FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA

Luana Janaína Souza Vera

ADEQUAÇÃO DA TÉCNICA DA PCR PARA

DIAGNÓSTICO DE M.OZZARDI

Porto Velho – RO
2012
1
 Luana Janaína Souza Vera

ADEQUAÇÃO DA TÉCNICA DA PCR PARA

DIAGNÓSTICO DE M.OZZARDI

Dissertação apresentada para obtenção do

Título de Mestre pelo Curso de Mestrado em
Biologia Experimental/PGBIOEXP do
Departamento de Biologia da Fundação
Universidade Federal de Rondônia.

Área de Concentração: Biologia Experimental

Orientador: Prof. Dr. Luís Marcelo Aranha

Camargo
Cep nº 373/09

Porto Velho – RO
2012
2
 LUANA JANAÍNA SOUZA VERA

ADEQUAÇÃO DA TÉCNICA DA PCR PARA

DIAGNÓSTICO DE M.OZZARDI

Dissertação apresentada para obtenção do

Título de Mestre pelo Curso de Mestrado em
Biologia Experimental/PGBIOEXP do
Departamento de Biologia da Fundação
Universidade Federal de Rondônia.

Área de Concentração: Biologia

Experimental
CEP /AP 373/09

Data: _____________________________

Resultado: _________________________

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. _____________________________________ ___________________________

Assinatura ___________________________________

Prof. Dr. _____________________________________ ___________________________

Assinatura ___________________________________

Prof. Dr. _____________________________________ ___________________________

Assinatura ___________________________________

3
Dedico este trabalho ao pai celestial, que
nunca me abandonou,

À Dr.ª Vera, minha amada mãe. Ao meu pai,

exemplo de inteligência e dedicação. Às
minhas queridas irmãs, Hellen e Juliana. À
minha avó, Tereza, e ao meu orientador e
eterno mestre, Prof. Dr. Luís Marcelo.

4
 AGRADECIMENTOS

Nessa caminhada um tanto quanto árdua e cheia de atropelos conheci e convivi com pessoas

maravilhosas que deixaram um pouco de si e levaram um pouco de mim, vou levar na

lembrança com certeza tudo que aprendi e vivenciei, peço desculpas se por ventura o nome de

alguém não foi listado, porem saibam que cada um teve uma grande importância para a

concretização do trabalho.

Aos meus companheiros do ICB V – USP, Leozinho, Silvana, Nayana, Joãozinho , pela
paciência e dedicação, mesmo nas horas mais difíceis das coletas em campo.
Aos meus queridos Leandro Garrido e Lucas Campana ICB II – USP, pelo sequenciamento
das amostras.
Aos professores da minha banca examinadora, por disponibilizarem tempo mesmo com uma
rotina repleta de atribuições para a leitura do meu trabalho, do meu sonho...a vocês meu
muito obrigada.
Em especial aos professores, Gilberto Fontes, Jansen Medeiros, Andonai Krauze, Almeida,
Vera Engracia, Ricardo Godoi, Sergio Basano, que estiveram diretamente ligados a
conclusão do trabalho.
Aos meus queridos amigos do IPEPATRO, Lílian, Daniel, Milena, Marlene, pelo apoio e
grande ajuda no processamento das minhas amostras e ainda pela paciência, ombro amigo.
Ao meu idolatrado mestre e orientador Prof. Dr. Luís Marcelo Aranha Camargo, pelos
ensinamentos e longas e valiosas lições que vou levar comigo ao longo da vida, sou e
sempre serei grata pelo grande carinho, meu grande amigo, mestre e segundo pai.
A minha querida Juliana Camargo, minha companheira de todas as
expedições....Jujuuuu....receba meu carinho e meus sinceros agradecimentos.
Aos meus professores da UNIR, Dra Manoela Moura, Dra Vera Engracia e Dr Luiz
Hidelbrando, pela transmissão de uma fração de seu vasto conhecimento.
A minha família que me deu total apoio nessa caminhada, ao meu pai Marcos Vera, exemplo
de inteligência e força, minha vida sem você nada seria possível, a minha amada mãe que
para mim sempre foi um exemplo de garra e superação.
As minhas irmãs, Juliana e Cris por fazerem parte da minha vida ...por tudo que passamos
juntas.
5
As minhas sobrinhas Fernanda e Sarah, minhas pequenas maravilhosas que com um abraço
acabam com qualquer mal estar..e transformam espinhos e delicadas rosas...amo vocês..
Ao grande amigo Cledson Junior, pelo carinho,..pelas horas difíceis que teve grande paciência
e me presenteou com suas palavras consoladoras.
A minha vó Tereza....meu infinito amor.
A minha meia Irma..Nanda...Fernanda da Silva Alves, por todos os momentos
compartilhados.
Ao meu anjo....Uendson....pessoa que escolhi para dividir todos os momentos da minha
vida.....por me proporcionar momentos maravilhosos....por mostrar, mesmo sem saber, que
sou capaz de tudo que mais sonho, basta querer.....por me trazer a calma nas horas de maior
aflição.....amor..vc chegou em minha vida e a transformou completamente....meu porto
seguro.....minha fortaleza....a vida ao seu lado é sempre mais doce....que fez parte da
conclusao deste com minha segunda familia que me acolheu com tanto carinho...minha sogra
– mãe Raimunda Lucia, a mulher do sorriso mais doce que já conheci, meus irmãos
cunhados, Weverton, Kenya, Uamdemberg e Ueslei, por todos os momentos maravilhosos
que me fizeram esquecer que o mundo pode ser tão cruel.
A todas as pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para a execução e termino do
trabalho, pela paciência e muitas vezes dedicação exclusiva ao trabalho e a mim, meu
muito obrigada

6
RESUMO

A Mansonelose é uma filariose causada por M.ozzardi, ocorrendo na Amazônia com

prevalências de até 60%. A técnica de diagnóstico habitual (hematoscopia através da gota
espessa) tem baixa eficácia para o diagnóstico de pacientes com baixa parasitemia. Neste
contexto foi aperfeiçoada a técnica da reação da polimerase em cadeia (PCR) para seu
diagnóstico. Quando comparada à gota espessa, a PCR apresenta sensibilidade de 100%, que
muito embora tenha apresentado, neste estudo, uma sensibilidade baixa (10,3%) e valor
preditivo negativo (VPN) de 100% mostrando eficácia bastante superior à técnica de filtração
de membrana uma sensibilidade 88,9% e VPN de 84,6%, quando também comparada à gota
espessa de sangue.

Palavras-chave: M.ozzardi.Diagnóstico.PCR.

7
 ABSTRACT

Improvement of a PCR test to diagnose infection by M.ozzardi

Mansoneliasis is caused by M.ozzardi. It is widespread in the Amazon region, with

prevalence’s as high as 60%.The examination of thick blood smears stained with Giemsa
shows low efficacy levels and has been an obstacle to diagnosing individuals with low blood
parasitemia. In order to increase diagnosis efficacy, the polymerase chain reaction (PCR)
technique was improved. PCR demonstrated best performance, with sensitivity and negative
predictive values (NPV) of 100%, although our study demonstrade a low specificity (10.3%).
On the other hand, the blood filtration through polycarbonate membrane, showed a sensitivity
of 88.9 % and a NPV of 84.6%, and also a low specicity of 37.9%, when compared with the
thick blood smears examination.

Keywords: M.ozzardi.Diagnosis.PCR

8
 LISTA DE FIGURAS

Figura 01 - Microfilárias de M. ozzardi em esfregaços de gota espessa ................................. 18

Figura 02 - Vetor, Simulium sp. ............................................................................................... 20

Figura 03 - Ovos de Simulium sp. ........................................................................................... 20

Figura 04 - Larva de Simulium sp............................................................................................. 21

Figura 05 - Ciclo Biológico de M. ozzardi .............................................................................. 22

Figura 06 - Características diferenciais das microfilárias ...................................................... 24

Figura 07 - Técnica da gota espessa ........................................................................................ 23

Figura 08 – Coleta de sangue .................................................................................................. 26

Figura 08 a – Seringa com holder encaixado ........................................................................... 26

Figura 08 b - Holder desmontado.............................................................................................26

Figura 08 c – Lâmina com membrana já corada ...................................................................... 26

Figura 09 – Técnica de Knott....................................................................................................27

Figura 10 – Mapa de Lábrea.....................................................................................................30

Figura 11 – Gel Poliacrilamida.................................................................................................34

9
 LISTA DE TABELAS

Tabela 01 - Comparação das técnicas de Filtração por Membrana com a Reaçao de Cadeia
Polimerase ............................................................................................................................... 32

10
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AM – Estado do Amazonas
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
dNTP – Deoxyribonucleotide triphosphate
EDTA – Ethylenediaminetetraacetic acid
HGE – Hemoscopia da Gota Espessa
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
TBE – 10mM Tris / 1mM EDTA
TEMED – Tetramethylethylenediamine - (CH3)2NCH2CH2N(CH3)2
TFMP – Filtração em Membrana de Policarbonato
VPN – Valor Preditivo Negativo
VPP – Valor Preditivo Positivo

11
 SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 14
2- OBJETIVOS ................................................................................................................ 16
2.1- Geral ........................................................................................................................... 16
2.2-Específicos ................................................................................................................. 16
3- REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................... 17
3.1- Histórico .................................................................................................................... 17
3.2- Agente Etiológico ..................................................................................................... 18
3.3- Vetor .......................................................................................................................... 19
3.4- Ciclo Biológico ......................................................................................................... 22
3.5- Manifestações Clínicas ............................................................................................. 23
3.6- Métodos Diagnósticos de M. ozzardi ........................................................................ 23
3.6.1-Diagnóstico Parasitológico ......................................................................................23
3.6.2- Gota Espessa de Sangue .........................................................................................24
3.6.3-Filtração de Sangue em Membrana de Policarbonato .............................................25
3.6.4-Técnica de Knott ......................................................................................................27
3.6.5- Diagnóstico Molecular..............................................................................................28
3.6.6- Reação em Cadeia da Polimerase ............................................................................28
3.6.7- Sequenciamento de DNA.........................................................................................28
3.7- Tratamento................................................................................................................. 29
4- METODOLOGIA ........................................................................................................ 29
4.1- Técnica de Gota espessa e Técnica da Filtração de Sangue em Membrana de
Policarbonato ............................................................................................................... 30-31
4.2 Técnica da Reação em Cadeia da Polimerase ............................................................ 31
4.3- Técnica de sequenciamento de DNA..........................................................................32
5- RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................. 32
6- CONCLUSÃO ............................................................................................................. 36
REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 37
ANEXOS A – E ............................................................................................................. 40
AUTORIZAÇÃO PARA CÓPIA....................................................................................63

12
1 INTRODUÇÃO

M.ozzardi está entre os oitos parasitos filarídeos que infectam o homem, sendo
endêmico em regiões tropicais da América do Sul e Central. Todavia, no Brasil, só são
considerados como problemas de saúde pública Onchocerca volvulus e Wuchereria bancrofti.
Dados obtidos sobre aspectos clínicos da infecção são escassos, o que pode levar a
interpretação errônea que a infecção humana por Mansonella ozzardi seja considerada não
patogênica (ADAMI & HERZOG, 2008).
As manifestações clínicas da mansonelose são muito discutidas, porém a maioria dos
autores refere-se a ocorrência de febre moderada, “frieza nas pernas”, dores articulares,
adenite acompanhada de tonturas e dor de cabeça (BATISTA et al., 1960). Apesar de serem
ainda objeto de questionamentos, estudos recentes revelaram uma nova sintomatologia para a
mansonelose, sobretudo pela presença de lesões oculares, com círculos brancos na córnea, que
podem evoluir para a cegueira (MEDEIROS et al., 2008).
Esse parasito tem distribuição geográfica limitada às Américas, sendo encontrado
entre o México e a Argentina, com exceção do Chile, Uruguai e Paraguai (TAVARES &
NETO, 1997).
No Brasil, foi descrito a priori na cidade de Manaus (AM), quando foram registrados
focos nos rios Solimões, Purus e Negro (LACERDA & RACHOU, 1956). Esse filarídeo está
presente em especial nas regiões das vilas e povoados da zona rural e silvestre, sobretudo
entre as populações indígenas (FRAIHA, 1983). O referido parasita foi encontrado, em menor
quantidade, nos Estados do Acre, na região norte do Mato Grosso e em Roraima (DEANE et
al., 1953; OLIVEIRA, 1963; MORAES et al., 1985).
M. ozzardi é transmitida por insetos de duas famílias de Diptera: Ceratopogonidae e
Simuliidae. No Brasil, até o momento, apenas os simulídeos Simulium amazonicum, S.
oyapockense e S. argentiscutum são relacionados como transmissores. (CERQUEIRA, 1959;
SHELLEY et al., 1980; MEDEIROS et al., 2004) .
A técnica da Hemoscopia da Gota Espessa (HGE), corada com Giemsa, é o método de
diagnóstico clássico para a detecção de M. ozzardi. Embora apresente baixa eficácia, tem sido
utilizada em inquéritos epidemiológicos por ser economicamente mais viável, com rápida e
fácil obtenção, permitindo a identificação da espécie do parasita, mesmo em locais com
ocorrência de infecções mistas com outros filarídeos (FONTES & ROCHA, 2005).

13
 Existem técnicas de diagnósticos mais eficientes, porém mais trabalhosas, como as
técnicas de concentração de Knott, com lise de sangue pela formalina 2% (KNOTT, 1939;
FONTES & ROCHA 2005) e a Técnica de Filtração em Membrana de Policarbonato (TFMP),
(FONTES & ROCHA, 2005). Morales-Rojas e seus colaboradores testaram, em amostras de
tecido, em 2001, a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) na detecção da M.
ozzardi e consideram-na como a mais eficaz para diagnóstico, porém na ocasião não foi
realizado teste populacional para sua validação, nem o exame do sangue periférico dos
pacientes.
Com o intuito de contribuir para o diagnóstico da M. ozzardi, esta pesquisa se
preocupa em adequar e avaliar a eficácia da PCR em relação à TFMP, quando comparada à
HGE, em estudo populacional e em sangue venoso.

14
2 OBJETIVOS

2.1 Geral:
Adequar e Avaliar a eficácia da PCR em relação à TFMP e HGE, em estudo
populacional e em sangue venoso.

2.2 Específicos:
 Adequar e Padronizar a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, para
diagnóstico de infecções por M. ozzardi.

 Determinar a sensibilidade, especificidade e descrever os parâmetros de eficácia da

PCR em relação a TFMP, e HGE.

 Avaliar os custos da técnica em comparação com as demais

15
3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Histórico
A pesquisa de Patrick Manson, realizada por volta de 1897, descreveu os primeiros
relatos de Mansonella, quando foi identificado o agente infeccioso a partir de microfilárias
encontradas em amostras de sangue periférico de índios caraíbas que habitavam a Guiana. Por
terem sido coletadas por Ozzardi, recebeu a denominação Filaria ozzardi (MANSON, 1897).
Posteriormente, Faust, em 1929, integrou-a ao gênero Mansonella (TAVARES & NETO,
1997).
M.ozzardi (MANSON, 1897) é um filarídeo humano próprio do continente americano,
com focos já detectados na Bolívia, Brasil, Colômbia, Guatemala, Guiana, Ilhas do Caribe,
México, Panamá, Peru, Suriname, Venezuela e norte da Argentina (FONTES & ROCHA,
2005).
No Brasil, a primeira descrição de M. ozzardi deu-se em 1949 na cidade de Manaus,
quando Maria P. Deane o revelou mediante inquérito que evidenciou a prevalência do
parasitismo por filárias entre a população. Das 2.045 pessoas examinadas, 15 (0,6%)
apresentaram microfilárias de M. ozzardi (DEANE, 1949). Posteriormente, estudos realizados
por Lacerda & Rachou (1956) deixaram óbvio que a mansonelose era encontrada no Estado
do Amazonas, nas comunidades ribeirinhas do rio Solimões e em seus afluentes. Além do
Estado do Amazonas, a enfermidade foi encontrada no Estado de Roraima (MORAES et al.,
1985) e alto Xingu, no Mato Grosso e Acre (OLIVEIRA, 1963). Este filarídeo está presente
especialmente nas vilas e povoados da zona rural e silvestre, atingindo principalmente as
populações indígenas (FRAIHA, 1983).
Estudo realizado no Estado de Rondônia, as margens dos rios Madeira, Mamoré,
Guaporé, Machado e Preto, onde 4452 foram testadas pelo método de gota espessa,
demonstrou que na há registro de M.ozzardi na região (BASANO, 2011).

3.2 Agente Etiológico

A Mansonelose é uma filariose que tem como agentes etiológicos os nematodos

Mansonella ozzardi (RACHOU ,1954), M, perstans (FORMICA& BOTTO, 1990; ORIHEL,
1967), M. streptocerca (FISCHER, 1998;CDC, 2010), espécies pertencentes à família
16
Onchocercidae (LEIPER, 1911). As três espécies se diferenciam pelas seguintes
características: afinidade por vetores, anatomia, sintomatologia e distribuição geográfica
(DOWNES & JACOBSEN, 2009).
As microfilárias de M.ozzardi (figura 01) medem aproximadamente 200µm. São
encotradas no sangue periférico, não possuem periodicidade, e concentram-se em capilares do
tecido subcutâneo humano (FONTES & ROCHA, 2005). Distinguem-se das demais
microfilárias pela ausência de bainha, cauda fina e curta em forma de gancho ou foice,
núcleos caudais reduzidos em uma fila de sete a nove elementos e ponta da cauda desprovida
de núcleos. Tipicamente, os primeiros núcleos somáticos são dispostos em fila única. As
microfilárias possuem uma sobrevida estimada em 32 meses e seu ciclo completa - se em
dípteros, seus hospedeiros intermediários (TAVARES & NETO, 1997).
Os vermes adultos de M. ozzardi apresentam dimorfismo sexual. As fêmeas medem
aproximadamente 32 a 61 mm de comprimento por 0,15 mm de diâmetro. Seus corpos são
transparentes, acompanhados de cutícula lisa e homogênea. Contudo, os machos são menores,
e têm entre 24 a 28 mm de comprimento por 0,07 mm de diâmetro. Estes apresentam ainda
sistema reprodutor em tubo simples, testículos dispostos na região esofágica, dois espículos (o
esquerdo maior que o direito), 11 papilas pericloacais e outros dois pares mais salientes
próximos à extremidade posterior (RACHOU & LACERDA, 1954; TAVARES & NETO,
1997).

Figura 01 - Microfilárias de M. ozzardi em esfregaços de gota espessa, coradas com Giemsa. Fonte: DPD, 2010.
Disponível em: <http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/html/imagelibrary/Filariasis_il.htm>. Acesso em: set. 2010

Os vermes adultos habitam o mesentério, tecido conjuntivo subperitoneal, e

membranas serosas (pleuras e peritônio) do hospedeiro humano (FONTES & ROCHA, 2005),
além linfonodos e vasos linfáticos adjacentes ou tecido subcutâneo (NUTMAN, 2001).

17
3.3 Vetor
M. ozzardi é transmitida por insetos dípteros das famílias Ceratopogonidae e
Simuliidae. A família Ceratopogonidae está presente nas ilhas do Caribe, sendo que nas
Américas Central e do Sul há presença das duas famílias (SHELLEY & COSCARÓN, 2000;
FONTES & ROCHA, 2005).
Os dípteros ceratopogonídeos são conhecidos como “mosquito pólvora” e “maruins”
no Brasil, “jejénes” nos países com idioma espanhol e “polvorines” na América do Norte
(MARCONDES, 2001). Essa família possui vinte e sete gêneros, na qual o Culicoides é o
mais expressivo hematófago (MONTEIRO, 2009).
O gênero Culicoides apresenta 924 espécies com vasta distribuição mundial. Destas,
73 são encontradas no Brasil (NEVES et al., 1997). As espécies relacionadas à transmissão de
M. ozzardi são Culicoides furens, C. barbosai e C. phlebotomus (em Trinidad e Tobago)
(DPMIAC, 1994).
Na América do Sul, os principais vetores são insetos do gênero Simulium (FONTES &
ROCHA, 2005). Cerca de mil e oitocentas espécies da família Simuliidae foram descritas no
mundo (CROSSKEY & HOWARD, 2010). Por volta de noventa espécies já foram
identificadas em solo brasileiro (PEPINELLI et al., 2003).
Os principais vetores incriminados para a transmissão de M. ozzardi no Brasil são os
simulídeos, S. amazonicum e S, argentiscutum, em especial na região norte do país
(SHELLEY et al., 1980; MORAES et al., 1985; TIDWELL & TIDWELL, 1982). Moraes et
al. (1985) identificou a espécie S. oyapockense como vetor da M. ozzardi no Estado de
Roraima.
Em território brasileiro, são denominados “piuns” nas regiões norte e nordeste, e
“borrachudos” nas demais regiões; em outras regiões do globo são também conhecidos como
black flies ou moscas negras (Figura 02) (BRASIL, 2006). Em geral, quando adultos, os
simulídeos são pequenos, têm coloração escura, asas largas de aspecto corcunda (tórax
curvado) e pernas curtas (MARCONDES, 2001).

18
 Figura 02 - Vetor, Simulium sp. Disponível em: <http://www.epa.gov/bioindicators/html/blackflies.html>.
Acesso em: nov. 2010
Seus ovos são pequenos, semitriangulares (Figura 03), e eclodem após decorridos dois
a sete dias. Em geral, são depositados em grande quantidade, submersos em água, em áreas
úmidas ou ao lado do curso da água, em corredeiras ou locais de rápido escoamento de água
(BRASIL, 2006; SIMULIIDAE, 2010).

Figura 03 - Ovos de Simuliumsp Fonte: (BRASIL, 2006).

<http://www.epa.gov/bioindicators/html/blackflies.html Acessado em novembro de 2010

As larvas dos simulídeos alimentam-se através de um par de leques filtradores

grandes, dispostos na cápsula cefálica (Figura 04). A região ventral, próxima à cabeça, possui
um pé, e no final do abdômen apresenta um disco de ganchos, que auxilia na fixação da larva.
Suas trocas iônicas são realizadas por papilas anais (BRASIL, 2006). As larvas respiram por
meio de brânquias e, após duas ou três semanas, tecem um casulo e se transformam em pupa
(MONTEIRO, 2009).

19
 Figura 04 - Larva de Simulium sp. Disponível em:
<http://www.diptera.info/photogallery.php?photo_id=5036>. Acesso em: nov. 2010

As pupas geralmente, são encontradas abaixo da lâmina d’água, mas também

sobrevivem em ambientes úmidos, e se apresentam envoltas em um casulo de seda auxiliadas
por um arranjo de ganchos presentes em seu abdômen (BRASIL, 2006).
Os mosquitos simulídeos adultos (Figura 02) são pequenos, com corpo bem definido,
medindo de 1 a 2 mm. As asas são largas e fecham-se uma sobre a outra quando em repouso.
Possuem probóscide curta do tipo sugadora, antenas pequenas, coloração quase sempre negra
ou acinzentada, salvo quando se apresentam na cor castanha, castanha avermelhada ou
amarela. Apenas as fêmeas adultas são hematófagas (mamíferos e aves) e os machos se
alimentam de néctar das flores. Esse repasto sanguíneo realizado pela fêmea está vinculado à
maturação dos oócitos. Os simulídeos são de hábitos diurnos, mas podem ser ativos no
crepúsculo, dependendo muito do clima (BRASIL, 2006).
3.4 Ciclo Biológico do Parasito
O ciclo biológico de M.ozzardi é do tipo heteroxênico, envolvendo insetos e humanos.
(01) As fêmeas dípteras, ao realizarem o hematofagismo em indivíduos parasitados,
ingerem as microfilárias, que,(02) após poucas horas no estômago do inseto,(03)
atravessam a parede do estômago do inseto e (04) migram para o tórax alojando-se nos
músculos deste(05 e 06) Em seguida, transformam-se em larvas L1 após 6 a 10 dias. Com o
repasto sanguíneo infectante,(07) a larva passa de L1 para L2. Decorridos 10 a 15 dias, a
segunda muda que se transforma em larva infectante L3, medindo cerca de 10 µm cuja
migração se dá até a probóscide do inseto. Assim que o inseto pratica o próximo repasto,
(08) as larvas L3 saem pelo lábio do inseto e penetram na pele do hospedeiro.
Posteriormente, migram para os vasos linfáticos, tornando-se vermes adultos que, dentro de

20
sete ou oito meses, produzem as primeiras microfilárias que migram para o sangue periférico
(Figura 05) (FONTES & ROCHA, 2005).

Figura 05 - Ciclo Biológico de M. ozzardi. Crédito: Prof. Dr. Fábio Barbieri-EMBRAPA-RO

(LEGENDA ITEM 3.4)

3.5 Manifestações Clínicas

Há poucos estudos sobre aspectos clínicos da infecção por M.ozzardi. Os estudos

descritos referem-se ao parasito que determina no organismo humano uma moléstia
provavelmente benigna, de evolução lenta, paucissintomática e de prognóstico benigno
(BATISTA et al, 1960). Apresenta uma sintomatologia correspondente a febre, cefaleia
intensa acompanhada de vertigem, dores articulares especialmente nos joelhos e tornozelos,
“frieza nas pernas”, adenite ínguino-crural e placas eritematopruriginosas. Em casos menos
comuns, pode ocorrer eosinofilia sanguínea, mais evidentes em pacientes com alta
parasitemia. Contudo, a maioria dos indivíduos infectados parece que permanece

21
assintomática (BATISTA et al., 1960; TAVARES & NETO, 1997; FONTES & ROCHA,
2005).
A patogenia dos sintomas clínicos da mansonelose pode, por sua vez, ser explicada
pela irritação local que as filárias vivas ou mortas provocam, bem como pelos fenômenos
alérgicos que acarretam. Similarmente, isso ocorre também no caso das demais filarioses
(BATISTA et al., 1960).
Além das lesões cutâneas, há algumas evidências que M. ozzardi pode causar lesões
oftalmológicas. Essas lesões oculares ocorrem possivelmente pela presença do verme na
estrutura ocular do indivíduo, resultando em conjuntivites e lesões corneanas (BRANCO et
al., 1998, BELFORT, inf. Pessoal).

3.6 Métodos Diagnósticos de M. ozzardi

3.6.1 Diagnóstico Parasitológico

O diagnóstico definitivo de M. ozzardi pode ser feito através da visualização do

parasito no sangue ou por biópsia da pele (NUTMAN, 2001).
O diagnóstico parasitológico possibilita a observação de microfilárias no sangue
periférico de indivíduos parasitados. Via de regra, esse tipo de diagnóstico pode ser realizado
por meio das seguintes técnicas: gota espessa de sangue, filtração de sangue em membrana de
policarbonato e técnica de Knott (FONTES & ROCHA, 2005).

3.6.2 Gota Espessa de Sangue (HGE)

A HGE, também conhecida como esfregaço em camada espessa, é uma técnica

bastante utilizada em inquéritos epidemiológicos, por ser de baixo custo e de grande
facilidade na obtenção e processamento das amostras. Com essa técnica, é possível realizar a
identificação do filarídeo mediante observação das características morfológicas específicas
das microfilárias (Figura 06), podendo ser utilizadas em locais onde ocorrem infecções mistas
com outros filarídeos (FONTES & ROCHA, 2005) (WHO, 1987).

22
 Figura 06 - Características diferenciais das microfilárias. Detalhe da porção anterior e posterior das
microfilárias, distribuição dos núcleos, presença e ausência da bainha. Fonte: Leite, 2008

Esse diagnóstico laboratorial se inicia com a coleta, fazendo-se uma punção na polpa
digital do anular esquerdo ou lóbulo da orelha, no qual a pele é fina e com excelente irrigação
sanguínea. O procedimento inicia-se com a retirada de aproximadamente 60 µL de sangue,
sem o uso de anticoagulante, porque esse produto pode levar a uma perda de até 69% das
microfilárias (PARTONO & IDRIS, 1977). Em seguida, é feita a gota espessa de sangue.
Transcorridas 5 a 10 horas, faz-se a desemoglobinização, cora-se com Giemsa e visualiza-se
ao microscópio com aumento de 10 x e 40 x (Figura 07) (FONTES & ROCHA, 2005).

Figura 7 - Técnica da gota espessa. Fonte: Prof. Dr. Gilberto Fontes/UFSJ

23
 A HGE apresenta grande sensibilidade quando o indivíduo infectado tem uma
microfilarêmia superior a 10 microfilárias/mL (mf/mL) de sangue (FONTES, 1996). Para
aumentar a sensibilidade da técnica, recomenda-se confeccionar mais de uma lâmina para
cada paciente (FONTES, 1996). Embora a HGE seja uma técnica de cunho qualitativo, é
possível estimar a microfilaremia do indivíduo parasitado, ou seja, pode-se realizar um
diagnóstico quantitativo com o uso da HGE mensurada. Para tal, usam-se tubos capilares
capazes de determinar o volume de sangue necessário para a confecção da lâmina (MS, 2008).

3.6.3 Técnica de Filtração de Sangue em Membrana de Policarbonato (TFMP)

A TFMP (CHULARERK & DESOWITZ, 1970) é uma técnica que avalia a presença
de microfilárias. A técnica consiste em um processo de concentração, no qual um volume de
sangue (colhido por meio de punção venosa) é filtrado em uma membrana de policarbonato,
com poros de 03 µm a 05 µm de diâmetro. Essa membrana retém as microfilárias existentes,
deixando os elementos figurados do sangue atravessarem a mesma (FONTES & ROCHA,
2005). A fixação da membrana é feita através de metanol, ou fixador da coloração Panótico
(Renylab®), sua coloração com Giemsa e analisada no microscópio com aumento de 10X.
Em virtude da TFMP utilizar uma quantidade maior de sangue (1 a 10 mL), bem maior
que a de HGE (60 µl), possibilita uma maior sensibilidade em seu diagnóstico. Assim, a
técnica é vantajosa no diagnóstico em pacientes com baixa densidade de microfilárias, bem
como em pacientes após tratamento específico (FONTES & ROCHA, 2005; DREYER,
1994). No entanto, a TFMP é uma técnica que requer um corpo técnico capacitado, de relativo
alto custo e execução demorada. Por esses motivos, não é uma técnica rotineiramente
utilizada (WEIL et, al., 1997).
Conforme Leite (2003), a TFMP é muito mais eficiente que a HGE, visto que o grau
de sensibilidade oferecido pelas técnicas são, respectivamente, 98% e 85%. Sendo assim, ao
ser utilizada a técnica TFMP, teremos uma chance 8,6 vezes maior de identificar um
indivíduo microfilarêmico (Figura 08) (LEITE et al., 2005).

24
 Figura 8 a Figura 8b

Figura 8 c Figura 8 d

Membrana de Policarbonato

Figura 08 a – Coleta de sangue.

Figura 08 b– Seringa com Holder encaixado para filtração.
Figura 08 c - Holder desmontado.
Figura 08 d – Lâmina com membrana já corada. Prof. Dr. Gilberto Fontes/UFSJ

3.6.4 Técnica de Knott

A técnica de Knott foi assim denominada por ter sido descrita por James Knott no ano
de 1939. Trata-se da diluição do sangue em formol a 2% em uma proporção de 1:10( uma
parte do sangue coletado com EDTA e nove partes de formol à 2%). Em seguida à diluição
em formol, a solução é centrifugada e com o sedimento produz-se a lâmina de gota espessa
fixada em metanol e corada em Giemsa (FONTES & ROCHA, 2005).
A sensibilidade da técnica de Knott se torna menor em pacientes com baixa
microfilaremia, porque as microfilárias são de difícil identificação e misturam-se ao
sedimento, interferindo na visualização ao microscópio (Figura 09) (FONTES & ROCHA,
2005).

25
 Figura 09 - Técnica de Knott. Fonte: Prof. Dr. Gilberto Fontes/UFSJ

3.6.5 Diagnóstico Molecular

3.6.6 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

A técnica da PCR baseia-se em uma metodologia in vitro de amplificar fragmentos de

DNA, possibilitando a amplificação específica de uma fita de DNA complementar por meio
de um molde de DNA, através de uma simples reação enzimática. Para que a amplificação
aconteça é necessário um primer (iniciador), que é composto por oligonucleotídeos com 15-
25 nucleotídeos. Esses são desnaturados e adicionados à fita de DNA molde, ligando-se às
sequência de DNA complementar. A síntese de novas fitas se dá pela presença de uma DNA
polimerase (Taq DNA Polimerase), termoestável, e dos desoxinucleotídeos (dATP, dCTP,
dGTP e dTTP). Assim as novas fitas de DNA são produzidas, amplificando a quantidade do
fragmento inicial (STRACHAN & READ, 1999).
Com o intuito de contribuir para o diagnóstico da mansonelose e melhorar a
identificação específica de M. ozzardi, Morales-Hojas e seus colaboradores (2001) realizaram
os primeiros estudos sobre o método da PCR para a detecção de M. ozzardi em 3 biópsias de
tecido humano e comprovaram em um reduzido número de pacientes a eficácia da técnica.

26
3.6.7 Sequenciamento de DNA

Com o avanço da genética em todo o mundo, a técnica para o seqüenciamento de

DNA é uma inovação que determina, através do estudo de uma sequência nucleotídica ou
parte dela, fornecendo informação sobre a expressão gênica tendo, com isso tem um papel
fundamental em contribuir para a análise da eficácia da PCR.

3.7 Tratamento
As drogas macro e microfilaricidas (dietilcarbamazina e suramina sódica) não
apresentam eficácia para M.ozzardi. No entanto, a Ivermectina (0,2 mg/kg - dose única) é
eficiente na eliminação das microfilárias do sangue periférico em 24 horas, em terapia
específica, eliminando a microfilaremia por 18 a até 365 dias (TAVARES & NETO, 1997,
BASANO, inf. pessoal). A Ivermectina é uma lactona macrocíclica que se liga aos canais de
cloro permitindo que os íons de cloreto penetrem nas células do parasito. As células ficam
hiperpolarizadas e causam paralisia muscular nas microfilárias de M. ozzardi, levando à morte
o parasito(SERVING HISTORY, 2010). Até o momento, embora não haja estudos muito
aprofundados, esta é a droga de escolha para o tratamento.

4 METODOLOGIA

Foram selecionados 47 pacientes escolhidos aleatoriamente de um universo de 232

indivíduos diagnosticados com M. ozzardi pela TFMP. Os indivíduos eram habitantes
ribeirinhos do município de Lábrea - AM (07o15’S 64o51’W) (Figura 10), área de elevada
prevalência da parasitose e que estavam participando do ensaio clínico sobre a eficácia de
invermectina em sua terapêutica.

Aspectos Éticos
O presente studo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade São
Lucas, devidamente credenciado ao CONEP, sob o registro AP/CEP/373/09. (Anexo K).

27
 Figura 10: Munícipio de Lábrea, Amazonas, área de estudo.

4.TÉCNICA HGE

O método HGE foi empregado de acordo com o seguinte procedimento: o sangue foi
coletado a partir da polpa digital (equivalente a 60 µL), utilizando-se lancetas descartáveis e,
em seguida, preparadas em lâminas de microscopia; posteriormente, deixou-se secar a
temperatura ambiente. Logo após, as lâminas foram lavadas em água destilada, fixadas com
metanol, coradas com Giemsa e secadas. As lâminas foram examinadas por duas vezes,
utilizando-se um microscópio óptico e objetivas ópticas de 10x e 40x por dois profissionais ?
?
experientes realizando um ensaio cego.
28 2
8
4.1 TFMP

O método TFMP foi realizado por filtração de 1 mL de sangue venoso com EDTA,
previamente diluído com 10 mL de soro fisiológico a 0,9%. A filtração ocorre através de uma
membrana de policarbonato com poros de três a cinco micrômetros de diâmetro (Poretics
Corporation® - Livermore-EUA), fixadas com metanol e coradas com Giemsa (FONTES &
ROCHA, 2005), em seguida as lâminas já previamente fixadas com metanol e coradas foram
analisadas por dois profissionais, em ensaio cego, em microsocópio com o aumento de 10 x.

4.2 Técnica da PCR

Na PCR foi realizada a extração de DNA de acordo com as instruções do Kit Quiamp
DNA Blood (Quiagen®). As eluições de DNA, mantidas em microtubos, foram conservadas a
– 20ºC. O primer utilizado foi produto amplificado da sequência GenBank AF228564, com a
seguinte sequência 5’GAAAGAAGAAGGATTTTTACT3 e primer reverso 3’
CTTTTCCTCCGCTTAATTATA 5’.

Os primers foram verificados quanto a sua especificidade utilizando um programa

Primer-Blast disponível no site :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primerinfo.html,
na busca foram introduzidos os primers e testados contra o banco de sequências de DNA
genômico não redundante completo do NCBI(“NR”).Os resultados estão no anexo C, e
demonstram a especificidade do par de primers, e que o produto observado nos géis tem o
mesmo tamanho do que o resultado apresentado pelos programas sequenciamento.

A amplificação do DNA foi executada sob as seguintes condições: 94º C – quatro

minutos (01 ciclo), 94º C – 45 segundos, 55º C – 30 segundos, 72º C – 45 segundos (35
ciclos), 72º C – cinco minutos (01 ciclo), 4º C – tempo final. A Mix da PCR utilizada foi:
14,75 uL H2O, 2,5 uL de tampão 10X, 1 uL de MgCl2, 2uL de primer, 0,25 uL de dNTP, 5 uL
de Taq Polimerase e 4uL de DNA. Para a eletroforese foi utilizado gel de poliacrilamida a
8%, obtendo-se um fragmento de 312 pb. A composição do gel de poliacrilamida de 8% em
placa pequena com composição final de 20 mL foi: 11 mL de H2O, 6 mL de poliacrilamida
30%, 2 mL de TBE 10X, 15 µL de TEMED e 200 µL de APS com tempo de corrida de duas
horas a 200V (Figura 10).
As duas técnicas (TFMP e PCR) foram comparadas com HGE que é técnica usual para
diagnóstico de M.ozzardi. Para comparar a eficácia das técnicas, foram usados os seguintes
29
parâmetros: sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo (VPN), e coeficiente kappa
de Cohen (Tabela 1). Utilizou-se o software OpenEpi® para análise estatística, com intervalo
de confiança de 95%.
Foi utilizado para controle negativo sangue de crianças recém-nascidas (insento de
contaminação ). Como controle positivo, foram utilizadas amostras gentilmente cedidas pelo
prof Jansen F. Medeiros (INPA), com microfilaremia acima de 200 mf/mm3.

4.3 Técnica de sequenciamento

Foi utilizado o produto da PCR, método clássico de Sanger, em sequenciador

automático, para confirmação se o fruto da amplificação da PCR era de fato M. ozzardi, sendo
realizado com a colaboraçao dos alunos Leandro Garrido, Lucas Camoana, ICB 2 USP,
departamento de Parasitologia, sob a orientação do Prof Dr. Henrique Krieger.

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A metodologia sugerida para a técnica da extração e PCR sofreu alterações. A

extração, inicialmente feita pelo método Iguchi, porém não obteve resultado satisfatório. Foi
então testado, sem sucesso, em fenolclorofórmio, com e sem fervura. A partir daí utilizou-se o
Kit da Quiagen®, nos quais se obteve frações de DNA purificado, possibilitando melhor
amplificação. Para a técnica da PCR as mudanças foram em nível de tempo de anelamento e
extensão dos ciclos, no primeiro MIX, utilizou-se 18,3 uL de água, 2,5 uL de tampão buffer,
0,5 uL de dNTPs, 1,5 uL de primer, 0,2 uL de Taq e 02 uL de DNA, com o seguinte ciclo
94°C – 04 minutos, 94°C – 30 segundos (35 vezes), 55°C – 45 segundos (35 vezes), 72°C -01
minuto (35 vezes), 72°C – 05 minutos (ciclo final), com gel de agarose 02 g, a segunda
alteração se descreve da seguinte forma, 16,3 uL de água, 02 uL de buffer, 05 uL de Mg Cl,
1,5 uL primers, 0,2 uL de Taq, 0,4 uL de DNA, com o ciclo 94°C – 04 minutos, 94°C – 30
segundos (35 vezes), 55°C – 45 segundos (35 vezes), 72°C – 01 minuto (35 vezes), 72°C – 05
minutos (tempo final), a mudança que foi padronizada e descrita no método utilizado obteve
um MIX de 21 uL e com corrida em gel de poliacrilamida a 8%.
Em suma, dos indivíduos que apresentaram resultado negativo para HGE, 62,1%
foram positivas pela TFPM. Dos 89,6%, que foram considerados negativos pela HGE, 100%
apresentaram-se positivos pela técnica de PCR, enquanto que 100% dos positivos pela HGE
evidenciaram os mesmos resultados na PCR. Nesse contexto, a PCR mostrou uma alta
sensibilidade e VPN sobre o TFMP quando foi comparado com a HGE. No entanto, ambos os
30
métodos apresentaram baixa especificidade e baixo coeficiente kappa em comparação com
HGE, ratificando a descrepância entre os métodos (tabela 01).
Morales-Hojas et al. (2001) realizou o primeiro estudo utilizando a técnica da PCR na
detecção de M. ozzardi, orientando-se pelo método de detecção de parasitas em 51 amostras
de tecido de biópsias humanas coletadas de três regiões endêmicas diferentes. A pesquisa
comprovou que a PCR é satisfatória no diagnóstico de M. ozzardi em 90% de suas amostras,
enquanto o exame parasitológico de sangue apresentou positividade em 83% das amostras.
Destarte, considerou a PCR eficiente para o diagnóstico de M. ozzardi, mesmo considerando-
se que o estudo não foi populacional e que a técnica utilizada foi em tecido e não em sangue.
A despeito dos resultados encorajadores, os custos da PCR são significantemente maiores
quando comparada a TFMP. Há ainda que se considerar as dificuldades de se executar a PCR
em condições de campo, fator que, sem dúvida, limita sua aplicação.
Tradicionalmente, os estudos de prevalência sobre a ocorrência de M.ozzardi apontam
para baixas prevalências em crianças, provavelmente por possuírem baixa concentração de
microfilárias (MEDEIROS et al., 2009; 2009a; MARTINS et al., 2010). O uso da técnica em
tela pode modificar este perfil, uma vez que detectará mais casos com baixas microfilaremia
em crianças.

Figura 11 - Eletroforese em gel de poliacrilamida a 8%: Coluna 1- Indicador de peso molecular de 312 pb;
Colunas 11 e 15- negativas para M.ozzardi; as demais colunas apresentam os positivos para M.ozzardi (312 pb)

31
 O produto amplificado, sequenciado correspondeu a sequencia alvo, como
demonstrado pelo alinhamento utilizando blast (anexo D).

Tabela 01 - Comparação das técnicas

METODO LABORATORIAL HGE POSITIVA HGE NEGATIVA TOTAL

TFMP(POSITIVA) 16 18 34

TFMP(NEGATIVA) 02 11 13

TOTAL 18 29 47

SENSIBILIDADE 88,9% (67,2-96,9)

ESPECIFICIDADE 37,9% (22,69-56,0)

VPN 84,6% (57,76-95,67)

KAPPA 0,2 (0,004-0,40)

TABELA 01 A – PARAMETROS TFMP COMPARADA A HGE.

METODO HGE POSITIVA HGE NEGATIVA TOTAL

LABORATORIAL

PCR POSITIVA 18 26 44

PCR NEGATIVA 0 3 3

TOTAL 18 29 47

SENSIBILIDADE 100% (82,41-100.0)

ESPECIFICIDADE 10,3% (3,6-26,4)

VPN 100% (43,8-100,0)

KAPPA 0,08 (0,03-0,19)

TABELA 01 B – PARAMETROS PCR COMPARADA A HGE

32
 Estudo recente realizado por Tang e seus colaboradores (2010) e publicados após este
estudo vem de encontro com os resultados aqui esboçados, confirmando a eficácia da técnica
da PCR na detecção da filária M. ozzardi. A pesquisa afirma a importância da técnica, pois
detecta sequências específicas da espécie, podendo diagnosticar quaisquer formas e fases do
ciclo de vida das filárias no hospedeiro humano ou em seu vetor. A técnica de extração
utilizada pelo autor se compara a utlizada na pesquisa porém, a amplificação se difere em
temperatura e extensão dos ciclos, o uso ainda de primer especifico para M.ozzardi e M.
perstans, fato que aumenta a especificidade da técnica. Além disso, a técnica aqui esboçada,
realiza um estudo populacional, enquanto o autor utilizou cinco pacientes positivos em
microscopia para PCR na diferenciação da espécie.
Estudo realizado por Degese e colaboradores (2010), em região endêmica da
Argentina, compara a técnica de Knott com a PCR, indicando que a PCR demonstra 100% de
sensibilidade frente a técnica de Knott, considerando que a baixa parasitemia justifica o fato,
o que confirma o que foi descito na pesquisa e considera a técnica de Knott como diagnóstico
complementar. Os autores não fazem referência à especificidade do método.
O diagnóstico microscópico é de especial importância, pois diferencia a microscopia
do parasita por meio da visualização de membrana, cauda e bainha (quando existente). Em
contraste, a PCR não fornece esse parâmetro, visto que a morfologia é perdida possibilitando
somente a visualização da amplicação de fragmento específivco de DNA.
Alguns fatos podem explicar a baixa especificidade dos métodos aplicados. No caso
da TFMP, o uso de EDTA, que pode destruir até 69% das microfilárias (PARTONO &
IDRIS, 1977). pode justificar o fato. A elevada discrepância observada no índice kappa
reforça esta hipótese, pois os 2 métodos (HGE e TFMB) são técnicas visuais.
Em relação ao PCR, a baixa especificidade pode ser justificada por: a-) erros no
processo de realização da PCR (duração de ciclos e temperatura) , b-) na comparação entre
um método molecular e outro de visualização (kappa muito baixo, demonstrando elevada
incongruência entre os métodos) c-) e/ou problemas operacionais durante o processo de coleta
e armazenamento de material durante o trabalho de campo, uma vez que o sequenciamento
genético confirma que o material amplificado pela PCR de fato era M. ozzardi.

33
6 CONCLUSÃO

A PCR apresenta maior sensibilidade e menor especificidade em relação a TFMP,

quando comparada a HGE.
A PCR apresenta um custo operacional mais elevado em relação as demais técnicas.
Excelente técnica para screening de pacientes com baixa parasitemia (banco de
sangue, estudos epidemiológicos).

34
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38
SHELLEY, A. & COSCARÓN, S. Simuliid Blackflies (Díptera: Simuliidae) and
Ceratopogonid Midges (Díptera: Ceratopogonidae) as Vectors of M.ozzardi (Nematoda:
Onchocercidae) in Northern Argentina. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 96
(4):451-458, May 2001.

SIMULIIDAE. Disponível em:

<http://www.ufrgs.br/parasite/siteantigo/Imagensatlas/Athropoda/Simulium.htm>. Acesso em:
set. 2010.
STRACHAN, T. & READ, A. Human molecular genetics. 2. ed. New York: Wiley-Liss,
1999.

TAVARES, A. M. & NETO, Fraia. Mansonelose. In: Queiroz Leão, R. N. (Ed) Doenças
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TANG, THT et al. Nested PCR to detect and distinguish the sympatric filarial species
Onchocerca volvulus, M.ozzardi and Mansonella perstans in the Amazon Region. Mem Inst
Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 105 (6):823-828, September 2010.

TIDWELL, M. A. & TIDWELL, M. H. P. Development of M.ozzardi in Simulium

amazonicum, S. argentiscutum and Culicoides insinuatus from Amazonas, Colombia.
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WEIL, G. J. et al. The ICT filariais test: a rapid format antigen test for diagnosis of
brancroftian filariasis. Parasitol Today; 13:401-4, 1997.

WHO, World Health Organization. Control of lymphatic filariasis: A manual for health
personnel. Geneva: 1987.

39
ANEXOS
A–E

40
ANEXO A – Artigo publicado na Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical
Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 44 (3):380-382,mai-jun,2011

Communication/Comunicação

Improvement of a PCR test to diagnose infection by M.ozzardi

Adequação da técnica da PCR para diagnóstico de infecção de M.ozzardi

Luana Janaína Souza Vera1, Sergio de Almeida Basano1,2, Juliana de Souza Almeida Aranha Camargo 1,
Andonai Krauze de França3, Ricardo de Godoi Mattos Ferreira4, Almeida Andrade Casseb3, Jansen
Fernandes Medeiros5,6, Gilberto Fontes7 and Luís Marcelo Aranha Camargo1,8

ABSTRACT the State of Amazonas4, Brazil; however studies

Introduction: Mansonelliasis is caused by M.ozzardi. It is
widespread in the Amazon region, with a high prevalence.
The common exam of thick blood smears stained with
Giemsa shows low efficacy levels and has been an obstacle
to diagnosing individuals with low blood parasitemia.
Methods: In order to increase diagnosis effi cacy, the PCR
technique was improved. Results and Conclusions: PCR
demonstrated the best performance, with sensitivity and
negative predictive values (NPV) of 100%, followed by
blood filtration through membrane filters, which showed a
sensitivity of 88.9% and a NPV of 84.6%, when compared
to thick blood smears.
Keywords: M.ozzardi. Diagnosis. PCR.
RESUMO
Introdução: A mansonelose é uma filariose causada pela
M.ozzardi, ocorrendo na Amazônia com prevalências de até
60%. A técnica de diagnóstico habitual (hemoscopia através
da gota espessa) tem baixa eficácia o para o diagnóstico de
pacientes com baixa parasitemia. Métodos: Neste contexto
foi aperfeiçoada a técnica da PCR para seu diagnóstico.
Resultados e Conclusões: Quando comparada à gota
espessa, a PCR
apresenta sensibilidade de 100%, e valor preditivo negativo
(VPN) de 100% mostrando eficácia bastante superior à
técnica da filtração em membrana que apresenta
sensibilidade de 88,9% e VPN de 84,6%, quando também
comparada à gota espessa de sangue.
Palavras-chaves: M.ozzardi. Diagnóstico. PCR.
The microfilariae of M.ozzardi (Nematode,
Onchocercidae) is the etiological agent of the
mansonelliasis. The parasite has a geographic
distribution limited to the Americas and it is found
from Mexico through Argentina, except Chile,
Uruguay, and Paraguay1. This filariasis was first
reported in Brazil in the City of Manaus in the State of
Amazonas2 and people infected by M. ozzardi were
later identified along the Solimoes, Purus and Negro
Rivers3. These findings reinforce many studies that
have warned that M. ozzardi was widely distributed in
concerning this filariasis remain scarce5-7.
1. Coordenação de Medicina, Faculdade São Lucas, Porto Velho, RO. 2. Setor
de Isolamento, Centro de Medicina Tropical de Rondônia, Porto Velho, RO.
3. Laboratório de Genética, Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais,
Porto Velho, RO.
4. Laboratório de Estudos em Bioinformática e Bioestatística, Fundação
Oswaldo Cruz Noroeste, Porto Velho, RO.
5. Coordenação de Pesquisas em Ciências
da Saúde, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, AM.
6. Escola Superior de Ciências da Saúde, Coordenação de Medicina,
Universidade Estadual do Amazonas, Manaus, AM.
7. Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de São João Del Rei,
Divinópolis, MG.
8. Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biomédicas 5, Monte
Negro, RO.
Address to: Dr. Luís Marcelo Aranha Camargo. Rua Francisco Prestes s/n,
76888-000
Monte Negro, RO, Brasil.
e-mail: spider@icb5usp.med.br
Received in 07/08/2010
Accepted in 16/11/2010
M.ozzardi is transmitted by insects of the families
Ceratopogonidae and Simuliidae (Diptera). Up to
now, only the Simuliidaes have been identified as
vectors in Brazil8,9. Infection symptomatology has
been widely discussed and according to Batista et al10,
people suffering from mansonelliasis present moderate
fever, leg coldness, joint aches, dizziness and
headaches. Recently, new symptomatology has been
attributed to this filariasis, which is characterized by
ocular lesions and white rings on the cornea that may
eventually cause blindness11.
Typically, microscopic examination of a thick
blood smear (TBS) stained with Giemsa, has been the
main method used in epidemiological assays. Despite
the low efficacy of TBS, particularly for patients with
low microfilaremia, it is more economically feasible,
promptly and easily obtained, and also permits
identification of the parasite species even in locations
where intermingled infections by other filariidaes
occur12. More laborious and effective methods are
feasible, such as Knott's concentration method (blood
lysis by 2% formalin)12,13, and by filtering the blood
through a polycarbonate membrane filter (PMF)12. The

41
PMF is considered the gold-standard. Morales-Rojas
et al first suggested polymerase chain reaction (PCR)
as an effective method to detect M. ozzardi14.
This study aimed to standardize the PCR for
diagnosing M. ozzardi and compare its effectiveness
in relation to the PMF, which is considered the gold-
standard for diagnosing the disease compared to the
traditional TBS method.
Forty-seven patients infected by M. ozzardi were
randomly selected from 232 individuals diagnosed by
PMF (Poretics Corporation, Livermore, USA). These
individuals lived alongside the rivers in the
municipality of Labrea, State of Amazonas, Brazil
(07o15’S 64o51’W), an area with high prevalence of
mansonelliasis. The TBS method was used according
to the following procedure: blood was collected from FIGURE 1 - Electrophoresis in 10% polyacrylamide gel
the digital pulp (equivalent to 0.06mL) using showing the PCR results for DNA extracted from blood.
disposable lancets and then prepared on microscope M50pb stands for the 50 base pairs size marker, M100bp for the 100
slides and left to dry at room temperature. Next, the base pairs size marker and the numbered lanes are: 1: sample 709,
slides were washed with distilled water, fixed with positive control; 2: newborn 90, negative control; 3-8: samples 704,
methanol, stained with Giemsa and dried off. The 708, 711, 712, 714 and 715; 9: sterile water negative control.
slides were then subjected to microscopic examination Both the PMF and PCR methods were compared to
using optical objectives of 10x and 40x by two the common method for M. ozzardi diagnosis (TBS).
professionals in a blind controlled trial. PMF was In order to compare the effectiveness of the methods,
conducted by filtering 1mL of venous blood the following parameters were considered: sensitivity,
previously diluted with saline 0.9% through a specificity, negative predictive value (NPV), and
polycarbonate membrane filter of 3-micrometer pore Cohen’s kappa coefficient (Tables 1 and 2). The
diameter size (Poretics Corporation - Livermore- OpenEpi® software was used for statistical analysis,
USA)12. with a confidence interval (CI) of 95%. The project
The PCR method was based on the detection of the was submitted to the Research Ethics Committee of
GenBank AF228564 DNA fragment from M. ozzardi the São Lucas College, Porto Velho and was approved
which comprises the partial sequence of the 18S under the registry number 344/09.
ibosomal RNA gene, the internal transcribed spacer 1, Of the 29 individuals who presented negative by
the complete sequence of the 5.8S ribosomal RNA TBS, 62.1% were identified as positive by PMF, while
gene and internal transcribed spacer 2 (ITS2) and the mong the 18 who were positive by the TBS method,
partial sequence of the 28S ribosomal RNA gene13. 88.9% showed the same results by PMF. On the other
The forward primer used was hand, TBS diagnosed 2 cases that were not diagnosed
5’GAAAGAAGAAGGATTTTTACT3’ on the ITS2 by PMF (false-negatives), despite its greater ensitivity.
and the reverse primer used was Regarding the PCR technique, 89.6% of those who
5’CTTTTCCTCCGCTTAATTATA3’on the 28S presented negative by TBS were positive by PCR,
ribosomal DNA. These genes are commonly used for while 100% of the positive cases showed the same
species identification on molecular bases since they results by PCR. Thus, the PCR technique showed the
comprise highly conserved sequences next to highly greatest sensitivity and NPV, followed by PMF, when
variable ones. The primers were verified using the compared to TBS. However, both these methods
NCBI primer design on-line tool based on the showed low specificity and low kappa coefficient
Primer315 software and showed no unintended DNA compared to TBS.
products.
Genomic DNA was extracted from the samples
according to the instructions of the Quiamp DNA
Blood Kit (Qiagen®). Blood samples of newborns
from the city of Porto Velho were taken as negative
control. The eluted DNA were maintained in
microtubules and stored at -20ºC. The following
procedure was used to amplify the DNA sequence: the
samples were maintained A) at a temperature of 94°C
for 4min (1 cycle); B) at 94°C for 45sec; at 55°C for
30sec; 72°C for 45sec (35 cycles); C) 72°C for 5min
(1 cycle), and D) 4°C for 1min (final time). The
amplification product up to 312bp was viewed on 10%
polyacrylamide gel with bromide staining (Figure 1).
42

Despite the encouraging results, the cost of PCR is
approximately US$8.60 per test, while PMF has a
significantly lower cost, US$0.80 (author’s personal
information). The difficulties of performing PCR
under field conditions must also be taken into account,
since this is an important limiting factor in its
application. Traditionally, studies concerning the
prevalence of the M. ozzardi indicate its low
prevalence rate in young individuals6-8, which is
probably due to their low microfilaria concentration.
The advent of PCR for mansonelliasis diagnosis,
which shows 100% sensitivity, may help correct this
bias by providing new epidemiological information on
parasitic infections and by promoting the
determination of higher prevalence rates.
1. Tavares AM, Fraia Neto H. Mansonelose. In: Queiroz-Leao RN,
editor. Doenças infecciosas e parasitarias. Manaus: Enfoque
Amazônico; 1997. p. 733-737.
2. Deane MP. Sobre a incidência de filárias humanas em Manaus,
Estado do Amazonas. Rev Fundação SESP 1949; 2:849-858.
3. Lacerda NB, Rachou RG. Filarioses humanas nas sedes
municipais do Estado do Amazonas e territórios do Acre, Guaporé e
Rio Branco. Rev Bras Malariol Doencas Trop 1956; 8:437-442.
4. Moraes MAP, Almeida MMR, Lovelace KJ, Chaves GM.
M.ozzardi entre índios Ticunas do estado do Amazonas, Brasil. Bol
Oficina Sanit Panam 1978; 85:16-25.
5. Medeiros JF, Py-Daniel V, Barbosa VE, Ogawa GM. Current
profile of M.ozzardi (Nematoda: Onchocercidae ) in communities
along the Ituxi river, Labrea municipality, Amazonas Brazil. Mem
Inst Oswaldo Cruz 2008; 103:409-411.
6. Medeiros JF, Py-Daniel V, Barbosa UC, Izzo TJ. M.ozzardi in
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region, in the state of Amazonas. Mem Inst Oswaldo Cruz 2009;
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7. Martins M, Pessoa FAC, Medeiros MB, Andrade EV, Medeiros
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10. Batista D, Oliveira WR, Rabello VD. Estudo da patogenicidade
da M.ozzardi e da sintomatologia da Mansonelose. Rev Inst Med
Trop Sao Paulo 1960; 2:281-289.
11. Branco BC, Chamon W, Belfort Neto R, Belfort-Costa Jr AJA.
Achados oculares entre habitantes do município de Pauini e possível
associação entre lesões corneanas e mansonelose na Amazônia. Arq
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12. Fontes G, Rocha EMM. Wuchereria bancrofti - Filariose
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editors. Parasitologia Humana. 11th ed. Rio de Janeiro: Atheneu;
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13. Knott J. A Method for making microfilarial surveys on day
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14. Morales-Hojas R, Port RJ, Shelley AJ, Maia-Herzog ER,
Coscaron S, Sheke RA. Characterization of nuclear ribosomal DNA
seqüences from Onchocerca volvulus and M.ozzardi (Neumatoda:
Filariodea) and development of a PCR based method for their
detection in skin biopsies. Int J Parasitol 2001; 31:169-177.
15. Rozen S, Skaletsky HJ. Primer3 on the WWW for general users
and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S, editors.
Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular
Biology. Totowa (NJ): Humana Press; 2000. p. 365-386.
43
Anexo B – Artigo Dr Sergio

44
45
46
47
48
ANEXO C –

49
Anexo D– ALINHAMENTO DE BLAST

BLASTN 2.2.25+

Reference: Zheng Zhang, Scott Schwartz, Lukas Wagner, and

Webb Miller (2000), "A greedy algorithm for aligning DNA

sequences", J Comput Biol 2000; 7(1-2):203-14.

RID: XAN2X8J1016

Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS,

GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences)

14,048,438 sequences; 36,048,382,813 total letters

Query= MT-5106

Length=281

Score E

Sequences producing significant alignments: (Bits) Value

gb|AF228561.1|AF228561 Mansonella ozzardi clone Mo8-3 18S rib... 357 2e-95

gb|AF228559.1|AF228559 Mansonella ozzardi clone Mo8-1 18S rib... 357 2e-95

gb|AF228563.1|AF228563 Mansonella ozzardi clone Mo9-1 18S rib... 351 9e-94

gb|AF228560.1|AF228560 Mansonella ozzardi clone Mo8-2 18S rib... 351 9e-94

gb|AF228564.1|AF228564 Mansonella ozzardi clone Mo9-3 18S rib... 346 4e-92

50
ALIGNMENTS

>gb|AF228561.1|AF228561 Mansonella ozzardi clone Mo8-3 18S ribosomal RNA

gene, partial

sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA

gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence;

and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Length=1097

Score = 357 bits (193), Expect = 2e-95

Identities = 236/263 (90%), Gaps = 1/263 (0%)

Strand=Plus/Minus

Query 19 GACTGAGTTGAGGTC-
AAGAAATGATAAATATATTGRARCARTGATATAAATAATCATTT 77

||||||||||||||| |||||||||||||||||||| | || ||||||||||||||||||

Sbjct 1045
GACTGAGTTGAGGTCAAAGAAATGATAAATATATTGAAACAATGATATAAATAAT
CATTT 986

Query 78 GAAGGGGTTCGTTTAGSRRAatatttctatatraaagatttaawrtattaggggcratat
137

|| ||| ||||| ||||||||||||| |||||||||| |||| | | ||||

Sbjct 985
TAAATCTTTCTTTTAGCAAAATATTTCTATATAAAAGATTTAAAATATTTTGTTCAAT
AT 926

Query 138 attttattaataagaaataaaatatttttttataaactatcatttttatttcttattttt 197

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

51
Sbjct 925
ATTTTATTAATAAGAAATAAAATATTTTTTTATAAACTATCATTTTTATTTCTTATTTT
T 866

Query 198 atcttcktarrtatcaggggatacatatatatatgatataGATTAATATCACCKGATGAT

257

|| || || |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||

Sbjct 865
ATTTTATTACTTATCAGGGGATACATATATATATGATATAGATTAATATCACCTGA
TGAT 806

Query 258 AAGTAAAAATCCTTCTTCTTTCA 280

|||||||||||||||||||||||

Sbjct 805 AAGTAAAAATCCTTCTTCTTTCA 783

>gb|AF228559.1|AF228559 Mansonella ozzardi clone Mo8-1 18S ribosomal RNA

gene, partial

sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA

gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence;

and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Length=1098

Score = 357 bits (193), Expect = 2e-95

Identities = 236/263 (90%), Gaps = 1/263 (0%)

Strand=Plus/Minus

Query 19 GACTGAGTTGAGGTC-
AAGAAATGATAAATATATTGRARCARTGATATAAATAATCATTT 77

||||||||||||||| |||||||||||||||||||| | || ||||||||||||||||||

52
Sbjct 1046
GACTGAGTTGAGGTCAAAGAAATGATAAATATATTGAAACAATGATATAAATAAT
CATTT 987

Query 78 GAAGGGGTTCGTTTAGSRRAatatttctatatraaagatttaawrtattaggggcratat
137

|| ||| ||||| ||||||||||||| |||||||||| |||| | | ||||

Sbjct 986
TAAATCTTTCTTTTAGCAAAATATTTCTATATGAAAGATTTAAAATATTTTGTTCAA
TAT 927

Query 138 attttattaataagaaataaaatatttttttataaactatcatttttatttcttattttt 197

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 926
ATTTTATTAATAAGAAATAAAATATTTTTTTATAAACTATCATTTTTATTTCTTATTTT
T 867

Query 198 atcttcktarrtatcaggggatacatatatatatgatataGATTAATATCACCKGATGAT

257

|| || || |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||

Sbjct 866
ATTTTATTACTTATCAGGGGATACATATATATATGATATAGATTAATATCACCTGA
TGAT 807

Query 258 AAGTAAAAATCCTTCTTCTTTCA 280

|||||||||||||||||||||||

Sbjct 806 AAGTAAAAATCCTTCTTCTTTCA 784

>gb|AF228563.1|AF228563 Mansonella ozzardi clone Mo9-1 18S ribosomal RNA

gene, partial

53
sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA

gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence;

and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Length=1061

Score = 351 bits (190), Expect = 9e-94

Identities = 236/264 (89%), Gaps = 3/264 (1%)

Strand=Plus/Minus

Query 19 GACTGAGTTGAGGTC-
AAGAAATGATAAATATATTGRARCARTGATATAAATAATCATT- 76

||||||||||||||| |||||||||||||||||||| | || |||||||||||||||||

Sbjct 1009
GACTGAGTTGAGGTCAAAGAAATGATAAATATATTGAAACAATGATATAAATAAT
CATTC 950

Query 77 TGAAGGGGTTCGTTTAGSRRAatatttctatatraaagatttaawrtattaggggcrata
136

| || ||| ||||| ||||||||||||| |||||||||| |||| | | |||

Sbjct 949 T-
AAATCTTTCTTTTAGCAAAATATTTCTATATGAAAGATTTAAAATATTTTGTTCAAT
A 891

Query 137 tattttattaataagaaataaaatatttttttataaactatcatttttatttcttatttt 196

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 890
TATTTTATTAATAAGAAATAAAATATTTTTTTATAAACTATCATTTTTATTTCTTATTT
T 831

54
Query 197 tatcttcktarrtatcaggggatacatatatatatgatataGATTAATATCACCKGATGA
256

||| || || |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||

Sbjct 830
TATTTTATTACTTATCAGGGGATACATATATATATGATATAGATTAATATCACCTG
ATGA 771

Query 257 TAAGTAAAAATCCTTCTTCTTTCA 280

||||||||||||||||||||||||

Sbjct 770 TAAGTAAAAATCCTTCTTCTTTCA 747

>gb|AF228560.1|AF228560 Mansonella ozzardi clone Mo8-2 18S ribosomal RNA

gene, partial

sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA

gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence;

and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Length=1061

Score = 351 bits (190), Expect = 9e-94

Identities = 235/263 (89%), Gaps = 1/263 (0%)

Strand=Plus/Minus

Query 19 GACTGAGTTGAGGTC-
AAGAAATGATAAATATATTGRARCARTGATATAAATAATCATTT 77

||||||||||||||| |||||||||||||||||||| | || ||||||||||||||||||

Sbjct 1009
GACTGAGTTGAGGTCAAAGAAATGATAAATATATTGAAACAATGATATAAATAAT
CATTT 950

55
Query 78 GAAGGGGTTCGTTTAGSRRAatatttctatatraaagatttaawrtattaggggcratat
137

|| ||| ||||| ||||||||||||| |||||||||| |||| | ||||

Sbjct 949
TAAATCTTTCTTTTAGCAAAATATTTCTATATGAAAGATTTAAAATATTTTTTTCAAT
AT 890

Query 138 attttattaataagaaataaaatatttttttataaactatcatttttatttcttattttt 197

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 889
ATTTTATTAATAAGAAATAAAATATTTTTTTATAAACTATCATTTTTATTTCTTATTTT
T 830

Query 198 atcttcktarrtatcaggggatacatatatatatgatataGATTAATATCACCKGATGAT

257

|| || || |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||

Sbjct 829
ATTTTATTACTTATCAGGGGATACATATATATATGATATAGATTAATATCACCTGA
TGAT 770

Query 258 AAGTAAAAATCCTTCTTCTTTCA 280

|||||||||||||||||||||||

Sbjct 769 AAGTAAAAATCCTTCTTCTTTCA 747

>gb|AF228564.1|AF228564 Mansonella ozzardi clone Mo9-3 18S ribosomal RNA

gene, partial

sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA

gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence;

and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

56
Length=1097

Score = 346 bits (187), Expect = 4e-92

Identities = 234/263 (89%), Gaps = 2/263 (1%)

Strand=Plus/Minus

Query 19 GACTGAGTTGAGGTC-
AAGAAATGATAAATATATTGRARCARTGATATAAATAATCATTT 77

||||||||||||||| |||||||||||||||||||| | || ||||||||||||||||||

Sbjct 1045
GACTGAGTTGAGGTCAAAGAAATGATAAATATATTGAAACAATGATATAAATAAT
CATTT 986

Query 78 GAAGGGGTTCGTTTAGSRRAatatttctatatraaagatttaawrtattaggggcratat
137

|| ||| ||||| ||||||||||||| |||||||||| |||| | | ||||

Sbjct 985
TAAATCTTTCTTTTAGCAAAATATTTCTATATGAAAGATTTAAAATATTTTGTTCAA
TAT 926

Query 138 attttattaataagaaataaaatatttttttataaactatcatttttatttcttattttt 197

|||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 925 ATTTTATTAATAAGAAATAAAATA-

TTTTTTATAAACTATCATTTTTATTTCTTATTTTT 867

Query 198 atcttcktarrtatcaggggatacatatatatatgatataGATTAATATCACCKGATGAT

257

|| || || |||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| ||||||

Sbjct 866
ATTTTATTACTTATCAGGGGATACATACATATATGATATAGATTAATATCACCTGA
TGAT 807
57
Query 258 AAGTAAAAATCCTTCTTCTTTCA 280

|||||||||||||||||||||||

Sbjct 806 AAGTAAAAATCCTTCTTCTTTCA 784

Database: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS,

GSS,environmental samples or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences)

Posted date: May 18, 2011 6:50 PM

Number of letters in database: -700,886,099

Number of sequences in database: 10,547,318

Lambda K H

1.40 0.641 1.19

Gapped

Lambda K H

1.28 0.460 0.850

Matrix: blastn matrix:1 -2

Gap Penalties: Existence: 0, Extension: 0

Number of Sequences: 10547318

Number of Hits to DB: 566476

Number of extensions: 0

Number of successful extensions: 0

Number of sequences better than 10: 0

Number of HSP's better than 10 without gapping: 0

Number of HSP's gapped: 0

Number of HSP's successfully gapped: 0

58
Length of query: 281

Length of database: 33658852265

Length adjustment: 31

Effective length of query: 250

Effective length of database: 33331885407

Effective search space: 8332971351750

Effective search space used: 8332971351750

A: 0

X1: 13 (26.3 bits)

X2: 32 (59.1 bits)

X3: 54 (99.7 bits)

S1: 13 (25.1 bits)

S2: 21 (39.9 bits)

59
ANEXO E - Carta Cep

60
Autorizo cópia total ou parcial deste trabalho, apenas
para fins de estudo e pesquisa, sendo expressamente
vedado qualquer tipo de reprodução para fins
comerciais sem prévia autorização específica do autor.

Luana Janaína Souza Vera

61
Cidade, mês e ano de impressão.

62