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Uberlândia - MG
Março - 2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
Instituto de Ciências Biomédicas
Programa de Pós-Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas
Uberlândia - MG
Março - 2011
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
CDU: 619:616.995.42
Dedico esse trabalho à minha esposa Maria pela paciência,
Amo você!
AGRADECIMENTOS
profissional. Sem o empenho de vocês não teria chegado até aqui. Serei
eternamente grato.
vocês.
descontração e motivação.
Página
RESUMO ------------------------------------------------------------------------------------------- 06
ABSTRACT ---------------------------------------------------------------------------------------- 07
1. INTRODUÇÃO ----------------------------------------------------------------------------------- 08
Imune ------------------------------------------------------------------------------------------ 16
2. OBJETIVOS -------------------------------------------------------------------------------------- 22
DH82 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 27
DH82 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 31
5. DISCUSSÃO -------------------------------------------------------------------------------------- 34
6. CONCLUSÃO ------------------------------------------------------------------------------------ 38
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO
Além disso, vale ressaltar a identificação recente de uma nova espécie por Shibata e
colaboradores (2000) no Japão, sendo isolada de carrapatos Ixodes ovatus, recebendo, assim,
a classificação de Ixodes ovatus ehrlichia (IOE).
10
No Brasil apenas três espécies já foram descritas (AGUIAR, 2006; MACHADO et al.,
2006; OLIVEIRA et al, 2009):
O ciclo da E. canis se inicia com a inoculação desse agente no cão pelo carrapato
Rhipicephalus sanguineus (POPOV et al., 1998).
Nos monócitos caninos, o ciclo se desenvolve mediante três estágios identificáveis
microscopicamente (NYNDO et al., 1971; DAGNONE et al., 2001):
Os corpos elementares multiplicam-se no interior dos vacúolos por fissão binária até
sua liberação através da ruptura do monócito ou exocitose, o que permite a repetição do ciclo
infeccioso e consequente disseminação do microrganismo pelo corpo do animal (NYNDO et
al., 1971; HILDEBRANDT et al., 1973).
Outra forma de transmissão da doença é a transfusão sanguínea de um animal
infectado para outro susceptível, podendo ocorrer a partir de cães com até cinco anos de
infecção crônica (SWANGO et al.; 1992).
No principal vetor, o carrapato R. sanguineus (Acari: Ixodidae), E. canis tem
transmissão transestadial, mas não transovariana, o que torna o cão o principal reservatório da
doença (AGUIAR, 2006). Os carrapatos se infectam ao ingerir leucócitos de cães
contaminados que estejam na segunda ou terceira semana de infecção (fase aguda da doença)
na qual existe maior concentração dessas células na corrente sanguínea do hospedeiro
(MACEDO, 2007).
E. canis multiplica-se nas células epiteliais do intestino, hemócitos e nas glândulas
salivares do carrapato e a transmissão aos cães ocorre durante o repasto sanguíneo de ninfas e
adultos (NICHOLSON et al., 2010).
O ciclo de desenvolvimento de Ehrlichia chaffeensis nas células do hospedeiro
(ZANGH et al., 2007; McBRIDE; WALKER, 2011) inicia-se pela endocitose mediada por
receptor de corpos erliquiais densamente corados (DC). Dentro de 1 h passam por uma fase
intermediária (IM 1) e posteriormente transforman-se em células reticuladas (RC). Durante as
próximas 48 h, essas células se multiplicam por divisão binária, duplicando seu número a
cada 8 h. Após passarem por outra fase intermediária (IM 2), maturam em corpos erliquiais
densamente corados (DC) dentro de 72 h após o contato inicial, podendo ser liberadas e,
assim, endocitadas por outras células (Figura 1).
12
Figura 1. Ciclo de desenvolvimento de E. chaffeesis na célula do hospedeiro vertebrado. (ZANGH et al., 2007;
McBRIDE; WALKER, 2011)
1.3) Patogenia
confirmada pelo contagem de plaquetas. Essa fase pode durar de duas a quatro semanas
(NEER, 1998).
1.4) Diagnóstico
A resposta imune inata se inicia pela fagocitose de patógenos por macrófagos, que por
sua vez desencadeia a resposta imune adaptativa. O primeiro desafio do sistema imune nesse
processo envolve a discriminação de agentes infecciosos em relação ao que é próprio. Para
isso macrófagos possuem um número restrito de receptores de fagocitose, que reconhecem
motivos conservados em patógenos, chamados de receptores de reconhecimento de padrão
(PRRs). Além disso, patógenos podem também ser fagocitados após seu reconhecimento por
receptores do complemento e por receptores Fc após opsonização específica com
imunoglobulinas (ADEREM, UNDERHILL, 1999).
A fagocitose é um processo extremamente complexo de internalização de grandes
partículas (> 0,5 µm), de forma que um único modelo é insuficiente para esclarecer
completamente as diversas estruturas e componentes associados a ele. Essa complexidade
pode ser relacionada à diversidade de receptores capazes de estimular a fagocitose, assim
como a capacidade que vários patógenos possuem de influenciar seu destino uma vez
internalizados. (ADEREM, UNDERHILL, 1999).
Um outro mecanismo que possibilita a captação seletiva de macromoléculas
específicas e patógenos é a endocitose mediada por receptor. As macromoléculas que são
internalizadas ligam-se inicialmente a receptores específicos de superfície celular. Esses
receptores estão concentrados em regiões especializadas da membrana plasmática,
denominadas de regiões recobertas por clatrina ou em pequenas invaginações da membrana
plasmática denominadas caveolas. As vesículas cobertas por clatrina ou caveolina fusionam-
se com os endossomos jovens, nos quais os seus conteúdos são transportados para lisossomos
e reciclados na membrana plasmática (COOPER, 2001).
Em ambos processos, fagocitose ou endocitose mediada por receptor, a formação do
fagossomo parece envolver diversos mecanismos capazes de desencadear diferentes vias de
sinalização. Alguns desses mecanismos incluem: a participação do citoesqueleto,
especificamente filamentos de actina e microtúbulos, GTPases, ativação de Fosfolipase C
(PLC), IP3-Kinase, Proteína-quinase C (PKC), canais de cálcio (Ca2+) e outras proteínas.
(JANMEY et al., 1994; ANDEREM; UNDERHILL, 1999)
Uma importante via de sinalização celular que pode estar envolvida com o processo de
entrada de patógenos é a via IP3/DAG e elevação do cálcio citosólico. Essa via pode ser
iniciada pela ligação do ligante a determinados receptores acoplados à proteína G, ou mesmo
por diversos outros tipos de receptores, levando à ativação da fosfolipase C. A clivagem do
17
PIP2 pela fosfolipase C dá origem ao IP3 e ao DAG (passo 1). Após sua difusão através do
citosol, o IP3 interage com os canais de Ca2+ na membrana do retículo endoplasmático,
abrindo-os (passo 2) e provocando a liberação dos íons Ca2+ estocados para o citosol (passo
3). Uma das várias respostas celulares induzidas por uma elevação de Ca2+ citosólico é o
recrutamento da proteína-quinase C (PKC) para a membrana plasmática (passo 4) na qual
será ativada pela DAG (passo 5). A quinase ativada pode fosforilar diversas enzimas e
receptores celulares, alterando, desse modo, suas atividades (passo 6). Conforme o estoque de
Ca2+ é depletado, os canais de cálcio controlados por IP3 se ligam aos canais de Ca2+ TRP,
operados pelo estoque, sobre a membrana plasmática, permitindo um influxo de cálcio
extracelular (passo 7) (LODISH et al., 2005). Esse processo é exemplificado na figura abaixo.
Figura 2. Captação e destino celular do ferro. Tf: transferrina, RTf y RTf2: receptores de transferrina, IRP (iron
regulatory protein): proteína regulatoria, DMT1 (divalent metal transporter 1): transportador. (PÉREZ et al.,
2005)
20
IL-12 e IFN- γ (FERREIRA; SILVA, 1999), havendo assim, a inversão de uma resposta do
tipo Th1 para Th2.
A secreção de TNF-α pelas células infectadas pode ser um dos mecanismos
implicados na aparente supressão da medula óssea (HARA et al., 2004), o que justificaria as
lesões hematológicas. A elevação dessa citocina também poderia justificar a alteração das
enzimas hepáticas devido à hepatotoxicidade (BRADHAM et al., 1998).
22
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
2.2. Específicos
o Fosfolipase C(PLC);
o Fosforilação da Proteína quinase (PTK);
o Papel do íon cálcio.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.3. Avaliação dos efeitos de várias drogas nos ensaios de proliferação e propagação
Cloridrato de Verapamil 100 μM (Sigma, St. Louis, Mo): inibidor de canal de cálcio
à nível de retículo endoplasmático e da membrana plasmática;
Deferoxamina 15 μM (Sigma, St. Louis, Mo): quelante de ferro;
Ehrlichia canis é uma bactéria que cresce e se agrupa em mórulas. Logo, é impossível
determinar o número exato de bactérias por célula. Para estimar esse número, as mórulas
foram classificadas em categorias de 0, 1-10, 11-50 ou 51-100 bactérias por mórula de acordo
25
com suas dimensões. O número total de bactérias foi obtido multiplicando a quantidade de
mórulas de cada categoria com a respectiva média de bactérias em cada categoria (0, 5, 30, 75
bactérias por mórula) (BARNEWALL; RIKIHISA, 1994). Os experimentos foram realizados
em triplicata de 100 células. As imagens foram capturadas utilizando o microscópio Leica
EZ4 e o Software LAS EZ (Leica Application Suite).
Figura 4. Fotomicrografia de células DH82 infectadas por E. canis sob a forma de mórulas. A figura evidencia
mórulas contendo aproximadamente 5 (cabeça de seta pequena); 30 (seta) e 75 (cabeça de seta grande) bactérias
por mórula. Coloração pelo Panótico Rápido.
26
3.5. Imunofluorescência
Com o auxílio do Software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA,
USA) as análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste unpaired 2-tailed Student´s t-
teste para constatar a existência de possíveis variações estatisticamente significantes do
número e porcentagem de células infectadas em comparação ao controle. Em ambos os casos,
considerou-se significativo p < 0.05.
27
4. RESULTADOS
Figura 5. Efeito das drogas no processo de proliferação de E. canis em células DH82. Após 3h de infecção, as
células foram tratadas com as drogas em seus respecitvos tempos e concentrações. O número total de bactérias
em 100 células evidenciado na figura acima é relativo a um período adicional de 4 dias de infecção.Os dados são
expressados em médias ± desvio padrão (n=3) e são representativos de pelo menos 2 experimentos
independentes com resultados similares. *, p<0.05 (unpaired two-tailed t test); **, p<0.01 (unpaired two-tailed t
test).
Figura 6. Efeito das drogas no processo de proliferação de E. canis em células DH82. Após 3h de infecção, as
células foram tratadas com as drogas em seus respecitvos tempos e concentrações. A porcentagem de células
infectadas evidenciadas na figura acima é relativa a um período adicional de 4 dias de infecção.Os dados são
expressados em médias ± desvio padrão (n=3) e são representativos de pelo menos 2 experimentos
independentes com resultados similares. *, p<0.05 (unpaired two-tailed t test); **, p<0.01 (unpaired two-tailed t
test).
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Figura 7: Ensaio de Proliferação de Ehrlichia canis em células DH82. A: Grupo Controle evidenciando
mórulas de E. canis em células DH82 (setas). B: Grupo tratado com Verapamil demonstrando reduzido número
de mórulas por célula e menor porcentagem de células DH82 infectadas em comparação ao grupo controle. C:
Grupo tratado com Verapamil demonstrando ausência de mórulas em células DH82. Coloração pelo Panótico
Rápido.
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Figura 8: Imunofluorescência de células DH82 infectadas com mórulas de Ehrlichia canis 24h pós-inoculação. Notar
formação de filopódios de células DH82 infectadas em direção às células DH82 não-infectadas (seta), e passagem de
mórulas de uma célula à outra (D). Marcação com Anticorpo primário (anti-E. canis) 1:250 e Anticorpo secundário
(anti-cão) FITC/Azul de evans 1% 1:400.
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Para avaliar os efeitos das drogas no ensaio de propagação, essas foram adicionadas à
células DH82 infectadas a uma taxa de 20%. Após 4 dias as análises demonstraram que,
exceto para Nocodazol, evidenciou-se uma diminuição do número total de bactérias após o
tratamento (Figura 9).
Observamos ainda que não houve diferença significativa na porcentagem de células
infectadas quando tratadas com Citocalasina D e Deferoxamina. Verapamil acarretou uma
diminuição desse valor e Neomicina levou a uma diminuição quase significativa (p = 0,053).
Quanto ao Nocodazol, assim como Genisteína, foi evidenciado aumento significativo na
porcentagem de células infectadas (Figura 10).
Nesse ensaio observa-se também um efeito significativo da droga verapamil em
relação ao controle (Figura 11).
32
Figura 9. Efeito das drogas no processo de propagação de E. canis em células DH82, com taxa inicial de
infecção de 20%. Após 4 dias o número total de bactérias em 100 células é evidenciado na figura acima. Os
dados são expressados em médias ± desvio padrão (n=3) e são representativos de pelo menos 2 experimentos
independentes com resultados similares. *, p<0.05 (unpaired two-tailed t test); **, p<0.01 (unpaired two-tailed t
test).
Figura 10. Efeito das drogas no processo de propagação de E. canis em células DH82, com taxa inicial de
infecção de 20%. Após 4 dias a porcentagem de células infectadas é evidênciada na figura acima.Os dados são
expressados em médias ± desvio padrão (n=3) e são representativos de pelo menos 2 experimentos
independentes com resultados similares. *, p<0.05 (unpaired two-tailed t test); **, p<0.01 (unpaired two-tailed t
test).
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Figura 11: Ensaio de Propagação de Ehrlichia canis em células DH82. A: Grupo Controle evidenciando
mórulas de E. canis em células DH82 (seta). B e C: Grupo tratado com Verapamil demonstrando reduzido
número de mórulas (seta) por célula e menor porcentagem de células DH82 infectadas em comparação ao grupo
controle. Coloração pelo Panótico Rápido.
34
5. DISCUSSÃO
6. CONCLUSÃO
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