FUNDAÇÃO CENTRO DE HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA

LABORATÓRIO DE HISTOCOMPATIBILIDADE

MÉTODOS LABORATORIAIS APLICADOS À HISTOCOMPATIBILIDADE

Felipe Carlos Brito de Souza

Laboratório de Histocompatibilidade – Fundação HEMOMINAS
Histórico - Imunogenética

1901 – Karl Landsteiner descobre o grupo sanguíneo ABO

(Prêmio Nobel em 1930)

Nos anos seguintes, outros polimorfismos genéticos eritrocitários

foram descobertos através de técnicas imunológicas como os
grupos: MNS, Le e Rhesus

1936 – Robert Irwin cria uma nova disciplina:

IMUNOGENÉTICA
Combinação de estudos Imunológicos e Genética
 1936 – Peter Gorer descreve o antígeno eritrocitário II em
camundongos

George Snell, em 1940 – Análise da rejeição de tumores e

outros órgãos transplantados, entre diferentes linhagens
de camundongo, utilizando técnicas genéticas
Doador Receptor

Enxerto
A A aceito

Enxerto
B A rejeitado

B AXB Enxerto
aceito

AXB Enxerto
B rejeitado
1948 – Peter Gorer associa-se a George Snell e juntos reportam que o antígeno II,
também era o Principal Antígeno de Histocompatibilidade do camundongo
(Prêmio Nobel em 1980)

Sistema H-2
1952 – Jean Dausset observa a presença de leucoaglutininas no soro de
um paciente politransfundido, quando misturava o soro do paciente
numa lâmina de vidro, com leucócitos de um outro indivíduo (Prêmio
Nobel em 1980)

Dausset, inicia imunização planejada através de transfusões seriadas obtidas de

um mesmo doador, num indivíduo anêmico nunca antes transfundido
Dausset observou algumas semanas mais tarde, um potente anticorpo anti-
leucocitário no soro deste paciente, com as seguintes características:

 Reagia forte e especificamente contra os leucócitos do doador, mas também

contra leucócitos de alguns indivíduos escolhidos ao acaso

 Não reagia contra os leucócitos do próprio indivíduo imunizado

Nascia o primeiro anticorpo HLA, denominado na época de MAC (iniciais dos 3

voluntários que doaram sangue para a experiência), hoje denominado:
HLA-A2
1958 – Rose Payne descreveu a presença de leucoaglutininas no soro de
gestantes e demonstra que reações febris transfusionais eram devidas a
anticorpos leucocitários, e que estas reações eram mais frequentes em
mulheres do que homens

1962 – Jon J van Rood testa por método de leucoaglutinação a reação de 100
soros de multíparas contra leucócitos de 100 indivíduos normais e seus
padrões de reação

Descreve um sistema alélico composto de pelo menos 2 séries,

que denominou de 4a e 4b , hoje conhecidos como

Bw4 e Bw6
 1964 – Paul Ichiro Terasaki introduz a técnica de microlinfocitotoxidade

September 10, 1929 – January 25, 2016

Workshop - HLA

1964 – I Workshop Internacional de Histocompatibilidade (EUA)

1965 – II Workshop Internacional de Histocompatibilidade (Holanda)

Foi evidenciado que a maioria dos antígenos reconhecidos, pertenciam a um sistema genético único. Experimentos
de transplante de pele, demonstraram por estes métodos que os antígenos estudados se comportavam como
antígenos de transplantes

1966 – III Workshop Internacional de Histocompatibilidade (Itália)

Foram definidas13 especificidades

Antígenos definidos pertenciam a um sistema genético único composto de 2 loci:

LA e FOUR
Dois meses mais tarde, este sistema foi denominado de: HL-A

HL-A, o principal complexo de Antígenos Leucocitários no Homem

 Contribuição dos Workshops nos primeiros 30 anos de
descobrimento do SISTEMA HLA

Definição dos produtos dos genes HLA e motivo de intensas análises até os dias de hoje
Reconhecimento da importância do HLA em transplantes de órgãos sólidos e de células
hematopoiéticas
A associação de HLA com genes de susceptibilidade a doenças
Descobrimento do papel das moléculas HLA na iniciação da resposta imunológica
Facilitaram o entendimento dos mecanismos de reconhecimento do “self e non-self”, sob o
qual depende a sobrevivência das espécies
Comprovaram que um dos determinantes mais importantes para a sobrevivência humana, é
o SISTEMA HLA
Transplante de Medula Óssea (Fatos Históricos)
1968 - Realizado o 1º Tx de medula com doador aparentado
1973 - Realizado o 1º Tx de medula com doador não aparentado
1974 - Criação do 1º Registro de doadores voluntários – The Anthony Nolan Trust
1979 - Realizado o 1º Tx de medula óssea no Brasil – UFPR- Dr.Ricardo Pasquini
1984 - Criação do CEMO - Centro de Medula Óssea - INCA
1986 - Criação do CRIR – Caitling Raymond International Registry
1987 - Criação do NMDP – National Marrow Donor Program
1988 - Criação do BMDW – Bone Marrow Donors Worldwide
1988 - Realizado o 1º Tx de células de cordão umbilical
1990 - Elaboração do projeto do Banco de Doadores Voluntários de Medula Brasileiro –
Dr. Jose Roberto Feresin Moraes
 1992 - Criação do REDOME

Fundação Pró-Sangue Hemocentro de São Paulo

– REDOME –
(Registro Nacional do Doadores Voluntários de Medula Óssea)

Objetivo:

BUSCAR DOADORES HLA COMPATÍVEIS NÃO PARENTADOS DENTRO DE

NOSSAS CARACTERÍSTICAS RACIAIS
 Definição de gene, alelo e locus

• GENE – Um trecho do DNA (seqüência de

nucleotídeos) que carrega a codificação
da síntese das moléculas HLA.

• LOCUS - A localização física do gene no

cromossomo.

• ALELO – Uma forma molecular alternativa

de um gene.

• As células diplóides possuem dois genes

(um par) para cada “tipo” de molécula
HLA em cromossomos homólogos.
 Complexo Principal de Histocompatibilidade
(MHC)

 Complexo de 3.500 a 4.000kb compreendendo mais de 80 genes

 Cerca de 40% dos seus genes codificam proteínas envolvidas na resposta
imune
 Em humanos é conhecido como “Sistema HLA” (Antígenos Leucocitários
Humanos)
 Foram identificados primeiramente na superfície de leucócitos
 Encontrado em todos os mamíferos
 Codificação genética das moléculas HLA

•• Sistema HLA 
Sistema HLA  localizado
localizado no
no braço
braço
curto
curto do
do cromossomo
cromossomo 6, 6, na
na região
região
6p21.3
6p21.3
•• ÉÉ oo representante
representante do
do MHC
MHC na
na espécie
espécie
humana.
humana.
•• Apresenta-se
Apresenta-se como
como um
um conjunto
conjunto de
de
genes
genes intimamente
intimamente relacionados,
relacionados, que
que
codificam
codificam aa síntese
síntese de
de dois
dois grupos
grupos
principais
principais de
de moléculas
moléculas (HLA-Classe
(HLA-Classe II ee
HLA-Classe
HLA-Classe II).
II).
•• Compreende
Compreende ainda
ainda genes
genes que
que codificam
codificam
moléculas
moléculas HLA
HLA “não-clássicas”
“não-clássicas” ee
moléculas
moléculas “não-HLA”.
“não-HLA”.
 Antígenos Leucotários Humanos
Cromossomo 6
Tel Braço longo Cen Braço curto Tel

Região HLA
6p21.1-21.3
Genes diferentes, produtos semelhantes, funções iguais

Dentro da mesma classe, as moléculas HLA têm a mesma estrutura geral.

Entretanto, cada alelo codifica uma molécula com uma seqüência particular.
 Organização Genética do Sistema HLA
Vários genes relacionados porém diferentes, com funções semelhantes

Poligenia é a presença de vários genes relacionados diferentes, que

codificam moléculas com sequências de aminoácido particulares,
mas funções biológicas semelhantes.
 Herança de genes co-dominantes

A
A expressão
expressão dos
dos genes
genes HLA
HLA éé co-dominante,
co-dominante, oo que
que equivale
equivale aa dizer
dizer que
que
os
os dois
dois alelos
alelos do
do par
par de homólogos são expressos nos heterozigotos.
Esquema de Poligenia

AA poligenia
poligenia garante
garante que
que cada
cada indivíduo
indivíduo produza
produza várias
várias moléculas
moléculas HLA
HLA diferentes,
diferentes, oo que
que
oo torna
torna mais
mais capacitado
capacitado aa enfrentar
enfrentar os
os diferentes
diferentes desafios
desafios imunogênicos
imunogênicos com
com
mais
mais chances
chances de
de “sobrevivência”
“sobrevivência” ..
 Herança - Modo mendeliano


Herança
Herança em Bloco

Distribuição
Distribuição dos
dos haplótipos
haplótipos parentais
parentais

AB CD

AD BD
AC BC

A
A segregação
segregação dos
dos haplótipos
haplótipos HLA
HLA éé dita
dita Mendeliana
Mendeliana porque ocorre, em
média,
média, em
em proporções
proporções fixas
fixas entre
entre aa prole
prole de
de cada
cada casal
casal específico.
específico.
 Recombinação (crossing-over)

•• A
A recombinação
recombinação ocorre
ocorre durante
durante aa
prófase
prófase da
da Meiose
Meiose I:I:
–– Os
Os cromossomos
cromossomos duplicam-se
duplicam-se na na
intérfase.
intérfase.
–– Durante
Durante aa prófase,
prófase, os
os homólogos
homólogos se se
alinham e cada par se apresenta
alinham e cada par se apresenta como como
um
um bivalente
bivalente ouou tétrade
tétrade (4(4 cromátides)
cromátides)
–– Os
Os dois
dois homólogos
homólogos de de cada
cada bivalente
bivalente
ficam
ficam muito
muito próximos
próximos ee uma
uma cromátide
cromátide
de
de cada
cada membro
membro do do par
par se
se une
une àà outra,
outra,
em
em pontos
pontos chamados
chamados quiasmas.
quiasmas.
•• Os
Os quiasmas
quiasmas sãosão marcadores
marcadores dos
dos
locais
locais onde
onde ocorre
ocorre crossing-over.
crossing-over.
•• Em
Em geral
geral ocorrem
ocorrem vários
vários quiasmas
quiasmas em
em
cada
cada bivalente
bivalente (em
(em média
média 50)
50) nos
nos
cromossomos
cromossomos humanos.
humanos.
 Haplótipo Recombinante

AB CD

AD BD
AC BC

CD

Gametas:
A
B A/BC etc ...
A/B
B/A

Quando
Quando ocorre, em um dos progenitores,
progenitores, um
um evento
evento de
de
recombinação
recombinação envolvendo
envolvendo aa região
região HLA,
HLA, o
o número
número de
de combinações
combinações
haplotípicas
haplotípicas possíveis
possíveis pula
pula de
de 44 para
para 8.
8.
 Probabilidades - fórmula de chance

No Chance de HLA-
Irmãos Idêntico(%)
1 25
••A
A probabilidade
probabilidade dede cada
cada combinação
combinação 2 43,7
haplotípica
haplotípica éé de
de 25%
25% emem cada
cada gestação.
gestação.
3 57,8
4 68,3
••A
A chance
chance de
de dois
dois irmãos,
irmãos, filhos
filhos do
do mesmo
mesmo
5 76,3
pai
pai ee da
da mesma
mesma mãe,
mãe, serem
serem HLA-idênticos
HLA-idênticos
6 82,2
éé calculada
calculada pela
pela fórmula
fórmula 1-0,75
1-0,75nn (onde
(onde nn ==
número 7 86,6
número dede irmãos).
irmãos).
8 89,9
9 92,5
 Estrutura da molécula HLA classe I

 Moléculas HLA classe I são heterodímeros

com polimorfismo na cadeia alpha, porém a
cadeia beta-2 microglobulina é comum
 A cadeia alpha é composta por 3 domínios
extracelulares (α1, α2 e α3)
 Os domínios α1 e α2 formam a fenda de ligação
do peptídeo
 Presente na superfície de todas as células nucleadas
e plaquetas
 Apresentam peptídeos derivados de proteínas
intracelulares para os receptores das células T CD8+
 Envolvidos na resposta imune contra parasitas
intracelulares, vírus e tumores
Estrutura da molécula HLA classe I

O sítio de ligação do peptídeo

consiste em uma fenda profunda,
formada lateralmente pelas α hélices
dos domínios α1 e α2, e o assoalho,
por oito (08) fitas β, pregueadas,
desses mesmos domínios,
acomodando peptídeos de 9-14
resíduos de aminoácidos

Os exons 2 e 3 codificam
os domínios alfa 1 e 2 das
moléculas HLA classe I
 Estrutura da molécula HLA classe II
 Moléculas HLA classe II são heterodímeros
com polimorfismo nas cadeias apha e beta (muito
menos polimórfica)
 Ambas as cadeias são compostas por 2 domínios
extracelulares (α1, α2 e β1, β2)
 Juntos os domínios α1 e β1 formam a fenda de
ligação do peptídeo
 Apresentam peptídeos derivados de proteínas
extracelulares para os receptores das células T CD4+
 Envolvidos na reposta imune à infecções com
agentes extra celulares e à moléculas HLA não-
próprias
 Retrito a superfície de células especializadas do
sistema imune (macrófagos, linfócitos B, ...)
 Estrutura da molécula HLA classe II

O sítio de ligação do peptídeo

consiste em uma fenda profunda,
formada lateralmente pelas α hélices
dos domínios α1 e β1, e o assoalho,
por oito (08) fitas β, pregueadas,
desses mesmos domínios,
pode acomodar peptídeos de 15 a 24
resíduos de aminoácidos
O exon 2 codifica o
domínio beta 1 das
moléculas HLA classe II

Diferenças encontradas nos diferentes alelos fora da região do SRA não são
consideradas relevantes na seleção dos pares receptores e doadores com
finalidade de transplantes de células progenitoras hematopoiéticas
Representação esquemática das moléculas de histocompatibilidade de classe
I (HLA-A, B e C) e das de classe II (HLA-DR, DQ e DP), ressaltando os
domínios de maior polimorfismo.

Fonte: Donadi EA, Medicina, Ribeirão Preto, 33:7-18 , 2000

Peptídeo exógeno Peptídeo endógeno
Tipagem HLA
 Especificidades HLA foram inicialmente identificadas utilizando soros
(anticorpos)

 Método: citotoxicidade celular mediada por anticorpo e

dependente do complemento

- Historicamente esses soros eram obtidos de mulheres multíparas

- Os laboratórios mantinham grandes bancos de soros

 Células dos pacientes eram misturadas com vários soros, incubadas e então o
Complemento e um corante vital eram adicionados

 Se a célula tivesse o antígeno correspondente, então o anticorpo se ligava, o

complemento se fixava e havia morte celular
Tipificação de moléculas HLA de classe I utilizando o teste de microlinfocitotoxicidade
dependente de complemento (sorologia)

 Linfócitos T para tipagem HLA-A, B, C  Linfócitos B para tipagem HLA- DR,

DQ
 Antígenos HLA-DP não são tipifificados por essa técnica (falta de anti-soros
específicos)
Fonte: Donadi EA, Medicina, Ribeirão Preto, 33:7-18 , 2000
 Tipagem HLA
Métodos Sorológicos

 Em 1964, Terasaki & McClelland - micrométodo de citotoxicidade

mediada por anticorpo e dependente de complemento

 Melhoria dos procedimentos de separação de linfócitos totais e B (HLA de

classe II) – células viáveis

 Disponibiidade de paineis de soros

 Obtenção de anticorpos monoclonais para diversas especificidades de

classe I e II
 Tipagem HLA
Métodos Moleculares

 No final dos anos 80 e durante os anos 90, houve um grande avanço nos
procedimentos de tipificação dos alelos HLA, utilizando-se o DNA genômico

 Especificidades HLA também passaram a se determinadas por análise

genética por identificação da presença ou ausência do gene que codifica a
proteína HLA

 As regiões polimórficas dos genes HLA classe I e II são amplificadas a partir

do DNA genômico por meio da técnica de PCR (reação em cadeia da
polimerase) utilizando primers que anelam nas terminações 5’e 3’ das regiões
flanqueadoras do DNA que são conservadas entre os indivíduos
 Tipagem HLA
Métodos Moleculares

 Conhecimentos necessários:

 Conhecimentos em biologia molecular

 Conhecimento da sequência gênica

 Polimorfismos genéticos e suas bases moleculares

Mutações de ponto (SNP)
Recombinações gênicas
Deleções
Inserções
 Tipagem HLA
Métodos Moleculares

Década de 80
PCR-RFLP (restriction fragment lenght polymorphism)

Nos últimos 20 anos

PCR-SSP - reação em cadeia da polimerase por iniciadores com
sequencias específicas
PCR-SSOp - reação em cadeia da polimerase por iniciadores e utilização
de sondas de oligonucleotídes com sequencias específicas
PCR-SBT - tipificação por sequenciamento de nucleotídeos na fita de
DNA
NGS - sequenciamento de nova geração
PCR- SSP
(sequence specific primer )

A tipificação do HLA é feita durante a etapa de amplificação.

 São utilizados primers sequência-específicos.
 Produto (DNA amplificado) corado com brometo de etídio
 Eletroforese em gel de agarose
 Leitura em transiluminador UV
 Fotografia
 Interpretação “manual” e através de software
 PCR- SSP
(sequence specific primer )

Cada reação de PCR utiliza primer específico para um alelo.

 Tipificação HLA por PCR-SSP (seqûência-específica)

Extração
Extração do
do DNA
DNA

Amplificação
Amplificação com primers
primers
Eletroforese
Eletroforese em gel
gel de
de agarose
agarose alelo-específicos
alelo-específicos
Coloração
Coloração com
com brometo de etídio
etídio
 PCR- SSOP
(sequence specific oligonucleotide probe)

 A tipificação do HLA é feita durante a etapa de

hibridização, que ocorre após a amplificação.
 São utilizados primers “genéricos” e probes sequência-
específicas. *
 Eletroforese em gel de agarose, para avalair o
resultado da etapa de amplificação
 Diversas técnicas de hibridização.
 Interpretação “manual” ou através de software
 PCR- SSOP
(sequence specific oligonucleotide probe)

A reação de PCR amplifica os exons responsáveis pelo

polimorfismo da molécula HLA – etapa de amplificação

HLA classe I

HLA classe II
 PCR- SSOP
Luminex (One Lambda ® )

Microesferas (beads) Microesferas capturam as moléculas-

atuam como carreadores alvo (DNA amplificado) através das
das probes sequência-específicos probes

Para realizar um teste, milhares de

probes são conjugadas a microesfera
 PCR- SSOP
Luminex (One Lambda ® )

As microesferas são analisadas O laser causa a emissão de

em um citômetro-de-fluxo fluorescência nas microesferas
conjugadas ao DNA

As reações são avaliadas como positiva

ou negativa em um software
• Microesferas são pré-conjugadas com uma única sonda.
 PMT

532 nm

633 nm

APD
APD APD
Princípio:

1. Amplificação 2. Desnaturação/Neutralização

3. Hibridização 4. Marcação
Avaliação do Resultado de Amplificação

Loco A 2 bandas maiores = Exon 2 e

Exon 3

Loco A: 571bp (Exon 2) e 348-

Loco B
349bp (Exon 3)

Loco B: 579-594bp (Exon 2) e

Loco C 333-338bp (Exon 3)

Loco C: 582-585bp (Exon 2) e

370bp (Exon 3)
 Procedimento LABType™
1. Desnaturação e
Neutralização (10
min.)
2. Adicionar
as Beads

3. Hibridização
7. Leitura (15 min. a 60ºC)
Amplificação
(90 min.)

6. Passo de Lavagem 4. Passo de

Lavagem
• Adicionar Wash
Buffer
5. Adicionar o • Agitar
SAPE • Centrifugar -
pulso
(5 min. a 60ºC) • Remover sobre.
felipe
 Nomenclatura HLA
Hífen utilizado para separar o nome do gene do prefixo HLA
Sufixo utilizado para denotar mudanças na
Separador Separadores de campos expressão

N = Null
HLA-A*01:101:01:02N L = Low
S = Secreted
Q = Questionable
Prefixo HLA Gene

1° campo:
Grupo alélico 4° campo: Polimorfismo fora da região
(equivalente 2° campo: codificadora (introns)
sorológico) Proteína HLA específica

3° campo: Mutação silenciosa (sinônima)

http://hla.alleles.org/alleles/index.html.
 Nomenclatura HLA
Haplótipo
-Combinação de alelos de dois ou mais loci localizados
o mesmo cromossomo
Ex: HLA-A*01-B*08 A*01 A*24
HLA-A*24-B*40 B*08 B*40
Genótipo
- Combinação de dois haplótipos, um de cada progenitor,
herdado por um indivíduo
Ex: HLA-A*01, A*24
HLA-B*08, B*40

Desequilíbrio de de Ligação
- Presença de dois alelos que são herdados juntos com uma frequencia maior do que o esperado,
baseado na frequencia de cada alelo
Desequilíbrio de ligação

Distribuição de registros de doadores entre 18 e 60 anos

do REDOME por Região e Gênero
Feminino Masculino Total
Região n Freq n Freq n Freq
Norte 119.998 48,2% 128.856 51,8% 248.854 6,8%
Nordeste 302.979 53,9% 259.370 46,1% 562.349 15,3%
Sudeste 951.121 55,9% 749.816 44,1% 1.700.937 46,3%
Sul 495.859 58,8% 346.920 41,2% 842.779 22,9%
Centro-oeste 180.560 56,3% 140.288 43,7% 320.848 8,7%
Distribuição geográfica de frequências

http://www.allelefrequencies.net/
Transplantes de células tronco hematopoiéticas

Tipos
 singênico (irmão gêmeo);

 alogênico;
 relacionado ou aparentado (irmão ou familiar);
não relacionado ou não aparentado (não familiar, por exemplo, os do Registro Brasileiro de Doadores
Voluntários de Medula Óssea - Redome);

 Autólogo ou autogênico (medula óssea originária do próprio paciente com ou sem tratamento in vitro).
Transplantes de células tronco hematopoiéticas

Tipos
singênico (irmão gêmeo);

alogênico;
- relacionado ou aparentado (irmão ou familiar);
- não relacionado ou não aparentado (não familiar, por exemplo, os do Registro
Brasileiro de Doadores Voluntários de Medula Óssea - Redome);

• autólogo ou autogênico (medula óssea originária do próprio paciente com ou sem tratamento in vitro).
HLA e Transplante
Transplante

Transferência de células, tecidos ou órgãos saudáveis de um indivíduo para outro

Histórico
Início dos anos 50 – primeiro Tx de rim entre dois irmãos gêmeos idênticos

Final dos anos 50 – primeiro Tx de rim entre dois indivíduos não aparentados

Atualmente – Tx de praticamente todos os órgãos e tecidos

 Tipos de Transplantes

Órgãos sólidos Células tronco hematopoiéticas

TIPOS DE TRANSPLANTES
 Imunologia dos Transplantes

Maior desafio para os especialistas em transplante

Rejeição Incompatibilidade
HLA
Imunológica

É a resposta imunológica indesejável envolvendo na maioria de vezes as moléculas HLA do órgão

/tecido transplantado
 HLA x Transplante

Células do sistema imunológico são capazes de reconhecer a diferença entre as

proteínas HLA

RECEPTOR RECEPTOR

ENXERTO

Células B Células T
 Imunologia dos Transplantes

Rejeição Imunológica
Resposta imune do receptor contra o transplante (enxerto):

Rejeição
Enxerto

Resposta imune do enxerto (doador) contra o receptor:

GVHD
Enxerto
 Imunologia dos Transplantes

GVHD (graft vs host disease)

DECH (doença do enxerto contra o hospedeiro)

 Reação de linfócitos T do doador contra os antígenos de

histocompatibilidade do hospedeiro
 Resposta imune dirigida primariamente contra a pele, o intestino e o
fígado
 As manifestações clínicas caracterizam-se por erupção cutânea, diarréia e
icterícia.
 Consequências da Rejeição

Perda do enxerto Histocompatibilidade: identidade,

reconhecimento, compatibilidade

Doença do enxerto vs hospedeiro

Duração e intensidade das terapias imunossupressoras

Mortalidade

Redução do risco da rejeição:

- Redução de diferenças entre os antígenos de histocompatibilidade (HLA)
- Imunossupressão
 HLA X Transplante

Grande variabilidade genética entre Dificuldade em selecionar um doador

indivíduos compatível

Alto polimorfismo das Moléculas altamente

moléculas HLA imunogênicas

Classe I - expressas em todas as

células nucleadas Grande exposição de antígenos
Classe II - células imunocompetentes após o transplante
Transplante de Medula Óssea

Primeira tentativa de Transplante de Medula

Óssea – 1896

A medula era administrada por via oral depois

das refeições
COMPATIBILIDADE HLA

1ª. FASE : Compatível (HLA classe I e II idênticos em baixa/média resolução) :

Solicitar HLA- C e Classe II de alta resolução do paciente e doador

A* B* C* DRB1* DQB1*

29 42 07
PACIENTE
01 07 04

29 42 07
DOADOR
01 07 04
COMPATIBILIDADE HLA

2ª. FASE : Incompatível (HLA classe I e II , diferente em DRB1 de alta

resolução)

A* B* C* DRB1* DQB1*

29 42 02 07:01 02:01
PACIENTE
01 07 04 04:03 03:01

29 42 02 07:01 02:01
DOADOR
01 07 04 04:02 03:01
COMPATIBILIDADE HLA

2ª. FASE : Compatível (HLA classe I e II idênticos em alta resolução): Solicitar

o teste confirmatório

A* B* C* DRB1* DQB1*

29 42 02 07:01 02:01
PACIENTE
01 07 04 04:03 03:01

29 42 02 07:01 02:01
DOADOR
01 07 04 04:03 03:01
COMPATIBILIDADE HLA

3ª. FASE : Confirmatório = AVANÇOS

Realizar Classe I também por alta resolução

(MAIOR DIFICULDADE DE SE ACHAR UM DOADOR)

A* B* C* DRB1* DQB1*

02:01 42:01 02:03 07:01 02:01

PACIENTE
29:01 07:02 04:01 04:03 03:01

02:01 42:01 02:03 07:01 02:01

DOADOR
29:01 07:02 04:01 04:03 03:01
Grau de Compatibilidade
entre Paciente e Doador
Método Molecular de Baixa Resolução: 10/10

A*02 B*08 C*07 DRB1*07 DQB1*02

Paciente
A*24 B*44 C*03 DRB1*12 DQB1*03

A*02 B*08 C*07 DRB1*07 DQB1*02

Doador
A*24 B*44 C*03 DRB1*12 DQB1*03
Grau de Compatibilidade
entre Paciente e Doador
Método Molecular de Média (HLA Classe I) e Alta Resolução (HLA Classe II)

A*02:CMZH B*35:CDUD C*03:CDMB DRB1*01:01 DQB1*02:02

Paciente
A* 03:CMZJ B*40:CDUE C*04:CRGC DRB1*07:01 DQB1*05:01

A*02:DEJN B*35:DBVG C*03:DGTK DRB1*01:01 DQB1*02:02

Doador
A* 03:CMZJ B*40:CDUE C*04:CRGC DRB1*07:01 DQB1*05:01
Grau de Compatibilidade
entre Paciente e Doador
Método Molecular de Alta Resolução: 6/10

A*02:01 B*08:01 C*07:01 DRB1*03:01 DQB1*02:01

Paciente
A* 24:02 B*44:02 C*03:03 DRB1*12:01 DQB1*03:02

A*02:01 B*08:01 C*07:01 DRB1*03:01 DQB1*02:01

Doador
A* 24:03 B*44:03 C*03:02 DRB1*12:02 DQB1*03:02
 Transplante de Medula Óssea

Critérios para seleção de doador de medula óssea / sangue periférico não

aparentado

Realizar tipificação de alta resolução para os locos HLA-A, B, C, DRB1 e

DQB1 do paciente para a busca de doador não aparentado e de seus
potenciais doadores (incompatibilidades alélicas podem ser funcionalmente
relevantes)

Selecionar, preferencialmente, doador com compatibilidade alélica 8/8 (HLA-

A, B, C e DRB1) devido ao efeito cumulativo ou sinergismo das
incompatibilidades HLA

◦ O número total de incompatibilidades HLA é fator de risco de falha de pega

do enxerto e DECHa
Quando não houver doador com compatibilidade alélica 8/8 (HLA-A, B, C e DRB1)
escolher preferencialmente:

◦ Doador com compatibilidade DQB1 (9/10) para evitar um “efeito aditivo de DQB1”

 Alguns estudos sugerem (sem significância estatística) um efeito aditivo de DQ ao avaliar

o risco de mortalidade associado às incompatibilidades HLA

◦ Doador com compatibilidade DRB1 e uma incompatibilidade em um dos locos de

classe I (A, B ou C)

 A incompatibilidade em DRB1 foi associada com maior risco de DECHa e de mortalidade

◦ Doador com incompatibilidade de alelos ao invés de antígenos

 As incompatibilidades de antígenos (baixa resolução), mas não de alelos (alta resolução)

estão associadas com falha de pega do enxerto
◦ Incompatibilidades DPB1 não constituem critério de exclusão de doador, exceto
quando o receptor apresentar anticorpos pré-formados contra moléculas HLA-
DP expressas pelo doador

◦ Fazer pesquisa de anticorpos anti-HLA de classes I e II no soro do receptor que

encontrar

 Doador com incompatibilidade HLA

―Evitar doador incompatível em qualquer loco HLA quando o receptor apresentar

anticorpos específicos para moléculas HLA expressas pelo doador

―Quando o receptor apresentar anticorpos anti-DPB1 considerar a tipificação DPB1 do

par doador/receptor

―Se não houver outro doador disponível ou tempo para iniciar outro processo de busca,
empregar medidas para a remoção dos anticorpos anti-HLA pré-formados
 Critérios de exclusão de receptor

Idade superior a 70 anos

Presença de malignidade concomitante
Função cardíaca anormal (fração de ejeção < 50%)
Presença de doença respiratória crônica (capacidade vital ou teste de difusão do
monóxido de carbono < 50% do normal)
Função hepática anormal (bilirrubina sérica > 2,0 mg/dl ou transaminases 2,5x o
valor normal)
Função renal anormal (creatinina sérica > 1,8 mg/dl; clearance de creatinina
abaixo de 60ml/min)
* Medula óssea
** Sangue Periférico mobilizado
*** Sangue de cordão
 Medula óssea

Riscos:

Anestesia

Infecção

Dor

Sangramento/ hematomas
MO aspirada da crista ilíaca posterior

Volume médio por coleta: 10-15ml/Kg do

receptor
 Sangue Periférico Mobilizado
Aférese:

2-4 coletas (3-4 horas por coleta)

Processamento de 2-4 volemias (10-20 litros de sangue) por coleta

Dose de células alvo ( 2,0 a 4,0 x 106 células CD34+ /kg)

Riscos:
Toxicidade do citrato Risco do cateter

Hipocalcemia:
Infecção
Trombose
Parestesias
Arritmias Pneumotórax
 Fator de crescimento

No sangue periférico normal

encontramos cerca de 0,01 a Armazenamento em freezer -80°C ou
0,1% de células CD34+
N2 líquido
Sangue de Cordão Umbilical
 Resumo do TCTH
1ª ETAPA - CONDICIONAMENTO
Quimioterapia e/ou Radioterapia corporal total
Erradicar a doença
Criar espaços para nova medula

2ª ETAPA - INFUSÃO
As Células migram para a Medula Óssea

AUTOGÊNICO ALOGÊNICO
Recuperação Hematológica 10 a 20 dias 2 a 4 semanas
Recuperação Imunológica 3 meses meses a anos
Drogas utilizadas no condicionamento
 Infusão
Dia 0 Dia +30
 Dados Atuais
Programa Nacional de Doadores de Medula (NMDP) relata que:

◦ Em média são necessários 4 meses para completar a busca de um

possível doador
◦ 30% dos potenciais doadores não doam

A chance no Brasil de encontrar um doador compatível é de 1/100.000

 Complicações após o
transplante
Infecciosas

Mucosite

Doença veno-oclusiva hepática (VOD)

Pulmonares (Pneumonias intersticiais)

Renais

Doença Enxerto versus Hospedeiro aguda e crônica (GVHD ou DECH)

 Doença Enxerto versus Hospedeiro (GVHD ou DECH)

Os linfócitos T do doador reconhecem os antígenos teciduais do receptor como

estranhos

Três fatores são essenciais:

 Competência imunológica dos linfócitos T do doador
 Algum grau de incompatibilidade entre doador e receptor
 Inabilidade do receptor em rejeitar as células do doador

Amplificação do processo é mediado por citocinas (IL-2, TNF)

Incidência da doença em relação à idade:

 11% - 3 meses a 4 anos
 35% - maiores de 4 anos
 40% a 60% - Adultos
 Graduação Clínica da
GRAU
DECHESTÁGIO

Pele Fígado Intestino Déficit Funcional

0 (nenhum) 0 0 0 0
I (leve) + a ++ 0 0 0
II (moderado) + a +++ + + +
III (severa) ++ a ++++ + a +++ + a +++ ++
IV (fatal) ++ a ++++ ++ a ++++ ++ a ++++ +++
 DECH Aguda - Quadro
Clínico
Febre

Rash cutâneo

Náusea

Diarréia

Alteração da função hepática

Endotelite e microangiopatia trombótica

Trombocitopenia e aplasia de medula

 AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS

Equipe HLA
Ágatha Costa
Beatriz Leal Isadora Cruz
Flávia Rodrigues Leciane Simões
Glaydson Fróes Luciana Lara
Mary Cruz Farmacêutico-Bioquímico
Dra. Milena BatistaRegina Responsável Técnico
Amarante ADC| T.GLA | LABORATÓRIO DE
Dr. Fernando Basques
HISTOCOMPATIBILIDADE
Fundação Centro de Hematologia e Hemoterapia de Minas
Gerais - HEMOMINAS
felipe.brito@hemominas.mg.gov.br
hla@hemominas.mg.gov.br
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Tel: (31) 3768-4603/4564
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