 tanto na degradação da celulose como Eubacterium cellulosolvens, quanto na degradação da
504 hemicelulose como os representantes Eubacterium uniformis e Eubacterium xylanophilum
505 (Miura et al. 1980).
506 Bacteroidetes como o segundo maior filo encontrado com 28,29% das sequências analisadas.
507 Apresenta uma maior porcentagem de indivíduos relacionados ao gênero Prevotella. Dentre as
508 espécies com maior predominância neste gênero destaca-se Prevotella bryantii, Prevotella
509 ruminicola e Prevotella melaninogenica, cujas principais funções no rúmen são degradação e
510 utilização do amido (Cotta 1992), além de serem responsáveis pela degradação de proteínas
511 (Russell 1983), como também dos polissacarídeos como pectinas e xilanas da parede celular de
512 plantas (Matsui et al. 2000). Outros estudos têm demonstrado, que este gênero é o mais
513 abundante no rúmen de bovinos, e que, as espécies pertencentes a esse gênero atuam em
514 diferentes funções metabólicas no ecossistema ruminal podendo influenciar em um maior
515 ganho de peso (Fouts et al. 2012; Hungate 1966; Wu et al. 2012).
516 O filo Proteobactéria, terceiro maior filo identificado no presente estudo (5,88%), é responsável
517 pela maior porção de bactérias gram-negativas presentes no rúmen (Gupta 2000). A maior parte
518 das OTUs atribuídas ao filo, possuem como representantes os gêneros Ruminobacter,
519 Campylobacter e Actinobacter, desempenhando no ambiente ruminal a função de degradar
520 proteínas da dieta (Arcuri et al., 2011).
521 Em relação ao filo Spirochaetes, todas as reads identificadas pertencem ao gênero Treponema,
522 que possuem como espécies mais importantes deste gênero, Treponema Bryantii e Treponema
523 saccharophilum. Segundo relatos, as espécies pertencentes a esse gênero são capazes de utilizar
524 polímeros como pectina e xilana como substratos fermentáveis, mas não celulose, o que explica
525 a maior ocorrência deste filo em dietas de alta energia (Paster and Canale-Parola 1982).
526 Fibrobacteres, foi identificado com menor expressão numérica quanto a quantidade de OTUs,
527 no entanto, a riqueza de espécies que este filo possui é relevante (11,37%). Evidencia-se que
528 este grupo possui um papel funcional de extrema importância no rúmen, sendo conhecido por
529 degradar com eficiência a celulose da parede celular (Miller 1978).
530 Ao contrário de outras bactérias do rúmen que derivam energia de inúmeras fontes de
531 polissacarídeos, espécies como Fibrobacter succinogenes são especializadas apenas em utilizar
532 celulose como substrato. O genoma desta bactéria codifica numerosas enzimas, as quais são
533 capazes de degradar uma grande variedade de polissacarídeos. Deste modo, foi sugerido o uso
534 dessas enzimas para remover hemicelulose da parede celular das plantas, com finalidade de
535 obter acesso à celulose. Supõe-se que, esses produtos da decomposição da hemicelulose
536 forneçam substratos de crescimento para outras bactérias presentes no ambiente ruminal (Suen
537 et al. 2011)
 32

538 Estima-se que tal mecanismo seja sustentado por nossos dados, uma vez que a riqueza do gênero
539 Fibrobacter apresentou maiores resultados para animais suplementados com o a alga marinha
540 L45, apresentaram 38% do total de OTUs identificadas. Por conseguinte, os resultados à cerca
541 da diversidade bacteriana apresentam uma dissimilaridade para o gênero em estudo (p<0,05),
542 levantando a hipótese de que a alga pudesse potencializar o aumento na atividade celulolítica
543 do rúmen por promover substrato ao ruminante e as outras populações microbianas.
544 Ressalta-se que o papel dos filos de baixa abundância como Elusimicrobia, Synergistetes,
545 Tenericutes Verrumicrobia dentro dos ecossistemas ruminais permanece comparativamente
546 vaga, uma vez que não há muita informação disponível sobre as respectivas espécies (Deusch
547 et al. 2017).

548 5 Conclusão
549 Observou-se uma variação entre a abundância e a diversidade bacteriana ruminal de 16 filos
550 bacterianos em função da alimentação. Dentre os quais, refletiram em uma maior riqueza e
551 diversidade de bactéria Prevotella nos animais suplementados com Lithothamnium calcareum
552 a 90g. Além de, uma maior diversidade bacteriana do gênero Fribrobacter para os tratamentos
553 avaliados.
554 Em relação aos parâmetros ruminais, do ponto de vista biológico observou-se que o aditivo BIC
555 manteve o pH mais elevado em comparação aos demais tratamentos.
556 Para os ácidos graxos de cadeia curta, foi observado uma diferença na concentração e proporção
557 molar do ácido valérico, como também da proporção molar do ácido acético no período que
558 antecede a alimentação.
559 Os parâmetros sanguíneos apontaram variações para os níveis séricos de lactato sanguíneo,
560 indicando que animais suplementados com o aditivo L45 apresentaram maiores concentrações,
561 demonstrando modificações nos parâmetros fermentativos que promovem a acidose ruminal.

562 6 Contribuições do Autor

563 RF, CT, MT e EM projetaram a pesquisa; RF, LL, LC e RR conduziram a pesquisa; LL, CT,
564 RN, AA e EA analisaram os dados; LL escreveu o manuscrito; CT ajudou a interpretar os dados
565 e a revisar o artigo. Todos os autores aprovaram o manuscrito final.

566 7 Declaração de conflito de interesse

567 Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais
568 ou financeira que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

569 8 Agradecimentos

570 Agradecemos aos órgãos financiadores CNPq, FAPEG, CAPES, INCT em EECBio, FUNAPE,
571 PRIMASEA e KONEKSI pela concessão da bolsa e/ou apoio financeiro que viabilizaram a
572 execução deste projeto.
 33

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738
 38

Material Suplementar
ANEXO A - APROVAÇÃO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS
 39

Figuras e Tabelas suplementares

Tabela 1. Efeitos da alga marinha Lithothamnium calcareum e do bicarbonato de sódio no pH

ruminal de bovinos Nelore em uma dieta de alto concentrado.

Horas CON L45 L90 BIC EPM CV% P-Value*

0 5,45 5,38 5,43 5,56 0,13 4,78 0,7815

1 5,63 5,37 5,42 5,58 0,07 2,61 0,1167
3 5,07 5,00 5,05 5,19 0,54 2,12 0,1693
6 4,95 5,07 5,08 5,14 0,05 2,06 0,1937
9 5,05 5,19 5,14 5,20 0,05 2,04 0,2812
12 4,78 4,80 4,86 4,91 0,04 1,47 0,118
18 5,29 5,06 5,15 4,99 0,13 4,88 0,4214
24 5,25 5,38 5,44 5,59 0,10 3,15 0,3206
EPM: Erro Padrão da Média; CV: Coeficiente de variação; Médias avaliadas a 10% de
significância (p<0,10), sob o teste de Scott-Knott.

Tabela 2. Concentração de ácidos graxos de cadeia curta do liquido ruminal de bovinos

Nelore sob inclusão de aditivos tamponantes em uma dieta de alto concentrado, avaliados no
período que antecede e pós alimentação.
Período antes da alimentação – hora 0
Parâmetro CON L45 L90 BIC EPM CV% P-value*
Acético 112,39 96,15 82,07 79,85 11,53 24,91 0,2203
Propiônico 43,29 34,20 57,56 50,95 8,93 38,41 0,3289
Isobutírico 1,01 0,95 0,86 0,82 0,07 16,27 0,3078
Butírico 18,21 14,16 20,52 18,74 3,65 40,77 0,6625
Isovalérico 2,40 2,13 1,56 1,77 0,41 41,39 0,5018
Valérico 2,82 2,08 5,32 4,43 0,88 48,01 0,0839*
Total 180,12 149,66 167,86 156,60 18,09 22,12 0,6611
Rel A_P 2,69 2,93 1,59 1,91 0,4631 40,64 0,1887
Período após a alimentação – hora 12
Acético 93,07 76,10 90,00 80,49 10,97 25,83 0,673
Propiônico 52,95 46,03 48,23 47,94 10,10 41,41 0,967
Isobutírico 1,03 0,81 0,95 0,72 0,11 25,31 0,2405
Butírico 16,20 20,04 15,97 20,42 4,15 45,70 0,8006
Isovalérico 2,13 1,78 1,84 1,79 0,41 44,02 0,9227
Valérico 3,87 3,26 4,04 4,07 1,09 57,33 0,9463
Total 169,25 148,01 161,03 155,42 17,79 22,46 0,8568
RelA_P 1,83 2,13 2,14 2,13 0,57 55,47 0,9736
 40

EPM: Erro Padrão da Média; CV: Coeficiente de variação; Médias avaliadas a 10% de
significância (p<0,10), sob o teste de Scott-Knott.*

Tabela 3. Proporção molar de ácidos graxos de cadeia curta do liquido ruminal de bovinos
Nelore sob inclusão de aditivos tamponantes em uma dieta de alto concentrado, avaliados no
período que antecede e pós alimentação.
Período antes da alimentação – hora 0
Parâmetro CON L45 L90 BIC EPM CV% P-value*
Acético 62,20 64,59 49,09 51,42 3,90 13,73 0,0734*
Propiónico 24,07 22,60 34,41 32,20 3,33 23,54 0,1114
Isobutírico 0,59 0,64 0,52 0,57 0,09 29,81 0,8079

Butírico 10,09 9,36 11,81 11,74 1,06 19,68 0,3492

Isovalérico 1,36 1,41 0,98 1,16 0,25 40,07 0,609

Valérico 1,69 1,39 3,19 2,91 0,38 32,75 0,0365*

Período após a alimentação – hora 12
Acético 54,44 53,07 55,46 54,03 2,80 10,32 0,9417
Propiónico 31,77 29,93 30,33 29,12 1,88 12,43 0,7939
Isobutírico 0,64 0,59 0,59 0,49 0,12 40,53 0,8196
Butírico 9,37 12,92 9,94 12,67 1,50 26,66 0,3079
Isovalérico 1,23 1,26 1,11 1,30 0,25 41,15 0,9479
Valérico 2,55 2,22 2,58 2,39 0,20 16,31 0,5969
EPM: Erro Padrão da Média; CV: Coeficiente de variação; Médias avaliadas a 10% de
significância (p<0,10), sob o teste de Scott-Knott.

Tabela 4. Parâmetros sanguíneos de bovinos Nelore sob inclusão de aditivos tamponantes em

uma dieta de alto concentrado.
Variáveis Horas CON L45 L90 BIC EPM CV% P-Value*
0 13,50 16,63 15,38 15,50 1,48 19,47 0,5556
TRI (mg/dL)
12 14,13 15,75 14,13 15,50 1,03 13,86 0,5770

0 7,65 7,72 7,92 8,09 0,17 4,29 0,3347

PT (g/dL)
12 7,62 7,88 7,70 7,98 0,11 2,86 0,1899

FA (U/L) 0 153,38 152,38 152,63 157,13 5,22 6,79 0,9070

 41

12 155,88 159,50 155,38 159,88 5,41 6,86 0,8992

0 77,13 80,25 80,17 79,13 1,33 3,36 0,3874

GLI (mg/dL)
12 73,50 75,25 76,38 71,00 3,48 9,39 0,7243

0 14,00 14,50 8,88 8,50 1,57 27,31 0,0629*

LS (mg/dL)
12 6,50 6,83 5,13 9,25 1,03 29,81 0,1337
TRI: Triglicerides; PT: Proteína Total; FA: Fosfatase Alcalina; GLI: Glicose; LS: Lactato
Sanguíneo. EPM: Erro Padrão da Média; CV: Coeficiente de variação; Médias avaliadas a
10% de significância (p<0,10), sob o teste e Scott-Knott.

Tabela 5. Diversidade bacteriana ruminal a nível de gênero de bovinos Nelore sob inclusão
de aditivos tamponantes em uma dieta de alto concentrado, utilizando a ferramenta
metabarcoding 16S rRNA.
Diversidade
Gêneros P-value*
CON L 45 L 90 BIC

Alistipes 1,75 1,25 1,75 1,75 0,1634

Anaeroplasma 2,75 2,00 4,00 3,25 0,1718

Butyrivibrio 4,50 2,50 3,75 2,75 0,3373

Clostridium_XlVa 1,75 1,50 1,50 1,75 0,191
Elusimicrobium 2,75 1,00 3,00 1,75 0,7819
Fibrobacter 3,50 3,50 3,50 3,25 0,0484*
Oscillibacter 1,25 0,75 0,75 1,25 0,9932
Prevotella 46,00 45,25 48,00 41,50 0,0943*
Ruminobacter 0,50 0,75 0,50 1,00 0,159
Ruminococcus 3,00 2,75 1,50 3,75 0,6529
Selenomonas 0,75 1,00 0,75 1,00 0,3916
Treponema 18,75 11,75 21,75 23,25 0,875
*Teste de Friedman com as médias ajustadas pela correção de FDR; Médias avaliadas a 10%
de significância (p<0,10).
 42

Tabela 6. Abundância bacteriana ruminal a nível de gênero de bovinos Nelore sob inclusão
de aditivos tamponantes em uma dieta de alto concentrado, utilizando a ferramenta
metabarcoding 16S rRNA.
Abundância
Gêneros P-value*
CON L 45 L 90 BIC
Alistipes 75,50 26,00 44,00 101,75 0,9725
Anaeroplasma 18,00 7,25 10,75 110,00 0,2675
Butyrivibrio 12,00 12,75 8,50 6,00 0,1616
Clostridium_XlVa 3,75 3,50 2,75 29,25 0,3225
Elusimicrobium 53,00 13,25 78,50 43,00 0,5374
Fibrobacter 294,00 988,00 545,25 742,75 0,2123
Oscillibacter 28,75 15,00 7,25 10,50 0,7192
Prevotella 4494,50 3934,25 4834,25 4327,75 0,0752*
Ruminobacter 265,00 5,50 2,25 13,00 0,149
Ruminococcus 15,00 32,75 18,75 84,50 0,5519
Selenomonas 9,25 4,00 9,00 35,25 0,8964
Treponema 209,00 231,00 223.75 392,50 0,2725
*Teste de Friedman com as médias ajustadas pela correção de FDR; Médias avaliadas a 10%
de significância (p<0,10).
 43

pH do rúmen
5,8
5,6
5,4
5,2
5
4,8
4,6
4,4
4,2
0 1 3 6 9 12 18 24
Controle Lithothamnium calcareum 45g
Lithothamnium calcareum 90g Bicarbonato
Figura 1. Variação do pH ruminal ao longo do dia em uma dieta rica em concentrado, em função
do uso de aditivos tamponantes.

Figura 2. Curva de rarefação das OTUs identificadas. Apresentando o número de OTUs,

considerando a uma identidade de 97% com base nas sequencias do gene 16S rRNA da digesta
do rúmen de bovinos Nelore, alimentados com uma dieta de alto concentrado e com a inclusão de
aditivos tamponantes.
 44

Actinobacteria
Armatimonadetes
Bacteroidetes
Candidatus_Saccharibacteria
Elusimicrobia
Fibrobacteres
Firmicutes
Fusobacteria
Filo

Lentisphaerae
NA
Planctomycetes
Proteobacteria
Spirochaetes
SR1
Synergistetes
Tenericutes
Verrucomicrobia

0 100 200 300 400 500 600

Número de OTUs

Figura 3. Distribuição taxonômica a nível de filo bacteriano do metagenoma total do conteúdo

ruminal de bovinos da raça Nelore, por meio da ferramenta de metabarcoding 16S.

g:Anaeroplasma
g:Treponema Bacteroidetes

g:Ruminobacter
g:Campylobacter Elusimicrobia
g:Acinetobacter
g:Selenomonas
Fibrobacteres
g:Schwartzia
g:Ruminococcus
g:Oscillibacter Firmicutes
g:Eubacterium
g:Clostridium_XlVa Proteobacteria
g:Butyrivibrio
g:Fibrobacter
Spirochaetes
g:Elusimicrobium
g:Prevotella
g:Alistipes Tenericutes

0 500 1000 1500 2000

Figura 4. Riqueza de espécies a nível de gênero dos sete principais filos bacterianos, a partir das
sequencias do gene 16S rRNA do conteúdo ruminal de bovinos Nelore, através da plataforma
Illumina Miseq.
 45

100%

90% g:Treponema
g:Selenomonas
80%
g:Ruminococcus
70%
g:Ruminobacter
60% g:Prevotella

50% g:Oscillibacter
g:Megasphaera
40%
g:Fibrobacter
30%
g:Clostridium_XlVa
20% g:Butyrivibrio

10% g:Anaeroplasma
g:Alistipes
0%
CONTROLE L 45 L 90 BICARBONATO

Figura 5. Diversidade dos principais gêneros bacterianos com base nas sequencias do gene 16S
rRNA do conteúdo ruminal de bovinos Nelore, através da plataforma Illumina Miseq.

100%

90% g:Treponema
g:Selenomonas
80%
g:Ruminococcus
70% g:Ruminobacter

60% g:Prevotella
g:Oscillibacter
50%
g:Megasphaera
40% g:Fibrobacter
g:Elusimicrobium
30%
g:Clostridium_XlVa
20% g:Butyrivibrio

10% g:Anaeroplasma
g:Alistipes
0%
Controle L 45 L 90 Bicarbonato

Figura 6. Abundância dos principais gêneros bacterianos identificados com base nas sequencias
do gene 16S rRNA do conteúdo ruminal de bovinos Nelore, através da plataforma Illumina
Miseq.
 46

CAPÍTULO 3 - CONSIDERAÇÕES FINAIS

Há um grande potencial para o desenvolvimento do sistema produtivo dos ruminantes

fundamentados no conhecimento à cerca dos microrganismos. Pois a adoção de técnicas que
maximizem a exploração da comunidade bacteriana ruminal vem sendo consideradas como as
oportunidades do século XXI, uma vez que todo o olhar à cerca do sistema de produção animal
está se voltando cada vez mais para as lentes de um microscópico.
Com base nos resultados, este estudo fornece evidências de que as OTUs bacterianas
identificadas no liquido ruminal em resposta a dieta, podem impactar o processo de degradação
dos polissacarídios complexos, por promover aos animais suplementados com a alga marinha
calcaria uma maior diversidade e abundância de OTUs responsáveis por melhorar o
proveitamento da dieta, aumentando a disponibilidade de nutrientes em função das condições
favoráveis fornecidas pelos aditivos em uma dieta extremamente desafiadora.
As variáveis metabólicas não apresentaram variações significativas em função dos
tamponantes, no entanto, estes são importantes indicadores para um monitoramento rotineiro
de diagnóstico, como por exemplo transtornos metabólicos, deficiências nutricionais e
auxiliando como preventivo de transtornos subclinicos.
Ressalta-se que em função da comunidade microbiana ruminal ser um dos
ecossistemas pouco explorados, uma maior investigação sobre as suas interações com o perfil
metabólico poderá auxiliar na otimização do desempenho, principalmente, mediante a seleção
de determinados alimentos que potencializem o crescimento de bactérias específicas para o
aumento da produtividade animal.