Arquivo2773 1

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS FARMACÊUTICAS
TESE DE DOUTORADO
PRÓPOLIS VERMELHA DO LITORAL DE PERNAMBUCO:

Caracterização, Atividade Biológica e Proposta de Gel Vaginal
Lívio César Cunha Nunes
RECIFE – PE
2008
15
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS FARMACÊUTICAS
TESE DE DOUTORADO

Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas

apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas do Departamento de
Farmácia da Universidade Federal de Pernambuco,
como requisito para obtenção do título Doutor.
Orientador: Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto

Co-orientação: Profª. Dra. Antônia Maria das Graças Lopes Citó
Lívio César Cunha Nunes
RECIFE – PE
2008
16
15
15
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS FARMACEUTICAS
TESE DE DOUTORADO

BANCA EXAMINADORA:
PRESIDENTE DA BANCA EXAMINADORA:

Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto
Dept° de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco
1º EXAMINADOR INTERNO:
Dra. Jane Sheila Higino
2º EXAMINADOR INTERNO:
Dr. Haroudo Sátiro Xavier
1º EXAMINADOR EXTERNO:
Dra. Ana Amélia de Carvalho Melo Cavalcante
Dptº. De ciência Biológica Universidade Federal do Piauí
2º EXAMINADOR EXTERNO:
Ednaldo de Lima Queiroga
Dept° de Ciências Agrária da Universidade Federal de Campina Grande
16
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS FARMACEUTICAS
TESE DE DOUTORADO
REITOR
Prof. Amaro Henrique Pessoa Lins
VICE-REITOR
Prof. Gilson Edmar Gonçalves e Silva
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Prof. José Thadeu Pinheiro
VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Prof. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros
CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMCÊUTICAS

Profª. Jane Sheila Higino
VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Prof. Samuel Daniel de Sousa Filho
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS
Profº Pedro José Rolim Neto
VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS
Profª Beate Seagene Santos
17
Dedicatória
A Deus, que é uma constante em todos os momentos de minha vida,

aos meus pais, meu grande exemplo de amor e coragem,
aos meus irmãos pelo incentivo, apoio e compreensão,
aos meus filhos pelo amor incondicional,
e aos meus amigos.
18
AGRADECIMENTOS
É difícil encontrar palavras que possam expressar o carinho, a gratidão e a amizade que
encontrei em todos os momentos desta jornada, mas espero que elas possam representar um
pouco do muito que tenho a agradecer a tantas pessoas maravilhosas, que Deus pôs em meu
caminho.
Aos meus orientadores, pelo estímulo, confiança, paciência e pelas tantas cobranças, sem as
quais esse trabalho iria demorar um pouco mais...
Aos meus amigos irmãos, que Deus me presenteou em minha graduação, os quais me dão
energia para seguir em frente. Obrigada por todos os momentos felizes que me
proporcionaram, pelos apoios nas dificuldades, pela compreensão, pelo amor que sempre
demonstraram e pela confiança que depositaram em mim. Amo vocês, estão guardados em
meu coração. OBRIGADO MESMO!
A Universidade Federal de Pernambuco, em particular ao curso de Graduação de Ciências

Farmacêuticas, pela oportunidade de realização deste curso.
A todos os professores, funcionários e amigos do Departamento de Ciências Farmacêuticas da

UFPE.
Ao LTM (Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos) e companheiros do LTM.
Aos amigos quem mesmo distante sempre me apoiaram.
19
LISTA DE FIGURAS
ARTIGO I
Figura 1: Constituintes químicos da própolis vermelha do nordeste do Brasil ....................... 23
ARTIGO II
Figura 1: Cromatografia em camada delgada das amostras de propolis reveladas com NEU e
observadas na luz ultra-violeta a 366 nm ................................................................................. 45
Figura 2: Varredura Espectrofotométrica dos Extratos de Própolis Analisados ..................... 45
ARTIGO III
Figura 1. Determinação gráfica da curva de linearidade da concentração de quercetina........ 64
ARTIGO V
Figura 1: Mistura de benzofenonas Gutiferona E: R = 3-metil-2-butenil Xantoquimol: R = 3-
metil-3-butenil ..........................................................................................................................81
Figura 2. Efeitos antioxidantes e antimutagênicos da própolis Saccharomyces cerevisiae. ... 83
Figura 3: Atividade da própolis na inibição de crescimento em Saccharomyces cerevisiae na
presença de agente oxidante: H2O2........................................................................................... 83
Figura 4. Efeitos da própolis vermelha na modulação (%) de danos oxidantes pelo H 2O2..... 84
Figura 5: Antimutagenicidade da própolis vermelha de Pernambuco em pós-tratamento, na
inibição de danos alquilantes e oxidativos induzidos ao DNA de medula óssea de
camundongos. ........................................................................................................................... 85
ARTIGO VI
Figura 1: Halo de inibição em placa de Petri: C. albicans, C. dublinienses e C.
guilliermondii. .......................................................................................................................... 95
ARTIGO VII
Figura 1: Teoria da interpenetração ou difusão para o mecanismo de ligação bioadesiva....109
Figura 2: Aspecto macroscópicos dos géis desenvolvidos....................................................110
20
Figura 3: Aspectos microscópicos dos géis desenvolvidos...................................................113
LISTA DE TABELAS
ARTIGO II
Tabela 1: Informações Gerais das Amostras Analisadas ........................................................ 41
Tabela 2: Características Organolépticas e Físico Químicas dos Extratos de Própolis........... 44
ARTIGO III
Tabela 1:Resultados das análises gravimétricas realizadas com amostras da própolis coletada
nos meses de fevereiro, junho e outubro de 2006..................................................................... 62
Tabela 2: Determinação dos Metais Pesados em própolis vermelha. ................................... 633
Tabela 3: Análises do teor de flavonóides totais e fenóis totais............................................. 63
Tabela 4: Determinação dos resultados da exatidão para doseamento de flavonóides. .......... 64
ARTIGO IV
Tabela 1: Compostos voláteis identificados em amostras de própolis vermelha de
Pernambuco (% do íon corrente total). .................................................................................6970
ARTIGO V
Tabela 1: Avaliação da ação do extrato de própolis vermelha na genotoxicidade induzida pela
ciclofosfamida em medula óssea de camundongos .................................................................. 84
ARTIGO VI
Tabela 01: Medida dos halos de inibição de cândida por extratos de própolis ....................... 96
Tabela 02: Efeito do extrato etanólico de própolis verde e vermelha no edema de pata
induzido por carragenina. Os valores representam a diferença de volume, em mililitros, entre
as patas injetadas com carragenina e aquelas injetadas com salina. ......................................... 98
ARTIGO VII
Tabela 01: Composição do pilotos........................................................................................107
Tabela 02: Caracterização físico-química dos géis desenvolvidos........................................110
21
LISTA DE GRÁFICOS
ARTIGO V
Gráfico 01: Atividade antioxidante de extratos de própolis frente ao DPPH.......................... 81
ARTIGO VI
Gráfico 1: Atividade antiedematogênica de extratos de própolis em edema de orelha de
camundongo.............................................................................................................................. 97
Gráfico 02: Efeito do extrato etanólico de própolis verde (EPvd) e vermelha (EPvm) no
edema de pata induzido por carragenina. .................................................................................98
ARTIGO VII
Gráfico 1: Perfis das viscosidades.........................................................................................114
Gráfico 2: Comportamento reológico dos géis desenvolvidos..............................................115
22
RESUMO
A própolis é uma substância balsâmica de origem vegetal, coletada e transportada pelas

abelhas dos ramos, flores, brotos, polém e exudatos de árvores, acrescentada de secreção
salivar. Tem por objetivo proteger a colméia vedando frestas e inibindo a proliferação
microbiana, tornando o interior da colméia tão asséptico quanto uma sala cirúrgica. É
composta por uma infinidade de substâncias de acordo com sua origem, época de coleta e
características das abelhas, sendo caracterizadas mais de 300 substâncias. É utilizada pelo
homem desde a antiguidade por apresentar propriedades terapêuticas como: bactericida,
fungicida, virocida, antiinflamatória, imunoestimulante, antioxidante, cicatrizante, dentre
outras. As amostras de própolis brasileiras podem ser classificadas em 13 grupos, dos quais o
grupo mais estudado é o da própolis verde, mais comum no sudeste e o menos estudado é o
grupo da própolis vermelha, que ocorre no litoral nordeste. A ocorrência da própolis vermelha
já foi citada na literatura, ocorrendo desde o litoral do Estado da Bahia até o litoral da Paraíba.
O presente estudo caracterizou uma amostra de própolis do litoral de Pernambuco do ponto de
vista da composição química e das atividades biológicas, bem como realizou o
desenvolvimento farmacotécnico de formulações semi-sólidas, para uso vaginal. A
caracterização química mostrou como constituintes voláteis majoritários os compostos trans-
anetol, -copaeno e o metil cis-isoeugenol, apresentando atividade tóxica contra Artemia
salina, com CL50 de 18,9 µg/mL, antioxidade, tanto no modelo in vitro, quanto in vivo,
atividade antigenotóxica, assim como atividades antiinflamatória e antifúngica. O extrato
hidroalcoólico se mostrou compatível em formulações de gel mucoadesivo, apresentando boas
características físico-químicas. Conclue-se que, complementando-se com testes clínicos, o gel
desenvolvido pode tornar-se um grande aliado no combate às vaginites inespecíficas, que
acometem milhares de mulheres.
PALAVRAS CHAVE: Própolis, produtos naturais, própolis vermelha, fitoterápicos.
23
ABSTRACT
The propolis is one nourishes balsamic of vegetable origin, collected and transported by the
bees of the branches, flowers, sprouts, polish and exudate of you hoist increased of secretion
to salivate. It has for objective to protect the beehive banning openings and inhibiting the
microbial proliferation (turning the interior of the beehive as aseptic as a surgical room). it is
composed by an infinity of you nourish in agreement with his/her origin, collection time and
characteristics of the bees, being characterized more than 300 substances. It is used by the
man from the antiquity for presenting therapeutic properties as: bactericidal, fungicide,
antivirus activite, anti-inflammatory, imunoestimulante, antioxidant, healing among others.
The samples of Brazilian propolis can be classified in 13 groups, of the which the group more
studied is it of the green propolis (southeast) and the fewer studied it is the group of the red
propolis (northeast coast). the occurrence of the red propolis was already mentioned in the
literature from the coast of the state of Bahia to the coast of the state of Paraíba. The present
study characterized a sample of propolis of the coast of Pernambuco (of the point of view of
the chemical composition and of the biological activity) as well as it accomplished the
development pharmacotechnical of semi-solid formulations of vaginal use. The chemical
characterization showed as constituent volatile majority the compounds trans-anetol, to-
copaeno and the methyl cis-isoeugenol, presenting activity citotóxica against Artemia salina
(CL50 of 18,9), activity so much antioxidade in the model in vitro as alive in, activity
antigenotoxic as well as anti-inflammatory and anti-fungic activities. The extract
hydroalcoholic was shown compatible in formulations of gel mucus-adhesive, presenting
good physiochemical characteristics. In conclued that complemented with clinical tests, the
developed gel can become a great ally in the combat the vaginits non specific that attack
thousands of women.
KEY WORDS: Propolis, natural products, red propolis, phytotherapic.
24
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 15
2. FUNDAMENT AÇÃO QUÍMICA E FARMACOLÓGICA .........................................................18
2.1. ARTIGO I: PRÓPOLIS: ATUALIZAÇÕES SOBRE A QUÍMICA E A FARMACOLOGIA .....19
2.2. ARTIGO II: AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS E ASPECTOS

LEGAIS DE EXTRATOS DE PRÓPOLIS COMERCIALIZADOS NO MERCADO BRASILEIRO 33
3 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 47
3.1 Geral......................................................................................................................................47
3.2 Específicos .............................................................................................................................47
4. CARACTERIZAÇÃO DA PRÓPOLIS ...................................................................................
4.1. ARTIGO III: PRÓPOLIS VERMELHA DO LITORAL DE PERNAMBUCO-BRASIL:

AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA SAZONAL NA CONSTITUIÇÃO QUÍMICA ...........................49
4.2. ARTIGO IV: VARIABILIDADE SAZONAL DOS CONSTITUINTES DA PRÓPOLIS

VERMELHA E BIOATIVIDADE EM Artemia salina LEACH ......................................................65
5. ATIVIDADE BIOLÓGICA DA PRÓPOLIS VERMELHA ...................................................
5.1. ARTIGO V: PRÓPOLIS VERMELHA: ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO E IN VIVO E

ANTIGENOTÓXICA, EM DANOS INDUZIDOS PELA CICLOFOSFAMIDA, EM
CAMUNDONGOS ......................................................................................................................76
5.2. ARTIGO VI: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DA PRÓPOLIS FRENTE A

ESPÉCIES DE Candida sp. E ANTIINFLAMATÓRIA EM EDEMA DE PAT A DE RATO E
EDEMA DE ORELHA DE CAMUNDONGOS .............................................................................89
6 DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO ..............................................................................
6.1 ARTIGO VII: DESENVOLVIMENTO DE GEL VAGINAL CONTENDO EXTRATO DE

PRÓPOLIS VERMELHA........................................................................................................... 104
7. CONCLUSÃO .................................................................................................................... 121
8. PERSPECTIVAS................................................................................................................ 123
9. REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 125
25
APRESENTAÇÃO
Nos últimos anos têm se intensificado as pesquisas voltadas para o estudo da própolis,
investigações sobre as suas propriedades biológicas, uma vez que a complexidade e
variabilidade de sua composição têm lhe atribuído multiplicidade de ações (antimicrobiana,
antiinflamatória, antioxidante, antiviral, cicatrizante) e despertado o interesse para o estudo
farmacológico dos efeitos do seu uso e da sua inserção no mercado sob diversas apresentações
e formas farmacêuticas, com indicações promissoras para melhora da saúde e prevenção de
doenças.
Em face da importância da própolis, por suas características e pelo menor quantitativo
de estudos voltados para a composição, aplicação, e bioatividade da própolis vermelha, típica
do nordeste brasileiro, em relação aos demais tipos de própolis, despertou o interesse pela sua
caracterização química e farmacológica e análise de atividades biológicas, baseados em
estudos comprobatórios in vitro e in vivo que delineassem o perfil dos compostos bioativos
integrantes e suas propriedades funcionais.
Todo texto é um embasamento técnico-científico para proposta de desenvolvimento de
novos fármacos, tendo a própolis vermelha como principio ativo, considerando e
correlacionando composição/atividade biológica, numa visualização das variações decorrentes
de sazonalidade, vegetação, local de coleta, variedades de abelhas e outras alterações que
possam interferir em suas características terapêuticas. Buscou-se desenvolver um estudo que
subsidiasse e estabelecesse um suporte de conhecimentos sólidos que caracterizem a matéria-
prima e os produtos acabados a ser desenvolvidos a partir da própolis vermelha.
Procurou-se não perder de vista e ressaltar a importância e a necessidade de
continuidade e intensificação de estudos e análises envolvendo a própolis vermelha e suas
variadas características, uma vez que o aprofundamento dos estudos e comprovações
científicas de efetividade tem evidenciado maior interesse na sua aplicação
farmacoterapêutica, fluindo para além do remoto emprego na medicina popular, nem sempre
conduzido de forma racional.
O trajeto proposto para caracterização e análise da atividade biológica da própolis
vermelha do litoral de Pernambuco, segue a linha de análise que favorece o desenvolvimento
26
de novos produtos para um mercado cada vez maior e mais exigente, onde a inserção e
manutenção de novos fármacos estão diretamente associadas a uma produção com bases
técnicas-científicas de segurança e efetividade de comprovação explícita.
27
1. INTRODUÇÃO
14
1. INTRODUÇÃO
A própolis é um material produzido por abelhas a partir de resinas encontradas no

caule de plantas, às quais são adicionadas cera e saliva. Este material possui atividades
biológicas, sendo empregado na colméia para a prevenção de contaminações microbianas nos
ninhos de deposição dos ovos, bem como para selar frestas e embalsamar os corpos de
invasores mortos. (Park, 2000; Pereira et al., 2002; Franco et al., 2000; Marcucci, 1996;
Bankova et al., 2005).
O uso da própolis para fins medicinais data de tempos remotos e o interesse pelo seu
uso terapêutico tem se exacerbado a partir do aprofundamento de estudos e comprovações
científicas relativas à sua aplicação na promoção da saúde e prevenção de doenças, pelas
inúmeras atividades biológicas (antimicrobiana, antiinflamatória, antioxidante, antiviral,
cicatrizante, hepatoprotetora, antitumoral, imunomodulatória etc.) a ela atribuídas (Bankova
(a), 2005; Kosalec et al., 2005; Alencar et al., 2005 Vargas et al., 2004; Da Silva et al., 2006;
Pereira et al., 2002; Salatino et al., 2005; Lima, 2006; Kujungiev et al., 1999; Lu et al., 2005;
Marcucci et al., 2001; Rezende et al., 2006; Oliveira et al., 2006).
As propriedades biológicas da própolis estão diretamente ligadas à sua composição
química, bastante complexa e variada, e este, possivelmente é o maior problema para sua
aplicação na terapêutica, tendo em vista que a sua composição química, propriedades físicas e
biológicas variam com a biodiversidade da flora de cada região visitada pelas abelhas, com o
período de coleta da resina e com a variabilidade genética das abelhas rainhas (Park et al.,
2002; Rocha et al., 2005; Park et al, 1998).
As amostras tropicais de própolis, especialmente as brasileiras, têm mostrado
diferenças significantes nas suas composições químicas em relação à própolis de zonas
temperadas. Por essa razão, a própolis brasileira tem se tornado objeto de grande interesse por
parte dos cientistas (Trusheva et al., 2006).
A própolis vermelha do nordeste do Brasil, de provável origem botânica da Dalbergia
ecastophyllum (L) Taub. (Park et al., 2002; Donnelly et al, 1973; Matos et al, 1975; Daugsch
et al, 2006), possui algumas moléculas que a diferenciam dos outros tipos de própolis já
largamente citadas na literatura. Acredita-se, dessa forma, que tais moléculas possam revelar
atividades biológicas ainda não conhecidas em outras amostras, resultando numa mistura
complexa de compostos bioativos e diversas propriedades biológicas (Gonsales et al., 2006).
15
As atividades antibacteriana e antifúngica da própolis têm sido as propriedades
biológicas mais extensamente estudadas, bem como os componentes químicos responsáveis
por tais atividades (Kujungiev et al., 1999). As ações antiinflamatórias e antioxidantes são
citadas em vários estudos, por diversos autores, merecendo especial interesse, pelos resultados
já obtidos. (Borrelli et al., 2002; Marquele et al., 2006). Não existem muitos relatos sobre a
atividade antiviral, porém algumas citações como Marcucci (1995) evidenciam uma provável
efetividade, mesmo que em menor escala, como virucida contra os vírus do herpes simplex
(HSV) e da estomatite vesicular (VSV).
Várias propriedades biológicas da própolis estão relacionadas à presença de
flavonóides e ácidos fenólicos, destacando a sua atividade cicatrizante, onde os ferimentos
tratados apresentaram menos inflamação e mais rápida cicatrização (Arvouet-Grand et al.,
1994; Gregory et al., 2002). Outras propriedades, como imunomodulação; redução de pressão
arterial; redução de níveis de colesterol e de infecções de vias aéreas; atividade
antiprotozoária; aplicação e indicações odontológicas têm sido constantemente citadas na
literatura (Sy et al., 2006; Ayres, 2007; Pietta, 2002; Prytzyk et al, 2003; Capasso & Castaldo,
2002; Tavares et al., 2006 Dantas et al., 2006).
Devido à sua extensão territorial continental e ao clima tropical, há grande diversidade
de própolis produzidas no Brasil, disponibilizada no mercado sob diversas formas
farmacêuticas, avaliamos também amostras de extratos de própolis comercializadas, quanto à
adequação a legislação vigente, características organolépticas e parâmetros físico-químicos
destes produtos.
As diversas composições químicas da própolis são relatadas para diferentes amostras
coletadas por todo o país, porém há poucos estudos envolvendo a própolis vermelha. Visando
a sua caracterização e perfil de bioatividade, fizemos coletas de variabilidade sazonal, em três
diferentes meses do ano, com o acondicionamento preciso, desenvolvemos um estudo de
caracterização de composição, com validação do método analítico para a quantificação de
teores na própolis vermelha que proporcionou resultados confiáveis para o doseamento de
flavonóides totais (bastante citados na literatura como sendo ricos em propri edades
farmacológicas), sendo linear, exato e preciso.
Obteve-se da própolis vermelha, extrato bruto metanólico e analisamos e realizamos

ensaio de letalidade em Artermia salina Leach, onde os resultados sugeriram atividade
biológica. Desenvolvemos correlação também entre os conteúdos de fenóis totais de extratos
16
etanólicos com variações de sazonalidade e a capacidade antioxidante do extrato comprovada
por diferentes métodos de análise.
Em relação à bioatividade, diferentes métodos aplicados in vivo e in vitro, com uso
de variados extratos, demonstrou efetividade antimicrobiana, antiinflamatória, antioxidante,
antigenotóxica, numa relação entre composição química e variabilidades, indicando que novas
pesquisas merecem maior atenção, especialmente se voltadas para a própolis vermelha e seus
efeitos para a saúde humana.
Após a caracterização em todos os aspectos anteriormente citados, e diante dos
resultados obtidos nos testes de atividade biológica, temos como etapa seqüencial a produção
de um gel vaginal à base de própolis vermelha para aplicação em combate às vulvovaginites.
As vaginoses bacterianas e a candídiase vulvovaginal são as causas mais freqüentes de
vaginites sintomáticas, acometendo 75% das mulheres pelo menos uma vez durante a vida, e
ocorrendo em 40% a 50% de maneira recorrente. São causadas por um desequilíbrio da flora
vaginal normal, aumento do pH vaginal, proliferação bacteriana e/ou fungica, interferindo na
saúde e qualidade de vida da mulher (M. Imhof et al, 2005; Sobel JD et al.1998; Hay P 2000).
Os ensaios realizados nestes e em outros estudos (Oliveira et al., 2006; M. Imhof et al, 2005;
Scazzocchio et al., 2005 Lu et al., 2005; Marcucci et al., 2001 Rezende et al., 2006) revelam
sensibilidade bacteriana e fúngica à própolis, respaldando o nosso intuito de produção do gel
vaginal, sob a forma farmacêutica mucoadesiva, que garante adesão do fármaco, em contato
por longo período, à mucosa vaginal, surtindo efeito de alívio sintomático, pela ação
antimicrobiana e antiinflamatória, apontando a própolis como uma alternativa terapêutica,
para a redução da tendente resistência, efeitos colaterais e adversos relacionados aos
antifúngicos e antibióticos tradicionais.
17
2. FUNDAMENTAÇÃO
18
2.1. ARTIGO I: PRÓPOLIS: ATUALIZAÇÕES SOBRE A QUÍMICA E A
FARMACOLOGIA
Artigo publicado pela Revista Brasileira de Farmacognosia (v.18; p.447-454, 2008).
RESUMO: Própolis é uma mistura complexa, formada por material resinoso e balsâmico.
Sua composição química é complexa e variada, estando relacionada com a flora de cada
região visitada pelas abelhas e com o período de coleta da resina. Inclui flavonóides, ácidos
aromáticos, terpenóides e fenilpropanóides, ácidos graxos e vários outros compostos. A
própolis tem sido objeto de intensos estudos farmacológicos e químicos nos últimos 30 anos.
Em várias partes do mundo é indicada para melhorar a saúde e prevenir doenças. Atualmente,
é disponível em várias formas farmacêuticas como cápsulas, extratos, enxaguatório bucal, na
forma de pó, entre outras. Ainda são necessários estudos correlacionando a composição
química com a atividade biológica, definindo cada tipo de própolis com a sua aplicação
terapêutica. É uma tarefa imprescindível para um mercado cada vez maior e exigente em todo
o mundo.
Keywords: Própolis, constituintes químicos, atividade biológica.
ABSTRACT: ―Propolis: updates on chemistry and the pharmacology‖ Propolis (bee glue) is
a complex mixture, formed by resinous and balsamic material. It is variable and co mplex
chemical composition, being related with the flora of each region visited by the bees and with
the period of resins collection. Chemical compositon as flavonoids, aromatic acids, terpenoids
and phenylpropanoids, fat acids, and others compounds are found in propolis. For the last 30
years, propolis has become the subject of intense pharmacological and chemical studies. In
different parts of the world it is indicated to improve the health and to prevent illnesses.
Currently, it is available in some phar maceutical forms as capsules, extracts, mouthrinses,
powder form, among others. Indeed, there are necessit correlating studies the chemical
composition with the biological activity, defining each type of propolis with its therapeutical
application. It’s na essential task for a market ever bigger and demanding in the whole word.
Keywords: Propolis, chemical composition, biological activity
INTRODUÇÃO: A palavra própolis é derivada do grego pro-, em defesa, e polis-, cidade ou

comunidade, isto é, em defesa da comunidade (Pereira et al., 2002). É uma mistura complexa,
formada por material resinoso e balsâmico coletado pelas abelhas dos ramos, flores, pólen,
brotos e exudatos de árvores; além desses, na colméia, as abelhas adicionam secreções
salivares e enzimas (Pereira et al., 2002; Franco et al., 2000).
Para a produção de própolis, abelhas usam materiais resultantes de uma variedade de
processos botânicos em diferentes partes das plantas. São substâncias ativamente secretadas
pelas plantas bem como exudatos de feridas nas plantas: materiais lipofílicos das folhas e
germes, látex, resinas, etc (Bankova, 2005-b; Capasso & Castaldo, 2002).
19
As abelhas de fato usam a própolis para protegê-las contra insetos e microrganismos,
no reparo de frestas ou danos à colméia, no preparo de locais assépticos para postura da
abelha rainha e na mumificação de insetos invasores (Marcucci, 1996).
De modo geral, contém 50 - 60% de resinas e bálsamos, 30 – 40% de ceras, 5 – 10%

de óleos essenciais, 5% de grão de pólen, além de microelementos como alumínio, cálcio,
estrôncio, ferro, cobre, manganês e pequenas quantidades de vitaminas B1, B2, B6, C e E
(Park, et al., 2002; Burdock, 1998; Funari & Ferro, 2006; Menezes, 2005; Woisky et al.,
1998).
A coloração da própolis depende de sua procedência. Varia de marrom escuro

passando a uma tonalidade esverdeada até o marrom avermelhado. Possui odor característico
que pode variar de uma amostra para outra (Marcucci, 1996).
Na Europa, América do Norte e oeste da Ásia, a fonte dominante de própolis é o
exudato do botão de álamo (Populus sp.). Entretanto, na América do Sul a espécie vegetal do
gênero Populus não é nativa, existindo uma grande diversidade vegetal para retirada de resina,
o que dificulta a correlação da própolis com a fonte prod utora (Park et al., 2002). Outras
espécies vegetais empregadas como fontes de própolis em várias partes do mundo são
pinheiros, carvalho, salgueiro, acácia, entre outras (Markham et al., 1996).
A própolis vermelha é reportada como sendo típica de Cuba e da Venezuela, onde as
origens botânicas foram identificadas como Clusia nemorosa (Clusiaceae) e Clusia
scrobiculata, respectivamente (Trusheva et al., 2006).
A própolis é um dos muitos produtos naturais que vêm sendo utilizados durante
séculos pela humanidade (Vargas et al., 2004). Os egípcios conheciam as propriedades anti-
putrefativas da própolis e empregavam para embalsamar cadáveres. Além disso, foi
reconhecida por suas propriedades medicinais por médicos gregos e romanos como
Aristóteles, Dioscorides, Plínio e Galeno (Capasso & Castaldo, 2002). O uso de extratos de
própolis na medicina popular data de 300 a.C. (Da Silva et al., 2006).
Na África do Sul, na guerra ao final do século XIX, foi amplamente utilizada devido
às suas propriedades cicatrizantes e na segunda guerra mundial foi empregada em várias
clínicas soviéticas (Pereira et al., 2002).
A própolis começou a ser apreciada como meio para tratamento de problemas de
saúde nos anos de 1950 e 1960 na ex-União Soviética e em países do leste da Europa, como
Bulgária, República Tcheca e Polônia. Nos países do oeste europeu, na América do Sul e do
Norte e no Japão, a própolis não adquiriu popularidade até 1980. Na metade dos anos 80, a
20
própolis tornou-se um importante produto na medicina alternativa e complementar. O Japão é
o principal importador de própolis, com preferência pela própolis brasileira (Salatino et al.,
2005).
O termo própolis já era descrito no século XVI na França e a Farmacopéia de Londres
do século XVII lista a própolis como droga oficial (Capasso & Castaldo, 2002; Pereira et al.,
2002; Cao et al., 2004). Em 1908 surgiu o primeiro trabalho científico sobre suas
propriedades químicas e ―composição‖, indexado no Chemical Abstracts (referência n° 192).
Em 1968 surgiu no Chemical Abstracts o resumo da primeira patente utilizando a própolis
Romena, para a produção de loções para banho. Até meados do ano 2000, o número de
trabalhos publicados citados no Chemical Abstracts totaliza 450, oriundos de 39 países, dos
cinco continentes, além de 239 patentes (Pereira et al., 2002). Partindo-se então, de 2003 até
início de 2008, uma busca realizada no European Patent Office tomando-se Worldwide como
base de dados, mostrou mais de 500 pedidos de patentes relacionados à própolis, o que
evidencia um exponencial interesse pela própolis (European Patents Office, 2008). Esses
dados podem ser explicados, também, por um número maior e um maior aprofundamento nos
estudos relativos à própolis: sua composição química e atividade biológica.
No Brasil, o interesse pela própolis aconteceu somente na década de 80 com o trabalho
pioneiro de Ernesto Ulrich Breyer (1981), demonstrando em seu livro, ―Abelhas e saúde‖, as
propriedades terapêuticas da própolis e sua utilização como antibiótico natural (Lima, 2006).
COMPOSIÇÃO QUÍMICA: A composição química é bastante complexa e variada, estando

intimamente relacionada com a ecologia da flora de cada região visitada pelas abelhas ( Park
et al., 2002) e com o período de coleta da resina (Rocha et al., 2003). Além disso, a
variabilidade genética das abelhas rainhas também influencia na composição química (Park et
al, 1998). Deste modo, um número significativo de trabalhos com a química da própolis foi
publicado para entender que sua composição varia grandemente e depende da flora local e da
região de coleta (Bankova, 2005-a).
O melhor indicador da origem botânica da própolis é a análise da sua composição
química comparada com a provável fonte vegetal. A determinação da origem geográfica da
própolis e, principalmente, a origem vegetal, se faz importante no controle de qualidade e até
mesmo na padronização das amostras de própolis para uma efetiva aplicação terapêutica (Park
et al., 2002).
21
Alguns componentes estão presentes em todas as amostras de própolis, enquanto
outros ocorrem somente em própolis derivadas de espécies particulares de plantas ( Vargas et
al., 2004).
A composição química da própolis inclui flavonóides (como a galangina, quercetina,
pinocembrina e kaempferol), ácidos aromáticos e ésteres, aldeídos e cetonas, terpenóides e
fenilpropanóides (como os ácidos caféico e clorogênico), esteróides, aminoácidos,
polissacarídeos, hidrocarbonetos, ácidos graxos e vários outros compostos em pequenas
quantidades (Hu et al., 2005; Hayacibara et al., 2005; Ozkul et al., 2004; Matsuda et al., 2002;
Rocha et al., 2003). Há também na sua constituição elementos inorgânicos como o cobre,
manganês, ferro, cálcio, alumínio, vanádio e silício (Marcucci, 1996). De todos esses grupos
de compostos, certamente o que vem chamando mais atenção dos pesquisadores é o dos
flavonóides (Lima, 2006). A eles, bem como aos ácidos fenólicos, são atribuídas as
propriedades antibacteriana, antiviral e antioxidante (Volpi & Bergonzini, 2006).
Pelo menos 200 compostos foram identificados em diferentes amostras de própolis,
com mais de 100 em cada uma (Marcucci et al., 2001). Em 2000, doze tipos distintos de
própolis brasileira foram quimicamente caracterizados e classificados de tipo 1 a 12 por Park
et al. (Alencar et al., 2005; Hayacibara et al., 2005).
As amostras tropicais de própolis, especialmente as brasileiras, têm mostrado
diferenças significantes nas suas composições químicas em relação à própolis da zona
temperada. Por essa razão, a própolis brasileira têm se tornado objeto de grande interesse por
parte dos cientistas (Trusheva et al., 2006). A própolis verde brasileira, produzida em São
Paulo e Minas Gerais é constituída principalmente de derivados prenilados do ácido p-
cumárico e possui grande quantidade de flavonóides, muitos dos quais não estão presentes e m
própolis da Europa, América do Norte e Ásia (Simões et al., 2004).
As técnicas mais frequentemente utilizadas para a análise e determinação dos
constituintes químicos da própolis são a cromatografia gasosa acoplada a espectroscopia de
massa (CG-MS) e a cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (Bankova, 2005).
Recentemente, foi encontrada uma própolis vermelha em colméias localizadas ao longo do
litoral e costas de rios no nordeste brasileiro a qual foi classificada como própolis do grupo 13
(Daugsch et al, 2006). Foi observado que as abelhas coletavam o exudato vermelho da
superfície da Dalbergia ecastophyllum (L) Taub. (Donnelly et al, 1973; Matos et al, 1975),
sugerindo que essa é a origem botânica da própolis vermelha. Então analisou-se
comparativamente as amostras de exudatos das plantas e da própolis vermelha, mostrando que
22
o perfil cromatográfico da própolis é exatamente o mesmo da D. ecastophyllum (Daugsch et
al, 2006). Na figura abaixo apresentamos algumas das principais substâncias identificadas nos
mais recentes trabalhos de caracterização desse novo tipo de própolis.
Figura 1: Constituintes químicos da própolis vermelha do nordeste do Brasil
23
Algumas dessas moléculas apresentadas na figura 1 são encontradas apenas na
própolis vermelha do nordeste do Brasil diferenciando-a dos outros tipos já largamente
citadas na literatura. Acredita-se, dessa forma, que tais moléculas possam revelar atividades
biológicas ainda não conhecidas em outras amostras.
PROPRIEDADES BIOLÓGICAS: A própolis tem sido objeto de estudos farmacológicos
devido às suas propriedades antibacteriana, antifúngica, antiviral, antiinflamatória,
hepatoprotetora, antioxidante, antitumoral, imunomodulatória, etc. (Bankova, 2005-a; Kosalec
et al., 2005; Alencar et al., 2005). Esse potencial biológico se deve a um sinergismo que
ocorre entre os muitos constituintes (Marcucci, 1996).
Atividade antimicrobiana: As atividades antibacteriana e antifúngica da própolis têm sido as
propriedades biológicas mais intensamente estudadas (Kujungiev et al., 1999). São atribuídas
principalmente à flavonona pinocembrina, ao flavonol galagina e ao éster feniletil do ácido
caféico, com um mecanismo de ação baseado provavelmente na inibição do RNA-polimerase
bacteriano (Uzel et al., 2005). Outros componentes como os flavonóides, o ácido caféico,
ácido benzóico, ácido cinâmico, provavelmente agem na membrana ou parede celular do
microorganismo, causando danos funcionais e estruturais (Scazzocchio et al., 2005).
A própolis possui atividade antibacteriana maior contra bactérias Gram-positivas e limitada
contra Gram-negativas (Lu et al., 2005; Marcucci et al., 2001). Estudo realizado com
extratos de própolis comercializados no Brasil mostrou atividade antimicrobiana pronunciada
contra bactérias Gram-positivas, e atividade menos evidente contra Gram-negativos (Rezende
et al., 2006).
Até o momento, não se tem dados que respondam o porquê desta menor atividade dos
extratos de própolis contra bactérias Gram-negativas. Estas bactérias possuem uma parede
celular quimicamente mais complexa e um teor lipídico maior, o que pode explicar essa maior
resistência (Vargas et al., 2004).
A própolis também tem demonstrado excelentes atividades fungistática e fungicida,
em testes in vitro contra leveduras identificadas como causadores de onicomicoses (Oliveira
et al., 2006).
Diversos trabalhos tem relatado ao logo de vários anos de pesquisa a atividade
sinérgica da própolis associada a diversos antibióticos, inclusive contra cepas resistentes a
benzilpenicilina, tetraciclina e eritromicina (Shub et al, 1981), esses e outros autores
concluem que a própolis possui ação sinérgica relevante, podendo se constituir como
24
alternativa terapêutica contra a resistência microbiana, porem dependente de sua composição
(Stepanovic et al, 2003; Fernandes Jr. et al, 2005; Onlen et al, 2007).
Atividade antiinflamatória: A atividade antiinflamatória observada na própolis parece ser
devida à presença de flavonóides, especialmente galangina. Este flavonóide apresenta
atividade inibitória para a ciclooxigenase (COX) e lipooxigenase. Tem sido relatado também
que o ácido fenil éster caféico (CAPE), possui atividade antiinflamatória por inibir a liberação
de ácido aracdônico da membrana celular, suprimindo as atividades das enzimas COX-1 e
COX-2 (Borrelli et al., 2002).
A própolis tem demonstrado ação antiinflamatória também por inibir a síntese das
prostaglandinas, ativar a glândula timo, auxiliando o sistema imune pela promoção da
atividade fagocítica e estimulando a imunidade celular (Kosalec et al., 2005).
Atividade antioxidante: A atividade antioxidante merece especial interesse, pois a própolis
poderia ser aplicada topicamente com sucesso para prevenir e tratar a pele danificada
(Marquele et al., 2006).
Flavonóides são relatados como os mais abundantes e efetivos antioxidantes na
própolis. Existe uma correlação entre o alto conteúdo de flavonóides totais e a atividade anti -
radicais livres em extratos de própolis da Argentina (Ahn et al., 2007). Da Silva et al. (2006)
sugerem que os flavonóides desempenham importante papel na atividade antioxidante de
extratos de própolis brasileira, mas outros fatores poderiam estar envolvidos (Choi et al.,
2006). Embora estudos com extratos etanólicos de própolis sejam mais comuns, é relatado
que o extrato aquoso possui uma boa atividade antioxidante, associada ao alto teor de
compostos fenólicos (Mani et al., 2006).
Atividade antiviral: Não existem muitos relatos sobre a atividade antiviral da própolis.
Marcucci (1995) cita uma ação virucida da própolis nos vírus do herpes simplex (HSV) e da
estomatite vesicular (VSV). Em estudo realizado na Ucrânia, foi comparada a eficácia de
pomada de própolis canadense com pomadas de aciclovir e placebo (veículo) no tratamento
de pacientes com herpes genital tipo 2 recorrente. A preparação de própolis contendo
flavonóides apresentou-se mais efetiva que as outras duas na cicatrização das lesões e redução
dos sintomas locais (Vynograd et al., 2000).
Estudos in vitro sugerem que a própolis tem uma potente atividade antiviral contra as
variantes X4 e R5 do HIV-1. Atividade similar foi observada com linfócitos CD4 + operando,
pelo menos em parte, como inibidor da entrada viral (Gekker et al., 2005).
25
Atividade cicatrizante: A propriedade cicatrizante da própolis, assim como várias outras
propriedades biológicas, está relacionada com flavonóides e ácidos fenólicos (Arvouet-Grand
et al., 1994). Em estudo comparado da propriedade cicatrizante de um creme de própolis com
um de sulfadiazina de prata, foi demonstrado que os ferimentos tratados com própolis
apresentaram menos inflamação e mais rápida cicatrização do que aqueles tratados com
sulfadizina de prata (Gregory et al., 2002).
Atividade imunomodulatória: Sy et al. (2006) demonstraram que o tratamento com extrato
de própolis atenua as inflamações das vias aéreas em ratos, provavelmente por sua habilidade
em modular a produção de citocina. Sendo assim, seria um novo agente no tratamento da
asma. Orsolic et al. (2004) demonstraram que derivados hidrossolúveis de própolis, ácido
caféico, éster feniletil do ácido caféico e quercetina poderiam ser extremamente úteis no
controle do crescimento tumoral em modelos experimentais. Nos últimos anos muitos estudos
tem demonstrado a atividade da própolis no sistema imunológico (ativando macrófagos,
aumentando a atividade lítica contra células tumorais, estimulando anticorpos, etc) como
apresentado numa extensa revisão realizada por Sforcin (2007), todavia, cita que os
mecanismos envolvidos na quimioprevenção ainda não são completamente conhecidos.
Outras propriedades: Há relatos de que a própolis baixa a pressão arterial e os níveis de
colesterol no sangue. (Capasso & Castaldo, 2002). Em muitos países, a própolis e o mel são
usados para o tratamento de infecções das vias aéreas (Tavares et al., 2006).
Como antiprotozoário, a própolis mostrou-se ativa contra Toxoplasma gondii,
Trichomonas spp. e Giardia lamblia (Dantas et al., 2006). Testes in vitro com extratos de
própolis foram realizados contra Trypanosoma cruzi e mostraram atividade contra as formas
epimastigotas desse parasita, sendo uma possível alternativa para o tratamento da Doença de
Chagas (Prytzyk et al., 2003). Giorgio et al (2006) estudaram a atividade da própolis brasileira
no tratamento da leishimaniose observando ser eficaz em culturas de macrófagos infectados,
baseado nesse e em outros estudos requisitaram patente para um método de tratamento para
leishimania com própolis brasileira. Mais tarde outros estudos realizados com própolis
vermelha, oriunda do nordeste do Brasil, mostrou ser ativo contra leishimania sem ser tóxico
para os macrófagos (Ayres, 2007).
A própolis também tem sido bastante utilizada em odontologia, estando presente em
enxagüatórios bucais e cremes dentais para prevenir cáries e tratar gengivites e estomatites
(Pietta et al., 2002). Em experimentos na área de Endodontia, Cariologia, Cirurgia Oral,
Periodontia e Patologia Oral, teve uma atuação positiva na reorganização tecidual, ação
26
antiinflamatória e antibacteriana (Manara et al., 1999). Recentemente, foi publicada uma
patente sobre a própolis intitulada ―Composição bucal de uso tópico, exaguatório bucal,
solução bucal e dentrifício, bem como o uso da referida composição‖ reivindicando o uso no
combate à formação de placa bacteriana dental prevenindo e/ou controlando a gengivite,
problemas periodontais e/ou as cáries, infecções causadas por diferentes etiologias, sem os
inconvenientes do manchamento intenso dentário provocado pelo uso contínuo da clorexidina
(D’Oliveira, 2007).
PANORAMA ATUAL: A própolis é usada em várias partes do mundo onde é indicada para
melhorar a saúde e prevenir doenças como inflamação, doenças do coração, diabetes e câncer.
(Kadota et al., 2002) Problemas tratados com própolis incluem mau hálito (halitose), eczema,
infecções na garganta, úlceras e infecções urinárias. (Pereira et al., 2002).
Atualmente, a própolis é usada como um remédio popular e está disponível na forma

de cápsulas, como extrato (hidroalcoólico ou glicólico), como enxaguatório bucal, na forma
de pó, entre outras (Capasso & Castaldo, 2002). Também é empregada em cosméticos e na
indústria alimentícia na forma de alimentos funcionais (Alencar et al., 2005; Sforcin et al.,
2000).
Em busca recentemente realizada na internet foi constatado a existência de
aproximadamente noventa produtos a base de própolis (dentre eles cápsulas, condicionador,
xampu, sabonete, dentrifício, batom, bala, chá, protetor solar, gel pós barba, creme, pomada,
etc) disponíveis no mercado brasileiro.
A maioria dos produtos à base de própolis comercializados no Brasil possuem registro
no Ministério da Agricultura, que preconiza os limites para fixação de identidade e qualidade
da própolis na Instrução Normativa nº 3, de 19 de janeiro de 2001 (Brasil, 2001). Os produtos
que contêm própolis e que apresentem indicações terapêuticas podem ser registrados como
medicamentos específicos segundo a Resolução-RDC nº 132, de 29 de maio de 2003, D.O.U.
de 02/10/2003, sendo classificados como opoterápicos (Brasil, 2003). A comprovação de
segurança e eficácia segue a nota técnica da Câmara Técnica de Medicamentos Fitoterápicos
(CATEF, 2005).
O consumo de própolis no mundo é estimado em cerca de 700-800 toneladas / ano (Da
Silva et al., 2005). Faltam estatísticas oficiais sobre o volume de própolis produzido
anualmente no Brasil, o que é exportado e o que é consumido pelo mercado interno. Existem
apenas avaliações de produtores e exportadores que situam a produção brasileira entre 49 e
150 toneladas anuais. O cálculo de 150 toneladas pode estar superestimado, mas é mais
27
realista. O consenso é que o Brasil é o segundo maior produtor mundial, logo atrás da China
(Lima, 2006).
Nas últimas décadas, foi observado um aumento, em todo o mundo, no uso de
produtos naturais (Hayacibara et al., 2005). Entretanto, apesar desse aumento e do fato de
existir uma considerável quantidade de informações disponíveis no que concerne aos aspectos
químicos e biológicos da própolis, sua aplicação terapêutica ainda pode ser considerada
incipiente (Funari & Ferro, 2006).
Atualmente, inúmeros trabalhos demonstram as atividades biológicas da própolis bem
como suas aplicações terapêuticas. Essas virtudes conduzem a própolis a um verdadeiro
modismo. Porém, é preciso estabelecer alguns pontos importantes. Apesar de ser aceita por
órgãos reguladores como produto com finalidade terapêutica, a própolis precisa ser
padronizada quimicamente para garantir sua qualidade, eficácia e segurança. O que não é
fácil, pois, como já foi visto vários fatores podem interferir na sua composição química.
Também são necessários estudos que relacionem a composição química com a atividade
biológica, pois assim seria possível correlacionar o tipo de própolis com a sua aplicação
terapêutica. Isso é uma tarefa imprescindível para um mercado cada vez maior e mais
exigente em todo o mundo.
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32
2.2. ARTIGO II: AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS E
ASPECTOS LEGAIS DE EXTRATOS DE PRÓPOLIS COMERCIALIZADOS NO
MERCADO BRASILEIRO
Artigo publicado na Revista Brasileira de Farmácia (v.89, p.59-63, 2008)
Resumo: O presente trabalho teve como objetivo a avaliação, tanto dos aspectos legais como
físico-químicos de extratos de própolis comercializados no mercado brasileiro. O estudo teve
como base para a realização das análises, as legislações vigentes, além de informações que os
autores julgaram imprescindíveis para um produto ter qualidade adequada ao uso. Os
resultados mostraram quanto ao aspecto legal, que diversos produtos analisados não traziam
as informações necessárias. Quanto aos aspectos físico-químicos algumas amostras foram
reprovadas nos testes de flavonóides totais e resíduo seco. Pode-se concluir que há uma falta
de padronização das informações disponibilizadas ao consumidor, além da omissão de
informações de grande importância para a utilização correta dos produtos e da indução por
parte dos fabricantes à utilização destes produtos para fins medicinais, sem a comprovação da
eficácia e segurança.
Palavras-Chave: Padronização, Controle de Qualidade, Própolis, Extrato Fluído.
Abstract: The present work aimed the evaluation of the legal aspects as the physical -
chemistry properties of propolis extracts commercialized in the Brazilian market. The study
had for the analyses accomplishment the current legislation, beyond information that the
authors had judged essential for a product have adequate quality to the use. The results had
shown for the legal aspects that the analyzed products didn't present the necessary
information, and for the physical-chemistry properties some samples had been disapproved in
the tests of total flavonoids and dry residue. It can be concluded that there is a lack of
standardization of the information made available the consumer, besides the omission of
information of great importance for the correct use of the products and of the induction by the
manufacturers to the use of these products as medicines, without the proof of the effectiveness
and safety.
Keywords: Standardization, Quality Control, Propolis, Fluid Extract.
1. INTRODUÇÃO
Atualmente o Brasil ocupa uma posição de destaque entre os maiores produtores
mundiais de própolis, entretanto, não existem estatísticas confiáveis sobre a produção
mundial. Segundo dados publicados pelo Serviço Brasileiro de Apoio às Micro e Pequenas
Empresas - SEBRAE (2007) os maiores produtores no mundo são China, Brasil, Estados
Unidos da América (EUA), Austrália e Uruguai, contudo dados divulgados pelo Banco
Nacional de Desenvolvimento Econômico e Social - BNDS (2007) apresentam o Brasil como
33
terceiro produtor mundial, sendo superado pela China e Rússia, respectivamente. Todos os
estados brasileiros praticam a criação de abelhas de forma racional, em maior ou menor
proporção, dada à expansão do número de enxames nativos e de apiários, apoiada na grande
quantidade e variedade da flora apícola brasileira. Soma-se a esse processo, o aparecimento de
diversas empresas especializadas na venda de insumos e acessórios para criação de abelhas,
além da criação de diversas linhas de pesquisa sobre o tema, nos vários centros de pesquisa
espalhados pelo País (SEBRAE, 2007).
O interesse pela utilização da própolis para fins medicinais remonta do seu uso
popular a 300 a.C. (PARK et al., 2005). Do ponto de vista etnofarmacológico, a própolis é um
dos poucos medicamentos de fonte natural que vem sendo utilizado por um longo período de
tempo por diferentes civilizações (CASTALDO & CAPASSO, 2002).
A popularização desse produto, sobretudo devido às suas propriedades antimicrobiana

(BOYANOVA et al., 2005), antiinflamatória (NAGAOKA et al., 2003), imunoestimulante
(SFORCIN et al., 2005), antioxidante (MORENO et al., 2000), antineoplásica (WENG et al.,
2005) dentre outras atividades, levou a produção e comercialização de inúmeras marcas em
nosso País, sobretudo na forma de extrato. A composição química da própolis é determinada
principalmente pelas características fitogeográficas existentes ao redor da colméia
(KUMAZAWA et al., 2004) e também de forma sazonal (SFORCIN et al., 2000) e/ou por
diferentes raças de abelhas (SILICI & KUTLUCA, 2005).
Devido à sua extensão territorial continental e ao clima tropical, é grande a diversidade
da própolis produzida no Brasil, divididas por PARK et al. (2005) em 13 grupos sendo a mais
estudada a própolis verde originária da Baccharis dracunculifolia e a mais recentemente
classificada, a própolis vermelha, oriunda da Dalbergia ecastophyllum.
Este trabalho tem por objetivo analisar amostras de extratos de própolis encontradas
no mercado brasileiro quanto à adequação, à legislação vigente e à qualidade físico-química
destes produtos, visando uma discussão sobre a padronização de um produto amplamente
difundido no mercado brasileiro sem, no entanto, um real conhecimento da população sobre
as suas peculiaridades.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Materiais
Na cidade de Recife- PE, adquiriu-se no mercado varejista de farmácias comerciais, 8
amostras de preparações de extrato fluído de própolis vastamente comercializadas, sendo
34
estes extratos não-alcoólicos, alcoólicos e hidroalcoólicos com concentrações de própolis
declaradas nos rótulos de 11 a 25%, produtos estes produzidos em Minas Gerais (02), Ceará
(01), São Paulo (02) e Paraná (03). Todas as amostras apresentavam o carimbo do Serviço de
Inspeção Federal – SIF, estando sob supervisão sanitária do Ministério da Agricultura.
2.2 Métodos
As questões legais, como o registro do produto e da empresa, rotulagem e adequação
da embalagem segundo a legislação vigente RDC 360 (BRASIL, 2003a) e RE 08 (BRASIL,
2001a) foram avaliadas, bem como, as características organolépticas e parâmetros físico-
químicos do produto extrato fluído de própolis de acordo com o Ministério da Agricultura
(BRASIL, 2001b).
2.2.1 Características Organolépticas
As características organolépticas foram avaliadas quanto ao aroma (resinoso ou

balsâmico), cor (âmbar, avermelhada ou esverdeada), sabor (suave, forte, amargo e/ou
picante) e aspecto (límpido, turvo, homogênio e heterogênio). Estes parâmetros foram
analisados por cinco especialistas na área.
2.2.2 Análise da embalagem
A análise das embalagens primária e secundária, rotulagem e panfletos informativos,

quando disponibilizados com o produto, foi procedida por meio de uma criteriosa seleção de
informações exigidas legalmente (BRASIL, 2001-a, 2001-b, 2003-a) e informações
necessárias ao paciente para um uso correto do produto, conforme as Tabelas 1 e 2.
2.2.3 Teor de Flavonóides Totais
Foi realizado segundo a metodologia de FUNARI & FERRO (2006). Os resultados

foram expressos em porcentagem de quercetina.
2.2.4 Propriedade Antioxidante
Foi realizado segundo a Instrução Normativa nº 3 - Anexo VII (BRASIL, 2001b). Os
resultados foram expressos em segundos e realizados em triplicata.
2.2.5 Resíduo Seco
O resíduo seco seguiu a FARMACOPÉIA BRASILEIRA IV (1998).
2.2.6 Cromatografia em Camada Delgada – CCD
Alíquotas de 10 µL de cada uma das amostras foram submetidas à cromatografia em
camada delgada (cromatoplacas de gel de sílica Merck-Alemanha). Para identificação dos
polifenois, empregou-se o sistema: A [AcOEt-HCOOH-AcOH-H2O (100:11:11:27 v/v)] para
35
os glicosídeos e B [AcOEt-HCOOH-AcOH-H 2O (100:3,0:3,0:3,0 v/v)] para as agliconas.
Estas foram co-cromatografadas com quercetina. Todos estes polifenóis foram revelados com
o reagente de Neu (difenilboriloxietilamina) e observados à luz ultra-violeta (366 nm),
segundo a metodologia de Wagner 1996.
2.2.7 Espectro de varredura (200-400 nm)
A varredura foi realizada na faixa de 200-400 nm no espectrofotômetro Vankel®,
modelo UV-VIS Cary 50. De cada amostra foi retirada uma alíquota a fim de se obter uma
concentração final de 0,8 µg/mL utilizando etanol como solvente.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após a análise das oito amostras comerciais selecionadas observou-se que não há
informações impressas nas embalagens sobre a aplicabilidade do produto, ou seja, sua
indicação de uso. No entanto 5 destes produtos continham panfletos informativos dentro da
embalagem secundária. Este panfleto é constituído de uma revisão bibliográfica sobre a
própolis e sua atividade terapêutica, indicando as suas principais atividades farmacológicas.
Estes produtos são registrados no Ministério da Agricultura e sua comercialização deveria ser
feita de acordo com suas propriedades nutricionais e não medicinais.
Devido à demanda pelo registro de produtos com indicações terapêuticas contendo,
como substância ativa a própolis, isolada ou associada, a Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA) classificou os produtos contendo própolis como um medicamento
opoterápico. Estes são medicamentos de origem animal, a base de vitaminas e/ou minerais
e/ou aminoácidos, isoladas ou associadas entre si, com, pelo menos, um dos componentes
acima dos limites nutricionais estabelecidos pela Portaria n° 33 (BRASIL, 1998),
posteriormente revogada pela Resolução RDC nº 269 (BRASIL, 2005).
Os requisitos do registro destes produtos estão definidos na RDC nº 132 (BRASIL,
2003-b) e a comprovação de segurança e eficácia deve ser apresentada por meio de um
relatório de ensaios clínicos para comprovar a eficácia terapêutica ou dados de literatura que
comprovem eficácia e segurança através de estudos clínicos publicados em revistas
indexadas. A Câmara Técnica de Medicamentos Fitoterápicos – CATEF, publicou uma nota
técnica sobre o registro de produtos contendo própolis que detalha a comercialização de
produtos à base de própolis com indicações terapêuticas, além dos requisitos mínimos de
qualidade para tais produtos (ANVISA, 2007).
36
Pode-se afirmar que os fornecedores dos produtos analisados, que continham um
panfleto informativo sugerindo a sua utilização para fins medicinais baseian-se no amplo
conhecimento das atividades terapêuticas da própolis para vender seus produtos sem ao
menos informar ao consumidor a sua finalidade real. Para aqueles que contem tais panfletos
informativos, pode-se afirmar que os produtores indiretamente divulgam apresentarem
propriedades terapêuticas e não informa qual é a posologia adequada e a comprovação clínica
de eficácia e segurança do seu produto para cada atividade descrita.
Como todaas as apresentações comerciais analisadas estavam sob registro no
Ministério da Agricultura, estas foram avaliados pelas devidas resoluções. A Resolução RDC
n° 360 (BRASIL, 2003-a), obriga a divulgação da informação nutricional para produtos
alimentícios, porém 4 das 8 amostras analisadas apresentaram tais informações descritas na
embalagem secundária, sendo que destas amostras, duas apresentaram tais dados na forma de
tabela e as outras duas amostras citaram que não continha quantidades significativas dos
elementos avaliados, demonstrando a falta de fiscalização das informações impressas nas
embalagens, além da falta de padronização das informações contidas nestas (Tabela 1).
O item 9 (Rotulagem) da Instrução Normativa nº 3 - Anexo VII (BRASIL, 2001-b)
exige a seguinte informação adicional: ―Extrato Seco: mínimo de .....%.‖ Pode-se constatar
que apenas a Amostra 6 (12,5% do total de amostras) continha tal informação, as amostras A4
e A8 (15% do total de amostras) não especificaram o percentual de extrato seco de própolis e
as amostras A1, A2, A3, A5 e A7 (62,5% do total de amostras) continham a informação do
valor utilizado, porém em frases não padronizadas e incompletas, uma vez que muitas vezes
não se sabe se este valor corresponde ao extrato seco, extrato líquido, própolis in natura, entre
outros (Tabela 2).
O preço dos produtos variou de R$ 6,40 para a amostra do Ceará a R$ 12,70 para
amostra de São Paulo. Apenas a amostra A2 especificou o tipo de própolis utilizada. Cinco
amostras especificaram o tipo de solução extrativa utilizada, dentre estas, quatro alcoólicas
(A2, A5, A6 e A7) e uma hidroalcoólica (A8), a amostra A3 informa ser um extrato não
alcoólico, porém não descreve qual solução extrativa (Tabela 1).
As amostras A1, A3 e A5 descreveram em sua embalagem secundária a posologia do
produto, no entanto estas amostras continham um panfleto informativo no interior da
embalagem, e a posologia descrita no panfleto não condizia com a descrita na embalagem.
As características organolépticas e os resultados de teor de flavonóides totais,
propriedade antioxidante e resíduo seco estão apresentados na Tabela 3.
37
Para o teor de flavonóides, das oito amostras analisadas, apenas a A7 e A8
apresentaram teor abaixo do exigido (0,25%). Já, para o teste de propriedade antioxidante
todas ficaram dentro do tempo estabelecido de até 22 segundos. No ensaio de resíduo seco o
percentual mínimo permitido é de 11 % apenas as A4, A7 e A8 ficaram abaixo deste limite e a
A3 não foi possível quantificar, devido à constituição do extrato.
Foi realizado também o perfil fitoquímico das amostras de própolis, teste este também
não exigido oficialmente para tal tipo de produto alimentício, mas como a cromatografia em
camada delgada requer apenas cromatoplacas, esta metodologia demonstra ser útil para testar
estas amostras sendo também uma metodologia útil no rápido controle de qualidade da
própolis (ACKERMANN, 1991). As amostras analisadas estão representadas na figura 1. O
ensaio fitoquímico evidenciou a presença de polifenóis, possivelmente flavonóides, dada a
comparação com a quercetina. Foi detectada a presença de quercetina em todas as amostras
com exceção da A3, onde não foi possível realizar a CCD.
Não foram observadas variações no perfil cromatográfico entre as amostras.
Entretanto, em relação à quantidade de flavonóides totais, foi evidenciado através da
metodologia de complexação com o cloreto de alumínio que a amostras A7 e A8 ficaram
abaixo do mínimo permitido.
De acordo com a literatura (AGRAVAL, 1989), nos espectros dos flavonóides
observam-se bandas de absorção na região do ultravioleta com máximos entre 240-285nm
(banda II referente a absorção do anel A) e entre 300-350nm (banda I referente a absorção do
anel B). O espectro de varredura na região de 200-400nm mostrou absorções características
de flavonóides. No entanto ocorreu uma sobreposição de bandas dificultando a visualização
da banda II. De acordo com os resultados apresentados no gráfico da varredura (figura 2),
definido como fator de análise de extratos de própolis onde ―devem apresentar picos
característicos de flavanóides entre 200 e 400nm‖ (BRASIL, 2001-b) podemos observar uma
certa homogeneidade nos perfis das amostras A1 a A6 e um perfil menos intenso, porém
característicos, para as amostras A7 e A8. Estes dados corroboram com os teores de
flavonóides encontrados (tabela 3) onde, as amostras A7 e A8 (0,04 e 0,18%) estão abaixo do
limite mínimo exigido (0,25%).
4. CONCLUSÕES
Após a avaliação das 8 amostras de extrato de própolis comercializadas no mercado
brasileiro e distribuídas nas farmácias e drogarias da cidade Recife, tem-se que os produtos
38
avaliados carecem de uma uniformização, que vai desde as informações disponibilizadas nas
embalagens à qualidade do conteúdo dos produtos.
Pode-se concluir que há uma falta de padronização das informações disponibilizadas

ao consumidor, além da omissão de informações de grande importância para a utilização
correta do produto e da indução por parte dos fabricantes a utilização destes produtos para fins
medicinais, sem a comprovação da eficácia e segurança do produto.
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40
Tabela 1: Informações Gerais das Amostras Analisadas
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
Amostra
São Paulo São Paulo São Paulo Minas São Paulo São Paulo Minas Gerais Ceará
Estado
Gerais
Preço (R$) 9,55 12,70 10,60 6,50 10,81 9,70 7,39 6,40
Volume 30 30 30 30 30 30 30 30
(mL)
Ingredientes Extrato das Extrato de própolis Extrato de Extrato de Própolis e Própolis e Própolis in Própolis e
melhores com álcool neutro própolis Própolis álcool de etanol natura e álcool solvente
própolis grau alimentício sem álcool cereais hidratado de cereais hidroalcóolico
Tipo de NE Própolis Verde NE NE NE NE NE NE
Própolis originária da
Baccharia
dracunculifolia
Tipo do NE Alcoólico NE NE Alcoólico Alcoólico Alcoólico Hidroalcoólico
Extrato
Informações E - Emb 2 E - Emb 2 NE E - Emb 2 E - Emb 2 NE NE NE
Nutricionais
41
Emb 2 A A A A A A A NA
Lacre de Segurança NA NA NA NA NA A A --
Emb 2
Lacre de Segurança A A A A A A A A
Emb 1
Posologia descrita Emb 30 gts NE 30 gts NE 20 a 40 gts NE NE NE
2 1 a 3 x ao 1 a 3 x ao dia
dia
Porcentagem de Substâncias Sólidos Substâncias Própolis Estrato Seco Estrato Seco Própolis in --
própolis descrita Emb 2 Ativas 11% solúveis 11% Ativas 12% 20% min. de 12% min. de 11 natura 12,5%
Porcentagem de Substâncias Sólidos Substâncias Própolis NE Estrato Seco Própolis in NE
Própolis Emb 1 Ativas 11% solúveis 11% Ativas 12% 20% min. de 11% natura 12,5%
N° do Registro no M.A. E E E E E E E E
Emb 1/2
SAC E E E E E E E E
Site E E E E E E NE NE
Lote – Emb 1/2 E E E E E Emb 2 E E
Prazo de Validade Emb E E E E E Emb 2 E E

1/2
Prazo de Validade 2 anos 2 anos 3 anos 2 anos 2 anos NE 4 anos 2 anos
42
2007 a 2006 a 2008 2007 a 2010 2006 a 2007 a 2009 Validade: 2006 a 2010 2007 a
2009 2008 2009 2009
Panfleto Informat. A A A NA A A NA NA
Responsável Téc. NE NE NE NE CRQ NE CRQ (Emb NE

(Panfleto) 1/2)
Legenda: A. Apresenta; NA. Não Apresenta; -- Não Aplicável; NE. Não Especificado; E. Especificado; Emb. 1. Embalagem Primária; Emb. 2.
Embalagem Secundária; Emb 1/2. Embalagem Primária e Secundária; Gts. Gotas; M.A. Ministério da Agricultura; Min. Mínimo.
43
Tabela 2: Características Organolépticas e Físico Químicas dos Extratos de
Própolis
A 01 A 02 A 03 A 04 A 05 A 06 A 07 A 08
Resinoso * * * * * *
AROMA
Balsâmico * *
Âmbar * * * * *
COR Avermelhada
Características Organolépticas
Esverdeada * * *
Suave *
Forte * * * * * * *
SABOR
Amargo * * * * * * * *
Picante * * * * * * * *
Límpido * * * * * * * *
Turvo
ASPECTO
Homogêneo * * * * * * * *
Heterogêneo
Flavonóides (%) 0,50 0,58 0,48 0,31 0,47 0,32 0,04 0,18
Parâmetros Propriedade Antioxidante
Físico- (‖) < 22 < 22 < 22 < 22 < 22 < 22 < 22 < 22
Químicos
Resíduo Seco (%)
11,27 13,10 -- 8,06 14,73 11,00 6,79 5,16
44
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
Figura 1: Cromatografia em camada delgada das amostras de propolis

reveladas com NEU e observadas na luz ultra-violeta a 366 nm
1,0
A 01
A 02
A 03
0,8
A 04
A 05
A 06
0,6
A 07
A 08
Abs
0,4
0,2
0,0
200 250 300 350 400
nm
Figura 2: Varredura Espectrofotométrica dos Extratos de Própolis Analisados
45
3. OBJETIVOS
46
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Realizar a caracterização da própolis vermelha e avaliar sua atividade biológica.
3.2 Específicos
 Avaliar as características químicas e fisico-quimicas da própolis vermelha de acordo

com a Instrução Normativa nº 3, de 19 de janeiro de 2003, do Ministério da
Agricultura;
 Determinar a toxicidade em Artemia salina Leach;
 Avaliar as variações sazonais dessas características;
 Avaliar a atividade biológica da própolis vermelha in vitro e in vivo
 Atividade antioxidante em radical DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil);
 Atividade antioxidante em Sacaromices cerevisae mutadas;
 Atividade antigenotóxica em medula óssea e sangue periférico de
camundongos;
 Antimicrobiano em Candida sp. e antiinflamatória em edema de pata de rato
e edema de orelha em camundongo.
 Proposta de um gel vaginal mucoadesivo contendo extrato de própolis
47
4. CARACTERIZAÇÃO DA PRÓPOLIS
48
4.1. ARTIGO III: PRÓPOLIS VERMELHA DO LITORAL DE PERNAMBUCO-
BRASIL: AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA SAZONAL NA CONSTITUIÇÃO
QUÍMICA
Artigo submetido à revista Ciência e Tecnologia de Alime ntos
RESUMO:
Diversas composições químicas de própolis são relatadas para diferentes amostras
coletadas por todo o país. Porém, ainda há poucos estudos quanto à própolis vermelha.
As amostras de própolis vermelha de Goiana, Pernambuco, Brasil, foram padronizadas
seguindo as exigências do Ministério da Agricultura. A influência sazonal dos meses de
Fevereiro, Junho e Outubro de 2006 foi avaliada e o método de doseamento de
flavonóides foi validado. Todas as amostras coletadas apresentaram boa qualidade, com
destaque para a amostra de outubro, que apresentou elevada concentração de
flavonóides e fenóis totais, e menor teor de cera. O método foi linear, exato e preciso.
Palavras-chave: Sazonalidade, padronização, flavonóides
BRAZILIAN RED PROPOLIS OF PERNAMBUCO COAST: EVALUATION OF

SEASON VARIATION IN CHEMICAL COMPOSITION
ABSTRACT:
Diverse chemical compositions of propolis are descriebed for different samples
collected for all the country. However, it has few studies in relation to the propolis red.
Sample of red propolis colleted from Goiana, Pernambuco, Brazil, was standardized
following the requirements of identity and quality of the Ministery of Agriculture. The
seasonal influence of the months February, June and October 2006 was avaliated and
flavonoids assay method was validated. It was observed that all the samples collected
showed good quality, with prominence to the sample collected in October that was
found to have a high concentration of flavonoids and total phenols, and less wax
content. The method was linear, accurate and precise.
Keywords: Seasonal evaluation, standardization, flavonoids
INTRODUÇÃO
O homem tem utilizado muitos produtos naturais ao longo da história. Dentre
eles, destaca-se a própolis, um material resinoso produzido pelas abelhas e que é
empregado na construção e reparo das colméias (PEREIRA, SEIXAS e AQUINO,
2002; SANTOS et al, 2002).
A composição básica da própolis é 55% de resinas e bálsamos, 30% de ceras,
10% de óleos essenciais e 5% de pólen e, em diferentes amostras, já foram identificados
mais de 300 constituintes (CUNHA et al, 2004; SILICI e KUTLUCA, 2005), dentre
49
eles podemos citar ácidos graxos e fenólicos, flavonóides (flavonas, flavanonas,
flavonóis), terpenos, β-esteróides, álcoois e aldeídos aromáticos, sesquiterpenos, entre
outros (MARCUCCI et al, 2001). A proporção dessas substâncias varia e depende do
local e da época da coleta (DA SILVA et al, 2005) e a elas, especialmente aos
flavonóides, são atribuídas algumas propriedades farmacológicas da própolis, como
cicatrizante (ARVOUET-GRAND et al, 1994), antioxidante (AHN et al, 2007),
antiinflamatória (BORRELLI et al, 2002), antimicrobiana (SCAZZOCCHIO et al,
2005), entre outras.
No entanto, para ser utilizada na terapêutica, a própolis deve ser padronizada
quimicamente e os procedimentos analíticos de controle químico e microbiológico
adotados devem ser descritos e validados, o que irá garantir sua qualidade, segurança e
eficácia (WOISKY e SALATINO, 1998 ; BANKOVA, 2005). A validação, como parte
integrante da qualidade, tem por objetivo garantir, por meio de estudos experimentais,
que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando confiabilidade
aos resultados (PARK et al, 2002).
No Brasil, são descritas propriedades biológicas e composição química distintas
para diferentes amostras coletadas em diferentes partes do país. Essa variação é
facilmente explicada pela grande biodiversidade brasileira (PEREIRA, SEIXAS e
AQUINO, 2002). Com relação à variação sazonal, a diminuição em alguns
componentes biologicamente ativos, como no caso dos compostos fenólicos, é
acompanhada pelo aumento de outros, por exemplo ácidos diterpênicos. Deste modo,
pode-se esperar que algumas atividades biológicas, relacionadas a estes compostos
(antibacteriana, antifúngica), sejam similares em diferentes estações do ano
(BANKOVA et al, 1998).
Park e colaboradores classificaram a própolis brasileira em 12 tipos de acordo
com a região geográfica de origem, composição química e vegetação de onde foi
extraída (PARK et al, 1998) a própolis vermelha, a qual é encontrada, sobretudo, nas
áreas litorâneas das regiões norte e nordeste, ainda é pouco estudada. Silva e
colaboradores relatam pela primeira vez a origem botânica da própolis vermelha como
sendo a Dalbergia ecastophyllum (L.) (Legumonisae) e classificaram a própolis
vermelha como o 13 tipo de própolis complementando os 12 tipos propostos por Park
(PARK et al, 2000).
O presente trabalho teve por objetivo padronizar o extrato da própolis vermelha
de Pernambuco, utilizando como parâmetro as especificações estabelecidas no
50
Regulamento de Identidade e Qualidade de Extrato de Própolis, do Ministério da
Agricultura, Brasil (BRASIL, 2001); avaliar as possíveis variações devido à
sazonalidade e validar o método de doseamento para flavonóides totais.
MATERIAL E MÉTODOS
Materiais
Reagentes e Padrões de Trabalho
Os reagentes utilizados foram álcool etílico absoluto (Cinética ® e Nuclear®,

Brasil), éter de petróleo, acetato de etila, ácido fórmico, ácido acético, benzeno, acetona,
tolueno, éter, butanol (todos da Vetec ®, Brasil). Os padrões primários foram quercetina
Dihidratada 98% (Sigma®, Alemanha, L. 39H0598), Ácido tânico (Merck®, Alemanha,
31761, USP). Cr, Zn, Co, Cd, Cu e Ni (Fluka® Chemie GmbH, Suiça), Mn e Pb (Sigma-
Aldrich®, USA). Todos os reagentes foram de grau analítico.
Própolis
Para o estudo, foram utilizadas amostras de própolis vermelha de apiário da

região de Goiana, PE, Brasil, (S: 7º 33’ 38’’ W: 35º 0’ 9’’) coletadas nos meses de
fevereiro, junho e outubro de 2006. Foram preparados extratos etanólicos de própolis
(EEP) a 20% (m/v), das três amostras coletadas, por maceração durante 48 h, e m
soluções hidroalcoólicas a 70, 80 e 90% Após esse tempo, os extratos foram filtrados e
acondicionados em frasco de vidro âmbar (PARK et al, 1998).
Métodos
Perfil fitoquímico através da Cromatografia em Camada Delgada (CCD):

Alíquotas de 5 µL dos EEP a 70, 80 e 90%, dos três meses de coleta (fevereiro, junho e
outubro) e da resina da Dalbergia ecastophyllum (L.) Taub, o material testemunho foi
depositado no Herbário Dárdano de Andrade Lima do Instituto Pernambucano de
Pesquisa Agropecuária (IPA –73438), foram submetidas à CCD (cromatoplacas de gel
de sílica Merck-Alemanha), empregando-se diversas fases móveis e reveladores
adequados (RANDAU et al, 2004) de acordo com o grupo de metabólitos secundários:
Alcaloides, Mono e sesquiterpenos, Iridóides, Saponinas, Cumarinas e
Fenilpropanoglicosídeos (WAGNER e BLADT, 1996), Triterpenóides e Esteróides
(HARBONE, 1998), Açúcares redutores (METZ, 1961), Derivados cinâmicos e
51
Flavonóides (NEU, 1956; HARBONE, 1998), Proantocianidinas condensadas e
Leucoantocianidinas (ROBERTS, CARTWRIGHT e OLDSCHOOL, 1957).
Características Organolépticas: Foram avaliadas as características de aroma, cor e

sabor segundo a Farmacopéia Brasileira IV (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 1998).
Perda por Dessecação: Determinada por termogravimetria segundo a Farmacopéia

Brasileira IV (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 1998). Esta análise foi realizada em
triplicata e os resultados expressos em porcentagem (% p/p).
Teor de Cinzas: Método utilizado segundo a Farmacopéia Brasileira IV

(FARMACOPEIA BRASILEIRA, 1998) e realizada em triplicata. Os resultados fora m
expressos em porcentagem.
Teor de Cera: Pesou-se 1,0 g de própolis e colocou-se em erlenmeyers previamente

tarados. Submeteu-se à extração com três frações de 10 mL de éter de petróleo, sob
aquecimento. A própolis foi desprezada e a fração etérea evaporada. Os erl enmeyers
foram pesados e o teor de ceras calculado pela diferença entre o peso final e inicial. A
análise foi realizada em triplicada e expressa em porcentagem de ceras (BRASIL,
2001).
Resíduo Insolúvel em Etanol: Pesou-se 1,0 g de própolis e submeteu-se à extração

com três frações de 30 mL de etanol, filtrando após cada extração, utilizando papel de
filtro previamente tarado. Desprezou-se a fração etanólica e secou-se o resíduo e m
estufa a 105º por 10 minutos. O teor de resíduo foi calculado pela diferença entre o peso
final e inicial. A análise foi realizada em duplicata e expressa em porcentagem de
resíduo insolúvel em etanol, segundo a Farmacopéia Brasileira IV (FARMACOPEIA
BRASILEIRA, 1998).
Propriedade Antioxidante: Foi realizado segundo a Instrução Normativa nº 3 - Anexo

VII (BRASIL, 2001). Os resultados foram expressos em segundos e realizados e m
triplicata.
Espectro de varredura (200-400 nm): A varredura foi realizada na faixa de 200-400

nm no espectrofotômetro Varian® modelo UV-VIS Cary 50 , onde a própolis deverá
apresentar picos característicos das principais classes de flavonóides. De cada amostra
foi retirada uma alíquota a fim de se obter uma concentração final de 1,0 µg/mL
utilizando etanol como solvente.
52
Determinação de Metais Pesados: Pesou-se aproximadamente 1,0 g de própolis bruta
(in natura) fez-se a digestão por 10 mL de HNO3 concentrado em bloco digestor aberto
por 10 minutos a 95±5°C. As amostras foram resfriadas e após a adição de mais 5 mL
de HNO 3, novamente levadas ao bloco digestor para aquecimento a 95±5°C por mais 2
horas. Adicionou-se 5 mL de HCl e 10 mL de água destilada e foram aquecidas até que
terminasse o desprendimento de vapores de NO 2 (vapor amarelado). O líquido
resultante foi filtrado, transferido para balão de 100 mL, completado o volume com
água destilada e guardados em geladeira em frasco plástico opaco. Alíquotas de 5 μL
das amostras foram injetadas em espectro de absorção atômica (Varian® SPECTRA
AA 220 FS), usando uma mistura de ar/acetileno tendo um fluxo de 13,5 L/min para o
ar e 2,0 L/min do acetileno, tempo de leitura de 5 segundos, comprimento de onda de
228,8 nm. A curva de calibração foi feita com 7 pontos e, tanto o padrão quanto as
amostras foram feitas em triplicata Os metais pesados analisados foram: Chumbo (Pb),
Cádmio (Cd), Cobalto (Co), Cromo (Cr), Cobre (Cu), Manganês (Mn), Zinco (Zn) e
Níquel (Ni) (SKOOG, HOLLER E NIEMAN, 2002; DIAZ, QUEVEDO e LUNA,
1997).
Teor de Flavonóides Totais: Metodologia utilizada segundo Funari e Ferro, utilizando
cloreto de alumínio na concentração de 5% as leituras foram realizadas em
espectrofotômetro em 425 nm (FUNARI e FERRO, 2006). Os resultados foram obtidos
em porcentagem de flavonóides totais expresso em quercetina e representam a média de
3 determinações.
Teor de Fenóis Totais: Foi construída uma curva padrão, utilizando como substância
de referência o ácido tânico. Alíquotas de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 mL da solução aquosa de
ácido tânico a 100 µg/mL foram transferidas para balões volumétricos de 100 mL e
adicionados 5 mL de Folin-Ciocalteau (FOLIN e CIOCALTEAU, 1927). Após 2
minutos, foram adicionados 10 mL de solução de carbonato de cálcio 15% e o volume
foi completado com água destilada. As soluções foram deixadas em repouso por 30
minutos e lidas a 760 nm. As amostras foram preparadas utilizando-se 3 mL do extrato
hidroalcoólico de própolis a 2 mg/mL. O branco do sistema foi preparado da mesma
forma, sem a alíquota da amostra.
Validação do Método Analítico para Teor de Flavonóides Totais: No estudo de

validação foram avaliados os parâmetros de linearidade, exatidão e precisão
(repetitividade e precisão intermediária). A linearidade foi avaliada através da análise de
53
regressão linear pelo método dos mínimos quadrados dos pontos médios de três curvas
autênticas, utilizando cinco pontos nas concentrações de 4, 6, 8, 10 e 12 μg/mL do
padrão de quercetina. O coeficiente de correlação obtido foi a partir das três curvas. A
exatidão foi realizada em triplicata, através do método de adição de padrão e os
resultados expressos como percentual de recuperação. A precisão foi verificada em dois
níveis: repetitividade e precisão intermediária, sendo a primeira determinada pela
análise de seis amostras individuais e a segunda em 2 dias diferentes por analistas
diferentes.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram escolhidos os meses de fevereiro, junho e outubro para coleta das

amostras, tendo como base as características de cada um: fevereiro, por ser alto verão;
junho, por ser um mês de chuva e outubro, por ser baixo verão.
O perfil fitoquímico da própolis e da resina da D. ecastophyllum foi analisado

através da cromatografia em camada delgada (CCD), esta metodologia é uma alternativa
a cromatografia liquida de alta eficiência, porque a CCD requer apenas cromatoplacas,
reagentes siples e um espectofotometro UV/VIS, sendo um método analítico útil no
rápido controle de qualidade da própolis (ACKERMANN, 1991).
Considerando que a composição da própolis varia de acordo com a região onde
foi coletada, da espécie vegetal selecionada e da época de coleta, foram comparadas
amostras da própolis com a resina da D. ecastophyllum.
De acordo com as análises em cromatografia em camada delgada, não fora m
observadas variações no perfil cromatográfico entre as extrações etanólicas de própolis
e a resina como entre as datas de coleta.
O ensaio fitoquímico evidenciou a presença de mono e sesquiterpenos,
triterpenos e esteróides, açúcares redutores e flavonóides. Não foi detectada a presença
de alcalóides, iridóides, saponinas, cumarinas, derivados cinâmicos,
fenilpropanoglicosídeos, proantocianidinas condensadas e leucoantocianidinas.
Flavonóides como quercetina, canferol, luteolina e apigenina, também não fora m
detectados, mesmo sendo relatados na literatura como existentes em outras própolis
(PIETTA, GARDANA e PIETTA, 2002; SALATINO et al, 2005). Diversos autores
verificaram diferenças qualitativas e quantitativas na composição química da própolis
vermelha, Trusheva e seus colaboradores identificaram 14 constituintes, sendo estes
fenilpropanóides, monoterpenos, triterpenos, e flavonóides do tipo isosativana e
54
medicarpina (TRUSHEVA et al, 2006). Castro e colaboradores (2007), analisaram uma
própolis originaria de Entre Rios- Bahia, que apresentou uma composição química com
poucos compostos de natureza fenólica, contudo não foram citados os flavonóides
encontrados. Alencar e colaboradores analisaram uma própolis originaria de Alagoas e
reportaram 4 isoflavonas: homopterocarpina, medicarpina, 4`-7-dimethoxi-2`isoflavonol
e 7-4`-dihidroxiisoflavona (ALENCAR et al, 2007). E Silva e seus colaboradores
analisaram uma própolis de Alagoas, no nordeste do Brasil, onde identificaram apenas
dois flavonóides: quercetina e crisina e um ácido fenólico, o acido ferúlico (SILVA et
al, 2007), estes também identificados nos 12 tipos de própolis descrito por Park e
colaboradores (PARK et al, 2004). Também identificaram medicarpina e 3-hidroxi-8,9-
dimetoxipterocarpana e isosativana. Em discordância com Silva e colaboradores
(SILVA et al, 2007), que citam pela primeira vez na própolis vermelha a quercetina, na
amostra coletada em Goiana-Pernambuco em nenhuma das amostras foi encontrada a
mesma. Podendo ser um diferencial entre as própolis vermelha do nordeste.
A Instrução Normativa nº 3 - Anexo VII (BRASIL, 2001) preconiza a
identificação dos grupos fenólicos através do ensaio com acetato de chumbo e hidróxido
de sódio, como prova qualitativa, as mesmas não foram realizadas uma vez que esta
identificação se deu através da cromatografia em camada delgada.
Na atividade antioxidante nenhuma das amostras ultrapassaram os 22 segundos
estabelecidos/permitidos pela instrução normativa.
As amostras de própolis apresentaram cor avermelhada, sabor suave, aroma
resinoso e balsâmico e consistência maleável à temperatura ambiente, sendo que a
amostra de outubro apresentou-se um pouco mais clara e levemente mais rígida.
Segundo Funari e Ferro (FUNARI e FERRO, 2006), quando apresenta-se maleável, a
própolis pode indicar um maior teor de ceras. Sendo rígida, pode indicar um elevado
teor de resinas, o que é desejável, pois as atividades biológicas vêm sendo atribuídas à
substâncias contidas nessa fração.
A tabela 1 mostra os resultados das análises gravimétricas realizadas nas três

amostras de própolis. As amostras foram avaliadas quanto aos testes de pureza: perda
por dessecação, teor de cinzas e resíduo insolúvel em etanol, os resultados obtidos
atenderam às especificações do Ministério da Agricultura (BRASIL, 2001). A
determinação do teor de cinzas é importante para a amostra de própolis, pois, através
55
dessa análise pode indicar uma possível adulteração do material pela adição de
impurezas, como terra ou mesmo de resíduos de própolis já extraída.
No parâmetro teor de ceras, as amostras apresentaram-se dentro da normalidade,

com exceção da amostra de fevereiro, a qual apresentou um teor pouco acima do
especificado. Ainda em relação a este parâmetro, a amostra coletada em outubro
apresentou um resultado menor de cera que as demais sugerindo uma melhor atividade
biológica.
Tabela 1.
A contaminação de vegetais por metais pode ter diversas origens, tais como
acidental, proposital, contaminação do solo, de materiais de origem natural ou mineral e
durante a manufatura. Estudos recentes, realizados no Brasil com plantas de origem
nacional e outras de diversas origens, mostraram a presença de metais em altas
concentrações (SILVA, 2005). Como a qualidade da própolis é dependente da orige m
vegetal, foi realizada a determinação de metais pesados nas amostras coletadas nos
meses de fevereiro, junho e outubro. Dos teores totais dos metais pesados analisados Pb,
Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Zn, Ni, verificou-se que nem o Co nem o Cr foram identificados
em nenhuma das amostras. A terceira coleta (outubro) foi onde se obteve o menor teor
de metais pesados seguindo da primeira coleta (fevereiro) e por fim a segunda (junho),
tabela 2.
Na coleta de fevereiro o manganês apresentou um elevado teor assim como
zinco na coleta de junho, quando comparado aos teores dos outros metais apresentados.
Todavia bem abaixo dos valores preconizados como limites aceitáveis para alimentos, a
saber: Antimônio 2,0; Arsênio 1,0; Cádmio 1,0; Chumbo 2,0; Cobre 30,0; Cromo 0,1;
Estanho 250,0; Mercúrio 0,5 e; Níquel 5,0 (BRASIL, 1965).
Para o zinco, que no mês de junho apresentou teores por volta de 85 ppm
encontrando-se acima do limite estabelecido pela legislação brasileira em vigor, que é
50,0 mg/kg, para qualquer tipo de alimento, exceto bebidas alcoólicas e sucos
(BRASIL, 1965).
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA, através de portarias
normativas, relaciona uma série de produtos alimentícios e determina as concentrações
máximas permitidas para diferentes metais, entretanto, não foi encontrada qualquer
referência a produtos oriundos da abelha, como a própolis, sob qualquer forma, no que
se refere ao chumbo. Não foram encontradas citações na literatura nacional e
56
internacional sobre contaminantes metálicos na própolis vermelha, portanto, a discussão
foi feita em relação aos valores encontrados em normas oficiais para alimentos.
Alguns metais pesados são importantes para o metabolismo dos seres vivos,
dentre eles pode-se citar cobalto, cobre, manganês, molibdênio, vanádio, estrôncio, e
zinco. Porém níveis excessivos desses elementos podem ser extremamente tóxicos.
Outros metais pesados como o mercúrio, chumbo e cádmio não possuem nenhuma
função dentro dos organismos e a sua acumulação pode provocar graves doenças,
sobretudo nos mamíferos (SILVA et al, 2005).
Tabela 2
A amostra de outubro apresentou um maior teor de flavonóides totais e fenóis
totais, conforme se observa na tabela 3. Quanto ao solvente utilizado, diferentemente
dos resultados encontrados por Park e colaboradores, nos quais o álcool a 80% mostrou
ser o melhor para preparação dos extratos (PARK et al, 1998), o álcool a 90% foi o que
apresentou melhor poder de extração, tanto de flavonóides, quanto de fenóis.
Tabela 3
De acordo com Agrawal (1989), nos espectros dos flavonóides observam-se bandas de
absorção na região do ultravioleta com máximos entre 240-285 nm (banda II - anel A) e
entre 300-350 nm (banda I - anel B). De acordo com Instrução Normativa n 3: ―a
própolis deve apresentar picos característicos de flavonóides entre 200 e 400 nm‖.
Observou-se aqui uma similaridade nos perfis das amostras, onde o pico máximo foi e m
282nm e as absorbâncias variaram entre 1,098 a 1,727, de acordo com a concentração
alcoólica.
Pela Instrução normativa n 3 tanto o teor de flavonóides totais quando fenóis
totais são indicadores da qualidade da própolis, no entanto aos polifenois, de uma forma
geral, são atribuídas a grande maioria das atividades biológicas (BURDOCK, 1998;
LIMA, 2006). Dessa forma optou-se pela validação da metodologia analítica para a
quantificação dos flavonóides.
Quanto à validação do método analítico, os resultados dos pontos das três curvas de
linearidade foram colocados em um gráfico (Figura 1). O comprimento de onda
utilizado foi de 425 nm, com limite de detecção (LD) de 0,3632 e limite de
quantificação (LQ) de 1,2103. A repetitividade foi de 2,52  0,04 g/mL. A
concentração de quercetina em g/mL versus a absorbância Y, através do método dos
mínimos quadrados origina a equação da reta: y = 0,0757x - 0,0184 e o coeficiente de
57
correlação R2 = 0,9999, valor este que comprova a linearidade do método, no intervalo
de variação estudado.
Figura 1
A exatidão do método foi comprovada pelo estudo de três concentrações diferentes (50,
100, 150%), onde o percentual de recuperação médio das triplicatas de cada
concentração analisada apresentou-se dentro dos limites como mostram os resultados da
tabela 4. O tratamento estatístico aplicado foi o Teste t-Student, o qual demonstrou que
o t calculado foi menor que o t tabelado comprovando que não houve diferença
estatisticamente significativa entre as médias das três concentrações analisadas com
95% de confiança.
Tabela 4
Para a precisão, nos ensaios de repetitividade foram realizadas seis determinações a 160
g/mL, referentes a 100% da concentração. Observando-se os resultados, conclui-se que
o método tem uma boa repetitividade, visto que o coeficiente de variação apresenta-se
inferior ao limite especificado de 5,0% pela Resolução RE nº 899 da ANVISA
(BRASIL, 2003).
A precisão intermediária entre dias e entre analistas foi realizada e o Fcalculado

obtido para analistas foi 0,7871, e para dias foi 4,009745, com F tabelado de 5,143 e 4,757
respectivamente, não havendo diferença estatisticamente significativa entre as médias,
sendo o método considerado preciso.
CONCLUSÕES
A partir dos resultados e evidências apresentadas, a própolis vermelha da região

de Goiana, Pernambuco, Brasil, mostrou atender às especificações de identidade e
qualidade estabelecidas pelo Ministério da Agricultura, nos meses avaliados, exceto a
amostra de fevereiro quanto ao teor de ceras. A amostra do mês de outubro apresentou
um maior teor de flavonóides e fenóis totais, bem como menor teor de ceras, o que
indica este mês como o mais apropriado para coleta, especialmente se a própolis for
utilizada para fins medicinais, uma vez que são atribuídas aos flavonóides várias
propriedades farmacológicas. A validação do método analítico para a quantificação dos
flavonoides na própolis vermelha proporcionou resultados confiáveis para o doseamento
de flavonóides totais, sendo linear, exato e preciso.
58
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61
AGRADECIMENTOS
Agradecemos à Empresa Mel Brasil pelo fornecimento das amostras de própolis

e ao LAFEPE, pela parceria estabelecida para a realização da validação do método
analítico. Ao LTM – Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos do Departamento de
Ciências Farmacêuticas – UFPE. A Capes e ao CNPq pelo apoio financeiro.
Tabela 1. Resultados das análises gravimétricas realizadas com amostras da

própolis coletada nos meses de fevereiro, junho e outubro de 2006.
Teste Especificações1 Amostra Amostra Amostra
Fevereiro/062 Junho/062 Outubro/062
Perda por Máximo 8% 1,77 ± 0,03 2,10 ± 0,17 2,36 ± 0,40

Dessecação
Teor de Cinzas Máximo 5% 1,57 ± 0,19 1,46 ± 0,24 1,87 ± 0,16
Teor de Cera Máximo 25% 30,5 ± 1,5 25,0 ± 0,0 19,0 ± 3,0
Resíduo Máximo 40% 31,3 ± 0,57 30,3 ± 0,57 11,6 ± 0,57

insolúvel em
etanol
1
Especificações estabelecidas pelo Ministério da Agricultura. 2Valores expressos em
porcentagem.
62
Tabela 2. Determinação dos Metais Pesados.
Metais Pesados Amostra Amostra Amostra
(ppm) Fevereiro/062 Junho/062 Outubro/06

2
Chumbo 13,2±1,368 21,9±1,713 6,7±0,788
Cádmio 0,05±0,090 0,19±0,171 0,30±0,097
Cobalto 0,0 0,0 0,0
Cromo 0,0 0,0 0,0
Cobre 4,3±0,750 3,2±0,113 1,3±0,119
Manganês 52,7±2,027 41,3±1,245 26,2±1,799
Zinco 0,0 85,4±0,559 23,0±2,243
Niquel 4,7±1,483 2,7±0,427 2,1±0,384
Tabela 3. Análises do teor de flavonóides totais e fenóis totais.

Teste Especificaçõe Amostra Amostra Amostra
s1 Fevereiro/062 Junho/062 Outubro/062
70% 80% 90% 70% 80% 90% 70% 80% 90%
Flavonóides Mínimo de 1,501 1,524 2,111 1,590 1,279 1,615 2,300 2,351 2,410
Totais (%) 0,5% ± ± ± ± ± ± ± ± ±
0,005 0,007 0,002 0,005 0,016 0,002 0,005 0,011 0,002
Fenóis Totais (%) Mínimo de 7,116 7,613 8,440 9,095 8,039 9,315 13,33 13,61 13,47
5% ± ± ± ± ± ± 4± 7± 6±
0,053 0,042 0,034 0,053 0,069 0,099 0,077 0,117 0,113
1
Especificações estabelecidas pelo Ministério da Agricultura. 2Valores expressos em
porcentagem.
63
Figura 1. Determinação gráfica da curva de linearidade.
1,05 2
0,9 R =0,9999
Absorbância
0,75 Y= 0,0757x-0,0184
0,6
0,45
0,3
0,15
0 [ ] µg/mL de
quercetina
0 2 4 6 8 10 12 14
[ ] µg/m L
Seqüência1 Seqüência2
Seqüência3 Linear (Seqüência2)
Linear (Seqüência1) Linear (Seqüência3)
Tabela 4. Determinação dos resultados da exatidão.

Quantidade adicionada Quantidade recuperada Teste t- Student t- tabelado
(%) (%) calculado
50 49,26  1,2 2,12
100 100,97  0,96 1,72 4,303
150 151,05  0,44 4,03
64
4.2. ARTIGO IV: VARIABILIDADE SAZONAL DOS CONSTITUINTES DA
PRÓPOLIS VERMELHA E BIOATIVIDADE EM Artemia salina LEACH
Artigo submetido a revista Brasileira de Farmacognósia
Resumo: A própolis é uma substância resinosa coletada pelas abelhas de diversas partes
das plantas. Sua composição depende da época, vegetação e local de coleta. Apresenta
diversas atividades biológicas como antimicrobiana, antioxidante, antitumoral, dentre
outras. Foi realizada a variabilidade sazonal nos meses de fevereiro, junho e outubro de
2006 dos constituintes voláteis da própolis vermelha de Pernambuco através da extração
por headspace dinâmico e identificação por cromatografia gasosa acoplada com
espectrometria de massas (CG-EM). Foram identificados 34 constituintes voláteis,
sendo monoterpenos e monoterpenóides, sesquiterpenos e sesquiterpenóides,
fenilpropanóides, aldeídos, cetonas e n-alcanos. Os constituintes majoritários foram o
trans-anetol, -copaeno e o metil cis-isoeugenol. Também foi realizado o perfil
fitoquímico por cromatografia em camada delgada (CCD). Através da qual os
constituintes fenólicos foram identificados como majoritários. Com o extrato bruto
metanólico da própolis foi realizado o ensaio de letalidade em Artemia salina, que
demonstrou DL50 de 18,9 µg/mL, sugerindo uma possível atividade antitumoral.
Palavras-chave: Própolis vermelha, constituintes voláteis, Artemia salina
Abstract: “Seasonal Variability of Red Propolis Constituents and Brine shrimp

bioassay‖. Propolis is a resinous hive product collected by honeybees from plant
sources. The composition of the propolis depends upon the season, vegetation, and the
area of collection. It presents a diverse biological activities such as antimicrobial,
antioxidant and antitumoral. The seasonal variability of the red propolis constituents
from Pernambuco State were accomplished in the months of February, June and
October of 2006. The volatile red propolis constituients were captured by the dynamic
headspace technique and analyzed by GC-MS. In the analysis of the samples, 34
constituents were identified such as the mono and sesquiterpens, phenylpropanoids,
aldehydes, cetons and n-alcanes, presenting as majority constituents the trans anethol,
-copaene and methyl cis-isoeugenol. The phytochemistry profile was performad by
Thin Layer Chromatography (TLC), throught this technique the majorities constituents
were identified as phenols. The Brine shrimp bioassay were evaluated of the red
propolis methanolic extract, which demonstrated a DL50 of 18,9 µg/mL and a activity
antitumoral was suggesting possible.
Key words: red propolis, volatile constituents, Artemia salina
Introdução
A própolis é considerada uma das misturas mais heterogêneas encontradas e m
fontes naturais. Mais de 300 constituintes já foram identificados e/ou caracterizados em
diferentes amostras (Burdock, 1998). As abelhas (Apis mellifera) usam esta substância
para se proteger contra insetos e microorganismos, empregando-a em finas camadas nas
paredes internas das colméias para vedar buracos e rachaduras, reparar e fortalecer os
65
favos de mel, proteger a entrada da colméia, no preparo de locais assépticos para a
postura da abelha rainha e na mumificação de insetos invasores (Bankova et al., 2000).
A própolis é coletada por abelhas a partir de diversas partes das plantas como
brotos, botões florais, casca e exsudatos resinosos (Park et al., 1997). As propriedades
biológicas da própolis estão diretamente ligadas à sua composição química e este
possivelmente é o maior problema para o uso da própolis na terapêutica, tendo em vista
que a sua composição química varia com a flora da região, locais e épocas de coleta.
Assim com a técnica empregada para a produção (tipo de coletores) e com as
características genéticas (gênero e espécie das abelhas). Este conjunto exerceu, portanto,
uma enorme importância nas suas propriedades físicas, químicas e biológicas (Pereira et
al., 2002; Park et al., 1998; Bianchini, 1998).
No Brasil, são descritas propriedades biológicas e composição química distintas
para diferentes amostras coletadas em diferentes partes do país. Essa variação é
facilmente explicada pela grande biodiversidade brasileira (Pereira et al., 2002). A
variação sazonal como a diminuição em alguns componentes biologicamente ativos, no
caso dos compostos fenólicos é acompanhada pelo aumento de outros, por exemplo,
ácidos diterpênicos. Deste modo, pode-se esperar que algumas atividades biológicas,
relacionadas a estes compostos (antibacteriana, antifúngica), sejam similares em
diferentes estações do ano (Bankova et al, 1998).
Park et al. (2002) classificaram a própolis brasileira em 12 tipos de acordo com a
região geográfica de origem, composição química e vegetação de onde foi extraída.
Porem, a própolis vermelha, que é encontrada sobretudo nas áreas litorâneas das regiões
norte e nordeste, ainda é pouco estudada. O presente trabalho objetiva caracterizar os
constituintes químicos, principalmente os voláteis, da própolis vermelha de Pernambuco
e realizar o biomonitoramento, através da avaliação de sua citotoxicidade sobre Artemia
salina Leach.
Material e Métodos
As amostras foram coletadas numa área de restinga, cidade de Goiana-PE
(Distrito de Atapuz), nos meses de fevereiro, junho e outubro de 2006, acondicionadas
em recipiente plástico opaco, hermeticamente fechado e conservadas sob refrigeração.
Identificação dos constituintes voláteis: 7,5 g de cada uma das amostras de própolis
foram submetidos à técnica de headspace dinâmico por duas horas, utilizando-se como
armadilha para a captura dos voláteis o Porapak-Q® (Divinilbenzeno/Etilvinilbenzeno).
66
Os constituintes voláteis foram dessorvidos do polímero pela adição de diclorometano,
que em seguida foi eliminado por um jato de nitrogênio. Posteriormente, a análise dos
constituintes foi realizada num cromatógrafo SHIMADZU GC-17A acoplado a um
espectômetro de massas GCMS-QP5050A equipado com uma coluna capilar de sílica
fundida DB-5 (95% polidimetilsiloxano e 5% difenil, 30 m de comprimento, 0,25 mm
de diâmetro externo, 0,25µm de diâmetro interno). A programação utilizada para
injeção e corrida das amostras foi a seguinte: injetor: 220 ºC, detetor: 240 ºC, coluna:
60ºC a 240ºC, 3ºC.min-1. O gás de arraste foi hélio com vazão de 1 mL. min-1.
A identificação dos constituintes foi realizada por inspeção visual dos seus
espectros de massas comparando-os com espectros da literatura (Adams, 1995),
observando principalmente os parâmetros: pico do íon molecular e pico base, além de
comparação com espectros de uma biblioteca computacional (Wiley299), e através da
comparação dos índices de Kovats calculados em co-injeção de uma série homologa de
n-alcanos, com os índices de Kovats encontrados na literatura (Adams, 1995).
Perfil fitoquímico da própolis através da CCD: 1,0 g de própolis triturado de
cada um dos três meses de coleta foi submetido à extração metanólica (20 mL).
Alíquotas de 10 μL foram analisadas por cromatografia em camada delgada (placas de
gel de sílica Merck - Alemanha, art.105554), para análise da presença de grupos de
metabólitos, empregando-se diversas fases móveis e reveladores adequados (Harborne,
1984; Wagner & Bladt, 1996; Senna Filho et al 2006).
Bioensaio de Letalidade sobre Artemia salina: O ensaio de toxicidade sobre a
Artemia salina Leach foi realizado de acordo com a metodologia proposta por Meyer
(1982). 1g da própolis foi submetido à extração em metanol por 24 horas sob agitação
(EB-MeOH). A partir de 20 mg do extrato seco, foram preparadas soluções de 1, 3, 10,
30, 100, 300 e 1000 µg/mL em triplicata, que foram ressuspensas em clorofórmio
(CHCl3) e 0,1mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Para o teste de letalidade, 10 espécimes
do microcrustáceo, com 48 horas de eclosão em água do mar e água destilada (1:1),
foram colocados em cada um dos tubos e em três tubos controle (clorofórmio +
DMSO). Após 24 horas, contou-se o número de mortos e os resultados obtidos fora m
tabulados e submetidos à análise de Probitos no software estatístico SPSS  for Windows
10.0, obtendo-se o valor da CL50, com intervalo de confiança a 95%.
Resultados e Discussão
67
Constituintes voláteis
Através da técnica de headspace dinâmico e da análise por CG-EM, fora m
identificados 34 constituintes voláteis, considerando as três amostras da própolis
vermelha. A Tabela 1 apresenta os constituintes voláteis identificados de acordo com a
classe química. Pelos resultados, evidencia-se uma composição química em voláteis
bastante variada, destacando-se como constituintes majoritários trans-anetol, α-copaeno
e metil cis isoeugenol. O trans-anetol, bem como o elemicin, foram apresentados em
estudo recente por Marcucci et al., (2006) como componentes majoritários de uma
amostra de própolis vermelha de Maceió-Alagoas, o que nos leva a correlacionar às
origens comuns para esse tipo de própolis. O elemicin foi citado co mo componente da
própolis pela primeira vez no estudo de Marcucci et al., (2006). Nesse estudo, nas três
amostras de própolis, o fenilpropanoide elemicin foi também identificado. Petri et al.,
(1988) classificaram a própolis de clima temperado em dois tipos, conforme o
constituinte volátil majoritário o ß-eudesmol ou o benzoato de benzila. Vários estudos
evidenciaram que a própolis destas regiões origina-se principalmente de botões florais
de plantas da espécie Populus, choupo, (Bankova, 2000). Nos países de clima tropical, a
composição química da própolis é de difícil caracterização, dada a grande diversidade
da flora por sua composição química diferir bastante da própolis produzida em regiões
de clima temperado.
A variação na composição química em voláteis, entre as três amostras coletadas,
em diferentes épocas do ano, foi pequena, havendo 17 constituintes comuns dentre os
compostos identificados. Contudo, apenas na amostra coletada em outubro foi
evidenciado o sesquiterpenóide δ-cardinol e os sesquiterpenos ß-gurjuneno,
isocariofileno e δ-cadineno. Os n-alcanos foram identificados na amostra do mês de
junho, assim como o monoterpenóide 1,8 cineol e o sesquiterpeno α-selineno.
No entanto, vale ressaltar que o constituinte majoritário foi o mesmo nas três
amostras, o trans-anetol, e que o percentual deste composto foi relativamente alto,
particularmente na amostra coletada em outubro 52,58%. Também destaca-se nas três
amostras o alto teor de fenilpropanóides, sendo cerca de 66% para a amostra coletada
em outubro. Os constituintes dos óleos essenciais pertencem a dois grupos de
metabólitos originados de rotas biossintéticas diferentes: o grupo dos terpenos, cuja rota
biossintética deriva de unidades de isopreno; e o grupo dos compostos aromáticos
derivados dos fenil-propanóides que tem como precursor o ácido chiquímico (Dewick,
2003). A amostra coletada no mês de outubro corresponde a estação após o período das
68
chuvas no Nordeste, época em que a maioria das espécies vegetais nativas floresce e por
isso a produção de própolis é maior nesta época do ano. Na estação das chuvas, as
abelhas visitam arbustos e subarbustos, enquanto que no período seco as espécies
lenhosas são as principais fontes de néctar, pólen e resina para as abelhas, mostrando
assim uma mudança no pasto apícola e, consequentemente, uma variação na
composição química da própolis (Costa, 2005). Ainda nas três amostras estudadas
observa-se grande percentual de sesquiterpenos. Esses compostos, juntamente com
fenilpropanóides, responsáveis por diversas atividades farmacológicas e como destaque
o constituinte majoritário trans-anetol apresenta atividades comprovadas, tais como:
analgésica, anestésica, antigenotóxica, antioxidante, dentre outras (Nirmala et al, 2005).
Mostrou-se ainda como sendo o principal constituite do óleo essencial de anis
(Pimpinella anisum) dotado de atividade inseticida e antifúngica (Costa, 2002; Harbone,
1998; Moersdorf, 1966; Shukla, 1987).
Essas e outras atividades atribuídas aos demais constituintes indicam um bom
potencial farmacológico para a própolis em estudo.
Tabela 1 – Compostos voláteis identificados em amostras de própolis vermelha

de Pernambuco (% do íon corrente total).
69
Composto IK* IK** Fev Jun Out
% área
Hidrocarbonetos 4,11 5,26 0,90
monoterpênicos
p-cimeno 1026 1026 0,60 0,52 --
Limoneno 1031 1031 3,51 4,74 0,90
Monoterpenos oxigenados 1,52 3,17 1,22
1,8-cineol -- 1034 -- 0,39 --
Linalool 1098 1099 1,52 2,78 1,22
Hidrocarbonetos 32,00 17,08 20,96
sesquiterpênicos
-cubebeno 1351 1355 1,17 0,33 2,49
-copaeno 1376 1382 14,70 5,97 7,27
-gurjuneno 1409 1417 -- -- 0,34
-cariofileno 1418 1420 0,85 3,45 1,48
-bergamoteno 1436 1440 0,51 0,88 0,49
Farneseno -- 1420 7,54 1,82 1,16
trans--farneseno -- 1458 0,58 -- 1,02
D-Germacreno 1480 1482 0,65 - --
-selineno 1494 1503 -- 0,41 --
Isocarofileno -- 1502 -- -- 0,33
-bisaboleno 1509 1513 6,00 2,39 5,29
-cadineno -- 1530 -- -- 1,09
cadineno 1538 1530 -- 1,83 --
Sesquiterpenos oxigenados -- -- 0,32
-cadinol -- 1500 -- -- 0,32
Hidrocarbonetos aromaticos -- -- 0,48
Naftaleno -- 1186 -- -- 0,48
Álcoois, aldeídos e cetonas 20,48 6,00 9,09
4-hiroxi-4-metil -heptan-2- -- 851 14,42 -- 0,41
ona
6-metil-5-hepten-2-ona 985 985 1,00 1,01 --
Octanal 1001 1001 0,50 0,58 0,78
Nonanal 1102 1103 1,52 1,90 2,46
n-Decanal 1204 1205 1,14 1,31 4,49
anisaldeido 1252 1255 1,20 1,20 0,95
n-Dodecanal 1417 1409 0,70 -- --
Hidrocarbonetos alifáticos -- 1,84 --
Tetradecano -- 1399 -- 0,55 --
Pentadecano 1500 1499 -- 0,85 --
hexadecano 1600 1598 -- 0,44 --
Fenil propanoides 37,10 65,92 66,32
Estragol -- 1200 3,62 6,16 3,61
trans-anetol 1283 1288 25,58 48,05 52,58
Metil-cis isoeugenol 1402 1404 5,61 8,18 7,38
trans-metil isoeugenol 1447 1497 0,83 1,35 1,16
Elemicin 1554 1555 1,46 2,18 1,59
Não identificados 4,79 0,73 1,19
IK* (Índice de Kovats calculado) IK** (Índice de Kovats da literatura)
70
Análise Fitoquímica
A cromatografia em camada delgada mostrou um mesmo perfil fitoquímico para
a própolis entre os meses de coleta. Os metabólitos secundários majoritários da própolis
foram os derivados fenólicos (flavonóides, antraquinonas) e terpenos (monoterpenos,
sesquiterpenos, triterpenos e esteróides), além da presença de açúcares. Não foi
detectada a presença de alcalóides, iridóides, saponinas, cumarinas, derivados
cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos, proantocianidinas condensadas e
leucoantocianidinas. Flavonóides como quercetina, kaempferol, luteolina e apigenina,
também não foram detectados, mesmo sendo reportados na literatura em outras própolis
(Pietra et al,, 2002; Salatino et al 2005). Porém, há uma grande controvérsia em relação
ao teor de flavonóides nas amostras brasileiras (Pereira et al., 2002). Bankova et al.,
(1995) concluíram que as própolis brasileiras têm uma baixa concentração de
flavonóides e ésteres de ácidos fenólicos, possuindo altas concentrações de ácido
dihidroxicinâmico, acetofenonas preniladas e alguns terpenóides específicos. Ainda
Bankova et al., (2000) citam que em alguns casos os flavonóides são importantes
componentes presentes na própolis brasileira. Aga et al., (1994) determinam os
compostos prenilados como os maiores constituintes da própolis brasileira e relatam que
a atividade antibacteriana destes compostos pode ser aumentada com o aumento do
número de resíduos prenil na molécula, como citado por Marcucci et al., (2001).
Bioensaio com Artemia salina Leach

No ensaio de toxicidade sobre Artemia salina, o extrato bruto metanólico da
própolis apresentou DL50 igual a 18,9 µg/mL, com intervalo de confiança a 95% entre
14,6 - 24,8 µg/mL. Este resultado sugere uma atividade antitumoral, devido a DL50 ser
menor que 1000 µg/mL, dosagem letal máxima para uma substância ser considerada
ativa, além de uma correlação estatística entre a DL50 e a atividadse antitumoral
(McLaughlin, 1993). Banskota et al., (1998) demonstraram que o extrato metanólico de
uma amostra de própolis possui uma citotoxicidade considerável contra células de
tumor de cólon, devido ao seu conteúdo de compostos fenólicos. Testes in vitro têm
demonstrado atividade antitumoral da própolis tanto citostática quanto citotóxica.
Conclusões
A composição química dos compostos voláteis da própolis vermelha no Estado
de Pernambuco mostrou-se variada, destacando-se como constituintes majoritários o
71
trans-anetol, α-copaeno e o metil cis-isoeugenol. A própolis apresenta como
constituintes majoritários os compostos fenólicos, do tipo flavónoides, antraquinonas e
fenóis. Estas substâncias na própolis são representadas pelas agliconas de flavonóides,
ácidos fenólicos e seus ésteres, os quais são responsáveis pela grande variedade das
propriedades biológicas (Banskota et al., 1998; Burdock, 1998; Koo & Park, 1997;
Banskota et al., 2000).
O bioensaio de letalidade em Artemia salina sugere esta própolis uma
promissora atividade antitumoral a partir de seu conteúdo em compostos fenólicos
confirmado. Dessa maneira, a expansão da indústria de própolis vermelha só será
possível, de forma segura, com a padronização da matéria-prima e dos produtos
acabados, levando-se em conta a diversidade da vegetação regional, a atividade de
coleta das diferentes variedades de abelhas e com o estabelecimento da eficácia e
segurança dos produtos obtidos.
Agradecimento(s):
Ao LTM – Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos do Departamento de Ciências
Farmacêuticas – UFPE. A CAPES/CNPq pelo apoio financeiro e a Mel Brasil pelas
amostras de própolis.
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74
ATIVIDADE BIOLÓGICA DA PRÓPOLIS VERMELHA
75
5.1. ARTIGO V: PROPOLIS VERMELHA: ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN
VITRO E IN VIVO E ANTIGENOTÓXICA EM DANOS INDUZIDOS PELA
CICLOFOSFAMIDA EM CAMUNDONGOS
Artigo a ser submetido ao Braz. J. of Medical and Biological Research
1. RESUMO
A própolis é um complexo resinoso de substâncias coletadas por abelhas de diversas
partes das plantas tendo composição que varia, principalmente, de acordo com a orige m
botânica e a época do ano. Possui uma composição variada de triterpenóides,
flavonóides, ácidos aromáticos, ácidos graxos, fenóis, aminoácidos e vitaminas A,
Complexo B e C. Dentre estes, os flavonóides, precursores de vitamina A e vitamina C
são relatados como compostos de excelentes atividades antioxidantes. No Brasil
classificou-se a própolis, até o momento, em 13 tipos dos quais o mais estudado é o da
própolis verde e o mais recente, e portanto ainda pouco estudado, é o da própolis
vermelha, típica do nordeste brasileiro encontrando-se distribuída desde o litoral da
Bahia até o Ceará. Objetivou-se avaliar a atividade antioxidate in vitro, utilizando o
método do DPPH e in vivo, em células eucarióticas, através do percentual de inibição de
crescimento em linhagens de Saccharomyces cerevisae tratadas com o agente estressor
peróxido de hidrogênio, bem como os efeitos na inibição da genotoxicidade induzida
pela ciclofosfamida em medula óssea e sangue periférico de camundongos, com a
aplicação do teste de Micronúcleo in vivo. Verificou-se atividade antioxidante tanto in
vivo quanto in vitro, bem como a inibição da genotoxicidade induzida pela
ciclofosfamida (50 mg/Kg) com doses de 0,2 mL/10g de peso de camundongo, em pré-
tratamento e pós-tratamento (75% e 62,5% de inibição, respectivamente). Esses
resultados sugerem que a própolis tem atividade antigenotóxica relacionada
possivelmente, com as atividades antioxidantes de seus constituintes químicos naturais.
Palavras-chave: Própolis, antioxidante, anti-genotóxica, DPPH
Abstract
The própolis is a resinous compound of you nourish collected by bees in several

parts of the plants tends composition varying, mainly, in agreement with the botanical
origin and time of the year. It possesses a varied composition of triterpenóides,
flavonóides, aromatic acids, acids grax, phenols, amino acids and vitamins A, C and B
Complex. among these, the flavonóides, vitamin A precursors and vitamin C is told as
composed of excellent antioxidant activities. In Brazil it was classified the própolis,
until the moment, in 13 types of the which the studied is the one of the green própolis
and the most recent, and therefore still little studied, the red própolis, typical of the
Brazilian northeast meeting distributed of the coast of Bahia to Ceará. It was aimed at to
evaluate the activity antioxidate in vitro, using the method of DPPH and alive in, in
cells eucariotics through the percentile of growth inhibition in lineages of S. cerevisae
treated with the agent estressor peróxido of hydrogen as well as the effects in the
inhibition of the genotoxicidade induced by the ciclofosfamida in bone marrow of mice,
with the application of the test on Micro core in vivo. Activity antioxidant so much in
vivo was verified as in vitro, as well as the inhibition of the genotoxicty induced by the
ciclofosfamida (50 mg/Kg) with doses of 0,2 mL/10g of mouse weight, in pré-treatment
and powder-treatment (75% and 62,5% of inhibition, respectively). Those results
76
suggest that the própolis has activity antigenotóxica related possibly, with their natural
chemical representatives' antioxidant activities.
keywords: Red própolis, Antioxidant, anti-genotoxic
2. INTRODUÇÃO
Própolis é uma denominação genérica utilizada para descrever uma mistura
complexa de substâncias resinosas, gomosas e balsâmicas colhidas por abelhas
melíferas de brotos, flores e exsudatos de plantas, às quais as abelhas acrescenta m
secreções salivares, cera e pólen para a elaboração do produto final (Brasil, 2001). Seu
emprego na vida da colônia está relacionado com suas propriedades mecânicas, sendo
utilizada na construção e adaptação da colméia, garantindo um ambiente asséptico
(Ghisalberti, 1979).
A composição química da própolis é muito complexa visto que as abelhas coletam
tecidos vegetais de diferentes origens botânicas (Pereira, 2002). Observa-se grande
variação de constituintes de própolis quando comparam-se amostras de regiões, de
climas diferentes (Bankova 2000).
Encontramos poucos e recentes estudos sobre própolis vermelha brasileira
(Trusheva, 2006; Sawaya, 2004; Alencar, 2007; Salomão, 2007; Park, 2006; Silva,
2007; Awale, 2008). A própolis vermelha é relatada ser típica de Cuba, onde a planta de
origem é a Clusia nemorosa (Clusiaceae) e Venezuela onde as abelhas coletam a
própolis de Clusia scrobiculata (Marcucci, 2006a).
A própolis do nordeste, em particular a vermelha, mostra-se promissora fonte de
novas descobertas no campo da terapêutica como apresentado por algumas pesquisas
recentes (Park, 2006; Marcucci, 2007; Rolim, 2007), mas as pesquisas no tema ainda
são insipientes.
Park et al. (2002 e 2006) classificaram a própolis brasileira em 13 tipos de
acordo com as suas características (como região geográfica de origem, composição
química e vegetação de onde foi extraída). O tipo mais popular e mais estudado é a
própolis verde, encontrado na região sul e principalmente suldeste do país. A própolis
vermelha é encontrada nas regiões norte e nordeste sobretudo nas áreas litorâneas.
Marcucci et al (2006b) apresentaram resultados sobre a atividade antibacteriana,
antioxidante bem como os constituintes químicos de uma amostra de própolis vermelha
coletada em Marceió – AL.
Sabe-se que os danos causados ao DNA, por agentes genotóxicos são
considerados como eventos iniciais que levam à mutação e inúmeros defeitos
77
hereditários, doenças degenerativas e câncer (Moutacchi, 2000). Grande parte de
doenças crônicas, incluindo não somente o câncer e envelhecimento, mas também as
doenças auto-imunes, inflamatórias, cardiovaculares e neurodegenerativas resultam dos
danos celulares causados por espécies reativas de oxigênio (ERO) (Aruoma, 2003). Nos
anos recentes, muitas substâncias presentes em vegetais têm sido consideradas como
uma alternativa para escapar dos processos de mutagênese e/ou carcinogênese, devido
às suas propriedades quimiopreventivas de mutações ao DNA e de interferência nas
etapas de iniciação, promoção e progressão da carcinogênese (Cambie e Ferguson,
2003; Lee e Park, 2003). A ciclofosfamida (CPA) é um agente alquilante bi-funcional e
de ação oxidante, particularmente pelos metabólitos secundários do composto (Franke
et al., 2005), que constituí um dos químicos presentes no coquetel para quimioterapia, a
qual pode ser utilizada para avaliar, in vivo, os efeitos da própolis na modulação da
mutagenicidade induzida pela ciclofosfamida.
MATERIAIS E MÉTODOS
a. Amostra de própolis
A amostra foi coletada numa área de restinga próximo à cidade de Itapissuma-
PE (coletada no apiário da empresa Mel Brasil Ltda, distrito de Atapuz – PE, S: 7º 33’
38’’ W: 35º 0’9’’), em outubro de 2006, acondicionada em recipiente plástico opaco,
hermeticamente fechado, e conservada sob refrigeração entre (-10 e -5ºC).
b. Obtenção do extrato
Foi preparado extrato etanólico de própolis (EEP) a 20% (m/v), por maceração
durante 48 h, em solução hidroalcoólica a 80%. Após esse tempo, o extrato foi filtrado e
acondicionado em frasco de vidro âmbar seguindo metodologia descrita por Park et al
1998.
c. Atividade antioxidante in vitro método do radical livre DPPH (1,1-difenil-2-

picrilhidrazil)
Foi preparada uma solução estoque de DPPH em metanol na concentração de 0,4
mM. A partir desta, foram feitas diluições de 0.2, 0.1, 0.05, 0.025 e 0.0125 mM. A
curva de calibração foi construída a partir dos valores da absorbância a 517 nm de todas
as soluções.
78
Alíquotas (0,6 mL) das soluções metanólicas de própolis, preparadas a partir dos
extratos hidoalcoólicos com concentrações totais de própolis de 25, 50 100 µg/mL,
foram colocadas em diferentes tubos de ensaio. Em seguida, 5,4 mL da solução de
DPPH em metanol (0,05 mM) foram adicionados e, após agitação, os tubos fora m
deixados em repouso ao abrigo da luz. Ao final de 15, 30, 45 e 60 min, a absorbância
foi medida a 517 nm e a capacidade de seqüestrar o radical, expressa como percentual
de inibição, calculada de acordo com a seguinte equação matemática:
% inibição = Abs controle – Abs da amostra x 100

Abs controle
Onde a Abs controle é a absorbância da solução de DPPH sem antioxidante.
O mesmo procedimento foi realizado empregando-se soluções metanólicas de

padrão rutina, nas concentrações de 12.5, 25.0, 50.0, 100.0 e 200 µg/mL, para a
construção de uma curva padrão (Melo et al., 2006).
c. Atividade antioxidante in vivo em linhagens de Saccharomyces cerevisiae

selvagem e mutadas em defesas antioxidante
As cepas de S. cerevisiae utilizadas e seus genótipos foram: SOD (Mata his3Δ
leu2Δ0 trp1-289 ura3); sod1Δ (Pouca SOD+ exceto sod1::URA3); sod2Δ (Pouca SOD+
exceto sod2:: TRP1); sod1Δ/sod2C (Pouca SOD+ exceto sod1:: URA3:: sod2:: TRP1);
cat1Δ (Pouca by4741 exceto cat1:KanMx) e sod1Δ,cat1Δ (EG103 exceto cat1::TRP1).
Meios, soluções e tampões foram preparados como descritos por Rosa et al., 2006.
50µL de extrato de própolis foi usado em tratamento com 10M de H 2O2 e 20 mg/mL de
quercetina. Os dados foram estatisticamente analisados pelo método ANOVA e teste de
Dunnett’s, com significância de **P≤ 0,01.
d. Atividade antigenotóxica
Reagentes químicos
Solução tampão 0,2M em fosfato de potássio, corante Giemsa e May-Grünwald,
Ciclofosfamida (200mg), ambos da Sigma (St. Louis. MO-US), heparina (Roche-Brasil)
e soro bovino fetal. Os extratos de própolis foram obtidos por maceração da própolis in
79
natura e triturada na proporção de 20% (p/v) em solução hidroalcoólica a 70% durante
48h. Após esse período foi feito uma filtração simples em papel de filtro e armazena e m
frasco âmbar sob refrigeração (±4 ºC).
Tratame nto dos animais

Camundongos machos (total de 24) obtidos do Biotério da Universidade Federal
do Piauí-UFPI, de cinco a sete semanas de idade, pesando de 20-30g, aclimatados
durante 2 semanas à temperatura de 22 a 25ºC e 60% de umidade, devidamente
alimentados com ração específica (NUVILAB) e água potável. Os animais foram
expostos a ciclos de luz segundo as normas vigentes durantes todas as etapas do teste.
Os camundongos foram divididas em 5 grupos de 6: (1) controle positivo (CPA-
ciclofosfamida na dose de 50mg/Kg), (2) controle negativo-solução salina (CN), (3)
extrato da própolis, (4) pré-tratamento dos camundongos durante três dias antes da
administração da CPA, (5) pós-tratamento com própolis após a administração da CPA.
Após coleta do material de análise os animais foram abatidos por deslocamento cervical
e incinerados. O pré-tratamento dos animais com própolis e CPA e o pós-tratamento
com CPA e própolis foram de três dias, sempre nos volumes de 0,1 - 0,2 mL de cada
solução para cada 10 g de peso de camundongo aplicadas por gavagem (via oral)
sempre no mesmo horário.
Teste de micronúcleos
O teste de micronúcleos (MN) com medula óssea foi feito como descrito por
Krishna e Hayashi (2000). Após 24 horas, do último dia de tratamento 15 μL de sangue
periférico foi coletado em corte feitos na cauda e misturados em tubos, contendo 7 μ L
de heparina. Após 24 horas as lâminas com esfregaço do sangue periférico foram
fixadas com metanol:ácido acético (3:1) e coradas com uma mistura de azul de metileno
(Giemsa com May-Grünwald e 0,2 M de tampão fosfato pH 5,8, na proporção de
60:30:10, respectivamente. A coleta de medula óssea foi feita extraindo-se os dois
fêmures dos animais. Em seguida, as células foram maceradas com soro bovino fetal
sobre lâminas para microscopia, onde se realizou o esfregaço. Após 24 horas fora m
coradas como descrito. A análise do material foi feita em microscópio óptico comum a
uma resolução de 10X100. Foram contados 500 eritrócitos imaturos policromáticos
(PCE) e eritrócitos maturos normocromáticos (NCE) (coloração seletiva para
ribossomos) por lâminas e mais 500 PCE totalizando 1000 células por lâminas de cada
80
cobaia. Foram lidas 3 lâminas por cobaia. A relação entre PCE e NCE foi observada. O
percentual de redução/modulação de micronúcleos foi calculado segundo Delmanto et
al. (2001) pela fórmula: % modulação = MN do grupo CPA – MN do grupo com suco
/MN do grupo CPA – MN do grupo CN X 100.
Análise estatística
Os resultados obtidos em cada grupo de tratamento foram analisados pelos
modos estatísticos análise de Variância ANOVA, seguida do teste de Student e teste T
de Tukey para detectar diferenças entre os grupos.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A relevancia para o estudo da atividade antioxidante vem do fato de que doenças

cardiovasculares, reumáticas, neurológicas, psiquiátricas, envelhecimento precoce,
neoplasias, osteoporose, diabetes e inflamação estão relacionadas a aumentos nos níveis
de radicais livres em nosso organismo (Devasagavan, 2004).
a. Atividade antioxidante in vitro
A própolis possui uma composição química rica em polifenois, alem de outros
compostos com a capacidade de remover radicais livres em excesso de nosso or ganismo
(Marquele, 2005).
A propolis vermelha estudada mostrou atividade antioxidante contra o DPPH,
comparando com o padrão rutina, dependente da concentração utilizada. Isso corrobora
com os estudos realizados anteriormente por diversos pesquisadores. A atividade
antioxidante é uma propriedade constante independente do tipo e origem de própolis
utilizada, variando apenas na sua potência (Menezes, 2005).
Gráfico 01: Atividade antioxidante de extratos de própolis frente ao DPPH
81
Atividade antioxidade da própolis x padrão de rutina
%90 84,52
80
66,94
70
60
52,67
43,29 41,6
50
33,71
40
30
20
10
0
Rutina 25 Propolis 25 Rutina 50 Propolis 50 Rutina 100 Propolis 100
µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL
Rutina 25 µg/mL Propolis 25 µg/mL Rutina 50 µg/mL Propolis 50 µg/mL Rutina 100 µg/mL Propolis
*P < 0.05
A mistura de benzofenonas preniladas

gutiferona E e xantoquimol ( FIG 01), mostrou
um significativo efeito anti-radical livre contra
DPPH sendo, obviamente, um dos mais
importantes componentes antioxidante do extrato
de própolis vermelha (Trusheva, 2006).
As isoflavonas, comuns na própolis
vermelha e incomuns nos outros 12 tipos de
própolis brasileira têm sido relacionadas à Figura 01: Mistura de benzofenonas
Gutiferona E: R = 3-metil-2-butenil
atividade antioxidante, bem como podem ser
utilizadas como marcador para esse tipo de própolis (Alencar, 2007).
Xantoquimol: R = 3-metil-3-butenil
Pode-se considerar que o sequestro de radicais livres gerados por neutrófilos
poderia ser um mecanismo antioxidante da própolis, que resultaria numa atividade
antiinflamatória final (Moreno, 2000).
b. Atividade antioxidante in vivo

Observou-se que a própolis vermelha inibe com significância (P<0,01) a
genotoxicidade induzida pelo H2O2, com percentuais de inibição de crescimento e m
todas as linhagens de Saccharomices cerevisiae testadas, em cerca de 28-32%, enquanto
o agente oxidante inibiu em 61-66% (Figura 2).
82
H2O2 Própolis Quercetina
Figura 2. Efeitos antioxidantes e antimutagênicos da própolis em S. cerevisiae.
A Figura 3 mostra que a própolis tem atividade antigenotóxica e antioxidante,

modulando os danos oxidativos induzidos pelo H2O2 entre 52-57%.
Inibição de crescimento (cm)
0
H2O2 Ácido gálico + Rutina + H2O2 Quercetina + Própolis+
H2O2 H2O2 H2O2
Tratamentos
SOD sod 1 sod 2 sod1/sod2 cat 1 sod1/cat 1
Figura 3: Atividade da própolis na inibição de crescimento em S.cerevisiae na

presença de agente oxidante: H2O2. ANOVA e Teste de Dunnett’s * * P≤ 0. 01.
O melhor desempenho obtido foi com a cat1Δ, linhagem defectiva na produção

de catalase (Figura 4). Antimutagenicidade de extratos etanólicos de própolis vermelha
contra vários mutágenos foram observadas (Jeng et al., 2000). Uma variedade de
substâncias presentes na própolis tem efeitos antimutagênicos, tais como carotenóides e
compostos fenólicos (Salatino et al., 2005).
83
s od1/cat 1
cat 1
Linhagens
s od1/s od2
s od 2
s od 1
SOD
0 10 20 30 40 50 60 70
Percentual de modulação
Ácido gálico + H2O2 Rutina + H2O2 Quercetina + H2O2 Própolis + H2O2
Figura 4. Efeitos da própolis vermelha na modulação (%) de danos oxidantes

pelo H2O2. ANOVA e Teste de Dunnett’s, com significância de * * P≤ 0. 01.
c. Atividade antigenotóxica
Os dados obtidos no teste de micronúcleos indicam que a própolis modula a

indução de danos citogenéticos (aberrações cromossômicas) em medula óssea de
camundongos, induzidas pela CPA em 75 % , em pré-tratamento e tem efeitos
inibidores na ordem de 62%, nos danos induzidos pela CPA, em pós-tratamento (Tabela
I).
Tabela I: Avaliação da ação do extrato de própolis vermelha na genotoxicidade

induzida pela ciclofosfamida (50 mg/Kg) em medula óssea de camundongos
em pré e pós-tratamento
Tratamentos Lam. Lam. Lam. ∑ Média/DV Nº de % % Inibição
1 2 3 PCE PCE
CN 3 3 4 10 3 ± 0,5 3.000 0,06 –
CP 9 11 14 34 11 ± 2 3.000 0,2 –
Ext. Propolis 4 5 5 14 5 ± 0,5 3.000 0,1 –
Pré-tratamento 5 4 6 15 5±1 3.000 0,1 75,0
Pós-tratamento 7 6 5 18 6±1 3.000 0,1 62,5
84
Fonte: Pesquisa realizada no laboratório de Genética Toxicológica do Centro Federal de
Educação Tecnológica do Piauí em 2006, CN=controle negativo e CP=controle
positivo.
A antimutagenicidade da própolis em pré-tratamento e pós-tratamento (Figura 2)

diante dos danos ao DNA de células da medula óssea de camundongos submetidos a
tratamento com CPA pode estar principalmente relacionada com atividade antioxidante
dos compostos químicos. A este respeito tem sido descrito que os compostos fenólicos
protegem efetivamente as células dos efeitos genotóxicos induzidos por agentes
oxidantes, principalmente pela habilidade desses compostos de seqüestrar ERO e quelar
metais (Khorkhar, 2003). Cabe lembrar que a ação sinergística entre compostos
antioxidantes foi relatada e relacionada com a alta atividade antioxidante de extratos
vegetais e que o ácido ascórbico em mistura com compostos fenólicos tem sua atividade
antioxidante aumentada (Moure et al., 2001).
Figura 5: Antimutagenicidade da própolis vermelha de Pernambuco em pós-

tratamento, na inibição de danos alquilantes e oxidativos induzidos ao DNA de
medula óssea de camundongos. Análise de Variância ANOVA, seguida do
teste de Student e teste T de Tukey. *** P≤ 0,001, CN=controle negativo e
CP=controle positivo.
A própolis é um importante produto químico natural que além das propriedades

nutritivas e medicinais também oferece proteção contra a mutagênese induzida por
agente alquilante e oxidante, com atividade antimutagênica observada in vivo em
medula óssea de camundongos em pré-tratamento e pós-tratamento (Figura I),
possivelmente por mecanismos atribuídos às propriedades antioxidantes de alguns dos
85
seus constituintes químicos, a exemplo dos flavonóides, por reação direta com o
mutágeno (CPA), por inativação e/ou ativação das enzimas de fase I, por indução das
enzimas de fase II e por prováveis participações nos mecanismos de reparo.
Um dos mecanismos propostos para os efeitos observados é a atividade
antioxidante da maioria dos compostos químicos presentes na própolis. Existem relatos
de que amostras de própolis apresentam excelentes propriedades antioxidantes com
atividade de seqüestrar radicais livres observadas com o teste DPPH devido a alta
concentração de compostos fenólicos tais como ácido cumárico, hidroxiacetofenona e
dihidroxi calconas (Trusheva et al., 2006). A própolis inibe neurotoxicidade de células
expostas em peróxido de hidrogênio (Inokuchi, 2004). Cabe lembrar que a ação
sinergística entre compostos antioxidantes foi relatada e relacionada com a alta
atividade antioxidante de extratos vegetais e que o ácido ascórbico em mistura com
fenólicos tem sua atividade antioxidante aumentada (Moure et al., 2001).
Os resultados (Tabela I, Figura I) demonstram que a própolis é importante fonte
de compostos químicos com excelentes atividades antimutagênicas em medula óssea de
camundongos avaliados pela freqüência de micronúcleos, em pré e pós-tratamento. O
estudo sugere que a própolis protege contra clastogênese e aneugênese induzida pela
CPA que pode ser devido a sua atividade antioxidante, modulação das enzimas de fase I
e II envolvidas na detoxificação da CPA ou como substrato competitivo para ação
nucleofílica da CPA.
4. CONCLUSÕES
A identificação de atividades antimutagênicas e antioxidantes in vivo associadas

aos mecanismos de ação de produtos químicos naturais a exemplo da própolis é um
indicativo preliminar de que novas pesquisas merecem atenção especial devido aos
efeitos da própolis para a saúde humana, como agente quimiopreventivo de mutações
e/ou câncer, bem como na sua ação terapêutica e complementar ao tratamento de
pacientes com doenças relacionadas com a instabilidade genética. Outros estudos in
vitro e in vivo serão feitos para avaliar os prováveis mecanismos para os efeitos
observados na ação quimiopreventiva dos componentes químicos naturais presentes na
própolis vermelha.
5. REFERENCIAS
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88
5.2. ARTIGO VI: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DA
PRÓPOLIS FRENTE A ESPÉCIES DE Candida sp. E ANTIINFLAMATÓRIA
EM EDEMA DE PATA DE RATO E EDEMA DE ORELHA DE
CAMUNDONGOS
Artigo a ser submetido ao Latin American Journal of Pharmacy
RESUMO
A ação antimicrobiana da própolis é a atividade farmacológica mais conhecida

popularmente e a mais estudada cientificamente, seguidamente temos a atividade nos
processos antiinflamatórios e oxidantivos (sendo interrelacionáveis). Esses processos
estão relacionados a um grande numero de doenças e mau funcionamento orgânico. A
princípio, a constatação de cepas de Candida em qualquer microbiota do homem não
induz nenhum transtorno que possa favorecer patologia, embora as leveduras de
Candida spp. talvez sejam o fungo mais oportunista descrito. O aumento crescente das
infecções por cândidas (sobretudo nosocomial) e a sua resistência a antimicrobianos te m
levado a busca de novas alternativas terapêuticas. Inúmeros pesquisadores têm
demonstrado a atividade antiinflamatória da própolis em diversos modelos, levando a
crer na possibilidade de vários mecanismos de ação. O presente estudo testou a
sensibilidade de sete espécies do genero Cândida de interesse clínico, bem como a
atividade antiinflamatória da própolis vermelha do litoral de Pernambuco e da própolis
verde de Minas Gerais em dois modelos animais. No ensaio de inibição em placas de
Petri usando discos de papel impregnado de extrato de própolis observou-se variados
níveis de inibição, pelo menos uma discreta inibição foi observada para a maioria das
cepas. Para a atividade antiinflamatória foi observado em ambos os modelos uma maior
efetividade para a própolis vermelha. Esses estudos preliminares apontam diferenças de
efetividade entre esses dois tipos de própolis e despertam para o aprofundamento da
pesquisa tendo em vista os escassos estudos realizados para a própolis vermelha.
Palavras-chave: Própolis vermelha, antifúngico, antiinflamatório
ABSTRACT
The microbiotics killer activity of propolis is the phar macological activity more
popularly known and the more studied scientifically, continuously we have the activity
in the anti-inflammatory processes and oxidantives (being interrelacionáveis). Those
processes are related to a big one number of diseases and bad organic operation. At first,
the verification of stumps of Cândida in any the man's microbiota doesn't induce any
upset to favor pathology, although the yeasts of Candida spp. maybe be the mushroom
more described opportunist. The growing increase of the infections for white (above all
nosocomial) and in his/her resistance the anti microbiotics has been taking the search of
new therapeutic alternatives. Countless researchers have been demonstrating the anti -
inflammatory activity of the própolis in several models taking to have faith in the
possibility of several action mechanisms. The present study tested the sensibility of
seven species of Cândida sp. Of clinical interest as well as the anti -inflammatory
activity of the red própolis of the coast of Perna mbuco and of the green própolis of
Minas Gerais in two animal models. In the inhibition rehearsal in plates of Petri using
89
disks of impregnated paper of própolis extract was observed variables inhibition levels,
at least a discreet inhibition was observed for all of the stumps. For the anti-
inflammatory activity it was observed in both models a larger effectiveness for the red
própolis. Those preliminary studies point differences of effectiveness among those two
própolis types and they wake up for the aprofundamento tends in view the scarce
studies accomplished for the red própolis.
Keywords: Red própolis, antifúngico, anti-inflammatory
INTRODUÇÃO
A capacidade da própolis em inibir o crescimento de microorganismos é a

atividade farmacológica mais popularmente conhecida e comprovada cientificamente.
Muitos estudos são realizados utilizando extratos de própolis com o objetivo de avaliar
sua atividade antimicrobiana e antifúngica. Essas atividades são justificadas devido à
sua complexa composição, incluindo a presença de compostos como flavonóides e
ácidos fenólicos (MENEZES, 2005).
Leveduras do gênero Candida constituem um grupo de fungo presente na
microbiota da pele e mucosa do homem desde o nascimento. Seu advento é decorrente
da presença na cavidade vaginal ou no ambiente de centro cirúrgico, sendo adquirida
através da passagem do feto via canal vaginal ou do ato de cesariana (BIRMAN, 1998).
Estas leveduras são detectadas momento após o nascimento na cavidade bucal do
recém-nascido e duas a três semanas em todo trato gastrointestinal da criança
(CARAMALAC, 1995; DONNEZ & SOYES,1987; LACAZ et al., 1991;
MARCANTONI, 1999; ODDS, 1993; PINTO, 2003; RIBEIRO, 2002). A convivência
levedura-hospedeiro ocorre durante toda a vida, sendo detectada nas sucessivas
microbiotas humanas até o estabelecimento da definitiva (PINTO, 2003).
A princípio, a existencia de cepas de Cândida em qualquer microbiota do
homem não induz nenhum transtorno que possa favorecer patologia, embora as
leveduras de Candida spp talvez sejam o fungo mais oportunista descrito. Todavia,
quaisquer alterações orgânicas, independente da natureza, comumente favorecem a
manifestação infecciosa deste fungo leveduriforme, principalmente quando as condições
tópicas, quanto aos aspectos físico-químico e biológico da pele ou mucosa envolvida,
propiciam a sua proliferação exacerbada com aguçamento de seus fatores de virulência,
havendo ainda alguma irregularidade funcional do sistema imunológico do home m
(CARVALHO et al., 2003; MARCANTONI, 1999).
90
Responsável por mais de 85% das infecções fúngicas, a Candida albicans são
tipicamente tratadas com antimicóticos do grupo azol, que muitas vezes já estão
associados a fenômenos de resistência. Devido às suas propriedades, estudos com a
própolis mostraram sua eficácia no combate à Candida sp presente em infecções
vaginais utilizando duchas vaginais contendo extratos de própolis (Imhof et al.,2005).
A relevância das infecções por Candida spp em ambiente hospitalar passou a
ganhar importância a partir da década de 1980, interligada ao avanço da tecnologia
científica médica e do melhor conhecimento dos mecanismos desencadeadores de
doenças, propiciando uma sobrevivência maior do homem. Este fato fez com que as
intervenções de procedimentos clínico-laboratoriais expusessem os pacientes a uma
seletividade de microrganismos mais resistentes, favorecidos pelo uso indiscriminado
ao longo do tempo dos fármacos disponíveis no mercado. Deste modo, os relatos de
cepas de Candida spp envolvidas em enfermidades humanas na condição de agente
principal e/ou secundário tornaram-se mais freqüentes, fazendo deste microrganismo
um dos mais relevantes e intimamente associado às infecções nosocomiais (BECK-
SAGUÉ & JARVIS, 1993; COLOMBO & GUIMARÃES, 2003).
Estudos realizados em diferentes países têm mostrado diferença na
epidemiologia das infecções invasivas por Candida spp. No período de agosto de 2002 a
agosto de 2003, foi conduzido estudo na Santa Casa Complexo Hospitalar, Porto
Alegre, Brasil, para determinar a distribuição das espécies de Candida , a maioria dos
episódios (51,6%) ocorreu por espécies outras que C. albicans, incluindo C.
parapsilosis (25,8%), C. tropicalis (13,3%), C. glabrata (3,3%), C. krusei (1,7%) e
outras espécies (7,5%) (Antunes, 1996).
Outra propriedade da própolis bastante citada na literatura é sua atividade
antiinflamatória. Os processos inflamatórios estão associados a diversas doenças e suas
causas são variadas. Freqüentemente a própolis é recomendada por fitoterapêutas
devido suas propriedades antiinflamatórias que foram descritas principalmente contra
doenças do sistema musculo-articular e outros tipos de inflamações, infecções,
reumatismos e torções (MARCUCCI, 1995). Foi utilizada na dermatologia, na
cicatrização de ferimentos, regeneração de tecidos, tratamento de queimaduras,
neurodermitis, eczemas, dermatites de contato, úlceras externas, psoriase, lepra, herpes
simples, zoster genitalis, pruridos e dermatófitos (GHISALBERTI, 1979; MARCCUCI,
1995).
91
NAITO et al (2007) demonstraram, em estudo recente, que a aplicação tópica de
extrato de própolis é efetivo na inibição do edema de pata em ratos induzido por
carragenina e que o efeito inibitório na quimiotaxia de polimorfonucleados pode
também contribuir para o efeito antiinflamatório.
Em trabalhos com camundongos e coelhos tem sido constatada uma atividade
antiinflamatória de soluções hidroalcoólicas da própolis, tanto em aplicações tópicas,
bem como através de injeções ou mesmo via oral. Detalhes desses estudos podem ser
encontrados em IVANOVSKA et al. (1995), PARK et al. (1996), LEDON et al. (1997)
e MENEZES et al. (1999). Alguns pesquisadores isolaram determinados compostos da
própolis que apresentam conhecida atividade antiinflamatória. MIRZOEVA &
CALDER (1996) atribuíram esta propriedade à presença na própolis de compostos tais
como o ácido cafeico, a quercetina, a narigenina e o éster fenetílico do ácido cafeico
(CAPE). Esta atividade antiinflamatória seria resultante da supressão da síntese de
prostaglandinas e de leucotrienos pelos macrófagos.
O presente trabalho objetiva testar a susceptibilidade de cepas de C. albicans, C.
luzitaniae, C. dublinienses, C. kruzei, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. guilliermondii
frente a extratos hidroalcoólicos de própolis verde e vermelha, bem como a atividade
antiinflamatória em edema de pata de rato e edema de orelha de camundongos.
METODOLOGIA
a. Amostra de própolis
A amostra de própolis vermelha foi coletada numa área de restinga próximo à
cidade de Itapissuma-PE (coletada no apiário da empresa Mel Brasil Ltda, distrito de
Atapuz – PE, S: 7º 33’ 38’’ W: 35º 0’9’’), em outubro de 2006, acondicionada e m
recipiente plástico opaco, hermeticamente fechado, e conservada sob refrigeração entre
(-10 e -5ºC) e a amostra de própolis verde foi obtida da empresa Apis & Indigenas de
Belo Horizonte-MG em janeiro de 2007. As amostras foram analisadas segundo a
Instrução Normativa nº3 do Ministério da Agricultura (2001).
.
b. Obtenção do extrato
durante 48 h, em solução hidroalcoólica a 80%. Após esse tempo, o extrato foi filtrado e
92
acondicionado em frasco de vidro âmbar seguindo metodologia descrita por Park et al
1998.
c. Atividade antifúngica
Foi realizado teste de inibição em placa contendo meio sólido Saboraud, para fungos
e leveduras. Colocaram-se discos de papel de filtro estéreis pesando 30 mg ± 4mg/cm 2
e 6mm de diâmetro, embebidos em extratos hidroalcoólicos de própolis verde e
vermelha, após secagem em estufa a 40ºC, dispostos na placa semeada com uma das
espécies de cândida em estudo. As placas foram incubadas em estufa de câmara úmida a
37ºC por 48 horas após a semeadura, quando a leitura foi realizada, avaliando-se o
tamanho do halo de inibição do crescimento microbiano em milímetros. Os
experimentos foram realizados em triplicata e os resultados expressos pela média
aritmética.
d. Atividade antiinflamatória
Animais
Os testes foram realizados em camundongos (Mus musculus) adultos de ambos os
sexos, com peso de 25 a 30g, provenientes do biotério da Faculdade de Ensino Superior
de Floriano-PI. Os animais foram previamente mantidos em condições controladas de
temperatura (22 ± 1ºC) e iluminação (ciclo claro/escuro de 12 horas) com livre acesso a
ração e água ( Ad libitum).
Ede ma de orelha
Os camundongos (n=6) foram tratados com extrato fluido hidroalcoólico de própolis
verde (grupo I), extrato fluido hidroalcoólico de própolis vermelha (grupo II), aplicados
topicamente um volume de 20µL em iguais concentrações e um controle positivo
(grupo III) tratado com Dexametasona 2mg/orelha.
Para as observações dos efeitos antiinflamatórios, os animais foram separados em
dois grupos: um experimental e outro controle positivo. Os extratos foram testados no
edema agudo após aplicação de 20µL na orelha direita dos camundongos dos sub
grupos experimentais I (Própolis verde) e II (Própolis vermelha), ambos a 100mg/mL
em resíduo seco. O sub grupo III foi tratado com o veículo, 20µL de álcool absoluto na
orelha direita, e o sub grupo IV foram tratados com Dexametasona 20µL (2mg) na
93
orelha direita. Todos os grupos têm como controle a orelha contralateral o mesmo
volume de solução salina. Após 1 hora da aplicação dos extratos, veículo e droga
controle, os animais receberam aplicação tópica de 20µL de óleo de cróton (5% e m
acetona) na orelha direita, tendo como controle a orelha contralateral administrada o
mesmo volume de acetona. Após 4 horas os animais foram sacrificados e removidos
discos de 5 mm de diâmetro das orelhas e pesados (SCHIANTARELLI, et. al, 1982)
citado por BRAGGIO, et. al (2002).
A diferença entre o peso das orelhas foi tomada como o edema induzido por óleo de
cróton.
Ede ma de pata
Foram utilizados ratos machos pesando de 150-200 g, reunidos em grupos de seis

animais. Estes animais tiveram suas patas traseiras direitas marcadas na borda póstero-
proximal da proeminência do calcanhar e seus volumes (ml) determinados através de
um pletismógrafo. Os animais receberam uma injeção intraplantar (100 l) de
carragenina 1 % (tempo 0). Após 1, 2, 3, 4 e 5 horas da injeção do agente edemaciante,
o volume da pata foi novamente medido (VF) e o volume de edema (VE) foi
determinado pela diferença em relação à medida inicial (VI).
VE = VF – VI
Trinta minutos (tratamento via i.p.) antes da injeção do agente edemaciante, os

animais foram tratados com o extrato hidroalcoólico de Própolis verde e vermelha. Os
animais controle foram administrados com um volume equivalente de salina 0,9%.
a. Atividade antifúngica
Na maioria das placas de Petri observou-se, pelo menos uma discreta inibição a
qual deve ser levada em consideração a concentração do extrato que pode ser
incorporada ao disco de papel (menos de 5mg). Esses resultados preliminares mostra m
uma atividade mais efetiva para o extrato hidroalcoólico de própolis vermelha do que
94
para o de própolis verde. Esse fato contraria a literatura e outros ensaios anteriores
(Fernandes, 2007), todavia se faz necessário a repetição bem como a definição precisa
das concentrações dos extratos ensaiados.
Abaixo pode-se observar a inibição para a Candida albicans (fig 01, placa 1)a
qual se mostrou discreta sendo melhor observada para a própolis vermelha (discos da
direita vm). Esse achado contraria o estudo realizado por Ota et al. (2001) no qual
encontrou-se, para extratos alcoólicos de própolis, a melhor efetividade para C. albicans
sendo que a C. guilliermondii apresentou a maior resistência a ação da própolis (fig 01,
placa 7).
Essa espécie é responsável pela maioria das infecções causadas por cândidas,
sendo de particular importância clínica.
Na Figura 01 (placa 3) pode-se observar o melhor resultado de inibição
conseguido neste ensaio com aproximadamente 4mg do extrato. Trata-se da Cândida
dublinienses, espécie recentemente descrita (1995) e primariamente relacionada com
candidiase oral em pacientes imonossuprimidos portadores do HIV, sintomáticos ou
não.
Fig 1: placa 1 C. albicans, placa 3 C. dublinienses e placa 7 C. guilliermondii.

Vm-própolis vermelha e vd-própolis verde.
vd
vd
vd
vm
vm vm
95
Tabela 01: Medida dos halos de inibição de crescimento de cândida por
extratos de própolis
CEPAS DE Candidas Própolis verde Própolis vermelha
C. albicans 6,5 mm 8,2 mm
C. parapsilosis * *
C. tropicalis * 6,5 mm
C. guilliermondii 6,2 mm 7,0 mm
C. cruzei * *
C. luzitaneae 6,0 mm 6,2 mm
C. dublinienses 7,0 mm 10,0 mm
* Não foi possível observar inibição
Vários estudos a respeito da suscetibilidade de espécies de cândida a vários

antifúngicos tem sido realizados, dentre os quais pode-se citar o trabalho realizado por
Ito et al (2004) que cita a suscetibilidade in vitro de cândidas isoladas de pacientes
mostrando a tendência do aparecimento de resistência. Corroborando com esse estudo
Batista et al. (1999), chama a atenção para os efeitos colaterais e adversos das drogas
antifúngicas utilizadas, sobretudo para a anfotericina B, tida como droga padrão em
efetividade contra esse gênero de fungo. Esse fato impulsiona para a necessidade de se
encontrar alternativas terapêuticas.
Holderna e Kedzia (1987) estudaram a ação combinada de antimicóticos e
própolis em C. albicans e encontraram um aumento da inibição mostrando a existência
de um efeito sinérgico.
O possível mecanismo de ação da própolis é a inibição da divisão celular na
presença desta; e este fato sugere que a própolis pode operar por inibição da replicação
do DNA e, indiretamente, na divisão celular, embora não se possa afirmar que seja
semelhante ao modo de ação dos antibióticos clássicos (OTA TA, 2001).
A maioria dos estudos não detecta a inibição no crescimento de Candida
albicans em cultura, embora poucos estudos como o de SOSA et al. (1997) e HEGAZI
et al. (2000) tenham constatado a inibição desta levedura pela própolis.
96
Realizaram-se testes de sensibilidade em 80 cepas de Cândidas (20 C.
albicans,20 C. tropiocalis,20 C. kruzei e 15 C. guilliermondii) mostrando clara
atividade antifúngica sendo a C. albicans a mais sensível e a C. guilliermondii a menos
sensível (OTA, 2001).
Embora a atividade ora apresentada tenha se mostrado baixa, é importante
ressaltar que associações da própolis com antimicrobianos convencionais ou mesmo
contra algumas cepas resistentes tem mostrado bons resultdos inibitórios. Cepas
resistentes a benzilpenicilina, tetraciclina e eritromicina foram sensíveis a própolis. A
própolis possui efeito sinérgico quando combinado com um dos três antibióticos para
essas cepas resistentes (SHUB, 1981).
b. Atividade antiinflamatória
Ede ma de orelha
Os resultados apontam, para a existência de atividade antiinflamatória para a
própolis vermelha nas concentrações utilizadas e a não existência, estatisticamente
significativa, para a própolis verde (Gráfico 1). Trabalhos anteriores mostram a
existência de atividade antiinflamatória para própolis verde (REIS, 2000).
20
Diferença de peso das orelhas (mg)
Controle
Própolis Vermelha
Própolis Verde
15
* Dexametasona
10
***
5
* P < 0.05 ***P < 0.001 (nível de significância em relação ao controle) one-way
ANOVA.
Gráfico 1: Atividade antiedematogênica de extratos de própolis em edema de
orelha de camundongo.
97
Ede ma de pata
O modelo de edema de pata é agudo e progressivo, proporcional a intensidade da
resposta inflamatória e seu desenvolvimento depende do agente flogístico utilizado. O
edema induzido por carragenina é um modelo bifásico, com vários mediadores atuando
em seqüência para produzir a resposta inflamatória. Na fase inicial (0-1 h) ocorre
liberação de histamina, serotonina e bradicinina. A fase posterior (1-6 h) está
correlacionada com elevada produção de prostaglandinas, ativação da COX-2 e, em
estudos mais recentes, liberação de NO, na resposta inflamatória (SILVA, 2005).
A tabela 1 e o grafico 2 apresentam a evolução do edema de pata induzido por
carragenina e a ação dos extratos testados. Pode ser observado que há uma ação tanto a
na inibição de histamina, serotonina e bradicinina quanto de prostaglandina.
Tabela 02: Efeito do extrato etanólico de própolis verde e vermelha no edema de pata
induzido por carragenina. Os valores representam a diferença de volume, em mililitros,
entre as patas injetadas com carragenina e aquelas injetadas com salina.
Controle
Tempo Dexametasona EPvd EPvd EPvd EPvd
NaCl
1mg/Kg 25mg/Kg 50mg/Kg 25mg/Kg 50mg/Kg
0,9%
0 0 0 0 0 0 0
60 0,67±0,03 0,15±0,03 0,39±0,04 0,26±0,05 0,31±0,04 0,23±0,06
120 1,13±0,06 0,25±0,05 0,52±0,03 0,5±0,08 0,49±0,06 0,6±0,09
180 1,38±0,09 0,3±0,06 0,78±0,07 0,77±0,04 0,75±0,05 0,74±0,08
240 1,36±0,12 0,22±0,07 0,88±0,03 0,55±0,08 0,72±0,04 0,58±0,05
300 1,15±0,10 0,1±0,06 0,7±0,09 0,49±0,11 0,6±0,11 0,49±0,03
Valores expressos como média ± e.p.m. de 6 animais.
98
ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA DE EXTRATOS DE PRÓPOLIS
1,6
Vol da pata
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300
Controle NaCl 0,9% Dexametasona 1mg/Kg EPvd 25mg/KgTempo (min)

EPvd 50mg/Kg EPvm 25mg/Kg EPvm 50mg/Kg
Gráfico 02: Efeito do extrato etanólico de própolis verde (EPvd) e vermelha (EPvm) no
edema de pata induzido por carragenina.
A participação do CAPE-éster fenetílico do ácido cafeico isolado da própolis, na

inibição da síntese de prostaglandinas foi também constatada por BORRELLI et al.
(2002). Além destes compostos, KRO et al. (1996) caracterizaram na própolis mais
outros 15 compostos que, conhecidamente apresentam esta atividade antiinflamatória,
entre eles o ácido salicílico, a apigenina, o ácido felúrico e a galangina. A inibição na
geração de óxido nítrico por macrófagos é também apontada como um dos fatores
responsáveis pela atividade antiinflamatória da própolis (Nagaoka et al., 2003).
Entretanto, outros estudos indicam um aumento na produção de H 2O2 e NO por estas
células (ORSI et al., 2000). Um incremento na mobilidade e espraiamento destas células
também foi constatado por TATEFUGI et al. (2003).da mesma forma que citado por
Menezes (2005) em estudos utilizando camundongos e coelhos aplicando soluções
hidroalcoólicas de própolis na forma tópica, intraperitoneal ou oral.
Observa-se, a partir dos ensaios realizados, a atividade antiinflamatória da
própolis tanto a nível tópico/local (no edema de orelha) quanto a nível sistêmico (edema
de pata).
CONCLUSÃO
O estudo mostra que o extrato de própolis vermelha mostrou uma melhor
atividade na inibição de espécies de cândida e como agente antiinflamatório que
oextrato de própolis verde. É importante ressaltar que os estudos aqui citados indicam
que a própolis apresenta potencial para as atividades farmacológicas aqui apresentadas,
99
tanto a vermelha quanto a verde. Todavia, ainda serão necessários muitos estudos
envolvendo ensaios pré-clínicos e clínicos capazes de determinar as doses corretas a
serem administradas e o real efeito da própolis.
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102
6 DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO
103
6.1 ARTIGO VII: DESENVOLVIMENTO DE GEL VAGINAL CONTENDO
EXTRATO DE PRÓPOLIS VERMELHA
Artigo a ser submetido ao Latin American Journal of Pharmacy
Resumo
A própolis é mundialmente conhecida por suas propriedades medicinais destacando-se

as atividades antibacteriana, antifúngica e antiinflamatória. As vaginites inespecíficas
podem ser causadas por bactérias e ou fungos desencadeando no quadro inflamatório. O
uso da própolis para esse fim já foi citado na literatura apresentando bons resultados,
todavia, no sentido de direcionar e prolongar o contato da própolis com a mucosa
vaginal, corroborando com uma atividade biológica mais efetiva. Os produtos
mucoadesivos permacem por um maior tempo aderidos ao local de ação devido a
interações entre os polissacarídeos do muco e as cadeias poliméricas dos géis. Este
trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de gel mucoadesivo, para o qual foi
obtido um extrato de própolis, secado a baixa pressão, ressuspendido em propilenoglicol
e incorporado em uma base de gel, caracterizado e verificado a compatibilidade em
cinco polímeros distintos (derivados celulósicose e ácido poliacrilicos). O pH das
formulações obtidas foi ajustado para valores compreendidos entre 4,5 – 5,5, a
viscosidade variou bastante (86000-350000cps) nas concentrações usuais do polímero e
as densidades relativas variaram entre 0,97 a 1,00. Os resultados levam a conclusão de
que os derivados poliacrílicos possuem melhor afinidade com o extrato de própolis
destacando-se o Pemulen, podendo se constituir numa formulação promissora para o
desenvolvimento de um medicamento a base de própolis.
Palavras-Chave: Própolis, Gel, Mucoadesão.
Abstract
Propolis is world famous for its medicinal properties is highlighting the activities
antibacterial, antifungal and antiinflammatory. The vaginites nonspecific may be caused
by bacteria or fungi and triggering under inflammatory. The use of propolis for this
purpose has already been cited in the literature showing good results, however, to direct
and prolonged contact with the lining of the vaginal propolis, favouring a more effective
activity, with the objective to study the development of gel mucoadhesive . The
products mucoadhesives permacem longer adhered to the place of action due to
interactions between the polysaccharides of mucus and the chains of polymer gels. For
both returned to the extract of propolis, dried up the low pressure, ressuspendeu in
propylene and incorporated into a base of gel characterizing them and found to be
compatible with five different polymers (cellulose derived acid poliacrilicos ee). The pH
of formulations obtained was set to values between 4.5 to 5.5 with latic acid, the
viscosity varied greatly (86,000-350000cps) in the usual concentrations of polymer and
the relative densities ranged from 0.97 to 1.00. The results lead to the conclusion that
the derivatives poliacrílicos have better affinity with the extract of propolis It points out
the Permulen, may constitute a form promising for the development of a drug the basis
of propolis.
Key words: Propolis, Gel, Mucoadesion.
104
INTRODUÇÃO
A própolis é uma mistura complexa, formada por material resinoso e balsâmico
coletado pelas abelhas dos ramos, flores, pólen, brotos e exudados de árvores; além
desses, na colméia, as abelhas adicionam secreções salivares (PEREIRA et al., 2002).
Não é utilizado apenas como material de construção, mas é a mais importante ―arma
química‖ das abelhas contra microorganismos patógenos e tem sido usada como
remédio por humanos desde a antigüidade (BANKOVA, 2005).
Para produção de própolis, abelhas usam materiais resultantes de uma variedade
de processos botânicos em diferentes partes das plantas. São substâncias ativamente
secretadas pelas plantas bem como exudados de feridas nas plantas: ma teriais lipofílicos
nas folhas e germes, látex, resinas, etc. A composição química depende da
especificidade da flora local e das características geográficas e climáticas. Este fato
resulta no interesse pela diversidade na composição química da própolis, especialmente
pela própolis originária das regiões tropicais (BANKOVA, 2005).
Várias atividades biológicas têm sido descritas para a própolis, incluindo
antibacteriana, antifúngica, antiprotozoária, antitumoral, imunomodulatória,
antiinflamatória, entre outras (SANTOS et al., 2002). Dentre elas, as atividades
antibacteriana e antifúngica são as mais populares e são as mais extensivamente
investigadas (KUJUMGIEV et al., 1999).
A vaginose bacteriana e a candidíase vulvovaginal são as causas mais
prevalentes de vaginite sintomática. Setenta a setenta e cinco por cento das mulheres
experimentarão pelo menos um episódio durante suas vidas e 40 a 50% delas
experimentarão infecção periódica (SOBEL, 1998; HAY, 2000).
O tratamento das infecções vaginais é realizado pelo uso de antibióticos tópicos
ou orais (Edwards, 2004) que, mesmo quando eficazes, estão associados com o
aparecimento de microorganismos resistentes, de efeitos colaterais e de altas taxas de
recorrência (Reid, 2002). Imhof et al, (2005) consideram que, diferente dos antibióticos
e antimicóticos químicos clássicos, a própolis não está associada ao aparecimento de
resistência microbiana, porque a duração da fase lag permanece inlterada até mesmo
após aplicação repetida. Ainda esses mesmos autores, em estudos realizados em
pacientes com vaginite crônica, observaram que uma solução aquosa de própolis a 5%
(na forma de enxaguatório ou ducha vaginal) resultou em melhorias significativas dos
esfregaços vaginais e bem estar subjetivo. Alem de fornecer efeitos antibióticos e
105
antimicóticos, conduziu a um alívio sintomático inicial devido suas propriedades
anestésicas.
As duchas vaginais possuem o incoveniente de, devido sua baixa viscosidade e
alta fluidez, não permanecerem aderidas a mucosa por um tempo prolongado ou seja,
não possuem bioadesão. Longer e Robinson, em 1986, citaram, pela primeira vez esse
termo como a ligação de macromoléculas sintéticas ou naturais a um muco e/ou
superfície epitelial. Podemos admitir, com base em Rathbone (1994) que, considerando
o muco que reveste a cavidade vaginal, do ponto de vista tecnológico, como um
substrato biológico, a sua presença permitirá que o sistema administrado permaneça
mais tempo aderido e que esse contato poderá ainda ser auxiliado pela presença de
compostos mucoadesivos. Estudos de Nagai et al, do final da década de 70 e início da
década de 80 renovaram o interesse pelo uso de polímeros bioadesivos, no sentido de
prolongar o tempo de contato da forma farmacêutica na membrana mucosa (LEE,
2000).
Sistemas de liberação de drogas na mucosa vaginal incluem uma extensa
variedade de formas farmacêuticas como semi-sólidos, comprimidos, cápsulas,
preparações líquidas, filmes, enxaguatórios, espumas e tampões. Os mais amplamente
utilizados são os semsólidos crme, pomadas e géis (Prista et al, 1996; Vermani and
Garg, 2000). Os géis, matrizes poliméricas tridimensionais na forma de suspensões
coloidais, podem apresentar diversas vantagens sobre os outros sistemas de
administração de medicamesntos via vaginal como alta biodisponibilidade segurança,
versatilidade e economia (Justin-Temu et al, 2004). Caracterizam-se como os sistemas
mucoadesivos mais estudadas e a via vaginal é altamente apropriada a bioadesão, tendo
como principal vantagem o aumento do tempo de co9ntato in sito da droga (Smaret,
2004; Edsman and Hagerstrom, 2005). A interpenetração do polímero formador do gel
com a camada mucosa vaginal pode resultar nessa, desejada, bioadesão. O mecanismo
de bioadesão não é bem compreendido, mas processos físicos como forças
electrostáticas, interações hidrofóbicas, pontes de hidrogênio e interações de Van Der
Wall's desempenham importantes papéis (Woodley, 2001). Muitos são os polímeros
empregados na obtenção de géis mucoadesivos, em sua maioria de natureza hidrofílica
(Correa et al, 2005), todavia as caracrterísticas hidrofóbicas, próprias da própolis devido
seu conteúdo em ceras, limita as possibilidades de incorporação nesses referidos géis.
Os polímeros utilizados agem como agentes suspensores que retardam a sedimentação e
a aglomeração das partículas ao atuarem como uma barreira energética que minimiza a
106
atração entre as partículas e sua agregação entre si, aumentando, assim, a viscosidade e
melhorando a estabilidade das suspensões (Lachman et al., 2001).
O presente estudo objetivou a obtenção de extrato de própolis vermelha, oriunda
do litoral de Pernambuco e sua incorporação na forma farmacêutica gel, com
características mucoadesivas, com vistas ao uso vaginal.
METODOLOGIA
Própolis
A amostra foi coletada numa área de restinga próximo à cidade de Itapissuma-

PE (coletada no apiário da empresa Mel Brasil Ltda, distrito de Atapuz – PE, S: 7º 33’
38’’ W: 35º 0’9’’), em outubro de 2006, acondicionada em recipiente plástico opaco,
hermeticamente fechado, e conservada sob refrigeração entre (-10 e -5ºC).
Preparação do extrato
durante 48 h, em solução hidroalcoólica a 80%. Essa preparação foi submetida à
sonicação à temperatura ambiente durante 15 minutos no início e após o tempo de
maceração. Após esse tempo, o extrato foi filtrado e acondicionado em frasco de vidro
âmbar foi então resfriado e filtrado a vácuo em papel de filtro por duas vezes para a
retirada do excesso de ceras. Posteriormente foi co ncentrado em rotavapor à
concentração de 63,85 mg/mL.
Preparação dos Géis
Foram preparados 8 lotes de bancada variando a concentração e/ou a natureza da

base do gel, mantendo-se a concentração do extrato de própolis em 20 mg/g de gel. As
bases utilizadas foram Pemulen TR-1 e TR-2, Natrosol, Cekol 2000 e CMC, todos com
características mucoadesivas, citados na literatura (Smart, 2005; Neves, 2006; Figueiras,
2007), conforme Tabela 1. A avaliação e subsequentes testes toxicológicos tê m
demonstrado uma baixa toxicidade e irritação potencial para esses polímeros. Como
resultado dos testes intensivos e as propriedades oferecidas pelos polímeros, eles
107
ganharam grande aceitação em uma variedade de produtos farmacêuticos, cosméticos e
dos detergentes (Noveon, 2003). As bases foram preparadas e o extrato suspenso em
propilenoglicol foi incorporado sob agitação constante com ajuste de pH ao final da
manipulação.
Tabela 01: Composição dos pilotos

COMPOSIÇÃO P 01 P 02 P 03 P 04 P 05 P 06 P 07 P 08
Carboximetilcelulose
sódica - - - - - 3% - -
Hidroxietilcelulse - 2% 3% - - - - -
Cekol 2000 - - - 4% 4% - - -
Cremophor - - - - 1% - - -
Pemulen TR 1 0,5% - - - - - - -
Pemulen TR 2 - - - - - - 1% 1%
Silsense 1% - - - - - 1% 1%
Novemer 3% - - - - - 3% 3%
Óleo mineral - - - - - - 20% -
Azeitede oliva - - - - - - - 20%
Metilparabeno 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01
Propilparabeno 0,01% % % % % % % %
Propilenoglicol 20% 20% 20% 20% 20% 20% 20% 20%
Ácido lático qsp qsp qsp qsp qsp qsp qsp qsp
Caracterização do Gel
Macro e Microscopia
Os aspectos organolépticos consistem em avaliar as características da

formulação detectadas pelo órgãos do sentido como aspecto, cor e odor. O aspecto é
detectado visualmente verificando se a formulação apresenta precipitado, turvação,
separação de fases. O odor é verificado pelo órgão do sentido olfato e a análise da cor é
verificada por modo visual ou instrumental.
Fez-se a análise macroscópica comparando as formulações entre si e, com
auxílio de microscópio óptico comum com aumento de 20x, fez-se a análise
microscópica dos géis. Colocou-se em uma lâmina de vidro uma pequena quantidade de
amostra, cobriu-se com uma lamínula e observou-se a aparência microscópica,
registrando-se fotograficamente.
108
Determinação de pH
Para determinação de pH utilizou-se potenciômetro marca Micronal, modelo B

474, com eletrodo de vidro combinado com solução interna de cloreto de potássio (KCl)
saturada com cloreto de prata (AgCl). O equipamento foi previamente calibrado com
soluções tampão de pH 4,0 e 7,0. Foi realizada uma análise de pH direta, sem diluição
da amostra, em triplicata.
Determinação da densidade relativa
Para determinação da densidade relativa foi utilizado picnômetro de alumínio,

específico para semi-sólidos, devidamente calibrado em água destilada e os dados
coletados em triplicata. O picnômetro foi tarado e seu volume preenchido com água
destilada, sendo pesado em balança analítica posteriormente com esse volume de água.
Depois de seco, o picnômetro foi em seguida preenchido por completo com o gele de
própolis e novamente pesado para cálculo da densidade. A densidade foi calculada a
partir da seguinte equação:
d gel, água = m gel
m água
Onde: m gel é a massa do gel que o ocupa o volume V do picnômetro; m água é a massa de
água pura que o ocupa o mesmo volume V.
Determinação da viscosidade
Para a análise de viscosidade foi utilizado viscosímetro da marca Brookfield,

modelo DVI+ vicometer, utilizando spindle nº 6 e7, velocidade de rotação variando de
10 em 10 até 100rpm, segundo recomendações de VAN WAZER et al. (1972). O ensaio
de viscosidade foi determinado em triplicata e o resultado da viscosidade foi expresso
em unidade de cP (centi Poise).
109
Garg et al (2003) apontaram como um dos principais problemas dos sistemas
convencionais de liberação de drogas no ambiente vaginal é a rápida remoção da droga
do local de aplicação. Os géis são sistemas semi-sólidos caracterizados por possuírem
pequenas quantidades de sólidos dispersos em grandes quantidades de líquidos, mesmo
aparentando características mais de um sólido que de um líquido, podem apresentar
várias vantagens sobre outros sistemas de administração de medicamentos vaginal,
como a maior biodisponibilidade, segurança, versatilidade e menor desperdício (Justin-
Temu et al., 2004).
A via vaginal parece ser altamente adequada aos sistemas de liberação de droga
mucoadesivos para tratamentos locais ou, em alguns casos, até mesmo sistêmico, sendo
os géis uma das formulações mucoadesivas mais comumente estudadas e utilizadas
(Smart, 2004; Edsman and Hagerstrom, 2005). O mecanismo mais aceitável atualmente
para explicar a mucoadesão é a teoria da interpenetação ou difusão na qual,
primeiramente, ocorre um íntimo contato entre a forma farmacêutica e a mucosa e
depois a interpenetração dos componentes de ambos os sistemas o que pode levar a
adesão, Fig 1 (Neves, 2006).
Figura 1: Teoria da interpenetração ou difusão para o mecanismo de ligação

bioadesiva (Figueiras, 2007).
Outro fato digno de nota é que géis vaginais contendo agentes antimicrobianos
demonstraram ser tão efetivos quanto tratamentos orais de vaginose bacteriana (Sweet,
1993). Assim sendo a escolha de géis como veículos de drogas para uso vaginal reúne
critérios importantes como segurança, eficácia e economia.
Determinação de pH e da densidade relativa
110
O pH final dos géis foram ajustados em torno de 4,5 a 5,5 para torná-los
compatíveis com o pH da cavidade vaginal. O pH vaginal é um parâmetro muito
importante envolvido na eficácia d um sistema de liberação de drogas a nível de mucosa
vaginal, apresentando uma significativa associação (Ramsey, 2002).
Tabela 02: Caracterização físico-química dos géis desenvolvidos

Ensaios P 01 P 02 P 03 P 04 P 05 P 06 P 07 P 08
pH 4,68 5,32 4,76 5,12 5,22 4,86 5,35 5,42
Densidade 0,9866 1,0038 0,9079 0,9618 0,9930 0,9865 0,9839 0,9735

± ± ± ± ± ± ± ±
0,0062 0,0801 1,0418 0,0041 0,0595 0,3700 0,0435 0,6238
Viscosidade
(cps à50rpm) 352000 286220 272610 212540 182300 96810 108810 132240
Macro e Microscopia
O aspecto macroscópico dos géis foram analisados visualmente, depois de 48

horas em repouso a temperatura ambiente como mostra a figura 2. Pode-se notar que as
formulações contendo os derivados celulósicos (1-5) aparentavem mais brilho e
viscosidade todavia nota-se, a olho nu, a presença de muitas partículas, sobretudo com a
carboximetilcelulose (CMC e Cekol 2000). As bases de natrosol e CMC fora m
escolhidas devido sua fácil disponibilidade no mercado e pelo fato de serem as bases
mais utilizadas nos produtos de uso vaginal atualmente presentes no mercado.
1 – CMC
2 – Cekol
3 – Cekol + Cremofor
4 – Hidroxietilcelulose
3%
5 – Hidroxietilcelulose
2%
6 – Pemulen TR 1
7 – Pemulen TR 2 +
azeite de oliva;
8 – Pemulen TR 2 +
óleo mineral
Figura 2: Aspecto macroscópicos dos géis desenvolvidos.
111
Já as formulações feitas com polímeros de ácido acrílico apresentam-se mais
homogêneas, com aspecto cremoso. Permulen é um polímero primário emulsificante de
óleo em água o qual pode emulsificar mais de 30% de óleo p/p. É um formador de
emulsão e não um estabilizador como a maioria dos outros carbopóis. Assim as
propriedades oleosas da própolis foram mais compatíveis com o permulen mesmo na
formulação com TR1 sem óleo. Devido à sua natureza química, esses polímeros de alto
peso molecular prontamente incham em água, proporcionando uma grande superfície
adesiva para o máximo de contato com a mucina (a glicoproteína predominante na
camada mucosa). Geralmente, são polímeros do ácido poliacrilico desenvolvido para
interagir com a mucina, resultando em aderência do polímero na mucina, embora o
mecanismo exato ainda não está total mente compreendido (Kerr, 1990).
A análise microscópica confirmou o que foi percebido na análise macroscópica
para os derivados celulósicos (na forma de CMC de alta ou baixa viscosidade), esses
polímeros aniônicos, solúveis em água são obtidos através da introdução de grupos
carboximetilicos ao longo da cadeia de celulose. O aspecto ―grosseiro‖ das dispersões
formadas podem ser derivadas também da força e velocidade de agitação durante sua
preparação. Resolveu-se adicionar um co-solvente (cremofor) para melhor dispersar o
extrato. O cremofor é largamente utilizado como solubilizante de extratos vegetais. Os
resultados melhoraram bastante a homogeneidade e diminuiu o tamanho das partículas
dispersas, todavia a aparência não era boa e o risco de coalescência ainda era alto.
Partiu-se então para outro polímero.
A hidroxietilcelulose (Natrosol), também um derivado celulósico, mostrou-se
mais homogênea com partículas dispersas bem menores que na carboximetilcelulose.
Esse fato leva a crer numa maior estabilidade para essas formulações em detrimento das
anteriores. Os testes foram realizados com Natrosol a 3% apresentando alta viscosidade,
partimos para uma concentração menor 2% o que melhorou a viscosidade e permaneceu
a boa homogeneidade. A dificuldade aqui encontrada é que o processo é feito a quente e
a dispersão do polímero é bastante demorada.
Com os derivados do ácido poliacrílico (pemulen TR1 e TR2) conseguimos os
melhores resultados tanto do ponto de vista do aspecto macroscópico quanto
microscópico. Após sete dias armazenadas a temperatura ambiente as formulações
contendo os derivados celulósicos apresentaram-se mais viscosas, menos brilho e com
coloração levemente mais escurecida. Acreditamos que a perda de água pode ser
responsável por essas modificações. No caso das formulações com derivados do ácido
112
poliacrílico a viscosidade não foi afetada. O caráter lubrificante do gel é diminuído pela
perda de água por tanto é importante o uso de agentes umectantes (como o
propilenoglicol nas citadas formulações) para impedir a perda de água, sendo um
importante fator de aceitabilidade e uso (Braunstein, 2005).
O pemulen tr2 suporta maiores quantidades de óleo, mantando-se estável, do que
o pemulen tr1 dessa forma ele foi escolhido quando utilizamos os óleos como veículos
(mineral e óleo de oliva). O óleo mineral é largamente utilizdo emformulações
farmacêuticas inclusive semisólidas não apresentando toxicidade ou irritção dérmica. O
óleo de oliva é indicado como lubrificante vaginal, sobretudo para mulheres após a
menopausa, sendo também atóxico e sem apresentar irritabilidade dérmica. Outro fato
que motiva o seu uso são suas atividades imunoestimulante e antimicrobiana. Estudos
em animais, dependendo do protocolo, espécie e tipo de medição, geralmente apoia m a
ideia de que o azeite de oliva é capaz modular de funções de células do sistema imune,
existem indícios de que os efeitos do azeite de oliva na função imunológica em estudos
em animais são devido ao ácido oleico, em vez de oligoelementos ou antioxidantes
(Yaqoob, 1998).
113
1 - Carboximetilcelulose 2 - Cekol 2000
3 - Cekol 2000 + Cremophor 4 - Hidroxietilcelulose 3%
5 - Hidroxietilcelulose 2% 6 - Pemulen TR1
7 - Pemulen TR2 + Oleo mineral 8 - Pemulen TR2 + Azeite de Oliva

Figura 3: Aspectos microscópicos dos géis
114
Perfil da viscosidade
O gráfico abaixo apresenta o perfil da viscosidade dos géis que apresentaram

melhores resultados na análise macro e microscópicas. O reograma apresenta a variação
da viscosidade com o aumento progressivo e regressivo da velocidade de rotação do
spindle, podendo ser observado que os géis estudados apresentaram comportamento
pseudoplástico.
Gráfico 1: Perfis das viscosidades
Com os dados coletados é possível determinar a relação de estado reológico

entre a rotação (taxa de cisalhamento) e o torque (tensão de cisalhamento), indicando o
comportamento reológico típico dos géis (pseudoplástico ou dilatante). Além deste
parâmetro, também podem ser extraídos dos ciclos de cisalhamento duas outras
importantes variáveis experimentais: o nível máximo de torque (esforço) durante o
cisalhamento e a área de histerese. O primeiro está relacionado à força necessária para o
espalhamento do gel, enquanto a área de histerese, que é inversamente proporcional a
eficiência de mistura, indica o nível de desaglomeração ou falta de homogeneidade
(Ferrari, 1998).
115
Gráfico 2: Comportamento reológico dos géis desenvolvidos.
As curvas apresentadas no reograma e os valores do índice de fluxo indicaram

que todas as formulações apresentaram comportamento não-Newtoniano
pseudoplástico, pois quanto maior a taxa de cisalhamento imposta, menor foi a
viscosidade dinâmica aparente, com áreas de histerese variáveis (Ferrari, 1998). A
amostra 5 apresentou grande área de histerese o que evidencia um caráter tixotrópico a
formulação. As demais, apesar de apresentarem pequenas áreas de histerese, se faz
necessários mais testes para classifica-las ou não como sistemas tixotrópicos.
CONCLUSÃO
Conforme os resultados obtidos nesse estudo, confirmou-se que o tipo de

polímero utilizado, assim como sua concentração na fórmula tem grande influência nos
caracteres organolépticos e reológicos de uma formulação adicionada de extato de
própolis. A natureza apolar da própolis, devido ao seu conteúdo de ceras, dificulta sua
dispersão nos polímeros hidrofílicos utilizados e que o uso de polímeros com
características emulsionantes como o pemulen podem se constituir em adjuvantes de
escolha para esse tipo formulação mucoadesiva. Como base nisso estudos de otimização
da formulação contendo própolis e pemulen necessitam serem realizados, bem como o
estudo de estabilidade conforme legilação pertinente.
116
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119
7 CONCLUSÕES
120
7. CONCLUSÕES
 A própolis, apesar de ser um produto bastante antigo e usado na medicina popular, e

apesar das tentativas do Ministério da Saúde e da Agricultura, carece de uma legislação
mais clara e específica que regule sua produção e comercialização;
 A própolis vermelha da região de Pernambuco, Brasil, mostrou atender às
especificações de identidade e qualidade estabelecidas pelo Ministério da Agricultura,
nos meses avaliados exceto a amostra de fevereiro quanto ao teor de ceras.
 A amostra do mês de outubro apresentou um maior teor de flavonóides e fenóis
totais, bem como menor teor de ceras, o que indica este mês como o mais apropriado
para coleta, especialmente se a própolis for utilizada para fins medicinais, uma vez que
são atribuídas aos flavonóides várias propriedades farmacológicas.
 A validação do método analítico para a quantificação na própolis vermelha
proporcionou resultados confiáveis para o doseamento de flavonóides totais, sendo
linear, exato e preciso.
 A composição química dos compostos voláteis da própolis vermelha no Estado de
Pernambuco mostrou-se variada, destacando-se como constituintes majoritários o trans-
anetol, α-copaeno e o metil cis-isoeugenol. A própolis apresenta como constituintes
majoritários os compostos fenólicos, do tipo flavónoides, antraquinonas e fenóis.
 O bioensaio de letalidade em Artemia salina sugere para esta própolis uma
promissora atividade citotóxica a partir de seu conteúdo em compostos fenólicos
confirmado;
 Foram identificadas atividades antioxidantes in vitro e in vivo para a própolis
vermelha nos modelos de: DPPH e saccharomices cerevisae;
 Foram identificadas atividades antimutagênicas in vivo associadas à própolis
vermelha em relação aos danos induzidos pela ciclofosfamida avaliado nos
micronúcleos;
 O extrato de própolis vermelha mostrou uma melhor atividade na inibição de
espécies de cândida e como agente antiinflamatório do que o extrato de própolis verde.
 O extrato de própolis mostrou-se mais compatível com polímeros formadores de gel
derivados do ácido acrílico (permulen) do que com derivados celulósicos.
121
8. PERSPECTIVAS
122
8. PERSPECTIVAS
 Concluir o desenvolvimento farmacotécnico das formas farmacêuticas semi-

sólidas;
 Realizar estudos de estabilidade acelerado das formas farmacêuticas
desenvolvidadas;
 Realizar estudos clínicos da atividade antiinflamatória e antimicrobiana;
 Firmar com uma empresa parceira a realização do registro junto a ANVISA, a
produção e a comercialização do produto obtido;
123
9. REFERÊNCIAS
124
9. REFERÊNCIAS
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PRÓPOLIS VERMELHA DO LITORAL DE PERNAMBUCO:

Lívio César Cunha Nunes

PRÓPOLIS VERMELHA DO LITORAL DE PERNAMBUCO:

Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas

Orientador: Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto

Lívio César Cunha Nunes

PRÓPOLIS VERMELHA DO LITORAL DE PERNAMBUCO:

PRESIDENTE DA BANCA EXAMINADORA:

DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMCÊUTICAS

VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

A Deus, que é uma constante em todos os momentos de minha vida,

A Universidade Federal de Pernambuco, em particular ao curso de Graduação de Ciências

A todos os professores, funcionários e amigos do Departamento de Ciências Farmacêuticas da

Ao LTM (Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos) e companheiros do LTM.

Aos amigos quem mesmo distante sempre me apoiaram.

A própolis é uma substância balsâmica de origem vegetal, coletada e transportada pelas

PALAVRAS CHAVE: Própolis, produtos naturais, própolis vermelha, fitoterápicos.

KEY WORDS: Propolis, natural products, red propolis, phytotherapic.

2. FUNDAMENT AÇÃO QUÍMICA E FARMACOLÓGICA .........................................................18

2.1. ARTIGO I: PRÓPOLIS: ATUALIZAÇÕES SOBRE A QUÍMICA E A FARMACOLOGIA .....19

2.2. ARTIGO II: AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS E ASPECTOS

3.2 Específicos .............................................................................................................................47

4. CARACTERIZAÇÃO DA PRÓPOLIS ...................................................................................

4.1. ARTIGO III: PRÓPOLIS VERMELHA DO LITORAL DE PERNAMBUCO-BRASIL:

4.2. ARTIGO IV: VARIABILIDADE SAZONAL DOS CONSTITUINTES DA PRÓPOLIS

5. ATIVIDADE BIOLÓGICA DA PRÓPOLIS VERMELHA ...................................................

5.1. ARTIGO V: PRÓPOLIS VERMELHA: ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO E IN VIVO E

5.2. ARTIGO VI: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DA PRÓPOLIS FRENTE A

6 DESENVOLVIMENTO TECNOLÓGICO ..............................................................................

6.1 ARTIGO VII: DESENVOLVIMENTO DE GEL VAGINAL CONTENDO EXTRATO DE

7. CONCLUSÃO .................................................................................................................... 121

9. REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 125

A própolis é um material produzido por abelhas a partir de resinas encontradas no

Obteve-se da própolis vermelha, extrato bruto metanólico e analisamos e realizamos

INTRODUÇÃO: A palavra própolis é derivada do grego pro-, em defesa, e polis-, cidade ou

De modo geral, contém 50 - 60% de resinas e bálsamos, 30 – 40% de ceras, 5 – 10%

A coloração da própolis depende de sua procedência. Varia de marrom escuro

COMPOSIÇÃO QUÍMICA: A composição química é bastante complexa e variada, estando

Figura 1: Constituintes químicos da própolis vermelha do nordeste do Brasil

Atualmente, a própolis é usada como um remédio popular e está disponível na forma

Arvouet-Grand A, Vennat B, Pourrat A, Legret P 1994. Standardization of propolis extract

Borrelli F, Maffia P, Pinto L, Ianaro A, Russo A, Capasso F, Ialenti A 2002. Phytochemical

Brasil. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº 132, de 29 de Maio de

CATEF- Câmara Técnica de Medicamentos Fitoterápicos. Nota Técnica sobre o Registro de

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Giorgio S, Ribeiro MCM, Ayres DC 2007. Composições medicamentosas a base de própoli s

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