Sistema BioRad

CFX96 Touch
Deep Well
Análise PCR
em
Tempo Real

Bióloga: Kelly Cristina Ribeiro da Silva

 PCR?

PCR é uma abreviação para polimerase chain reaction

Reação em cadeia de polimerase

A descoberta da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) trouxe

enormes benefícios e desenvolvimentos científicos como o
sequenciamento de genomas, a expressão de genes em sistemas
recombinantes, o estudo de genética molecular, a determinação
rápida da paternidade e o diagnóstico rápido de doenças infecciosas.
Aplicações da técnica PCR

• A PCR é utilizada para amplificar, detectar, quantificar  sequências

específicas de ácidos nucleicos.
• Isso abriu enormes perspectivas para a análise de genes,
diagnóstico de doenças genéticas e detecção de agentes
infecciosos como vírus, bactérias, fungos etc.
• A técnica de biologia molecular por PCR promove, in vitro e por
meio de artifícios de variação de temperatura, o que o organismo
realiza naturalmente em condições fisiológicas: a duplicação de
cadeias de DNA, envolvendo nucleotídeos, sequências iniciadoras
e enzima polimerases.
 PCR e sua importância
• Desenvolvida por Kary Banks
Mullis, em 1983, essa técnica
consiste na síntese enzimática
de cópias de ácidos nucléicos
em laboratório, e não se utiliza
de organismos vivos. Mullis
recebeu o prêmio Nobel de
Química de 1993 por sua
descoberta.
 PCR e sua importância
• Por meio deste processo, é possível a obtenção de muitas
cópias de uma sequência específica de ácido nucléico a
partir de uma fita molde.
• Cada ciclo é repetido varias vezes, e promove a
amplificação da região alvo determinada conforme
afinidade das sequencias iniciadoras. Assim, o iniciador
reconhece por complementaridade o local de início do
local a ser amplificado, efetua a ligação e sinaliza para a
polimerase o início da sequência a ser replicada.
Estrutura da célula bacteriana
Estrutura da célula bacteriana
DNA e RNA o que são?

• Essas macromoléculas são

subdivididas em unidades menores,
os nucleotídeos. A unidade
formadora é composta por três
componentes: fosfato, pentose e
base nitrogenada.

• A pentose presente no DNA é a

desoxirribose, já no RNA trata-se da
ribose e, por isso, a sigla DNA
significa ácido desoxirribonucleico e
RNA é o ácido ribonucleico.
 DNA e RNA o que são?
• DNA e RNA são ácidos nucleicos que possuem diferentes
estruturas e funções. Enquanto o DNA é responsável por
armazenar as informações genéticas dos seres vivos, o RNA
atua na produção de proteínas.
Passo a passo da técnica PCR em geral

• Para a realização deste procedimento, o primeiro passo é

extrair o material genético da célula ou do local a ser
estudado com cuidado para que o mesmo não seja
danificado e nem sofra contaminação. Habitualmente, o
material coletado é o DNA; todavia, pode-se utilizar
também o RNA.
Passo a passo da técnica PCR em geral
• Após a extração do material, é adicionada uma mistura chamada
de dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfato), sendo estas bases
nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os denominados primers
(uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de
partida para a síntese de DNA.
Passo a passo da técnica PCR em geral

• Em uma reação de PCR, o pesquisador determina a região do DNA

que será copiada, ou amplificada, pelos primers que ela ou ele
escolher) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão.
Este material vai para um aparelho conhecido como termociclador,
aquecendo e esfriando o material ali contido em ciclos de
temperatura pré-estabelecidos. (Fases e temperaturas no próximo
slide)
• Primeiramente, o tubo é aquecido a uma temperatura entre 90° a
96°C para que ocorra a desnaturação do DNA (separação das fitas).
Passo a passo da técnica PCR em geral

• Em seguida, a temperatura do termociclador cai entre 55°C e

65°C para que haja a hibridização ou anelamento. Neste ponto
do procedimento, os primers se ligam com às suas sequências
complementares do DNA.
• Há, então, uma elevação da temperatura a aproximadamente
72°C para que ocorra a síntese pela polimerase (extensão de
uma nova molécula).
• Em seguida, um novo ciclo é iniciado, sendo que normalmente
são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação, apresentado
taxa de replicação exponencial.
As etapas básicas são:

• Desnaturação
(96°C): Aquece fortemente a reação para separar, ou desnaturar, as
fitas de DNA. Isso proporciona um molde de fita simples para a
próxima etapa.
• Anelamento
(55C° - 65°): Resfria a reação para que os primers possam se ligar às
suas sequências complementares no DNA molde de fita simples.
• Extensão
(72°C) Eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase
estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA.
 Equipamentos para análise PCR

• O equipamento utilizado é chamado de Termociclador.

• Ele possui um bloco térmico com espaços para os tubos

das reações.

• Esse equipamento aumenta e diminui a temperatura de

acordo com a programação que foi feita pelo utilizador.
 Biologia molecular
Reação da Polimerase em Cadeia (PCR)
iQ-Check Biorad

• Facilidade e rapidez comparado aos métodos tradicionais

• Metodologia alternativa validada
• Maior especificidade
• Maior sensibilidade
• Menor tempo de retenção de produtos
• Resultados consistentes e fidedignos
• Menor possibilidade de contaminação
 O que são os Controles?

•Controle positivo: DNA sintético que amplifica a

mesma sequência gene alvo do patógeno monitora
qualidade do kit e funcionamento do equipamento;

•Controle negativo: Controle de contaminação geral

com DNA da reação ou do kit;
 Visão geral do sistema CFX96
Visão geral do sistema do sistema CFX96 inclui dois componentes:

• Módulo de reação óptico. Este módulo inclui um sistema óptico

para recolha de dados de fluorescência e um termociclador com
bloco

• Base do termociclador C1000™. A C1000 base apresenta uma

interface de utilizador para controlar o sistema quando este se
encontra no modo de funcionamento independente e um botão de
alimentação e portas (ambos no painel traseiro) para ligar a um
computador
 Visão geral do sistema CFX96
• Tampa interior com placa de aquecimento. A tampa de
aquecimento mantém a temperatura no topo do consumível para
evitar a evaporação das amostras. Evite tocar ou contaminar de
outra forma a placa de aquecimento. Nunca insira nada nos
orifícios, uma vez que poderá danificar o sistema de vaivém óptico

•Bloco. Carregue amostras neste bloco antes do ciclo

• Botão de fecho. Prima este botão na parte interior da tampa para

fechar a tampa motorizada
 • Salmonella spp.
• Listeria monocytogenes
Produtos • E. ColiO157:H7
iQ-Check® • STECs (E.coli O157:H7, O111, O103, O145,
O26, O45, O121)
• Ser0
 Salmonella spp.
• A Salmonella spp. é uma bactéria entérica responsável por graves
intoxicações alimentares, sendo um dos principais agentes
envolvidos em surtos registrados em vários países. A sua presença
em alimentos é um relevante problema de saúde pública que não
deve ser tolerado nos países desenvolvidos, e principalmente nos
países em desenvolvimento, porque os sinais e sintomas podem
ser mal diagnosticados, sobrecarregando ainda mais todo o
sistema de saúde.
 Salmonella spp.
• Devemos ressaltar que a maioria dos sorotipos desse gênero são
patogênicos ao homem, apresentando diferenças de
sintomatologia em decorrência da variação no mecanismo de
patogenicidade, além da idade e da resposta imune do
hospedeiro.
• Devemos ressaltar que a maioria dos sorotipos desse gênero são
patogênicos ao homem, apresentando diferenças de
sintomatologia em decorrência da variação no mecanismo de
patogenicidade, além da idade e da resposta imune do
hospedeiro.
 Salmonella spp.

• A salmonelose é uma das principais zoonoses para a saúde pública

em todo o mundo, exteriorizando-se pela suas características de
endemicidade, alta morbidade e, sobretudo, pela dificuldade da
adoção de medida no seu controle. Além da importância das
medidas preventivas para evitar o risco de infecção da salmonelose
na população humana, o controle desta doença é de grande
interesse para a economia dos países em que ocorrem esses
surtos.
 Salmonella spp.
• Os custos estimados da alta incidência da salmonelose nos
Estados Unidos variaram entre $1,3 a $4,0 bilhões por ano, em
decorrência de despesas médicas, ausência ao trabalho e
quebras na produtividade.
• O Brasil, como grande exportador mundial de carne bovina e
de aves, deve estabelecer medidas de controle sanitário cada
vez mais rígidas, evitando assim grandes prejuízos devido às
perdas indiretas, através de embargos econômicos impostos
pelos países importadores.
 Salmonella spp.

• A grande maioria dos sorotipos de salmonelas são patogênicas para

o homem, de forma que os sintomas clínicos podem ser divididos em
três grupos:
• A febre tifóide, causada por S. typhi, que só acomete o homem e não
possui reservatórios em animais. Normalmente, a forma de
disseminação da infecção é interpessoal e através da água e
alimentos contaminados com material fecal humano. Os sintomas
são muito graves e incluem septicemia, febre alta, diarréia e vômitos.
 Salmonella spp.
• Após a infecção, os indivíduos podem se tornar portadores por
meses ou anos, constituindo então uma fonte contínua de infecção.
A febre tifóide pode evoluir para óbito, caracterizada por
septicemia, febre contínua, cefaléia e diarréia.
• O período de incubação usualmente varia de 7 a 21 dias e a
duração da doença pode chegar a oito semanas.
 Salmonella spp.

• Na febre entérica, o agente etiológico é a Salmonella paratyphi

A, B e C, os sintomas clínicos são mais brandos que em relação
à febre tifóide, podendo evoluir para septicemia e
freqüentemente desenvolver um quadro de gastroenterite,
febre e vômitos. O período de incubação é usualmente de 6 a
48 horas e a duração média da doença é de três semanas. Essa
doença pode ser causada pelo consumo de água e alimentos,
especialmente leite e vegetais crus, mariscos e ovos.
 Salmonella spp.

• As infecções entéricas em decorrência de outras salmonelas, ou

também chamadas de salmoneloses, desenvolvem um quadro
de infecção gastrointestinal, tendo como sintomas dores
abdominais, diarréia, febre baixa e vômito, sendo raro os casos
clínicos fatais. Os sintomas aparecem de 12 a 36 horas, podendo
durar os sintomas até 72 horas. Trata-se da manifestação mais
comum de infecção por Salmonella e o episódio geralmente
sofre resolução em dois a três dias, não necessitando de
tratamento com antibióticos. Os alimentos mais incriminados
são carne bovina, aves, suíno e ovos crus.
 L. monocytogenes
• L. monocytogenes é o agente etiológico da listeriose, uma infecção
grave, veiculada principalmente por alimentos, que ocasiona
encefalites, septicemias, meningites e abortos. Pertence ao
gênero Listeria, composto por seis espécies que se apresentam
amplamente distribuídas no ambiente devido às suas
características fisiológicas peculiares, que as capacitam a
sobreviver e a se multiplicar sob condições adversas a muitos
outros microrganismos.
 L. monocytogenes
• L. monocytogenes é a principal espécie de Listeria envolvida em
doenças em humanos, entretanto, as outras espécies são
importantes por apresentarem ecologia semelhante à deste
patógeno, podendo ser consideradas indicadoras de sua presença.

• Um importante aspecto a ser considerado nas indústrias de

alimentos é o fato de existirem cepas de L. monocytogenes
persistentes, as quais são capazes de permanecer meses, ou até
anos, no ambiente de processamento, podendo assim provocar
contaminações recorrentes no produto final.
 L. monocytogenes
•A dificuldade em eliminar esse
microrganismo das indústrias é
potencializada pelas condições de umidade,
temperatura e presença de matéria
orgânica nas plantas de processamento, que
aliadas à habilidade do patógeno em
produzir biofilmes, podem desencadear a
colonização de superfícies de equipamentos
e utensílios
 Tipos de Escherichia Coli

A E. coli enterohemorrágica (EHEC) é o tipo mais agressivo da bactéria

e provoca cólicas abdominais e diarreia com sangue. A EHEC produz
duas toxinas: “verotoxina” e “Shiga”. Por isso, ela também é chamada
de E. Coli produtora de verotoxina (VTEC) ou E. Coli produtora de toxina
Shiga (STEC). 
 Os outros tipos de Escherichia Coli são:
E.Coli enteropatogênica (EPEC): os estudos sobre essa bactéria foram
realizados pela primeira vez na Alemanha, durante os anos de 1920 e
1930, associada a diarreia humana. A EPEC pode causar sintomas
diarreias sem sangue em crianças, lesão histopatológica, febre, náuseas
e vômito.

E.coli enterotoxinogênica (ETEC): provoca a chamada diarreia do

turista ou viajante, que manifesta-se a partir ingestão de grandes
quantidades de comidas mal cozidas ou água contaminada. A infecção
geralmente atinge o intestino delgado e causa dores abdominais,
vômitos, náuseas e febre baixa.
Os outros tipos de Escherichia Coli são:

•E.coli Enteroinvasiva (EIEC): atinge e destrói a mucosa do intestino, causando diarreia

aquosa, seguida de diarreia com sangue e muco. Além de complicações como úlceras e
inflamação na região afetada. 

•E.coli Entero-hemorrágica (EHEC): essa bactéria possui fímbrias aderentes que produzem
um toxina. Os sintomas iniciais envolvem diarreia aquosa e podem evoluir para anemia,
trombocitopenia e insuficiência renal aguda.

•E.coli Enteroagregativa (EAEC): também possui fímbrias e produz toxinas que são
parecidas com as da ETEC. Os sintomas mais comuns da infecção por EAEC são diarreia
aquosa e/ou hemorrágica em crianças. 
 Escherichia coli O157:H7 e as demais
produtoras de toxina Shiga (STEC)
• Escherichia coliO157:H7A Escherichia coli é uma bactéria em forma de
bastonete, com cerca de 0,5μm de diâmetro de base por 2,0 μm de
comprimento. É uma bactéria Gram-negativa comumente presente no
intestino dos animais.
• Dentre as diversas classes de E. coli reconhecidas, está a cepa de E.
coliO157:H7, que pertence ao grupo de EHEC ou produtora de
verotoxina.
• A combinação de letras e números utilizada na classificação da
bactériase refere aos marcadores específicos encontrados em sua
superfície: O157 é referente ao antígeno somático e H7 é referente
ao antígeno flagelar.
 Escherichia coli O157:H7 e as demais
produtoras de toxina Shiga (STEC)

• 10 a 15% dos casos de colite hemorrágica se agravam até o

quadro de HUS, situação em que ocorre destruição de
eritrócitos e falha aguda dos rins, levando à necessidade de
diálise, transplante dos rins ou até morte.

• O grupo das EHEC tem mais de 60 sorotipos que produzem

shiga-like toxinas, mas o sorotipo O157:H7 predomina,
sendo o mais frequentemente associado a surtos de colite
hemorrágica.
 Escherichia coli O157:H7 e as
demais produtoras de toxina Shiga
(STEC)
• As principais características que distinguem a E. coliO157:H7
das demais cepas de E. coli são o crescimento pobre ou nulo a
44ºC e a incapacidade de utilizar o sorbitol e produzir a enzima
β-glucoronidase.
• Em função dessas características, a cepa de E. coliO157:H7
não é detectável na análise de coliformes fecais pelo método do
número mais provável, pois o mesmo utiliza a fermentação da
lactose a 44,5ºC como características confirmativa, nem através
dasanálises diretas de E. coli utilizando substratos para a
enzima β-glucoronidase.
Escherichia coli O157:H7 e as demais
produtoras de toxina Shiga (STEC)
• Acredita-se que a patogenicidade das cepas
enterohemorrágicas de E.coli esteja ligada à produção de
diversas citotoxinas, coletivamente chamadas de verotoxinas ou
“shiga-like” toxinas, similares à toxina produzida pela bactéria
Shigella.

• As verotoxinas provocam uma doença chamada de “colite

hemorrágica”que, em casos mais extremos, resulta em um
quadro conhecido como “síndrome urêmica hemolítica”(HUS, do
inglês Hemolytic-Uremic Syndrome).
 Escherichia coli O157:H7 e as demais
produtoras de toxina Shiga (STEC)
• A toxina de Shiga (Stx) é o principal fator de virulência de STEC. É
codificada pelo gene stx cujas toxinas produzidas são
subdivididas em dois tipos (Stx1 e Stx2), de acordo com o gene
que as codifica (stx1 e stx2)
• Outros sorogrupos estão ganhando importância, como O26, O45,
O103, O111, O121 e O145, os quais estão sendo denominados
de “Top Six STEC non O157”(Seis principais Stec não O157).
 Escherichia coli O157:H7 e as demais
produtoras de toxina Shiga (STEC)
• Escherichia coli produtora da toxina Shiga (STEC) é agente de diarreia
esporádica e de epidemias, podendo ocasionar quadros clínicos
graves em seres humanos. A habilidade de STEC em causar doenças
severas em seres humanos está relacionada com a sua capacidade
de secretar as toxinas Stx1, Stx2 e/ou variantes toxigênicas.
• Outro fator de virulência de STEC é a intimina, codificada pelo gene
eae associada com aderência íntima, inicialização das vias de
transdução de sinais e formação da lesão intestinal íntima.
• Algumas STEC também produzem enterohemolisina, codificada pelo
gene ehxA, que tem sido associada com doença severa em seres
humanos.
 Escherichia coli O157:H7 e as demais
produtoras de toxina Shiga (STEC)
• A principal característica de virulência, a produção de toxinas Shiga,
não é suficiente para causar doenças e outros fatores são
considerados relevantes, como a produção de enterohemolisina e
de adesinas fimbriais e afimbriais.

• Embora as doenças humanas associadas a STEC sejam pouco

descritas no Brasil, podemos observar uma significativa ocorrência
destas cepas nos rebanhos bovinos, bem como a correlação entre
sorotipos encontrados nestes animais e em pacientes humanos.
 Escherichia coli O157:H7 e as demais
produtoras de toxina Shiga (STEC)
• Bovinos constituem seu principal reservatório assumindo papel
relevante na infecção dos seres humanos. Características de
manejo do animal sugerem conferir fatores de risco para a
excreção desses patógenos.
• O gado bovino, geralmente saudável, é o principal reservatório de
STEC, embora estas cepas também tenham sido isoladas de outros
animais domésticos: ovelhas, cabras, cães, gatos e suínos.
 Produtos iQ-Check® e Validações
Salmonella spp.
 AOAC-RI 010803

Listeria monocytogenes
 AOAC-RI 010802
 NF- Afnor 07/10-04/05

E. ColiO157:H7
 AOAC-RI020801

STECs (E.coli O157:H7, O111, O103, O145, O26, O45, O121)

 AOAC-RI121203
 MLG-5C.00.USDA

SerO
 AOAC-RI121203
 Resumo
do
Procedimento
• Primeiro passo: enriquecimento e incubação de acordo com cada validação.
• Segundo passo: pipetar 100µL do reagente lise de cada kit e 100µL da amostra enriquecida após
incubação de acordo com a validação escolhida nos poços profundos (placa Deepwell) e selar com selo
pré-perfurado.
• Terceiro passo: Incubar no termomixer entre 95-100°C por 10-15 minutos a 1300rpm.
• Quarto passo: aguardar resfriar por 10 minutos.
• Quinto passo: Preparar o mix PCR de acordo com a quantidade de amostras de acordo com tabela do
guia rápido. (Utilizar o Mix PCR imediatamente ou então manter estável por até 1 hora em temperatura
de 2°C a 8°C)
• Sexto passo: Distribuir o Mix PCR nas placas de PCR, Sendo 45µL/poço para os Kit de Listeria
monocytogenes, Salmonella spp e E.coli O157:H7 e 20µL/poço para o Kit de Stec Virx.
• Sétimo passo: Adicionar 5µL do sobrenadante de cada amostra em seu respectivo poço, assim como os
controles negativo e positivo.
• Oitavo passo: selar a microplaca PCR com a tampa óptica.
• Nono passo: Programar as reações no equipamento CFX96.
• Décimo passo: Inserir a microplaca com as amostras já pipetadas no equipamento e iniciar a
amplificação clicando em “Run”(Correr).
 Thermomixer
Responsável pela etapa de
extração do DNA é um
Termo bloco que aquece e
agita a amostra.
 Checagem de Sistema Resultado
Ligue por 15 minutos antes de iniciar a medição.  
Preencha a posição E6 da placa Deep Well com 200uL de óleo mineral,  
permita que a placa aqueça por 10 e 15 minutos e anote as temperaturas:  
- Após 10 minutos (resultado deve ser >85ºC) ___._ºC
- Após 15 minutos (resultado deve ser >90ºC) ___._ºC

Preencha os poços A1, A12, H1 e H12 da placa Deep Well com 200ul de óleo  
mineral. Permita que a placa aqueça por 15 minutos e anote as  
temperaturas:  
  ___._ºC
A1 ___._ºC
A12 ___._ºC
H1 ___._ºC
H12  
 
Termômetro utilizado:
Sonda utilizada:
 The CFX Manager™
Software
• Fácil utilização apenas uma tela para programar as
análises
• É possível personalizar de acordo com as preferências do
usuário
• Protocolos compatíveis podem ser corridos
simultaneamente
 Validações

O laboratório utiliza somente métodos com validações

internacionais reconhecidas.

•Kit I-Check Salmonella II

VALIDAÇÃO: AOAC-RI certificado n° 010803

•Kit I-Check Listeria Monocytogenes II

VALIDAÇÃO: AOAC RI certificado n° 010802
Certificate Reference NF – Afnor Validation N° BRD 07/10-04/05
 Validações

O laboratório utiliza somente métodos com validações internacionais

reconhecidas.

•Kit I-Check STEC Virx (E.coli Produtora de Shiga Toxina (E.coli O157:H7,
E.coli 026, E.coli 045, E.coli 0103, E.coli 0111, E.coli 0121, E.coli 0145)
VALIDAÇÃO: AOAC RI certificado n° 121203
MLG-5C.00.USDA

•Kit I-Check E.coli O157:H7

VALIDAÇÃO: AOAC-RI certificado n° 020801
 Kit I-Check Salmonella II
VALIDAÇÃO: AOAC-RI certificado n° 010803
Permite a detecção de Salmonella spp em amostras de alimentos utilizando
tecnologia de PCR em tempo real.

Produtos destinados a consumo humano e animal (alimentos e geral): Pesar ou

medir 25g ± 0,2 g 25 mL da amostra e transferir para o saco de amostras em seguida
hidratar com 225 mL de Água Peptonada Tamponada (BPW) e verter o frasco em
temperatura ambiente dentro do saco de amostras, Homogeneizar completamente o
conteúdo no homogeneizador de amostras.
Swab/esponja: Encaminhar diretamente para o pré-enriquecimento. Adicionar a Água
Peptonada Tamponada (BPW) suficiente para cobrir o swab/esponja. O volume exato
deve ser conhecido, exemplo; 50 mL. Homogeneizar completamente o conteúdo a
mão ou mecanicamente para esponja/fibra ou utilizar o agitador de tubos para swabs.
 Kit I-Check Listeria Monocytogenes II
VALIDAÇÃO: AOAC RI certificado n° 010802
Permite a detecção de Listeria Monocytogene em Peito
de Peru, cachorro quente, salmão defumado e queijo
cottage.

VALIDAÇÃO: Certificate Reference NF – Afnor

Validation N° BRD 07/10-04/05
Permite a detecção de Listeria Monocytogene todas as
amostras de ambiente e produtos alimentícios.
Kit I-Check Listeria Monocytogenes II
AOAC RI certificado n° 010802
Certificate Reference NF – Afnor Validation N° BRD
07/10-04/05
 Kit I-Check E.coli O157:H7
VALIDAÇÃO: AOAC-RI certificado n° 020801
Kit I-Check STEC Virx (E.coli Produtora de Shiga Toxina (E.coli O157:H7,
E.coli O26, E.coli O45, E.coli O103, E.coli O111, E.coli O121, E.coli O145)

• Permite a detecção de E.coli Produtora de Shiga

Toxina (E.coli O157:H7, E.coli 026, E.coli 045, E.coli
0103, E.coli 0111, E.coli 0121, E.coli 0145

VALIDAÇÃO: AOAC RI certificado n° 121203

VALIDAÇÃO: MLG-5C.00.USDA
Kit I-Check STEC Virx (E.coli Produtora de Shiga Toxina (E.coli O157:H7, E.coli
O26, E.coli O45, E.coli O103, E.coli O111, E.coli O121, E.coli O145)
Kit I-Check STEC Virx (E.coli Produtora de Shiga Toxina (E.coli O157:H7, E.coli O26, E.coli O45, E.coli O103,
E.coli O111, E.coli O121, E.coli O145)
Kit I-Check STEC SerO
 Kit I-Check STEC SerO

VALIDAÇÃO: AOAC RI certificado n° 121203

Preparação de Mistura de PCR

• Prepare 3 misturas de PCR de acordo com o guia de cálculo de
mistura de PCR encontrado no Anexo. Para encontrar os volumes
corretos para uso, adicione o número total de amostras e controles a
ser analisado, e encontre os volumes correspondentes na tabela. Ao
menos um controle positivo (reagente E) e um controle negativo
(reagente D) devem ser incluídos em cada Grupo de Teste de PCR
para a validação de cada mistura de PCR.
 Kit I-Check STEC SerO

Preparação de Mistura de PCR

• Grupo de Teste de PCR SerO1: solução de amplificação de mistura

(reagente C) e sondas fluorescentes B1.
• Grupo de Teste de PCR SerO2: solução de amplificação de mistura
(reagente C) e sondas fluorescentes B2.
• Grupo de Teste de PCR SerO3: solução de amplificação de mistura
(reagente C) e sondas fluorescentes B3.
 Kit I-Check STEC Ser0

• Após a preparação, as misturas de PCR (reagente B + C) devem ser usadas

imediatamente, ou ficar estáveis por 1 hora no máximo a +2°C - 8°C.
• Pipete 20 μL destas misturas de PCR nos poços de acordo com a configuração da
sua placa (uma mistura para um Grupo de Teste de PCR).
• Adicione 5 μl da amostra ou reagente D (controle negativo) ou reagente E (controle
positivo) nos poços de cada Grupo de Teste de PCR. Não agite a amostra no
agitador de tubos antes de pipetar. Vede os poços da placa ou tiras (strips) de
forma hermética É importante evitar a formação de bolhas no fundo dos poços,
pipete com cuidado. Como etapa opcional, para eliminar as bolhas, centrifugue a
placa de PCR vedada ou as tiras de PCR (giro rápido).
• Coloque a placa ou tiras no termociclador. Certifique-se em colocar a placa
corretamente: Poço A1 no canto esquerdo superior. Feche o módulo de reação.
Kit I-Check
STEC SerO
Protocolo Harmonizado com menor tempo de
Incubação.
Fim...