Rela Coes Filo Genetic As To Xo Car A

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
Instituto de Ciências Biomédicas
Programa de Pós-Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
Relações filogenéticas de Toxocara spp. e

Toxascaris sp. provenientes de diferentes regiões
do mundo
Natália de Melo Nasser Fava
Uberlândia
Julho - 2017
Relações filogenéticas e filogeográficas de

Toxocara spp. e Toxascaris sp. provenientes de
diferentes regiões do mundo
Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-

Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
como parte de obtenção do título de Doutor
Natália de Melo Nasser Fava

Aluna
Profª. Drª Márcia Cristina Cury

Orientadora
Prof. Dr. Peter Nejsum

Coorientador
Uberlândia
Julho - 2017
Relações filogenéticas de Toxocara spp. e Toxascaris sp.

provenientes de diferentes regiões do mundo
Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-

Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
como parte de obtenção do título de Doutor
Área de concentração: Parasitologia
____________________________________________________________________________
Profª. Drª. Suzana Angélica Zevallos Lescano
____________________________________________________________________________
Prof. Dr. Stefan Michael Geiger
____________________________________________________________________________
Prof. Dr. Carlos Ueira Vieira
____________________________________________________________________________
Drª. Juliana Silva Miranda
____________________________________________________________________________
Profª. Drª. Márcia Cristina Cury
Uberlândia
Julho-2017
1
Dedicatória
A Deus, meu sossego e meu conforto, razão principal de todas as coisas.
À minha mãe, fonte inesgotável de amor. Pela mão, que quando entrelaçada à minha,
direciona, dá força e coragem, pelo colo que cura qualquer dor, e pelo sorriso que afasta
qualquer monstro. Ah, se todos no mundo fossem iguais à você!
Ao meu amor dessa e de todas as outras vidas, Rafael, por sonhar meus sonhos comigo.
Por me lembrar, todos os dias, que minhas escolhas são feitas por amor, e que amor
nunca é demais! Eu não conseguiria sem você. Nosso time é o melhor!
À minha amada tia Vera, por me ensinar que meus horizontes são do tamanho da minha
vontade. Nós conseguimos tia!
Agradecimentos
Às mulheres fortes da minha vida, Vovó Nair, Vovó Luzia, Tia Beth, Tia Heloísa e Nara, que me
inspiram a cada dia. Obrigada pelo amor de sempre. Saibam que eu se eu cheguei até aqui, com certeza
foi porque trouxe um pouco de vocês pelo caminho.
À minha FAMÍLIA de amigos, que fazem meus dias mais leves e felizes. Cada abraço, cada sorriso e
cada palavra de carinho me ajudaram a vencer etapa por etapa. Sintam-se parte fundamental dessa
conquista!! Eu amo vocês, Gordice!
Às minhas amigas da vida, Paula e Mariana por entenderem minhas ausências sem nunca duvidarem do
meu amor.
Às minhas florzinhas Maria Júlia, Letícia, Kelem, Talita, Camila, Juliana, Daliane e Luana que eu levo do
laboratório pra vida. Vocês são definitivamente o maior e melhor presente que a UFU já me deu. Nossos
encontros me renovam. Vocês não sabem como fazem diferença!!
À Profª. Drª. Márcia Cristina Cury, pela confiança dedicada, e por extrair de mim o meu melhor. Você é
muito responsável pela profissional que sou e por onde cheguei. Mas mais do que isso, obrigada por fazer
parte da minha vida. Você também me inspira!
Ao Professor Dr. Peter Nejsum, da Universidade de Copenhagen, pelos ensinamentos durante o período
de doutorado sanduíche e pela parceria mantida, mesmo após o fim.
A Iasmin, pelo auxílio na formatação do trabalho e pelas incontáveis risadas.
Aos amigos do laboratório de Sorologia e Biologia Molecular de Parasitos por propiciarem um ambiente
tão bom de trabalho.
Aos colaboradores Nao Takeushi-Storm, Profª. Drª. Katharina Raue, Prof. Dr. Xing-Quan Zhu, Profª. Drª.
Taira Kensuke, Profª. Drª. Irina Odoevskaya e Profª. Dra. Teresa Mateus pelo fornecimento de amostras,
que muito contribuíram para esse trabalho.

Pensamento
“E a coisa mais divina que
há no mundo é viver cada
segundo como nunca
mais”
(Vinícius de Morais)
Lista de figuras
Figura 1 – Ovos de Toxocara spp. (A) e Toxascaris leonina (B) observados em microscópico
óptico em objetiva de 40X e corados com lugol após técnica de centrífugo flutuação em Sulfato
de Zinco 33%. Fonte: Acervo da autora ........................................................................................ 29
Figura 2 – Espécime adulto de Toxocara spp. observado em microscópico estereoscópico.

Fonte: Acervo da autora ................................................................................................................ 30
Figura 3 - Extremidade anterior com aletas cefálicas em evidência, de T. canis(A), T. cati (B), T.
malaysiensis (C) e T. leonina (D).................................................................................................. 30
Figura 4 - Fluxograma das etapas do experimento ..................................................................... 46
Figura 5A - Mapa de restrição para Toxocara canis feito com o auxílio da ferramenta online
NEBcutter®. Setas indicam sítio exato de clivagem da enzima MseI. ......................................... 55
Figura 5B - Mapa de restrição para Toxocara cati feito com o auxílio da ferramenta online
Figura 5C - Mapa de restrição para Toxocara malaysiensis feito com o auxílio da ferramenta
online NEBcutter®. Setas indicam sítio exato de clivagem da enzima MseI. .............................. 57
Figura 5D - Mapa de restrição para Toxocara leonina feito com o auxílio da ferramenta online
Figura 6 - Extremidade anterior de Toxocara canis observada em microscópio esteoreoscópio.

Setas indicam as aletas cefálicas. Fonte: acervo da autora ........................................................... 61
Figura 7 - Extremidade anterior de Toxascaris leonina observada em microscópio

esteoreoscópio. Setas indicam as aletas cefálicas. Fonte: acervo da autora .................................. 62
Figura 8 - Extremidade anterior de Toxocara cati observada em microscópio esteoreoscópio.

Setas indicam as aletas cefálicas. Fonte: acervo da autora ........................................................... 62
Figura 9 - Ovos de Toxascaris leonina observados em microscópio óptico na objetiva de 40X e

corados com Lugol. Setas indicam a membrana externa lisa. Fonte: acervo da autora ................ 63
Figura 10 - Fragmentos de 490pb do gene Cox1 em gel de agarose 2% corado com GelRed®.
Marcador de peso molecular - 100pb ............................................................................................ 64
Figura 11 - Relações filogenéticas entre espécimes de T. canis, T. cati, T. malaysiensis e T.
leonina de diferentes regiões do mundo inferidas a partir de sequencias parciais do gene Cox1
utilizando o método Neighbor-Joining com boostraps estabelecidos em 1000 réplicas ............... 66
Figura 12 - Padrões de restrição gerados pela reação de PCR-RFLP com enzima MseI
visualizados em gel de agarose 2% corado com GelRed®. Linha 1 – Fragmento de gene cox1
integral; Linha 2 – T. canis; Linha 3 – T. cati, Linha 4 - T. malaysiensis; Linha 5 – T. leonina.
Marcador de peso molecular – 100pb ........................................................................................... 68
Figura 13 - Padrões de restrição gerados pela reação de PCR-RFLP com enzima MseI
visualizados em gel de agarose 2% corado com GelRed®. Linha 1 – CDK2_1 (padrão de T.
canis/T. leonina); Linha 2 – CBRU38_1 (padrão de T. canis/T. leonina); Linha 3 – DRU2_1
(padrão de T. cati); Linha 4 – CML1_1 (padrão de T. cati). Marcador de peso molecular – 100pb
....................................................................................................................................................... 70
Lista de tabelas
Tabela 1 - Perfil epidemiológico e demográfico dos animais dos quais foram obtidos os
ascaridídeos analisados nesse estudo ............................................................................................ 48
Tabela 2 – Número de amostras coletadas, provenientes de canídeos e felídeos, em cada país

incluído nesse estudo ..................................................................................................................... 50
Tabela 3 - Primers utilizados nas reações de PCR para amplificação de fragmento do gene cox1
....................................................................................................................................................... 53
Tabela 4 - Número de acesso das sequências disponíveis do GenBank utilizadas como

referências para análises filogenéticas nesse estudo ..................................................................... 59
Tabela 5 - Quantidade de helmintos, provenientes de cada país abrangido nesse estudo, (adultos
e ovos) submetidos à reação de sequenciamento do fragmento do gene cox1 ............................. 64
Tabela 6 - Isolados analisados e número de referências das sequências disponíveis no Genbank

homólogas à eles ........................................................................................................................... 67
Sumário
1. Introdução geral .................................................................................................................................. 23
1.1 - Histórico ................................................................................................................................... 26
1.1.1 Toxocara canis ................................................................................................................... 26
1.1.2 Toxocara cati...................................................................................................................... 27
1.1.3 Toxocara malaysiensis ....................................................................................................... 27
1.1.4 Toxascaris leonina ............................................................................................................. 27
1.2 Morfologia .................................................................................................................................. 28
1.3 Biologia ...................................................................................................................................... 31
1.4 Aspectos clínicos e sintomatologia da Toxocaríase ................................................................... 32
1.5 Métodos diagnósticos ................................................................................................................. 34
1.6 Prevalência ................................................................................................................................. 35
1.7 Potencial zoonótico .................................................................................................................... 36
1.8 Especificidade de hospedeiro ..................................................................................................... 37
1.9 Biologia Molecular ..................................................................................................................... 38
1.10 Distribuição geográfica e variabilidade intragenotípica ............................................................. 40
2. Justificativa......................................................................................................................................... 42
3. Objetivos ............................................................................................................................................ 44
4. Metodologia........................................................................................................................................ 46
1. Aprovação ética .............................................................................................................................. 47
2. Regiões do estudo........................................................................................................................... 47
3. População de estudo: ...................................................................................................................... 47
4. Coleta dos Parasitos........................................................................................................................ 50
5. Processamento dos parasitos .......................................................................................................... 51
6. Identificação morfológica............................................................................................................... 51
7. Identificação molecular .................................................................................................................. 51
7.1 Extração do DNA ................................................................................................................... 52
7.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (Realizada na Universidade de Copenhagen – DK)
52
7.3 Sequenciamento (Realizada na Universidade de Copenhagen – DK) .................................... 53
7.4 Reações de Restriction Fragment Length Polymorfism (RFLP-PCR) ................................... 53
7.5 Análise filogenética ................................................................................................................ 59
5 Resultados .......................................................................................................................................... 61
1. Análise morfológica ....................................................................................................................... 61
2. Análises molecular ......................................................................................................................... 63
2.1 PCR ........................................................................................................................................ 63
2.3 RFLP ...................................................................................................................................... 67
2.4 Variabilidade genotípica intra e interespecífica associadas à distribuição geográfica ........... 68
2.5 Comparação entre a técnica morfológica e as moleculares na determinação da espécie
parasito ............................................................................................................................................... 69
6 Discussão ............................................................................................................................................ 72
7 Conclusões ......................................................................................................................................... 83
8 Bibliografia......................................................................................................................................... 85
18
Resumo
19
Os nematódeos dos gêneros Toxocara e Toxascaris são identificados, tradicionalmente, com

base nos aspectos morfológicos, entretanto a diversidade genética entre esses parasitos é
reconhecida, sendo a análise precisa dessa variação é necessária para o entendimento da biologia
desses organismos. Esse trabalho teve como objetivos estabelecer relações filogenéticas e
filogeográficas entre espécimes de Toxocara canis, Toxocara cati, Toxocara malaysiensis e
Toxascaris leonina, e comparar os resultados das técnicas morfológica e moleculares. Foram
coletados 436 helmintos adultos e quatro “pools” de ovos de canídeos e felídeos, procedentes de
oito países. Os parasitos foram analisados por microscopia estereoscópica, pela Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR) e “Restriction Fragment Lenght Polymorfism” (PCR-RFLP). Os
primers TOXCOIF3 e TOXCOIF2 foram desenhados para amplificar 490 pares de base do gene
mitocrondrial Cox1 e a PCR-RFLP foi realizada utilizando-se a enzima MseI. As relações
filogenéticas entre os isolados foram observados no filograma e pelo cálculo das taxas de
variabilidade genotípicas (distância filogenética). Dos 313 parasitos adultos provenientes de
cães, 309 foram identificados, por microscopia, como T.canis e quatro como T. leonina. Dos 123
oriundos de gatos, 118 foram identificados como T. cati, quatro T. malaysiensis e um T. leonina.
Dentre os “pools” de ovos, os três de leoas foram identificados como T. leonina e o de cão como
T. canis. A PCR em todas as amostras analisadas (n=440) apresentou falha de 3,6%. Das
amostras amplificadas (n=424) 72 foram selecionadas para o sequenciamento. Com exceção de
três amostras, duas provenientes de gato foram caracterizadas como T. canis, e uma proveniente
de cão como T. cati, todas as restantes foram caracterizadas em concordância com os respectivos
hospedeiros. Das 424 amostras submetidas a PCR-RFLP, 351 foram identificadas como T.
canis/T.leonina, 70 como T. cati e três como T. malaysiensis. Essa técnica apresentou resultados
semelhantes ao sequenciamento. Foram observadas homologia e variação genotípica nas
espécies, sendo a maior 6,6%. Relações filogeográficas, dentro das espécies, puderam ser
observadas pelo filograma. Entre as técnicas, observou-se 9,7% de incongruência de resultados
entre microscopia e sequenciamento e 0,9% entre microscopia e PCR-RFLP. Entre as técnicas
moleculares, considerou-se somente T. cati e T. malaysiensis, o que significou 100% de
concordância entre resultados. A partir dos achados desse trabalho, conclui-se que alguns
isolados, da mesma espécie, apresentaram variabilidade intragenotípica; Sequências homólogas
foram identificadas em diferentes países, sugerindo a ocorrência de fluxo gênico; A procedência
geográfica teve relação direta com a variação genética dos parasitos; T. canis e T. cati
apresentaram taxa de variabilidade semelhante às de T. cati e T. leonina; E as três técnicas
utilizadas apresentaram resultados que indicam a preferência de T. canis, T. cati e T.
malaysiensis por determinados hospedeiros.
Palavras chave: Toxocara spp., Toxascaris, relações filogenéticas, filogeografia, especificidade

de hospedeiro, microscopia e técnicas morfológicas.
20
Abstract
21
The nematodes of the genus Toxocara and Toxascaris are identified, traditionally, based on the
morphologic aspects, however the genetic diversity among these parasites is recognized, being
an accurate analysis of this variation necessary for the understanding of the biology of these
organisms. This work aimed to establish the phylogenetic and phylogeographic relationships
among specimens of Toxocara canis, Toxocara cati, Toxocara malaysiensis and Toxascaris
leonina and to compare the results given by the morphologic and molecular techniques. In total,
436 helminths adults and four pools of eggs were collected from canids and felines from eight
countries. The parasites were analyzed by stereoscopic microscopy, by Polymerase Chain
Reaction (PCR) and by Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). Primers
TOXCOIF3 and TOXCOIR2 were designed in order to amplify 90pb of the mitochondrial gene
Cox1, and the PCR-RFLP using the enzyme MseI could discriminate between these four species.
The phylogenetic relationships among the isolates were observed in the phylogram and by the
genetic variability (phylogenetic distance) rates. Of the 313 parasites adults, from dogs, 309 were
identified, by microscopy, as T. canis and four as T. leonina. Of 123 originating from cats 118
were identified as T. cati, four as T. malaysiensis and one as T. leonina. Among the pools the
three from lions were identified as T. leonina and that of dog as T. canis. PCR in all analyzed
samples (n=440) failed in 3,6%. Of the amplified samples (n=424) 72 were selected to
sequencing. With the exception of three samples, two from cats, were characterized as T. canis
and one from dog as T. cati, all remaining were identified in agreement with their respective
hosts. Of the 424 samples submitted to PCR-RFLP 351 were identified as T. canis/T.leonina, 70
as T. cati and three as T. malaysiensis. This technique presented similar results to sequencing.
Homology and genotypic variation were observed within species, being the largest one 6.6%.
Phylogeographic relationships within species could be observed by the phylogram. Among the
techniques it was observed 9,7% of incongruence in the results between microscopy and
sequencing, and 0,9% between microscopy and PCR-RFLP. Between the molecular techniques,
it was considered only T. cati and T. malaysiensis which meant 100% of agreement. Based on
the findings, of this study, it was concluded that some isolates of the same specie presented
intragenotipic variability; Homologous sequences were identified in different countries,
suggesting the occurrence of gene flow; The geographic origin was directed related to the
genetic variation of the parasites; T. canis and T. cati presented variability rates similar to T. cati
and T. leonina; And the three techniques used, herein, showed results that indicate a preference
of T. canis, T. cati and T. malaysiensis for certain hosts.
Keywords: Toxocara spp., Toxascaris sp., phylogenetic relationships, host specificity,

microscopy, molecular techniques
22
Introdução
23
1. Introdução geral
A superfamília Ascaridoidea é constituída de 50 gêneros que parasitam vários grupos de

hospedeiros vertebrados (Fagerholm, 1991). Dentre eles, estão os gêneros Toxocara e Toxascaris
os quais possuem espécies que parasitam canídeos e felídeos, algumas com significância na
saúde humana (Sprent 1992). O gênero Toxocara tem particular importância, compreendendo 21
espécies sendo Toxocara canis e Toxocara cati os endoparasitos mais prevalentes em todo o
mundo.
T. canis e T. cati e T. malaysiensis são helmintos gastrointestinais de canídeos e felídeos,
cujas fêmeas produzem em torno de 200 mil ovos por dia (Glickman & Schantz, 1981). Esses
parasitos possuem transmissão oral-fecal e o ciclo e a epidemiologia são dependentes de fatores
ambientais. Os ovos são excretados não embrionados e, sob condições ideais podem ficar viáveis
por até um ano (Lloyd, 1993). Estudos ao redor do mundo têm demonstrado taxas entre 10-30%
de contaminação de solos, jardins, parques e outros lugares públicos por ovos de Toxocara spp.
(Mizgajska-Wiktor & Uga, 2006). O desenvolvimento larvário até a forma evolutiva infectante
ocorre, geralmente, em um período de três semanas até meses, dependendo do clima e do tipo do
solo (Overgaauw, 1997).
Apesar dos canídeos e felídeos serem considerados hospedeiros definitivos, larvas podem
persistir ou causar grave doença em várias espécies de hospedeiros paratênicos. No interior
desses hospedeiros as larvas possuem comportamento similar ao que ocorre nos hospedeiros
definitivos, porém sem que haja o desenvolvimento até a fase adulta do parasito, sendo a
infecção pela larva de terceiro estádio persistente nos tecidos em forma latente.
A toxocaríase em cães e gatos é infecção helmíntica comum, sendo rotina na clínica
médica veterinária. É zoonose ocasionada pela ingestão acidental de ovos embrionados dos
nematódeos dos gêneros Toxocara e Toxascaris. Devido a esse aspecto é importante para
humanos, sendo comumente relatada, com interesse crescente em relação à biologia e
epidemiologia desses parasitos (Magnaval et al., 2001). Embora a maioria das infecções
humanas seja atribuída ao T. canis, o potencial zoonótico de T. cati não deve ser subestimado, já
que as frações antigênicas são partilhadas entre essas duas espécies. Além disso modelos em
animais infectados, experimentalmente, mostram que ambas se comportam de forma semelhante
após a eclosão (Strube et al., 2013).
Toxascaris leonina é outro nematódeo de canídeos e felídeos embora apresente menor
frequência e seja menos estudado do que os outros ascaridídeos de carnívoros. A fase parasitária,
não migratória, restringe-se ao intestino delgado dos hospedeiros definitivos. Este parasito pode
24
ser confundido com o Toxocara canis, sendo a diferenciação realizada por este não possuir o
processo digitiforme na cauda do macho e pela forma das aletas na extremidade anterior dos
parasitos (Urquhart et al., 1996). Os ovos desenvolvem-se e, normalmente atingem a fase
infectante em torno de uma semana, contrastando com as quatro semanas das espécies de
Toxocara. O rápido desenvolvimento dos ovos pode explicar a persistência da infecção do T.
leonina em canis, mesmo aqueles em boas condições de controle sanitário (Bowman et al.,
2009). O ciclo biológico deste parasito, também, é caracterizado pelo rápido desenvolvimento da
fase larval infecciosa e, pela facilidade de parasitar hospedeiros paratênicos, os quais constituem
problema para o aumento da prevalência e contaminação do ambiente. Segundo Cho et al. (2009)
o Toxascaris leonina pode ser também considerado agente zoonótico, pois foram capazes de
invadir tecidos de animais infectados experimentalmente. Entretanto, existem dúvidas sobre o
grau de envolvimento em produzir em doenças nos humanos (Holland e Smith, 2006).
São vários os mecanismos responsáveis pela manutenção de infecções naturais em cães e
gatos, por Toxocara spp. e Toxascaris sp. De acordo com Overgaauw (1997) a infecção por
esses gêneros ocorre, nos animais, pela via transplacentária (cães), lactogenica (cães e gatos),
ingestão de ovos embrionados presentes no meio ambiente e ingestão de larvas (em fezes de
animais recém nascidos ou pelo consumo do hospedeiro paratênico). Aproximadamente 100%
dos filhotes são infectados no útero pela reativação de larvas somáticas e após o nascimento a
principal fonte passa a ser o leite materno (Lloyd et al.,1983).
Prevalências, especialmente, em animais abandonados, destacam a necessidade de
compreender a biologia dos parasitos em outros hospedeiros, que não sejam espécies-específicos.
A prevalência nos hospedeiros depende do ambiente, assim como das condições higiênicas. O
aumento da população de roedores em áreas urbanas pode atrair predadores, que servirão de
reservatórios para Toxocara spp. e Toxascaris sp. e para outros parasitos zoonóticos que
acometem cães e gatos (Reperant et al., 2009).
Pesquisas epidemiológicas indicam que a prevalência do T. canis em cães está entre 5,5%
e 64,7% (Oliveira-Sequeira et al., 2002; Rubel et al., 2003; Wang et al,2006; Daí et al.,2009) e a
do T. cati em gatos é de 4,7% a 55,2% ( Mircean et al.,2010; Barutzki e Schaper, 2011;
Khalafalla, 2011). Nos trabalhos realizados por Santos (2001) e Barbosa et al., (2005) o
Toxascaris leonina apresentou prevalências superiores a do T. canis em carnívoros domésticos e
silvestres.
A soroprevalência da Toxocaríase humana em países da Europa, tais como França,
República Tcheca e Áustria varia entre 2% a 40%, sendo mais alta nas áreas rurais. Em países
tropicais, como Indonésia e Brasil foram relatados índices entre 8% e 63% (Anaruma Filho et al.,
25
2002; Figueiredo et al., 2005; Teixeira et al., 2006; Strube et al., 2013). Dados epidemiológicos
demonstram ser a toxocariase prevalente helmintíase em países industrializados, representando
típica doença negligenciada e problema de saúde pública (Magnaval et al., 2001; Turrientes et
al., 2011).
Em humanos os estádios larvais são inábeis para a maturação em parasitos adultos, os
quais migram pelo tecido causando danos e manifestações clínicas. O risco de infecções para
humanos aumenta com a prática da geofagia, consumo de alimentos crus, principalmente
vegetais, e pobres condições de higiene (Magnaval et al.,2001, Mattia et al , 2012). Parques,
praças e áreas de recreação em escolas são locais de potencial risco para a transmissão, devido à
possível contaminação do local com ovos desses helmintos. A ingestão de carne crua ou mal
cozida de coelho, porco, frango ou fígado de bovino tem sido considerada via de transmissão
para Toxocaríase humana (Kwon et al.,2006).
O quadro clínico da toxocariase humana tem sido classificado em quatro grupos distintos
denominados de: Larva migrans visceral (LMV), Larva migrans ocular (LMO),
Neurotoxocariase (NT) e ‘Covert toxocariase ’(CT) (Magnaval et al.,2001; Chen et al.,2012). O
amplo espectro das consequências clínicas e patológicas da toxocariase, assim como, frequentes
infecções inaparentes, podem causar dificuldade na identificação e classificação de casos
clínicos. A gravidade e o padrão sintomatológico dependem do tecido invadido, do número de
larvas migrantes no tecido e da idade do hospedeiro.
Tradicionalmente os nematódeos dos gêneros Toxocara e Toxascaris são classificados
com base nos aspectos morfológicos e “habitat” nos hospedeiros (Borecka et al., 2010). Sprent
(1983) avaliou relevância taxonômica de recursos, tais como as estruturas labiais, esôfago, ceco,
sistema excretório e cauda do macho. A partir dessas características várias espécies de Toxocara
foram classificadas tais como, T. canis (canídeos), T. cati (felídeos), T. lyncus (felídeos
selvagens), T. vitulorum (bovinos), T. tanuki (canídeos), T. apodemi e T. mackerrasae
(roedores), T. paradoxura e T. sprenti (mustelídeos), T. pteropodis (morcegos) e T. malaysiensis
(felídeos). Porém, os tradicionais métodos podem ser considerados limitados para uma
identificação e diferenciação precisa de espécies especialmente em relação a ovos e larvas. Isso
provavelmente levará a questionamentos em relação à análise taxonômica do gênero (Gasser et
al.,2006).
A diversidade genética é reconhecida entre os parasitos e representa importante papel na
sobrevivência e adaptabilidade dos mesmos. Uma profunda análise dessa diversidade é aplicável
em estudos sobre a biologia, epidemiologia e evolução desses parasitos. Diferentes métodos
26
como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e sequenciamento de genes parciais ou

completos, têm sido usados para análises genéticas (Mikaeilli et al., 2015).
Para ensaios de PCR a escolha da região alvo do DNA apropriada é fundamental para a
identificação específica dos parasito. Como diferentes genes evoluem em diferentes níveis, a
região escolhida precisa fornecer sequências suficientemente variáveis que permitam a
identificação de parasitos nos níveis taxonômicos requeridos (Zhu et al., 2001).
O DNA mitocondrial (mtDNA), devido a altas taxas de mutação fornece grande número
de informações filogenéticas, sendo assim fonte valiosa para o teste de hipóteses relativas a
relações evolutivas entre nematódeos (Hu et al., 2003).
Toxocara canis tem sido encontrado em gatos, sendo identificado a partir das
características morfológicas. Mundim et al. (2004), realizando necropsia em gatos observaram a
presença dessa espécie nesses animais. Outros autores como Parsons (1987), Baker et al. (1989),
Lee et al. (1993) e Scholz et al.(2003), também identificaram esse parasito em gatos domésticos.
Por muito tempo acreditou-se que a espécie encontrada em gatos na Malásia era T. canis,
devido às características morfológicas. Somente com a utilização de testes moleculares Zhu et al.
(1998) conseguiu demonstrar tratar-se de nova espécie que posteriormente foi denominada como
T. malayiensis (Gibbons et al., 2001). A identificação e a ocorrência dessa nova espécie, em
gatos, podem ter implicações médicas, pois essa pode ser mais uma espécie capaz de produzir
Larva Migrans Visceral e ou Larva Migrans Ocular.
Essa descoberta associada aos relatos de identificação de parasitos hospedeiros-
específicos em hospedeiros diferentes dos originais tem levantado dúvidas sobre a identidade
específica dos ascaridideos, em várias regiões geográficas, estimulando a caracterização genética
das espécies provenientes de carnívoros.
1.1 - Histórico
1.1.1 Toxocara canis
Na literatura existem poucas informações sobre a descoberta e descrição de Toxocara

canis. Originalmente essa espécie foi descrita como Lumbricus canis por Werner(1782) após a
análise de espécimes encontrados em cão e ficando, posteriormente, conhecida como Ascaris
canis.
Em 1907 com a criação do gênero Toxocara por Leiper, A. canis foi considerada a
espécie tipo do gênero e portanto, renomeada como Toxocara canis.
27
1.1.2 Toxocara cati
Goeze (1782) descreveu um verme de gato que continha grandes aletas cervicais e
Schrank (1788) atribuiu a esse helminto o nome de Ascaris cati. Zeder (1800) introduziu o
nome específico mystax para esse parasito, entretanto o anterior, dado por Schrank em 1788, teve
prioridade.
O gênero Toxocara foi criado por Stiles e Hassal (1905) e em 1907 Leiper criou o gênero
Belascaris, o qual foi diferenciado dos outros gêneros de ascaridídeos devido à presença do
ventrículo na base do esôfago dos parasitos. O autor atribuiu a Ascaris mystax a representação
desse gênero.
Em 1924 Stiles e Brown confirmaram que o gênero Toxocara tinha prioridade sobre
Belascaris e criaram o nome Toxocara mystax para o nematódeo do gato. No entanto, “cati” é
preferido em relação a “mystax”, fazendo com que a espécie fosse padronizada como Toxocara
cati.
1.1.3 Toxocara malaysiensis
Rhode (1962) e Lee et al. (1993) reportaram a ocorrência de ascaridídeos encontrados em

gatos na Malásia e os identificaram como T. canis, devido às semelhanças na morfologia.
Exames microscópicos de um espécime macho imaturo revelaram, no entanto,
inconsistências com descrições de T. canis publicadas, e uma coleção de ascaridídeos de gatos de
Kuala Lumpur, Malásia foi iniciada.
Estudos moleculares do material resultante indicaram que esse parasito era geneticamente
diferente de T. canis e de T. cati (Zhu et al., 1998), sendo considerado uma nova espécie
atribuída ao genêro Toxocara (Stile, 1905) e designada como Toxocara sp. cf. canis.
Em estudo posterior Gibson et al. (2001) detalharam a morfologia de 26 helmintos, sendo
que 11 deles haviam sido, anteriormente, utilizados nos estudos moleculares de Zhu et al. (1998).
Dessa forma os autores observaram que esses espécimes são morfologicamente distinguíveis dos
espécimes das outras espécies do gênero. A partir desse entendimento atribuíram a essa espécie o
nome de Toxocara malaysiensis, devido ao lugar de encontro dos primeiros exemplares.
1.1.4 Toxascaris leonina
Rudolphi (1809) descreveu um ascaridídio proveniente do intestino de um leão e o

nomeou como Ascaris lepdoptera. Pela descrição era possível ver que a espécie apresentava
28
aletas cervicais estreitas. Leões são parasitados por Toxocara cati e Toxascaris leonina os quais
podem ser diferenciados pelo formato das aletas.
Provavelmente, essa era a mesma espécie por Linstow (1902) como Ascaris leonina,
inclusive proveniente também de leão.
O gênero Toxascaris foi estabelecido por Leiper (1907) devido à presença de aletas
semelhante a dos ascaridídeos, porém com ovos de cascas lisas e sem o ventrículo esofágico
comum aos outros gêneros.
Railliet e Henry (1911) aceitaram Ascaris leonina como a espécie tipo do gênero e
acrescentaram outras duas, Toxascaris limbata de cão e Toxascaris microptera de lobo. A
primeira foi considerada espécie nova, enquanto a segunda foi identificada como a espécie
descrita por Rudolphi em 1809, após avaliar o exemplar original provenientes do museu de
Viena.
Leiper também reexaminou T. microptera e concluiu que o parasito era idêntico ao T.
leonina e pela lei da prioridade, esse foi o nome que prevaleceu. O mesmo ocorreu para T.
limbata, que anos mais tarde foi considerado sinônimo de T. leonina, pois os espécimes foram
considerados idênticos aos encontrados em leões e lobo, embora tivessem hospedeiro diferente.
1.2 Morfologia
Os ovos pertencentes ao gênero Toxocara são subglobulares, de cápsula espessa e rugosa,

com dupla membrana e medem aproximadamente 85-90x 75 micrômetros - Toxocara canis e/ou
65-75 micrômetros de diâmetro -Toxocara cati/Toxocara malaysiensis. Aqueles pertencentes ao
genêro Toxascaris apresentam as mesmas características, porém com membrana externa lisa
(Figuras 1A e 1B).
Os adultos apresentam corpo cilíndrico, não segmentado, robusto, esbranquiçado e
revestido por espessa cutícula quitinosa. O dimorfismo sexual é bem definido com fêmeas
maiores do que os machos, os quais possuem bolsa copulatória incompleta com espículos, duplos
ou únicos de tamanho variável. Na extremidade anterior do parasito observam-se três lábios bem
definidos e expansões cuticulares, denominadas asas ou aletas cefálicas, que possuem forma e
tamanhos diferentes de acordo com a espécie, sendo ferramenta de identificação pela
microscopia estereoscópica (Figura 2).
A extremidade anterior do T. canis adulto é elíptica em função das aletas cefálicas que
são estreitas e semi-lanceoladas (Figura 3A). Os machos medem entre 4 e 10cm, a cauda
apresenta pequeno processo digitiforme na extremidade além de espículos, ligeiramente
31
1.3 Biologia
Os ovos são eliminados nas fezes e o embrionamento ocorre no solo, sob condições
favoráveis de temperatura (10ºC e 30ºC) e umidade. Em média, após 28 dias a larva atinge o
estádio infectante (L3) (Taylor et al., 2010; Freitas, 1980). Temperaturas superiores a 37ºC
aceleram o desenvolvimento, mas também podem causar a degradação do ovo. Assim como
temperaturas menores a 10ºC são insuficientes para a maturação ou sobrevivência do ovo
(Gamboa, 2005).
Os ovos são resistentes e conseguem sobreviver durante o inverno por 12 meses em
climas temperados. Em temperaturas amenas e em ambientes úmidos a sobrevivência pode
ocorrer por quatro anos ou mais (Azam et al., 2012). O tipo do solo, pH e a porcentagem de
cobertura vegetal contribuem para a viabilidade e contaminação ambiental. Solos argilosos
impactam negativamente na viabilidade do ovo (Trejo et al., 2012).
Após a ingestão, o ovo, sob ação das enzimas do trato gastro intestinal tem a parede
rompida e a larva de terceiro estádio é liberada. Essa penetra e atravessa a parede intestinal,
migra pelo corpo do hospedeiro realizando a rota hepato-traqueal e chega ao fígado 24 horas
após a infecção. A mudança para quarto estádio ocorre nos pulmões do hospedeiro, 12 horas
após as larvas deixarem o fígado. A partir daí, a rota de migração depende de fatores como a
idade, condição imune do hospedeiro, e da dose infectante ingerida. No entanto, em condições
normais as larvas são deglutidas e retornam, pela traqueia, ao lúmen do intestino delgado onde
ocorrem novas mudas, até atingirem o estádio adulto e a maturidade sexual em 7 a 15 dias.
(Sprent et al., 1958). Entre quatro a cinco semanas, após esse período, os ovos estarão prontos
para serem eliminados, juntamente, com as fezes do hospedeiro (Freitas, 1980).
A larva, também, é capaz de retornar ao sistema circulatório pela penetração nos
alvéolos, o que a torna novamente capaz de invadir tecidos somáticos (Sprent, 1956; Webster
1958b).
A transmissão de Toxocara spp. e Toxascaris sp. ocorre, principalmente, pela ingestão de
ovos viáveis e embrionados, entretanto outras formas de infecção podem ocorrer. Larvas
presentes nos tecidos dos hospedeiros paratênicos vertebrados e invertebrados e transmissões
transplacentária (T. canis e T. cati) e transmamária (T. cati) são, também, citadas na literatura
como fontes de infecção (Overgaauw e Van Knapen, 2013).
Vertebrados como roedores, pássaros e porcos podem servir como hospedeiros
paratênicos, para esses helmintos. Geralmente, o padrão de migração, nesses animais é
32
comparável ao que ocorre nos hospedeiros definitivos. Entretanto, acredita-se que a distribuição
larval seja influenciada, diretamente, pela espécie do parasito. Comumente os ovos eclodem,
liberando as larvas que migram pelos tecidos, realizando a rota hepato-traqueal (Sprent et al.,
1952. As larvas encapsuladas permanecem em latência, nos tecidos, por extensos períodos de
tempo mantendo-se viáveis por até 10 anos (Oryan et al., 2010; Taira et al., 2011). Quando os
hospedeiros paratênicos são ingeridos, pelos hospedeiros definitivos, as larvas são reativadas,
passam por mudas na parede do estômago e intestino delgado, até tornarem-se adultas e
continuarem o ciclo biológico (Strube et al., 2013).
Filhotes de cães são infectados no útero, pela reativação de larvas somáticas da mãe a
partir do 42º dia da gestação. Essa rota eficiente de transmissão resulta em excreção de ovos
aproximadamente 16 dias após o parto (Lloyd 1993). Para filhotes de gatos, a eliminação de ovos
inicia-se aproximadamente 47 dias após o nascimento. De forma mais limitada, a transmissão
lactogênica continua a ocorrer por cinco semanas (Overgaauw & van Knapen, 2013).
As infecções pré-natais as larvas se mobilizam três semanas antes do parto e migram para
os pulmões, local no qual ocorre muda de L3 para L4, pouco antes do parto. No cão recém-
nascido o ciclo se completa quando as larvas retornam ao intestino, via traqueia, onde tornam-se
adultas. A cadela infectada abriga larvas suficientes para infectar todas as ninhadas
subsequentes, mesmo que nunca mais adquira a infecção. Na infeção pela via lactogênica não há
migração larval no filhote, sendo o ciclo direto e no intestino (Taylor et al., 2010).
T. canis e T. cati apresentam afinidade pelo sistema nervoso central humano, sendo os
olhos e o cérebro os órgãos mais atingidos, entretanto, o T. cati parece migrar mais lentamente
que T. canis (Glickman and Summers, 1983; Akao et al., 2003).
Pesquisas têm sugerido que a diferença de tamanho entre as duas espécies pode ser uma
das explicações para a grande neuroafinidade apresentada pelo T. canis. Como as larvas de T.
cati são menores, elas seriam capazes de sair facilmente das artérias, enquanto as de T. canis,
devido ao tamanho maior, seriam menos propensas a deixar o sistema circulatório, ficando
retidas no cérebro (Hamilton et al., 2006; Chieffi et al., 2009).
Estudos sobre formas alternativas de transmissão de T. malaysiensis e T. leonina são
escassos na literatura, entretanto devido às semelhanças morfológicas e genéticas com T. canis e
T. cati supõe-se que os mecanismos se assemelhem.
1.4 Aspectos clínicos e sintomatologia da Toxocaríase
Os sintomas clínicos dependem da idade do animal, carga parasitária, localização do

parasito no corpo do hospedeiro e do estágio de desenvolvimento dos helmintos, sendo os
33
animais com até seis meses de idade os mais afetados pela doença (Sprent, 1956). Como em
todos os casos de helmintoses a diarreia, constipação, vômito e descarga nasal podem ser
observados (Parsons 1987).
Infecções intensas em filhotes de canídeos e felídeos podem resultar em abaulamento do
abdomên, déficit nutricional, perda de peso, podendo, em alguns casos, levar à morte
(Overgaauw & van Knapen, 2013) principalmente nos casos de obstrução dos ductos biliares e
pancreáticos pelas larvas (Parsons, 1987).
A infecção pré-natal parece ser responsável por nascimentos prematuros e abortos
(Scothorn, 1965). Após o nascimento podem apresentar pneumonia associada à migração
traqueal e obstruções no trato digestivo resultantes da presença do parasito no estômago e
intestino (Overgaauw, 1997) que podem levar a morte em até três dias.
Em gatos, por ser a transmissão transmamária a fonte primária de infecção, a rota
traqueal não é comum. A maturação dos parasitos leva mais tempo nos gatos do que nos cães, o
que poderia ser suficiente para que esses animais desenvolvessem melhores condições corporais
antes da doença se instalar. Por essas razões os sintomas clínicos, usualmente, são inaparentes
(Overgaauw, 1997).
As infecções são comuns em filhotes jovens com idade inferior a seis meses. Após essa
idade há o desenvolvimento da imunidade adquirida, conhecida como teoria da idade-resistente,
a qual sugere que com o aumento da idade do animal, as larvas teriam dificuldade em
transformarem-se em adultos e a migração somática aumentaria (Greve 1971). Essas larvas
poderiam ficar em latência enquanto a imunidade adquirida atuasse. Entretanto, na quebra do
equilíbrio parasito/hospedeiro em situações com prenhes e lactação, por exemplo, as larvas
seriam reativadas, indo para a placenta e glândulas mamárias pela corrente sanguínea.
A contribuição significativa da imunidade adquirida é extensivamente demonstrada em
vários estudos (Barriga, 1988). O mecanismo de resistência em animais mais velhos,
provavelmente, ocorre parcialmente dentro dos pulmões, talvez como resposta tardia à
hipersensibilidade (Oshima, 1976)
Nos humanos, considerados hospedeiros paratênicos, o quadro clínico pode variar de
assintomático a fatal sendo dependente de fatores como a carga parasitária, idade do indivíduo,
padrão de migração larval e resposta imune do hospedeiro.
Nos casos sintomáticos a doença é dividida em quatro tipos distintos denominados de:
Larva migrans ocular (LMO), Larva migrans visceral (LMV), Neurotoxocariases (NT) e
“Covert” toxocaríase(CT) (Magnaval et al.,2001; Chen et al.,2012). O amplo espectro das
34
consequências clínicas e patológicas da toxocariase humana, assim como, frequentes infecções

inaparentes, podem causar dificuldade na identificação e classificação de casos clínicos.
LMO é caracterizada por resposta imune eosinofílica à migração da larva dentro do olho;
ocorre predominantemente de forma unilateral (Taylor, 2006) e pode causar desde prejuízo
visual, estrabismo, leucocoria, descolamento de retina, endofitalmite e uveíte até glaucoma
secundário e cegueira (Despommier, 2003).
LMV afeta, principalmente, crianças menores de cinco anos (Worley et al., 1984) as
quais podem apresentar febre, aumento e necrose do baço e fígado, sintomas respiratórios como
broncoespasmos e asma, eosinofilia e hipergamaglobulinemia. Com o agravamento da doença
quadros clínicos como Miocardite (Prunier et al., 2001) e Nefrite (Shetty e Aviles, 1999) podem
surgir.
Existem na literatura poucos casos descritos de NT, entretanto existem relatos que as
manifestações são variáveis de acordo com as condições do hospedeiro, mas de modo geral o
envolvimento do Sistema Nervoso Central pode gerar dores de cabeça, fotofobia, convulsões,
aparecimento de sintomas neuropsiquiátricos, epilepsia e encefalite (Bachli et al., 2004; Finsterer
& Auer 2007).
Manifestações sutis da doença podem ser resposta ao longo tempo de exposição às larvas
migrantes. Esse quadro conhecido como “Covert” toxocaríase ou forma oculta da doença varia
entre a falta de sintomas (Tariq et al., 1997: Shargi et al., 2001) a sintomas inespecíficos, tais
como dor abdominal recorrente, cefaléia, astenia, e hepatomegalia. A eosinofilia pode estar
ausente, apesar de altos títulos sorológicos para Toxocara spp (Overgaauw, 1997a).
1.5 Métodos diagnósticos
Nos hospedeiros definitivos, canídeos e felídeos, o diagnóstico para Toxocara spp. e

Toxascaris sp. é, rotineiramente, feito pela visualização dos ovos presentes nas fezes dos animais
positivos, por microscopia, após técnicas qualitativas que utilizem gradientes de diferentes
densidade. (Macpherson, 2013). Essas são sensíveis para diagnóstico nos animais com grande
eliminação de ovos, entretanto naqueles com pouca proporção e/ou eliminação intermitente de
ovos não apresentam confiabilidade (Macpherson, 2013).
Em humanos, as lesões causadas por Toxocara spp. na LMV e na LMO são detectadas
por várias técnicas de imagem, tais como ultrassom, tomografia computadorizada e ressonância
magnética. As lesões diferem-se de nódulos metastáticos por causa das margens distorcidas, do
tamanho uniforme e da forma não esférica (Lim, 2008). Biópsia e exames histopatológicos
usando técnicas especiais de coloração podem levar ao diagnóstico definitivo (Parsons et al.,
35
1986). O método diagnóstico mais utilizado são as análises sorológicas, principalmente

“Enzyme-linked Immunosorbent Assay” (ELISA), que apresenta aproximadamente 78% de
sensibilidade e 92% de especificidade (Queiroz et al., 2005) e “Western blot” (de Savigny et al.,
1979; Magnaval et al., 1991).
O diagnóstico da NT é o mais difícil e deve incluir além da sorologia tradicional a análise
do fluido cérebro espinhal para detecção de anticorpos anti-Toxocara spp. e eosinófilos
(Finsterer e Auer, 2007).
Resultados de ELISA devem ser interpretados cuidadosamente, pois reações cruzadas
com outros parasitos podem ocorrer. Pacientes com LMO podem apresentar titulações negativas,
apesar da existência da doença, o que pode ser devido à pequena quantidade de larvas associadas
ao longo intervalo entre a infecção e o teste diagnóstico (Overgaauw, 1997).
Técnicas moleculares baseadas na identificação do DNA do parasito no corpo do
hospedeiro, não são usualmente aplicados no diagnóstico da Toxocaríase humana e animal,
principalmente devido ao alto custo de execução, no entanto são fundamentais na diferenciação
das espécies infectantes, o que não ocorre na sorologia.
1.6 Prevalência
Apesar de ser helmintíase prevalente em regiões tropicais, e a mais prevalente nas

Américas, com distribuição mundial a Toxocaríase animal é subestimada (Fialho e Corrêa,
2016).
No mundo a maioria dos trabalhos reporta prevalência entre 1 a 60% de T. canis nos cães
(Willingham et al., 1996). Levantamentos em vários países da Europa reportaram entre 4-6% na
Espanha, 16-17% na Polônia e 27-81% na Bélgica, Alemanha, Áustria, Suíca e Irlanda
(Rodriguez – Carbonell, 1998; Criado-Fornélio et al., 2000; Gundlach et al., 1999; Luty et al.,
2001; Losson et al., 1997; Pfeiffer et al., 1997; Lassnig et al., 1998; Hofer et al., 2000). No Iran e
Argentina pesquisas relataram índices de positividade de 6 e 16,3% respectivamente (Dalimi et
al., 2006; Soriano et al., 2010).
Infecções por endoparasitos são menos estudadas em gatos do que em cães, porém
existem relatos sobre a prevalência de infecções patentes de T. cati em gatos indicando que esses
animais são responsáveis por parte considerável da contaminação ambiental por esse parasito
zoonótico (Fisher, 2003).
Nijsse et al. (2016) observaram 7,2% de positividade em gatos na Holanda. Na Alemanha
Barutzki e Schaper (2003), Barutzki e Schaper (2011) e Gates e Nolan (2009) relataram índices
variando entre 4,7-6,3%. Na Bélgica e na Dinamarca as taxas de positividade atingiram os 60 e
36
79% respectivamente (Vanparijs et al., 1991; Engbaek et al., 1984). No Iran 44% dos gatos do
norte e 42% dos gatos do sul apresentaram-se positivos (Sharif et al., 2010; Zibagi et al., 2007).
Existem poucos estudos sobre a prevalência de T. malaysiensis no mundo, entretanto, um
estudo em Kuala Lumpur encontrou esse parasito em 11% dos gatos domésticos analisados (The
Center for Food Security and Public Health, 2016).
A prevalência de T. leonina é menos relatada na literatura do que as de T. canis e T. cati.
A positividade em cães em países da América do Sul, Europa e Ásia variou entre 0,6 e 32%
(Soriano et al., 2010; Dubna et al., 2007; Xhaxhiu et al., 2011; Szabova et al., 2007; Dalimi et
al., 2006) e entre 0 e 12,9% em gatos nos países da Europa e da Ásia (Mircean et al., 2010;
Sharif et al., 2010; Zibagi et al., 2007) .
No Brasil não existem levantamentos amplos em relação a positividade desses parasitos
em canídeos e felídeos. Nos países existentes, os estudos são regionais e não são específicos
relacionando a presença de outros endoparasitos nesses animais. Em Londrina, no estado do
Paraná T. canis foi observado em 44,3% dos cães analisados (Chieffi e Muller, 1976), índices
menores, de 18,9% e 9,3% foram encontrados por Labruna et al. (2006) e Scaini et al. (2003)
respectivamente. Em gatos, o único trabalho disponível relata prevalência de 25,2% para T. cati
e 11,9% para T. leonina (Labarthe et al., 2004).
Análises sorológicas sugeriram que a positividade para Toxocaríase humana em países
industrializados é de 0,7% na Nova Zelândia, 1,6% no Japão, 2,4% na Dinamarca, 7,5% na
Austrália, 14% nos Estados Unidos e 15% na Polônia (Jarosz et al., 2010; Fan et al., 2013).
Maiores taxas têm sido reportadas em países menos desenvolvidos e tropicais nos quais
observaram-se soropositividade entre 30 a 93% (Smith e Noordin, 2006; Liao et al., 2010;
Roldan et al., 2010; Schoenardie et al., 2013).
Entre humanos, no Brasil a maioria dos trabalhos publicados relata prevalência que varia
entre 4,2% a 65,4%, sendo a região norte do país a mais prevalente (Fialho e Corrêa, 2016).
1.7 Potencial zoonótico
O papel zoonótico de T. canis é reconhecido, entretanto o mesmo não acontece para T.

cati (Fisher, 2003) embora haja similaridades no modo de infecção e esses dois helmintos
compartilhem grande número de frações antigênicas (Cardillo et al., 2009).
Até pouco tempo a maioria das infecções humanas era atribuída ao T. canis. Entretanto,
análise dos epítopos e dos antígenos secretados pelas duas espécies revelou homologia
psicoquímica e imunológica suficientes para que nos testes sorológicos básicos não haja
diferença nos resultado (Kennedy et al., 1987).
37
Para corroborar a idéia de que ambos os parasitos têm a mesma capacidade de infectar, se
estabelecer e causar patologia em humanos, estudos vêm revelando, com frequência, que a
maioria dos ovos encontrados em solos contaminados é de T. cati e não de T. canis (Matsuo e
Nakashio, 2005). Além disso, em países islâmicos onde cães são evitados, por motivos
religiosos, e os gatos são, preferencialmente, os animais de estimação, a soroprevalência de
toxocaríase humana apresenta níveis consideráveis (Smith e Noordin, 2006).
Fischer (2003) estudando pacientes com LMO observou que alguns tiveram maior reação
ao antígeno de T. cati do que ao de T. canis no teste de Oucterlony. Esses resultados reiteraram a
idéia de que T. cati pode estar mais relacionado a casos humanos, em especial da LMO, do que
se pensava anteriormente. Nesse mesmo estudo, o pesquisador relata que esse parasito foi
implicado em pelo menos um caso de LMV.
Alguns pesquisadores acreditam que T. malaysiensis apresenta o mesmo potencial
zoonótico do T. canis e T. cati, devido às semelhanças morfológicas e moleculares (Le et al.,
2016) porém, não existem trabalhos que comprovem essa questão.
Infecções experimentais com T. leonina (com ovos provenientes de canídeos e felídeos)
foram originalmente estabelecidas em modelos murinos por Sprent (1959) demonstrando que
esse parasito pode infectar hospedeiros paratênicos. Entrentanto, o papel na patogênese humana
permanece desconhecido, particularmente devido a não diferenciação das espécies pelas técnicas
sorológicas. Tem sido sugerido que o potencial zoonótico de T. leonina é limitado pois a
migração somática não ocorre e a larva não é transmitida verticalmente (Gasser et al., 2006).
1.8 Especificidade de hospedeiro
Uma boa estratégia evolucionária é ter um mecanismo eficiente de dispersão aliado a

habilidade de se reproduzir em diversas espécies. Entretanto, T. canis e T cati são considerados
parasitos exclusivos de canídeos e felídeos, respectivamente e até hoje poucos autores
constestaram a especificidade de hospedeiro dessas espécies.
Roth e Schneider (1971) encontraram espécimes adultos de T. canis no intestino de gatos
adultos necropsiados. Bhowmick (1964) relatou o estabelecimento de infecções patentes
experimentais por T. canis em gatos. De forma similar Fahrion et al. (2011) observaram a
eliminação de ovos de T. canis, repetidamente, nas fezes de gatos que haviam sido transferidos
para gaiolas, anteriormente utilizadas por cães infectados.
Achados de cães infectados por T. cati são mais comuns, havendo vários relatos como o
de Mundim et al. (2004) que realizaram necropsia em gatos e observaram a presença do adulto
dessa espécie nesses animais. Outros autores como Parsons (1987), Baker et al. (1989), Lee et al.
38
(1993) e Scholz et al.(2003) identificaram ovos desse parasito em gatos domésticos. O fato de
esses animais eliminarem ovos de T. canis nas fezes é explicado pela coprofagia, hábito
considerado comum para cães. Portanto, a eliminação seria simplesmente resultado da passagem
intestinal de fezes contendo esses ovos (Fahrion et al., 2011).
Apesar de todos esses relatos, nenhuma explicação foi atribuída, e os eventos parecem ser
considerados excepcionais.
Só existem registros de T. malaysiensis em felídeos. No entanto, questiona-se se devido
às semelhanças moleculares com T. cati esse parasito não seja também capaz de parasitar outros
grupos animais.
1.9 Biologia Molecular
Devido a limitações inerentes das técnicas tradicionais de identificação morfológica,

vários ensaios a partir do DNA, em especial as técnicas de Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR), têm sido desenvolvidos e utilizados para identificação e diagnóstico (Gasser et al., 2006).
A PCR é amplamente usada para diagnóstico e para aplicações analíticas, pela capacidade
de amplificar DNA rapidamente a partir do parasito em qualquer proporção (Gasser et al.,2006).
Na identificação realizada por essa técnica a região alvo ou o marcador genético é de
importância para o sucesso da metodologia. Diferentes genes necessitam de diferentes padrões e
a escolha do alvo é fundamental para auxiliar na identificação de parasitos no nível taxonômico
requerido. DNA ribossomal (rDNA) e/ou DNA mitocondrial (mtDNA) são usados para
identificar espécies ou genótipos de parasitos (Gasser et al., 2008).
A primeira e a segunda região espaçadora transcrita interna (ITS-1 e ITS-2,
respectivamente) do rDNA tem sido comumente utilizadas como marcadores genéticos para a
identificação e diferenciação de espécies de Toxocara e outros nematódeos. Utilizando o ensaio
baseado nessa região do gene, pesquisadores conseguiram pela primeira vez diferenciar entre si
as espécies T. canis, T. cati (Li et al., 2007). Essa técnica específica de PCR apresenta alta
sensibilidade e especificidade e fornece ferramentas moleculares para o diagnóstico e pesquisa
da epidemiologia molecular de infecções por Toxocara spp. em humanos e animais (Chen et al.,
2012).
Zhu et al. (1998) utilizaram as sequências ITS-1 e ITS-2, em nematódeo de gatos
procedentes da Malásia, anteriormente descritos, morfologicamente, como T. canis. Esse estudo
revelou espécie variante desse gênero, ainda não conhecida, a qual foi inicialmente denominada
como Toxocara spp. cf. canis (Zhu et al., 1998). A observação de que o Toxocara encontrado em
39
gatos na Malásia não era o T. canis, mas apresentava similaridade genética com o T. cati, foi
suficiente para concluir que se tratava de espécie distinta, a qual posteriormente foi nomeada de
T. malaysiensis (Gibbons et al., 2001). T. malaysiensis, também, foi observado em gatos da
China, confirmando que a utilização de abordagens moleculares é importante na identificação e
caracterização de espécies crípticas.
Em adição à análise de sequências do rDNA estudos têm demonstrado que sequências
derivadas do genoma mitocondrial têm sido alternativa na investigação de genética populacional,
sistemática e filogenia de nematódeos, devido ao alto padrão de mutação frente a genes nucleares
(Hu et al., 2004; Hu e Gasser, 2006).
Várias regiões do mtDNA, como citocromo c oxidase 1 (cox1), NADH subunidade
desidrogenase 1 e 4 (nad1 e nad4) e atp6 (Li et al., 2008; Mikaeili et al., 2014; Le et al., 2016)
têm sido empregadas no estudo de genética de nematódeos. Entretanto, as informações sobre o
genoma mitocondrial de vários parasitos socioeconomicamente importantes são limitadas,
embora significantes avanços tenham sido feitos. Utilizando esses métodos Zhu et al. (2008) e
Liu et al. (2014) caracterizaram o genoma mitocondrial de T. canis, T. cati, T. malaysiensis e T.
leonina, respectivamente. Essa caracterização fornece rica fonte de material para investigações
da epidemiologia, ecologia e genética populacional dos vermes (Gasser et al., 2013).
O emprego do mtDNA em estudos populacionais e evolutivos é importante por esse
possuir alta taxa de substituição de bases nitrogenadas e apresentar alteração no tamanho original
da molécula, devido à inserções e deleções, principalmente na região rica em A+T. Observa-se
também o fato de que translocações de genes codificadores de tRNA parecem ser mais
frequentes do que se imaginava, acarretando alterações na ordem gênica entre organismos
filogeneticamente relacionados (Arias et al., 2003).
A revolução nas tecnologias moleculares forneceu oportunidades substanciais para
exploração de patógenos, elucidando aspectos da epidemiologia, ecologia, evolução e
patogênese. Entretanto, o alto custo, algumas vezes, impede o processo, principalmente no
campo da ciência veterinária. Por isso o desenvolvimento e/ou aperfeiçoamento de técnicas com
o mesmo potencial, no entanto, mais baratas e simples são fundamentais para a manutenção dos
estudos.
Estudos de Turcekova e Dubinsky (1996) indicaram o potencial do Restriction Fragment
Length Polymorfism (RFLP-PCR) para análise do DNA genômico. Comparado com outros
métodos moleculares as vantagens do RFLP-PCR é ser rápida na execução e não necessitar de
equipamento especial, além dos utilizados na PCR tradicional (Tan et al., 2016).
40
A precisão da análise da variação gênica têm importantes implicações na

identificação específica e intraespecífica de parasitos, além de ser fundamental para estudos
relacionados à organização e função do gene (Zhu e Gasser, 1998).
1.10 Distribuição geográfica e variabilidade intragenotípica
Análises do DNA permitem não só a diferenciação de espécies como também revelam

diferenças polimórficas intraespecíficas. Em alguns parasitos essas diferenças ocorrem raramente
e em outros refletem considerável variabilidade intrapopulacional (Zhu et al., 2001).
Sequências da região ITS de T. canis, T. cati e T. leonina provenientes de diferentes
regiões podem ser encontradas no GenBank (Banco de sequências gênicas do Centro Nacional
para Informação Biotecnológica – NCBI) e a análise comparativa dessas espécies, revela que
existem variações intrapolimórficas que podem estar diretamente relacionadas ao local de
origem.
Para T. canis foi demonstrado que a latitude geográfica não desempenha nenhum papel
nas diferenças polimórficas estando as sequências quase constantes e pequenas mudanças (0.4%)
são, principalmente, inserções e substituições (Fogt-Wyrwas et al., 2012).
T. cati, provenientes de Malásia e T. leonina provenientes da Polônia apresentaram
variabilidade de 2,9% (Zhu et al., 1998) e 7,2% (Zhu e Gasser, 1998) respectivamente, nas
sequências da região ITS, quando comparadas com àquelas originárias da Austrália.
Essas análises, também, foram feitas por Mikaeili et al. (2014) e Li et al. (2008) os quais
utilizaram os genes mitocondriais cox1 e nad1 e encontraram, em ambos os casos, variações
significativas entre sequências provenientes de diferentes regiões geográficas.
Variações intrapolimórficas relacionadas à distribuição geográfica são claros exemplos da
evolução do parasito, para adaptarem-se melhor ao ambiente e aos hospedeiros, garantindo a
manutenção da espécie.
Dada à distribuição mundial de Toxocara spp. e Toxascaris sp. é provável que a
diversidade genética exista entre as populações (Jenkins et al., 2011) e embora existam
progressos muitas informações permanecem obscuras, o que propicia excelentes oportunidades
para futuras investigações utilizando marcadores mais sensíveis, como os mitocondriais.
41
Justificativa
42
2. Justificativa
Ascaridídeos têm sido identificados a partir de características morfológicas e

locais de predileção em uma determinada espécie de hospedeiro. Entretanto, esses
métodos tradicionais apresentam limitações consideráveis na identificação e
diferenciação de algumas espécies, o que faz com que surjam questionamentos,
especialmente sobre a taxonomia desses parasitos.
O reconhecimento das diferentes espécies de Ascaridídeos é importante, devido
às implicações associadas, não somente à sistemática, mas também em relação à
biologia populacional e ao comportamento epidemiológico dos parasitos. Essa
identificação se torna importante, quando se trata de parasitos potencialmente
zoonóticos e que causam síndromes sérias no homem.
Existe diversidade genética não reconhecida entre as populações dos gêneros
Toxocara e Toxascaris e uma análise acurada dessa variação é fundamental para melhor
entendimento de todos os aspectos que envolvam a biologia desses parasitos.
Os estudos sobre padrões genotípicos de Toxocara spp. e Toxascaris sp. apesar
de estarem ganhando visibilidade nos últimos anos, ainda são escassos e fornecem
informações, muitas vezes, limitadas à região gênica abrangida pelo estudo. Portanto,
pouco se sabe sobre as relações intraespecíficas dos indivíduos provenientes de regiões
geográficas diferentes. A especiação é algo plenamente estabelecido e sabe-se que as
mudanças começam timidamente pelo DNA.
No Brasil não existem informações sobre os padrões genotípicos das espécies
desses dois gêneros. Portanto, além de ser o primeiro estudo a abordar essa questão, o
presente trabalho, ao compilar dados de organismos provenientes de três continentes,
tenta estabelecer uma visão global sobre a genética desses parasitos. Isso fornecerá
informações que possam ser futuramente usadas para a criação, por exemplo, de
marcadores genéticos mais específicos e sistemas de detecção mais sensíveis, os quais
teriam impacto direto no desenvolvimento de estratégias de intervenção contra
infecções humanas e animais.
43
Objetivos
44
3. Objetivos
Geral:
Estabelecer relações filogenéticas entre espécimes de Toxocara canis, Toxocara cati,
Toxocara malaysiensis e Toxascaris leoninas procedentes de diferentes regiões geográficas
Específicos:
- Verificar morfologicamente a identidade específica de parasitos adultos e ovos de
ascaridídeos;
- Caracterizar molecularmente os isolados pelas técnicas de Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR) seguida de sequenciamento e Restriction Fragment Lenght Polymorphism (PCR-
RFLP);
- Verificar as diferenças polimórficas intraespecíficas e interespecíficas;
- Determinar a distância evolutiva entre indivíduos da mesma espécie e de espécies diferentes;
- Observar se as variações intragenotípicas encontradas têm relação com a procedência
geográfica do helminto;
- Verificar a especificidade da relação parasito-hospedeiro;
- Comparar os resultados fornecidos pela microscopia óptica e as duas técnicas moleculares;
45
Metodologia
46
4. Metodologia
Aprovação do projeto pelo

CEUA-UFU
Coleta dos parasitos
Brasil Rússia Japão Portugal Dinamarca Malásia China Alemanha
Encaminhadas ao Brasil Encaminhadas a Dinamarca
Análise Morfológica Análise Morfológica
Extração de DNA Extração de DNA
DNAs direcionados à Universidade de

Copenhagen, Dinamarca - Doutorado
Sanduíche
PCR – COX1
Sequenciamento PCR-RFLP -
MseI
Análises filogenéticas
Figura 4 - Fluxograma das etapas do experimento

47
1. Aprovação ética
Esse projeto foi aprovado pela Comissão de ética no uso de animais da Universidade
Federal de Uberlândia (CEUA-UFU) sob o protocolo 08813.
2. Regiões do estudo
O estudo foi realizado a partir de amostras coletadas em diferentes localidades de oito

países, distribuídos em três continentes (Tabela 1).
Os parasitos procedentes do Brasil foram obtidos de duas cidades da região
sudeste do país, Belo Horizonte, capital do estado de Minas Gerais e Uberlândia, a segunda
maior cidade do estado.
Da Europa as amostras foram coletados em Copenhagen e em diversas regiões da ilha
da Zelândia na Dinamarca, em Hannover na Alemanha, Moscou, Perm e Yakutia na Rússia e
na Cidade do Porto em Portugal.
Na Ásia as amostras foram provenientes de três províncias na China (Jilin, Guandong
e Changsha), de Sagamihara no Japão e de Kuala Lumpur na Malásia.
3. População de estudo:
Foram incluídos no projeto parasitos adultos de Toxocara spp. e Toxascaris sp. e ovos
de Toxascaris sp. obtidos de canídeos e felídeo. Os animais eram prodecentes de 47
domicílios, estabelecimentos comerciais, abrigos protetores e reserva conservacionista das
regiões citadas, independente da idade, sexo, raça. Os dados demográficos e epidemiológicos
dos animais estão descritos na tabela 1.
Ao todo, foram coletadas 438 amostras sendo 434 helmintos adultos e 04 pools de
ovos, procedentes de 129 animais (Tabela 2).
48
Tabela 1 - Perfil epidemiológico e demográfico dos animais dos quais foram obtidos os
ascaridídeos analisados nesse estudo
Hospedeiro ID isolado Idade Sexo Localidade Origem
Cão DBRU1 0-6m F Uberlândia –Brasil Abrigo
Cão DBRU2 0-6m F Uberlândia-Brasil Abrigo
Cão DBRU3 0-6m M Uberlândia-Brasil Abrigo
Cão DBRU6 6m-1 a M Uberlândia-Brasil Abrigo
Cão DBRU7 6m-1 a F Uberlândia-Brasil Abrigo
Cão DBRU16 0-6m F Uberlândia-Brasil Domiciliado
Cão DBRU19 0-6m M Uberlândia-Brasil Domiciliado
Cão DBRU27 0-6m M Uberlândia-Brasil Domiciliado
Cão DBRU29 0-6m M Uberlândia-Brasil Canil
Cão DBRU30 0-6m F Uberlândia-Brasil Canil
Gato CBUR38 0-6m F Uberlândia-Brasil Abrigo
Cão DBRBH1 0-6m M Belo Horizonte-Brasil Canil
Cão DDK1 6m-1 a F Copenhagen-Dinamarca Canil
Cão DDK4 6m-1 a M Copenhagen-Dinamarca Canil
Gato CDK1 0-6m F Copenhagen-Dinamarca Canil
Gato CDK2 0-6m F Copenhagen-Dinamarca Abrigo
Gato CDK4 0-6m M Copenhagen-Dinamarca Abrigo
Gato CDK 39 8a M Zelândia-Dinamarca Abrigo
Gato CDK 41 6 – 12m M Zelândia-Dinamarca Abrigo
Gato CDK 42 1a F Zelândia-Dinamarca Abrigo
Gato CDK 46 6-12m M Zelândia-Dinamarca Abrigo
Gato CDK 49 2-3 a F Zelândia-Dinamarca Abrigo
Gato CDK 50 10 a M Zelândia-Dinamarca Abrigo
Gato CDK 57 1-2 a M Zelândia-Dinamarca Abrigo
Gato CDK 65 6 -12m M Zelândia-Dinamarca Abrigo
Gato CDK66 1-2 a M Zelândia - Dinamarca Abrigo
Continua...
49

Gato CDK 73 14 a M Zelândia-Dinamarca Abrigo
Gato CDK 75 10 a F Zelândia-Dinamarca Abrigo
Gato CDK 90 6m-1 a F Zelândia-Dinamarca Abrigo
Gato CDK 91 6m- 1ª F Zelândia-Dinamarca Abrigo
Gato CDK 97 6m-1 a F Zelândia-Dinamarca Abrigo
Gato CDK 107 0-4m F Zelândia-Dinamarca Abrigo
Gato CDK122 1-2 a M Zelândia-Dinamarca Abrigo
Gato CDK123 9a M Zelândia-Dinamarca Domicilado
Gato CDK124 5 -6 a F Zelândia-Dinamarca Domiciliado
Gato CDK125 5a F Zelândia-Dinamarca Domiciliado
Gato CDK126 1a M Zelândia-Dinamarca Domiciliado
Gato CDK127 6m-1 a M Zelândia-Dinamarca Domiciliado
Cão DDE1 6m-1 a F Hannover-Alemanha Abrigo
Cão DDE2 6m-1 a F Hannover-Alemanha Abrigo
Gato CDE1 1-2 a F Hannover-Alemanha Abrigo
Gato CML1 1 -2 a M Kuala Lumpur – Malásia Abrigo
Cão DCH1 1 -2 a F Jilin – China Abrigo
Cão DCH2 1 -2 a M Guangdong – China Abrigo
Cão DCH3 1 -2 a F Changsha – China Abrigo
Cão DCH4 1 -2 a M Changsha-China Abrigo
Gato CCH1 1 -2 a F Guangzhou – China Abrigo
Gato CCH2 1 -2 a F Guangzhou – China Abrigo
Cão DJA1 0-6m M Sagamihara – Japão Canil
Cão DJA2 0-6m M Sagamihara-Japão Canil
Gato CJA1 1 -2 a M Sagamihara – Japão Canil
Gato CJA2 0-6m F Sagamihara – Japão Canil
Cão DRU1 0-6m M Moscou – Rússia Canil
Cão DRU2 0-6m F Moscou – Rússia Canil
Cão DRU3 0-6m M Moscou – Rússia Canil
Cão DRU4 0-6m F Yakutia – Rússia Canil
Cão DRU5 0-6m F Yakutia – Rússia Canil
Cão DRU6 0-6m M Perm – Rússia Canil
Gato CRU1 6m-1 a M Moscou – Rússia Canil
Gato CRU2 1 -2 a F Moscou – Rússia Canil
Gato CRU3 6m-1 a F Perm - Rússia Canil
Leão CPT1 1-3 a F Cidade do Porto - Portugal Reserva conservacionista
Cão DPT1 6m-1 a M Cidade do Porto - Portugal Abrigo
Legendas: ID - Identificação; F – Fêmea; M – Macho ; DBRU – DogBrasil Uberlândia, DBRBH – Dog Brasil
Belo Horizonte; DDK – Dog Dinamarca, CDK – Cat Dinamarca; DDE – Dog Alemanha, CDE – Cat Alemanha;
CML – Cat Malásia; DCH – Dog China, CCH – Cat China; DJA – Dog Japão; CJA- Cat Japão; DRU – Dog
Rússia, CRU – Cat Rússia, CPT – Cat Portugal e DPT – Dog Portugal.
50
Tabela 2 – Número de amostras coletadas, provenientes de canídeos e felídeos, em cada país

incluído nesse estudo
Animais Países
Brasil Dinamarca Alemanha Malásia China Japão Rússia Portugal

Canídeos 282 (37)* 12 (04) 6 (2) 0 5 (4) 2 (2) 11 (6) 1 (1)
Felídeos 1 (1) 93 (60) 4 (1) 5 (1) 4 (2) 2 (2) 7 (3) 3 (3)
Total 283 (38) 105 (64) 10 (3) 5 (1) 9 (6) 4 (4) 18 (9) 4 (4)
*Números dentro dos parênteses correspondem à quantidade de animais dos quais os vermes foram procedentes.
4. Coleta dos Parasitos
Os adultos e os ovos de ascaridídeos foram obtidos de duas formas: pelas fezes e por
necropsia. Todos helmintos de cães, do Brasil, foram obtidos pela administração oral de
Sulfato de Piperazina 46% (dose de 45 mg/kg). Após 24 horas os parasitos foram eliminados
inteiros juntamente com as fezes dos animais. O único parasito de gato do Brasil foi obtido
por necropsia, durante uma aula de patologia na Universidade Federal de Uberlândia, de um
animal cuja morte ocorreu por causas naturais.
Os helmintos de cães proveniente de Uberlândia foram coletados pela doutoranda
responsável por esse projeto e os de Belo Horizonte pelo Ms. Hudson Andrade dos Santos do
Laboratório de Helmintologia da Universidade Federal de Minas Gerais.
Todos os helmintos restantes foram coletado por necropsia seguindo as normas
estabelecidas por cada pesquisador e/ou instituto de pesquisa.
Os parasitos provenientes da Dinamarca foram coletados e cedidos pelo Prof. Dr. Peter
Nejsum, coorientador desse trabalho, e pela doutoranda Nao Takeushi-Storm ambos da
Universidade De Copenhagen, Copenhagen, Dinamarca. Os parasitos provenientes da
Alemanha, Malásia, China, Japão e Rússia foram cedidos para esse trabalho, respectivamente
pelos colaboradores Profª. Drª. Katharina Raue da Universidade de Medicina Veterinária de
Hannover, Hannover, Alemanha; Prof. Dr. Xing-Quan Zhu do Instituto Lanzhou de Pesquisas
Veterinárias, Província Gansu, China; Profª. Drª. Taira Kensuke da Universidade de Azabu,
Kanawaga, Japão e Profª. Drª. Irina Odoevskaya do Instituto de Helmintologia Skriabin,
Moscou, Rússia.
Os ovos provenientes de cães de Portugal foram eliminados naturalmente com as fezes
dos animais, sem nenhum tratamento prévio. As fezes contendo os ovos foram enviadas pela
Professora Dra. Teresa Mateus da Universidade do Porto, Cidade do Porto, Portugal.
51
5. Processamento dos parasitos
Os helmintos adultos e as fezes contendo ovos foram armazenados em recipientes estéreis

contendo tampão fosfato salino (PBS). Os coletados no Brasil, Rússia, Portugal e Japão foram
encaminhados ao Laboratórios de Sorologia e Biologia Molecular de Parasitos da
Universidade Federal de Uberlândia – Brasil, e os provenientes de Copenhagen, Alemanha,
China e Malásia foram direcionados ao Laboratório de Doenças Veterinárias e Biologia da
Universidade de Copenhagen, onde a doutoranda realizou durante sete meses parte desse
projeto pelo programa de Doutorado Sanduíche promovido e financiado pela Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Nos laboratórios, os parasitos foram lavados várias vezes em água destilada, e
posteriormente, armazenados em tubos cônicos de 15 mL contendo solução fisiológica. Os
tubos foram identificados de acordo com a procedência geográfica, espécie animal, data e
forma de coleta, e estocados a 4Cº até o momento da análise morfológica, realizada no
máximo três dias após a coleta.
As fezes contendo ovos foram submetidas a técnica de centrifugo-flutuação em
Sulfato de Zinco 33% (Faust, 1938) para isolamento dos ovos. Os ovos foram recolhidos em
tubos de poliestireno de 1.5mL e centrifugados a 10.000xg com PBS. Ao final da
centrifugação o sobrenadante foi descartado e o procedimento repetido por três vezes até
completa eliminação dos resíduos do sal. O “pellet” de ovos foi armazenado a -20ºC para
posteriores análises.
6. Identificação morfológica
Os parasitos adultos foram observados em microscópico estereoscópico e as

características morfológicas foram utilizadas para identificação específica conforme as chaves
de Yamaguti (1961), Vicente et al (1997) e Anderson et al (2009).
Após a identificação, todos os parasitos foram armazenados, individualmente, em
tubos de poliestireno e acondicionados a -20º C para posterior extração do DNA.
7. Identificação molecular
52
7.1 Extração do DNA
O DNA foi extraído pela técnica da proteinase K/ fenol-clorofórmio modificada

(Sambrook et al., 1989). Fragmentos iguais (aproximadamente 0,5cm) de cada parasito adulto
foram lavados duas vezes com água destilada. Subsequentemente, 500µL de tampão de lise
(100mM NaCl, 1mM EDTA, 10mM Tris-HCL 2%, 0,5% SDS) foram acrescidos à amostra e
a mistura foi congelada em nitrogênio líquido e descongelada em banho-maria por três vezes,
cada etapa teve duração de um minuto e meio.
Ao produto líquido foram adicionados 20 µL de proteinase K, com posterior
incubação a 56º “overnight”. Posteriormente, 300µl de Fenol e de Clorofórmio foram
adicionados e a amostra foi centrifugada a 10000 xg por cinco minutos. O sobrenadante foi
descartado e em seguida, para a precipitação do DNA, foi adicionado volume igual de
Isopropanol (300 µL) e as amostras foram levemente agitadas. Os tubos foram então
incubados a -20ºC por 18 horas e após isso, centrifugados a 10000 xg por 10 minutos. O
sobrenadante foi descartado e 500 µl de etanol 70% foram adicionados ao “pellet”. Os tubos
foram novamente centrifugados a 10.000xg por 10 minutos, o etanol descartado e as amostras
ficaram em temperatura ambiente até a completa evaporação do etanol . O DNA extraído foi
armazenado à -20ºC para posterior realização das técnicas moleculares.
Tubos livres de DNA foram incluídos em todas as extrações de DNA como controle
negativo do processo.
Os ácidos nucleicos obtidos foram dosados e a pureza das alíquotas foi observada em
espectofotômetro (Nanodrop®).
As amostras cujo DNA foi extraído no Brasil, antes do período de Doutorado
Sanduíche na Universidade de Copenhagen, foram enviadas ao Departamento de Biologia e
Doenças Veterinárias, seção de Parasitologia e Doenças Aquáticas da Universidade de
Copenhagen, Campus Frederiksberg, Frederiksberg – Dinamarca para continuação das
análises que ocorreram sob a supervisão do Prof. Dr. Peter Nejsum.
7.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (Realizada na Universidade de

Copenhagen – DK)
Para as reações de amplificação a região da subunidade c oxidase do citocromo

mitocondrial 1 (cox 1), foi eleita como alvo, e a partir disso, um par de primers (TOXCOIF3 e
TOXCOIR2), que amplifica sequência de 490 pares de bases, foi desenhado, com o auxílio do
programa online Primer3® especificamente para esse estudo (Tabela 3).
53
As reações foram realizadas em volume final de 20µL contendo 10X PCR Buffer,
0,25mM MgCl2+, 4mM dNTP, 10 pmol de cada primer, 1U de Taq Polimerase e 90-130 ng de
DNA, em termociclador Mastercyclerpro (Eppendorf, Brasil) sob as seguintes condições:
95ºC por 15 minutos (desnaturação inicial) seguida de 35 ciclos de 95ºC por 30 segundos
(desnaturação), 60ºC por 40 segundos (anelamento), 72ºC por 1 minuto (extensão) e 72ºC por
5 minutos (extensão final). As bandas de interesse foram visualizadas pela técnica de
eletroforese em gel de agarose a 1,5% (P/V) corado com Gel Red 10000X (Biotium) e
fotografados com a ajuda de software visualizador de gel. Para estimativa do tamanho dos
fragmentos, foi utilizado o marcador ΦX 174-Hae III (Promega).
Amostras livres de DNA foram incluídas em todas as reações como controle negativo
de contaminação.
Tabela 3 - Primers utilizados nas reações de PCR para amplificação de fragmento do gene
cox1
Sequência Fragmento amplificado
5’ – GATTTTACCTGCTTTTGGTATTATTAG – 3’ 490pb
5’ – CCAAAGACAGCACCCAAACT – 3’
7.3 Sequenciamento (Realizada na Universidade de Copenhagen – DK)
Os “amplicons” obtidos, nas reações de PCR foram enviados imediatamente após as

reações para a empresa privada Macrogen, na Coréia do Sul, a qual foi responsável pela
purificação e sequenciamento dos fragmentos por eletroforese capilar. Esse é o procedimento
padrão adotado pelo Professor Doutor Peter Nejsum, da Universidade de Copenhagen, para
todos os sequenciamento de amostras realizados por ele.
7.4 Reações de Restriction Fragment Length Polymorfism (RFLP-PCR)
Para escolha da enzima foi criado um mapa de restrição com o auxílio da ferramenta
online NEBcutter® (New England Biolabs) a partir de sequências bases disponíveis no
GenBank. Essas promovem a visualização dos pontos de corte da enzima e por consequência,
os fragmentos gerados com a restrição (Figuras 5A, 5B, 5C e 5D).
54
Os produtos das reações de PCR (3µL) foram digeridos diretamente com 3 unidades
(0.2µL) da endonuclease de restrição MseI (New England Biolabs) em 10µL por duas horas a
65ºC. Os fragmentos foram separados em gel de agarose 2,0% corado com Gel Red 10000X
(Biotium) e fotografado com o auxílio de software visualizador de gel. Para estimativa do
tamanho dos fragmentos, foi utilizado o marcador ΦX 174-Hae III (Promega).
55
Toxocara canis
Fragmentos:
95 pb
5’ - TTTTTTTCCCGCTTTTGGTATTATTAGGCAAAGTAGTTTGTATTTGACTGGTAAAAAGGAGGTTTTTGGTTCTTTGGGTATGGTCTATGCTATTT - 3’
120pb
5’ - TAAGTATTGGTCTGATTGGTTGTGTGGTTTGGGCCCATCATATGTATACGGTGGGCATAGATTTGGATTCTCGTGCCTATTTTACTGCGGCAACGATGGTTATTGCTGTGCCTACGGGGGT - 3’
161pb
5’ - TAAGGTTTTTAGTTGGTTAGCCACTCTTTTTGGTATGAAGATGGTGTTTCAACCTTTGCTTTTGTGGGTGTTGGGTTTTATTTTTTTATTTACTATTGGGGGGTTGACTGGTGTTATGTTATCTAATTCTAGGTTGGATATTATCTTGCATGATACTTATTA - 3’
Figura 5A - Mapa de restrição para Toxocara canis feito com o auxílio da ferramenta online NEBcutter®. Setas indicam sítio exato de clivagem da enzima MseI.
56
Toxocara cati
Fragments:
176pb
5’- CGTAATTCCTCTCAGATAATAGGTATCATGCAAAATAATATCCAAACTAGAATTAGAAAGCATAACTCCAGTAAGCCCACCAATAGTAAACAAAAAAATAAAACCCAACACTCACAAAAGCAAAGGTTGAAAAACCATTTTTATACCAAAAAGAGTAGCCAACCAACTAAAAACCT – 3’
109pb
5’- TAACACCCGTAGGCACAGCAATAACCATAGTAGCCGCAGTAAAATAAGCCCGAGAATCCAAGTCTATACCAACAGTATACATGTGGTGAGCTCACACCACACAACCAAT – 3’
63pb
5’- TAAACCAATACTCAAAATAGCATAGACCATGCCCAAAGAACCAAAAACCTCCTTCTTACCAGT - 3’
’
49pb
5’- TAAATATAAACTACTTTGACTAATAATACCAAAAGAGGGGTAAAAATCA – 3’
’
-
Figura 6B - Mapa de restrição para Toxocara cati feito com o auxílio da ferramenta online NEBcutter®. Setas indicam sítio exato de clivagem da enzima MseI.
57
Toxocara malaysiensis
Fragmentos:
40pb
5’- TTTCCCCTCTTTTGTATTATTTGTCAGAGTAGTTTGTATT – 3’
52pb
5’- TAACTGGTAAGAAGGAAGTTTTTGGTTCGTTGGGGATGGTTTATGCTATTT – 3’
121pb – 3’
5’ – TAAGTATTGGTTTGATTGGCTGTGTGGTTTGGGCTCATCATATGTATACCGTGGGTATAGATTTGGATTCTCGGGCTTATTTTACTGCGGCGACTATGGTTATTGCTGTGCCTACTGGTGT – 3’
207pb
5’–TAAGGTTTTTAGTTGGTTGGCTACTCTTTTTGGTATGAAAATGGTTTTTCAGCCTTTACTTTTATGGGTGTTAGGTTTTATTTTCTTGTTTACTATTGGGGGCCTTACTGGTGTGATGCTTTCTAATTCTAGCCTTGATATTATTTTGCATGATACCTAATATACAAATAACTCTGAAAAATAATACAAAAAGCAGGTAAAATCA – 3’
Figura 7C - Mapa de restrição para Toxocara malaysiensis feito com o auxílio da ferramenta online NEBcutter®. Setas indicam sítio exato de clivagem da enzima MseI.
58
Toxascaris leonina
Fragmentos:
86pb
5’–CGCTTTTGGTATTATTAGTCAGAGTAGTTTATATTTGACTGGTAARAAGGAGGTTTTTGGTTCTTTGGGTATGGTTTATGCTATTT – 3’
121pb
5’–TAAGTATTGGGTTGATTGGTTGTGTTGTTTGGGCTCATCATATGTATACTGTTGGTATGGATTTGGATTCTCGTGCTTATTTTACTGCGGCTACTATGGTTATTGCTGTTCCTACTGGTGT – 3”
188pb
5’–TAAGGTTTTTAGTTGGTTGGCCACATTGTTTGGTATGAAAATGGTGTTTCAGCCGTTRCTTTTATGGGTAATAGGTTTTATTTTTTTATTTACTATTGGTGGTTTGACTGGTGTTATGTTTCCTAATTCTAGTTTGGATATTATCTTGCATGATACTTATTATGTTGTTAGTCATTTTCATTATGTTT – 3”
Figura 8D - Mapa de restrição para Toxocara leonina feito com o auxílio da ferramenta online NEBcutter®. Setas indicam sítio exato de clivagem da enzima MseI.
59
7.5 Análise filogenética
A qualidade das sequencias parciais e a união dos fragmentos sequenciados nas

respectivas zonas de intersecção, foram obtidas com o auxílio do programa Sequence
Scanner versão 1.0 (Copyright Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).
O alinhamento dos nucleotídeos foi realizado de forma manual utilizando o
programa BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, 1999), tomando-se como base
sequências disponíveis no GenBank (Tabela 4).
Para visualização das relações filogenéticas entre as espécies/genótipos
filogramas foram construídos a partir do programa Mega v.5.1 Beta. Para obtenção de
resultados fidedignos o método Neighbor-Joining com valores de “bootstrap”
estabelecidos em 1000 réplicas foi utilizado.
As distâncias evolutivas entre os pares de sequências originadas nesse estudo
foram calculadas pelo método Pairwaise disponível no mesmo programa usado para a
construção dos filogramas.
Tabela 4 - Número de acesso das sequências disponíveis do GenBank utilizadas como

referências para análises filogenéticas nesse estudo
Número de acesso Espécie Origem do isolado

AM411108 Toxocara canis China
AJ920055 Toxocara canis Holanda
AJ920054 Toxocara canis Austrália
KC293899 Toxocara canis Iran
AM411622 Toxocara cati China
AJ920057 Toxocara cati China
KC200179 Toxocara cati Iran
AM412316 Toxocara malaysiensis Malásia
NC023504 Toxascaris leonina Austrália
KC293927 Toxascaris leonina Iran
60
Resultados
64
500pb
Figura 13 - Fragmentos de 490pb do gene Cox1 em gel de agarose 2% corado com GelRed®. Marcador
de peso molecular - 100pb
2.2 Sequenciamento
Das 424 amostras que obtiveram sucesso na amplificação 72 foram escolhidas
para o sequenciamento do fragmento de DNA amplificado. Do Brasil, as amostras
foram escolhidas aleatoriamente. Do restante dos países, todas aquelas que foram
positivas na PCR, foram submetidas ao sequenciamento (Tabela 5).
Tabela 5 - Quantidade de helmintos, provenientes de cada país abrangido nesse estudo,

(adultos e ovos) submetidos à reação de sequenciamento do fragmento do gene cox1
Animais Países
Brasil Dinamarca Alemanha Malásia China Japão Rússia Portugal

Canídeos 12 (11)* 11 (4) 5 (2) 0 3 (1) 2 (2) 10 (5) 1 (1)
Felídeos 1 (1) 9 (9) 4 (1) 3 (1) 1 (1) 2 (2) 5 (3) 3 (3)
Total 13 (12) 20 (13) 9 (3) 3 (1) 4 (4) 4 (4) 15 (8) 4 (4)
*Números dentro dos parênteses correspondem à quantidade de animais dos quais os vermes foram
procedentes.
65
Do total de amostras sequenciadas (n=72), 21 (29,1%) foram identificadas como

T. cati, 46 (63,9%) como T. canis, duas (2,8%) como T. malaysiensis e três (4,2%)
como T. leonina.
Duas amostras provenientes de gatos (CDK 2_1 e CBRU38_1) apresentaram
sequência correspondente a de T. canis, e uma proveniente de cão (DRU2_1) foi
identificada como T. cati.
Das 72 sequências obtidas, nesse estudo, 23 (31,9%) foram idênticas a oito
sequências disponíveis no Genbank (Tabela 6); as outras 49 (68,1%) apresentaram
identidade gênica entre 96 e 99%. Todas as sequências não idênticas serão depositadas
no Genbank no momento da publicação dos respectivos artigos científicos.
Entre os isolados que não tiveram correspondência no Genbank alguns
apresentaram sequências idênticas entre si, mesmo sendo provenientes de diferentes
hospedeiros, como é o caso dos isolados DDE1_1, DDE1_2, DDE2_2, DDE2_3 e
DDE2_4; DDK4_5; DDK4_6; e DDK4_8; CRU3_1 e CRU3_2; LPT1_1, LPT2_1 e
LPT3_1. Todos os resultados bem como as relações filogenéticas estão ilustrados
na figura 11.
66
Figura 14 - Relações filogenéticas entre espécimes de T. canis, T. cati, T. malaysiensis e T. leonina de diferentes regiões do mundo
inferidas a partir de sequencias parciais do gene Cox1 utilizando o método Neighbor-Joining com boostraps estabelecidos em 1000
réplicas
67
Tabela 6 - Isolados analisados e número de referências das sequências disponíveis no Genbank

homólogas à eles
Isolado Número de acesso Genbank

DBRU6_1 KC293906
DBRU16_1 KC293911
CBRU38_1 KC293911
DBRBH3_5 KC293906
DBRBH6_3 KC293906
DDK3_1 KC293913
DDK4_1 KC293913
DDK4_2 KC293913
DDK4_3 KC293913
DDK4_4 KC293913
DDK4_9 KC293913
CDK5_1 KC200199
CDK7_1 KC200199
CDK9_1 KC200199
DDE2_2 KC293911
DDE2_3 KC293911
DDE2_4 KC293911
CDE1_4 AM411622
CML1_2 AM412316
CML1_5 AM412316
DCH2_2 LC13353
CJA2_1 KC200192
CJA3_1 KC200192
2.3 RFLP
Todas as 424 amostras que tiveram o fragmento do gene Cox1 amplificado,

foram submetidas as reações de RFLP.
Os padrões de restrição observados, mostraram que 351 (75,7%) parasitos
(adultos e ovos) eram T. canis/T.leonina (95pb, 120pb, 161pb /86pb, 121pb, 188pb) 70
(16.5%) eram T. cati (49pb, 63pb, 109pb, 176pb) e três (7.8%) T. malaysiensis (40pb,
52pb, 121pb, 207pb) (Figura 12).
Dois helmintos de gato (CDK2_1, CBRU38_1) foram identificados, como T.
canis e um de cão (DRU2_1) foi identificado como T. cati.
69
realizada somente com duas amostras indicando taxa de 0,01. No Brasil não houve
amostra de T. cati e na China como só houve uma, não foi possível fazer o cálculo.
A taxa de variabilidade observada nos T. canis foi de 0 a 0,03 naqueles
procedentes Brasil, 0 a 0,02 nos da Dinamarca, 0 a 0,026 nos da Rússia e de 0,036 a
0,05 nos da China. Como no Japão só foram analisadas duas sequências a variação entre
elas foi de 0,04%. Na Alemanha, todas as sequências foram idênticas não havendo,
portanto, variação.
Não houve variação entre as três amostras de T. leonina procedentes de Portugal
e nem entre as três de T. malaysiensis procedentes da Malásia.
Nos países estudados a variabilidade de T. cati foi entre 0 a 0,1, com a menor
taxa para os helmintos da Alemanha e Japão e a maior da Rússia e Alemanha. A de T.
canis foi entre 0 e 0,06, sendo a menor variação entre Brasil e Dinamarca e a maior
entre Brasil e Japão.
Entre as espécies observou-se que a variabilidade ascendeu entre 0,1 e 0,2 para
T. canis e T. cati, 0,07 e 0,1 para T. canis e T. leonina, 0,1 e 0,12 para T. canis e T.
malaysiensis, 0,09 e 0,2 para T. cati e T. leonina, 0,1 para T. cati e T malaysiensis e 0,1
para T. leonina e T. malaysiensis.
Isolados identificados pelo sequenciamento como T. canis e T. cati foram
encontrados, juntos, em cinco dos oitos países incluídos nesse estudo, fato não
observado para outras espécies, visto que T. malaysiensis foi restrita à Malásia e T.
leonina a Portugal. Portanto calculou-se variabilidade intergenotípica destas duas
espécies resultando em variações de 0,1 na Dinamarca, 0,2 na Alemanha, 0,11 a 0,13 na
China, 0,11 a 0,13 no Japão e de 0,1 na Rússia.
2.5 Comparação entre a técnica morfológica e as moleculares na determinação

da espécie parasito
Na comparação entre as amostras identificadas pela microscopia e as

sequenciadas, observou-se que sete (9,7%) apresentaram incongruência de resultados.
Dentre essas amostras CDK2_1 e CBRU38_1 provenientes de gatos e
identificadas, morfologicamente, como T. cati foram consideradas T. canis pelo
sequenciamento.
71
Discussão
72
6 Discussão
Felídeos e Canídeos podem abrigar diversos parasitos, responsáveis por quadros

patogênicos significantes, os quais pode-se incluir ascaridídeos dos gêneros Toxocara e
Toxascaris. Além disso, essas espécies adquirem importância na saúde pública por
serem consideradas zoonóticas. Entretanto, são parasitos negligenciados, não havendo
amplos levantamentos de prevalência em animais e humanos. Da mesma forma análises
genéticas dessas espécies são escassas, e no Brasil não existem trabalhos publicados que
abordem essas questões.
A forma convencional de identificação desses nematódeos, é a microscopia, e
embora seja considerada padrão ouro, apresenta limitações que podem levar a falsos
diagnósticos. Em Toxocara canis e Toxocara cati o formato das aletas é de fácil
visualização e usada de forma efetiva para diferenciação entre as espécies. Entretanto, o
mesmo não ocorre em relação ao Toxocara malaysiensis devido a morfologia muito
semelhante a do T. canis, tornando quase impossível a diferenciação. Em relação à
Toxascaris leonina a diferença relevante entre essa espécie e o gênero Toxocara é a
ausência do bulbo na parte final do esôfago, o qual requer técnica e experiência para
correta visualização e identificação.
A identificação detalhada destas espécies é necessária para estudos de
sistemática, ciclo de vida, epidemiologia e diagnóstico. Porém, Zhu et al. (2001)
mencionaram que a diferenciação de nematódeos proximamente relacionados baseada,
unicamente, na estrutura corporal é difícil e em algumas vezes até impossível.
A espécie, animal, na qual o parasito se encontra, também, é usada como
referência na identificação. Toxocara canis, Toxocara cati e Toxocara malaysiensis são
considerados parasitos exclusivos de canídeos e felídeos, respectivamente, enquanto
Toxascaris leonina tem a capacidade de parasitar ambos os grupos. Embora existam
relatos das diversas formas evolutivas de T. canis e T. cati em hospedeiros não
tradicionais, não existem questionamentos sobre essas questões, necessitando de mais
estudos que aprofundem esses achados.
Nesse estudo a identificação morfológica de todos os espécimes corroborou com
a ideia da especificidade de hospedeiro, a qual é amplamente difundida na literatura,
pois todos os espécimes provenientes de gato foram identificados como T. cati ou T.
malaysiensis e os de cães como T. canis ou T. leonina.
73
Nematódeos tendem a ser bastante conservados em relação à morfologia, o que

reduziria o poder discriminatório das técnicas morfológicas (Anderson et al., 1998). O
advento das técnicas moleculares, fez com que essas questões pudessem ser elucidadas
de forma mais efetivas, levando a resultados mais fidedignos.
Entre as técnicas, PCR é uma das mais utilizadas, devido à alta aplicabilidade,
principalmente, pela capacidade em amplificar genes ou fragmentos de genes a partir de
pequenas quantidades de material (Gasser, 1999).
A falha (3,6%) registrada por essa técnica, no presente estudo, pode ser,
explicada pela forma de extração do DNA, pela escolha do gene alvo e/ou pelo primer
escolhido para as reações de amplificação (Thompson, 2008).
Ácidos nucleicos intactos com alto grau de pureza são essenciais para a
realização dessa técnica. Obter DNA molde puro e em quantidade suficiente a partir de
alguns parasitos e/ou estádios evolutivos, pode ser tarefa difícil. Essa dificuldade pode
ser exemplificada pela cutícula dos helmintos, que devido à sua robustez não se rompe
com facilidade (Dawkins e Spencer, 1989).
Os kits para extração do DNA genômico total são utilizados, na maioria dos
estudos, entretanto são relativamente caros e podem não estar disponíveis em alguns
países. Dessa forma, é importante elaborar e aperfeiçoar protocolos que tenham como
objetivo reduzir os custos mantendo a proporção e qualidade da extração dos ácidos
nucleicos. Existem estudos comparativos de diferentes métodos de extração de DNA
para fungos (Noor Adila et al., 2007; Fredericks et al., 2005), bactérias (Dauphin et al.,
2010; Mygind et al., 2003), vírus (Dokanehiifard e Bidmeshkipour, 2010) e alguns
parasitos (Babaei et al., 2011; Adamska et al., 2010; Sharbatkhori et al., 2009),
entretanto nenhum desses estudos abordou a eficiência de diferente métodos na extração
de DNA de Toxocara spp. e Toxascaris sp.
Mikaeilli et al (2013) identificaram essa lacuna e testaram seis diferentes
protocolos para extração de DNA de parasitos destes gêneros. Os autores concluíram
que o congelamento e descongelamento em nitrogênio líquido é, altamente, eficiente no
rompimento da cutícula do parasito otimizando a extração do DNA. A desvantagem é o
alto custo quando comparado à métodos que utilizam somente rompimento mecânico da
cutícula. Porém, é consideravelmente mais barato do que kits comerciais com
resultados, igualmente, bons.
Baseado na publicação de Mikaeilli et al. (2013) o método escolhido para
extração do mtDNA, nesse trabalho, foi o congelamento e descongelamento em
74
nitrogênio líquido, associado com ciclos de sonicação manual e posterior, digestão da

cutícula remanescente com proteinase K. A otimização do protocolo permitiu que
quantidade suficiente de DNA fosse extraído com sucesso.
Para esse trabalho o mtDNA foi eleito para as reações moleculares, pois devido
a sua rápida evolução através de mutações (Gasser et al., 2013) apresenta sequência
mais variável entre as espécies do que o rDNA (Gasser et al., 2006).
Em relação à escolha do gene alvo, cox1 é integrante do mtDNA dos parasitos.
Apesar de não ser o gene mais conservado dentro desse DNA (Li et al., 2008), apresenta
alta taxa de substituição de nucleotídeos. Isso faz com que esse gene, seja capaz de
fornecer informações mais detalhadas sobre os menores níveis taxonômicos do parasito.
No entanto, essa mesma variabilidade pode levar a excessivos desequilíbrios na região
de ligação, resultando em baixa sensibilidade da PCR (Cacciò e Ryan, 2008).
A escolha do primer é o passo chave no desenvolvimento de ensaios de PCR
para a identificação de parasitos (Li et al., 2007). No presente estudo os primers
TOXCOIF3 e TOXCOIR2 foram desenhados a partir de sequências do genoma
mitocondrial, das espécies aqui estudadas, depositadas no Genbank. Hung et al. (1999)
mostraram que uma ou duas bases nitrogenadas podem ser deliberadamente alteradas na
porção 3’do primer senso ou na porção 5’do primer anti-senso para ampliar a
especificidade dos mesmos Nesse estudo a intenção era somente amplificar o fragmento
do gene, para posterior realização de outras técnicas, tais como sequenciamento e PCR-
RFLP. Dessa forma, os primers foram desenhados sem qualquer “mismatch” nas
extremidades, garantindo total anelamento com as quatro espécies analisadas,
minimizando o risco de falhas nas reações.
Foram obtidas e analisadas, nesse trabalho, 72 sequências das quatro espécies de
ascaridídeos procedentes de diferentes regiões geográficas do mundo. Os resultados
mostraram que a maioria dos isolados foi identificado como sendo de parasitos
hospedeiros-específicos, à exceção de T. leonina, confirmando o que se preconiza para
esses helmintos. Três amostras fugiram desse padrão e apresentaram sequências
relativas a outras espécies do gênero Toxocara, que teoricamente não deveriam parasitar
aquela espécie de hospedeiro. Bhowmick (1964), Roth e Schnider (1971), Farion et al.
(2011), Parsons et al. (1987), Baker et al (1989), Lee et al. (1993), Scholz et al. (2003) e
Mundim et al. (2004) relataram resultados semelhantes a esse, ou seja, o encontro de T.
canis em gatos e T. cati em cães, respectivamente, porém nenhum dos autores
conjecturou hipóteses que justificassem esses achados.
75
Sequenciamento de ácidos nucleicos tem o potencial de resolver questões

filogenéticas desde eventos recentes de especiação até divergência entre linhagens
anciãs. A habilidade de elucidar as relações evolutivas em um nível particular é
dependente do encontro de genes com determinada taxa de mudança. Em adição,
conjuntos de dados de ácidos nucleicos contém grande número de caracteres que podem
fornecer informações adicionais (Nadler, 1990).
A precisa visualização da variação de nucleotídeos necessita de sequenciamento,
mas a PCR-RFLP é capaz de realizar a identificação de organismos nos menores níveis
taxonômicos (Nadler et al., 1990). Esse, ensaio indireto usando endonucleases de
restrição, surge como alternativa ao sequenciamento devido à fácil execução,
reprodutibilidade e baixo custo operacional, fatores que tornam essa técnica atrativa.
Na literatura existe apenas o estudo de Jacobs et al. (1997) em relação à
padronização de PCR-RFLP para Toxocara spp. e Toxascaris sp. o qual é baseado no
gene ITS2 do DNA ribossomal. Essa reação, feita em duas etapas, é capaz de
diferenciar entre T. canis, T. cati e T. leonina. A presente pesquisa teve como objetivo
padronizar reação de restrição para o gene cox1 capaz de diferenciar as quatro espécies
estudadas. De acordo com os padrões de restrição gerados foi possível diferenciar entre
T. canis/T.leonina, T. cati e T. malaysiensis.
T. canis e T. leonina geraram o mesmo padrão de restrição não podendo ser
diferenciadas entre si. MseI foi eleita, entre outros motivos, pois enzimas que
reconhecem sequências de quatro bases, são normalmente mais utilizadas, em estudos
de população, devido ao fato de terem mais sítios de reconhecimento ao longo da
sequência, fornecendo, assim, melhores resultados (Nadler et al., 1990). Essa escolha
foi feita a partir da criação de mapas de restrição, os quais foram baseados
primeiramente em sequências disponíveis no Genbank e validados, posteriormente, com
as sequências geradas nesse estudo. O mapa de restrição criado para T. leonina indicava
a ausência de sítios de restrição compatíveis com a enzima, portanto o DNA não seria
digerido, sendo essa espécie facilmente distinguível das outras, pelo PCR-RFLP. Como
os parasitos dessa espécie foram os últimos a serem integrados ao projeto não houve
validação, pois a técnica já estava padronizada.
Embora a técnica não tenha sido totalmente eficiente na diferenciação das
espécies, os resultados obtidos enfatizam a especificidade de hospedeiro de T. cati e T.
malaysiensis haja vista que exceto por quatro helmintos a maioria teve associação
específica com o hospedeiro de origem.
76
A técnica desenvolvida, nesse estudo, apresenta considerável potencial,

entretanto ressalta-se que a mesma necessita, ainda, de alguns ajustes de otimização.
O dogma ecológico convencional sugere que uma espécie deve ocupar
determinado nicho ecológico (Anderson et al., 1998). T. cati parasitando cães e/ou T.
canis parasitando gatos parece ir na direção contrária a isso. Algumas hipóteses foram
estabelecidas para tentar explicar tais divergências, como as encontradas pelo
sequenciamento e pela PCR-RFLP nesse trabalho. Uma delas estaria baseada no fato de
ser resultado da mistura de espécies que se desenvolveram em alopatria e representam
uma situação transitória na qual uma espécie está tentando substituir a outra. Outra
hipótese seria a coexistência de espécies em um mesmo nicho como situação estável.
Em complemento a isso, tais espécies estariam evoluindo no intuito de se estabelecerem
em novos nichos ou em novos hospedeiros, garantindo assim a manutenção da espécie
(Anderson et al., 1998).
A especificidade de hospedeiro é preconizada para diversos tipos de patógenos,
não sendo exclusiva dos helmintos. Entretanto, acredita-se que essa característica possa
ser superestimada devido a alguns fatores como: baixa amostragem de hospedeiros
analisadas nas pesquisas; remoção de parasitos pelo próprio hospedeiro, seja ela
mecânica ou imunológica; facilidade em se analisar hospedeiros amplamente
difundidos; efeitos ambientais no sucesso das transmissão desses parasitos; e as práticas
taxonômicas (Costello, 2016).
No contexto evolutivo um organismo só pode ser altamente específico se o
hospedeiro tiver ampla distribuição, for abundante ou pelo menos facilmente infectado,
caso contrário ele corre o risco de ser extinto (Poulin, 2014). Dessa forma, potenciais
hospedeiros que são geograficamente raros, em pequeno número e que se localizam em
áreas pobres em fauna não são candidatos à especificidade do parasito (Costello, 2015).
Cães e gatos estão presentes em todo o mundo, pois são animais extremamente
próximos ao homem. Portanto, de acordo com os preceitos da teoria evolutiva, isso
favoreceria a manutenção da especificidade de hospedeiro de T. canis, T. cati e T.
malaysiensis. Independente da abundância de hospedeiros, as estratégias evolutivas
mais importantes para os patógenos é ter eficientes mecanismos de dispersão
(transmissão) e habilidade de reprodução nos diversos hospedeiros. Isso permitiria ao
parasito, por exemplo, sobreviver mesmo com a escassez de hospedeiros bem como
estender o alcance geográfico, passando a infectar indivíduos em outras áreas
geográficas (Costello, 2016).
77
Ao longo da evolução de uma espécie as mudanças genéticas, quase

invariavelmente, antecedem as alterações fenotípicas (Nadler et al., 1995), o que
explicaria os helmintos, desse trabalho, apresentarem características morfológicas de
uma espécie com genótipo de outra. Em corroboração a isso, Anderson et al. (1998)
relataram que muitas espécies de nematódeos apresentam altos níveis de diferenciação
genética, indicando que a evolução morfológica, deve progredir bem lentamente nesse
filo.
Esses achados reforçam a idéia de que esses parasitos poderiam estar se
modificando para aumentar a reprodutibilidade e consequentemente garantir a
perpetuação da espécie.
A existência de variabilidade gênica e relações filogenéticas de Toxocara spp. e
Toxascaris sp. baseados nos DNAs ribossomal e mitocondrial foram reportadas em
diferentes estudos (Jacobs et al., 1997; Zhu e Gasser, 1998; Zhu et al., 1998; Gasser et
al., 2006; Li et al., 2008; Fogt-Wyrwas et al., 2013; Mikaeili et al., 2015; Le et al.,
2016). Entretanto, os ensaios baseados em genes ribossomais parecem ser mais
populares e, pouca atenção é dispensada aos mitocondriais.
Dentre os genes ribossomais a regiões ITS são as principais escolhas por serem
alguns dos loci gênicos mais variáveis e devido à existência de primers universais
consolidados. No entanto, na análise das taxas de variabilidade intragenotípica,
fornecidas por esses genes, entre indivíduos da mesma espécie percebe-se que são,
praticamente, iguais àquelas que ocorrem, internamente, nesses indivíduos, com
porcentagens inferiores a 1% (Stevenson et al., 1996; Heise et al., 1999; Dallas et al.,
2000). Em contrapartida os genes mitocondriais, especialmente cox1 e nad4 apresentam
diferenças entre 10 e 20% nas sequencias de organismos de espécies diferentes, e de até
2% naqueles pertencentes à mesma espécie.
Diferentes marcadores genéticos fornecem diferentes padrões de estrutura
genética dentro das populações de parasitos. Por ser haplóide o tamanho do mtDNA é
menor do que os loci nucleares diploides, na mesma população o que faz com que haja
maior variação intrapopulacional (Birky et al., 1989).
Nesse estudo foi observada grande variabilidade genotípica, havendo indivíduos
da mesma espécie que apresentaram sequencias idênticas entre si, assim como
indivíduos apresentando variações gênicas de até 6,6%. Essa mesma taxa foi relatada
por Blouin et al. (1998) e Anderson et al. (1998) em análises de nematódeos de bovinos
pertencentes à espécie Ostertagia ostertagi e em Ascaris suum, respectivamente.
78
Entretanto, para Toxocara spp. e Toxascaris sp. a maior variação gênica, em sequências
do gene cox1, de indivíduos da mesma espécie, relatada foi de 3.7% (Mikaeilli et al.,
2015).
Os índices de variabilidade observados entre sequências da mesma espécie (2 a
5%) e de espécies diferentes (10 a 20%) no presente trabalho, corroboraram com os
dados relatados por Mikaeilli et al. (2015) e Li et al. (2008).
Na comparação entre T. cati e T. leonina, a variação nucleotídica observada (10-
20%) foi a esperada, visto que são duas espécies pertencentes a gêneros distintos. No
entanto, essa mesma taxa foi observada entre T. canis e T. cati, indicando que dentre as
três espécies do gênero Toxocara, analisadas, nesse estudo, essas são as mais
geneticamente divergentes. Essa distância talvez seja uma das explicações para as
diferenças encontradas na biologia desses dois helmintos, tais como a preferência por
determinado hospedeiro e a principal forma de infecção (transplacentária para T. canis e
transmamária para T. cati).
A partir desses resultados, conjectura-se que T. canis e T. cati estão especiando-
se a ponto de, daqui há algum tempo, serem completamente diferentes induzindo,
inclusive, nova classificação taxonômica.
A análise dos loci ITS-1, 5.8S e ITS-2 do DNA ribossomal, embora mais
conservados e por isso com menos taxa de substituição de nucleotídeos do que os
mtDNA, também indicou considerável variabilidade entre T. canis e T. cati (9,4-11,3
para o ITS-1, 1.9 para o 5.8S e 26,1 para o ITS-2) (Zhu et al., 1998) reiterando os dados
encontrados nesse estudo.
Os resultados dessa pesquisa reforçam a capacidade dos genes mitocondriais em
diferenciar espécies efetivamente. Além disso, a variação na estrutura do genoma
mitocondrial entre algumas espécies de nematódeos, estudados até hoje, indicam que os
genes mitocondriais nesse grupo sofrem rearranjos gênicos relativamente frequentes, o
que facilita o estudo de evolução do genoma mitocondrial. A elucidação desses
mecanismos tem implicações na investigação das relações evolucionárias dos
nematódeos (Hu e Gasser, 2006).
Análises em relação à filogenia e variações intragenotípicas, associadas à
distribuição geográfica, também, foram realizadas. T. canis e T. cati foram provenientes
de vários países, o que é pré-requisito para esse tipo de análise. O mesmo não ocorreu
para T. malaysiensis e T. leonina que foram restritas à Malásia e Portugal,
impossibilitando estudos filogeográficos.
79
Como ilustrado na árvore filogenética, construída nesse estudo, é possível

observar que enquanto alguns isolados agruparam-se em um mesmo ramo, outros
posicionaram-se em ramos diferentes e, às vezes, distantes.
A relação íntima observada pelo agrupamento de isolados de diferentes países
em um mesmo ramo do filograma, sugere a existência atual ou recém interrompida de
grande fluxo gênico entre as populações. Fluxo esse que é facilitado pela soma de três
fatores: distribuição mundial da espécie hospedeira, o manejo humano e o tráfego entre
as regiões geográficas dos hospedeiros. Em contrapartida, as barreiras de dispersão, o
habitat, a estrutura social e o comportamento do hospedeiro podem influenciar
negativamente no fluxo gênico (Nadler et al., 1990). Esses fatores fazem com que
indivíduos da mesma espécie porém, geograficamente independentes se distanciem a
ponto de apresentarem sequências gênicas, consideravelmente, divergentes.
A existência da variação geográfica não é surpreendente e foi confirmada para
Parascaris equorum (Bellini et al., 1986) Ascaris suum (Betson et al., 2014; Betson et
al., 2012; Criscione et al., 2007; Nejsum et al., 2005; Bellini et al., 1986) e
Echinococcus granulosus (Limbery e Thompson, 1988). Alguns estudos sugerem que a
diferenciação genética dos helmintos, aumenta em resposta ao aumento da distância
geográfica entre populações (Flockhart et al., 1986; Limbery e Thompson, 1988).
Entretanto, pouco é conhecido sobre o quanto a distribuição geográfica
influencia na variabilidade intragenotípica de Toxocara spp e Toxascaris sp, pois os
trabalhos são restritos e os poucos que abordam essa questão envolvem um número
limitado de isolados.
Nesse sentido, Fogt-Wyrwas et al. (2013) analisaram sequências do gene ITS-2
de T. cati e T. leonina ourindas da Polônia e da Austrália e observaram variações
intragenotípicas de acordo com o local de origem do helminto. No entanto, para T. canis
houve homologia entre as sequencias gênicas de alguns espécimes independente da
procedência geográfica. Zhu et al. (2001) em análise dos genes ITS-1, 5.8S e ITS-2
também relataram ocorrência de variação nucleotídica entre sequências de T. canis e T.
cati, provenientes da Malásia e do Reino Unidos e da Malásia e da Austrália,
respectivamente. Os autores observaram que as maiores variações ocorreram entre
isolados de T. cati, concordando com os resultados desse estudo. Não há embasamento
na literatura para se explicar tal achado.
A diversidade de sequências intrapopulacionais no mtDNA varia
consideravelmente em nematódeos. Alguns não apresentam variação e outros possuem
80
números até 10 vezes maiores do que os comumente observados em vertebrados, como

é o caso de Ascaris spp. e de trichostrongilideos (Blouin et al., 1992; Blouin et al., 1995;
Anderson e Jaenike, 1997).
Essa diferença de padrão pode ser explicada pela mistura de populações de
localidades diferentes, resultante do movimento global de pessoas e animais
domésticos. Da mesma forma, o tamanho total da população também pode influenciar,
sendo a taxa de variação diretamente proporcional ao tamanho efetivo da população.
Além disso, a rápida evolução do mtDNA parece ser responsável pelos níveis de
variação alélica.
O mtDNA evolui em diferentes velocidades nos diferentes grupos de
organismos (Rand et al., 1994), entretanto nos nematódeos, esse parece evoluir de forma
mais rápida. Martin e Polumbi (1993) mostraram que o mtDNA evolui mais rápido em
endotérmicos do que em ectotérmicos. Os autores sugeriram que a alta taxa metabólica
dos endotérmicos, resulta em excesso de produção de radicais livres que causam danos
oxidativos nesse DNA.
Embora essa teoria não seja comprovada, Hugall et al. (1995) e Hugall et al.
(1997) relataram maior variabilidade em Ascaris spp. do que em nematódeos que
parasitam plantas e insetos. Como os helmintos desse estudo, parasitam mamíferos, os
quais são animais endotérmicos, acredita-se que eles passem por processo semelhante, o
que justificaria tal variabilidade.
Os níveis de variação no gene cox1, observados no presente trabalho, para a
mesma espécie, porém de diferentes regiões geográficas excede o padrão de variação
intraespecífica comum, o que pode sugerir que um processo de especiação esteja em
andamento. Baseado em estudos filogenéticos com diversos organismos, infere-se que
as espécies estudadas nesse trabalho, tinham um ancestral comum, e que devido à
processos como mutações, isolamento simpátrico e isolamento reprodutivo, esse
ancestral diferenciou-se em uma dessas espécies. Embora essas espécies estejam agora
em íntimo contato, devido à ampla distribuição mundial e o fluxo gênico esteja
reestabelecido, o processo evolutivo continua, fazendo com que elas se distanciem cada
vez mais, especializando-se em hospedeiros e formas de infecção, bem como,
diferenciando-se fenotípica e genotipicamente.
Para garantir a fidelidade dos resultados, bem como avaliar o potencial na
identificação de espécies, foram empregadas três técnicas de identificação, sendo uma
morfológica e duas moleculares.
81
A comparação entre as técnicas revelou divergências de resultados de 9.7.1%

entre sequenciamento e microscopia e 0,9% entre PCR-RFLP e microscopia. Como os
padrões de restrição de T. canis e T. leonina, no PCR-RFLP, foram muito semelhantes,
não houve comparação entre as técnicas moleculares. Entretanto ressalta-se que para T.
cati e T. malaysiensis o sequenciamento e o PCR-RFLP apresentaram 100% de
concordâncias nos resultados.
Com base nos resultados obtidos, sugere-se que mais estudos devem ser
realizados utilizando-se outros genes, de diferentes regiões do DNA, para comparação e
obtenção de dados mais fidedignos. De acordo com Yang et al. (2009), quando o
resultado é fornecido por somente um locus gênico, os dados não são conclusivos.
Dados moleculares têm vários atributos que são atrativos, particularmente em
casos de análises evolucionárias nas quais as características morfológicas disponíveis
são insuficientes. Entretanto, estudos moleculares e morfológicos podem e devem ser
complementares (Hillis et al., 1987) e quando combinados podem ajuda a elucidar
questões que não poderiam ser resolvidas utilizando-se apenas um dos ensaios (Nadler,
1990).
Esse estudo forneceu bases sobre a estrutura do genoma, a genética de
populações, taxonomia e evolução de parasitos com importância socioeconômica. O
conjunto de dados sobre nucleotídeos e sequências de aminoácidos, derivados do
sequenciamento do genoma mitocondrial, pode ser empregado para estudos amplos da
filogenia desses parasitos. Ferramentas moleculares disponíveis e os avanços obtidos até
o momento, fornecem prospectos e oportunidades para estudos futuros em diversas
áreas, tais como processos de rearranjos gênicos, herança de genes mitocondriais e
sistemática, ecologia e epidemiologia de nematódeos.
82
Conclusões
83
7 Conclusões
A partir dos resultados obtidos nesse estudo, concluiu-se que:
 Pela microscopia estereoscópica, todos os helmintos provenientes de canídeos

foram identificados como T. canis ou T. leonina, e os de felídeos como T. cati
ou malaysiensis.
 Pelo sequenciamento, com exceção de três amostras, todas as restantes,
apresentaram especificidade de hospedeiro.
 O PCR-RFLP não foi capaz de diferenciar entre T. canis e T. leonina.
 Pelo padrão de restrição gerado duas amostras de gato foram consideradas
T.canis/T. leonina e uma de cão T. cati.
 Variação genotípica e homologia foram observadas entre isolados da mesma
espécie.
 A maior taxa de variabilidade (distância filogenética) encontrada foi de 10%
 A distância filogenética entre T. canis e T. cati foi similar às encontradas entre
T. cati e T. leonina.
 A procedência geográfica tem relação com a genética dos helmintos.
 Foram observadas sequências homólogas em isolados de diferentes países,
indicando a ocorrência de fluxo gênico.
 A especificidade de hospedeiro preconizada para T. canis, T. cati. e T.
malaysiensis foi confirmada com exceção de três helmintos.
 Houve divergência de resultados entre microscopia e sequenciamento e entre
microscopia e PCR-RFLP.
 As técnicas moleculares apresentaram concordância nos resultados de T. cati e
T. malaysiensis.
84
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

Instituto de Ciências Biomédicas

Programa de Pós-Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Relações filogenéticas de Toxocara spp. e

Natália de Melo Nasser Fava

Instituto de Ciências Biomédicas

Programa de Pós-Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Relações filogenéticas e filogeográficas de

Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-

Natália de Melo Nasser Fava

Profª. Drª Márcia Cristina Cury

Prof. Dr. Peter Nejsum

Instituto de Ciências Biomédicas

Programa de Pós-Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Relações filogenéticas de Toxocara spp. e Toxascaris sp.

Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-

Área de concentração: Parasitologia

foi porque trouxe um pouco de vocês pelo caminho.

parte da minha vida. Você também me inspira!

de doutorado sanduíche e pela parceria mantida, mesmo após o fim.

A Iasmin, pelo auxílio na formatação do trabalho e pelas incontáveis risadas.

que muito contribuíram para esse trabalho.

há no mundo é viver cada

segundo como nunca

Figura 2 – Espécime adulto de Toxocara spp. observado em microscópico estereoscópico.

Figura 4 - Fluxograma das etapas do experimento ..................................................................... 46

Figura 6 - Extremidade anterior de Toxocara canis observada em microscópio esteoreoscópio.

Figura 7 - Extremidade anterior de Toxascaris leonina observada em microscópio

Figura 8 - Extremidade anterior de Toxocara cati observada em microscópio esteoreoscópio.

Figura 9 - Ovos de Toxascaris leonina observados em microscópio óptico na objetiva de 40X e

Tabela 2 – Número de amostras coletadas, provenientes de canídeos e felídeos, em cada país

Tabela 4 - Número de acesso das sequências disponíveis do GenBank utilizadas como

Tabela 6 - Isolados analisados e número de referências das sequências disponíveis no Genbank

Os nematódeos dos gêneros Toxocara e Toxascaris são identificados, tradicionalmente, com

Palavras chave: Toxocara spp., Toxascaris, relações filogenéticas, filogeografia, especificidade

Keywords: Toxocara spp., Toxascaris sp., phylogenetic relationships, host specificity,

A superfamília Ascaridoidea é constituída de 50 gêneros que parasitam vários grupos de

como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e sequenciamento de genes parciais ou

1.1.1 Toxocara canis

Na literatura existem poucas informações sobre a descoberta e descrição de Toxocara

1.1.2 Toxocara cati

1.1.3 Toxocara malaysiensis

Rhode (1962) e Lee et al. (1993) reportaram a ocorrência de ascaridídeos encontrados em

1.1.4 Toxascaris leonina

Rudolphi (1809) descreveu um ascaridídio proveniente do intestino de um leão e o

Os ovos pertencentes ao gênero Toxocara são subglobulares, de cápsula espessa e rugosa,

1.4 Aspectos clínicos e sintomatologia da Toxocaríase

Os sintomas clínicos dependem da idade do animal, carga parasitária, localização do

consequências clínicas e patológicas da toxocariase humana, assim como, frequentes infecções

1.5 Métodos diagnósticos

Nos hospedeiros definitivos, canídeos e felídeos, o diagnóstico para Toxocara spp. e

1986). O método diagnóstico mais utilizado são as análises sorológicas, principalmente

Apesar de ser helmintíase prevalente em regiões tropicais, e a mais prevalente nas

1.7 Potencial zoonótico

O papel zoonótico de T. canis é reconhecido, entretanto o mesmo não acontece para T.

1.8 Especificidade de hospedeiro

Uma boa estratégia evolucionária é ter um mecanismo eficiente de dispersão aliado a

1.9 Biologia Molecular

Devido a limitações inerentes das técnicas tradicionais de identificação morfológica,

A precisão da análise da variação gênica têm importantes implicações na

1.10 Distribuição geográfica e variabilidade intragenotípica

Análises do DNA permitem não só a diferenciação de espécies como também revelam

Ascaridídeos têm sido identificados a partir de características morfológicas e