Métodos de confirmações bioquímicas

empregadas na Microbiologia de Alimentos

Bióloga: Kelly Cristina Ribeiro da Silva

 O que são provas Bioquímicas

• A investigação das atividades metabólicas das bactérias “in vitro” é

chamada de Provas Bioquímicas e servem para auxiliar o
microbiologista a identificar grupos ou espécies de bactérias ou
leveduras através da verificação das transformações químicas, que
ocorrem num determinado substrato, pela ação das enzimas de
um dado microrganismo. Como muitas vezes um determinado
microrganismo possui um sistema enzimático específico,
promovendo transformação bioquímica específica, as provas
bioquímicas podem ser utilizadas na prática para a sua
caracterização.
 O que são provas Bioquímicas
• Para a realização das provas bioquímicas é necessário utilizar
meios de cultivo especiais contendo o substrato a ser analisado e
fornecer ao microrganismo as condições nutritivas e ambientais
necessárias ao seu desenvolvimento. 

• Objetivos: executar e interpretar os resultados e as transformações

metabólicas ocorridas em algumas provas bioquímicas empregadas
para identificação de bactérias.
 Algumas das principais e mais utilizadas
provas bioquímicas são: 
• Reação de catalase
• Teste de oxidase
• Teste de Indol
• Coloração de Gram
 Reação de catalase
Produção de catalase 

• O teste objetiva verificar se a bactéria é capaz de

produzir a enzima catalase responsável pela
decomposição do peróxido de hidrogênio H2O2
produzido pelas células durante o metabolismo
 Reação de catalase
• O peróxido de Hidrogênio é um metabolito toxico
formado durante a utilização aeróbica dos
carboidratos pelas bactérias podendo provocar a
morte das bactérias se não for rapidamente
decomposto. A decomposição desse material pode
ocorrer através da ação das enzimas classificadas
como hidroperoxido que incluem a peroxidase e a
catalase (peróxidos de hidróxidos redutores)
Reação de catalase
 Reação de catalase
• As bactérias que não apresentam catalase ou peroxidase não são
capazes de decompor o peróxido de hidrogênio, tendo seu
crescimento inibido pelo acumulo desse produto no seu próprio
metabolismo.

• O teste deve ser realizado com culturas jovens (18 a 24 horas)

pois culturas velhas podem perder a atividade da catalase.

• Não é recomendável utilizar culturas com crescimento limitado

pois o teste exige inóculo pesado.
 Reação de catalase
• Produção de catalase - Esta enzima atua sobre a água
oxigenada (peróxido de hidrogênio 3 a 5%) desdobrando-a
em oxigênio e água. A prova é feita colocando uma gota de
solução aquosa de peróxido de hidrogênio a 3-5% numa
lâmina e, em seguida, com uma alça de platina, colocar
uma porção do crescimento bacteriano sobre a gota. Ou de
outra forma, adicionando-se 0,5 ml da mesma solução a
uma cultura em meio líquido ou em ágar inclinado.
 Reação de catalase
• A prova é considerada positiva quando há borbulhamento
ou efervescência devido à liberação do oxigênio. A catalase
é produzida por muitos microrganismos e é usualmente
empregada para diferenciar Staphylococcus, que são
catalase positivos de Streptococcus, catalase negativos, ou
os bacilos Gram positivos catalase
negativos Lactobacillus e Listeria são em sua
maioria catalase positivos. 
 Reação de catalase
• O teste de catalase é um teste bioquímico rápido, que consiste
em colocar uma amostra de bactéria em contato com o peróxido
de hidrogênio, e pesquisar a formação de bolhas de oxigênio.

• A função da CATALASE é proteger os tecidos contra os efeitos

tóxicos da Água Oxigenada (H2O2) formada durante o
metabolismo celular, uma vez que aceleram a decomposição
dessa substância em H2O e O2.
 Reação de catalase
• Quando essa ENZIMA se encontra na presença do
Peróxido de Hidrogênio (H2O2), ela DEGRADA o
mesmo, com formação de H2O e O2, onde a liberação
de Oxigênio poderá ser confirmada através da
formação de bolhas
 Teste de Oxidase
• O teste objetiva verificar a presença da enzima citocromo, uma das
oxidases que participam do processo da respiração celular.

• No teste o reagente utilizado é sempre um reagente redutor

artificial que atua como aceptor final dos elétrons transferidos pelo
citocromo oxidase.

• Este reagente apresenta a característica de mudar de cor ao passar

do estado reduzido para o oxidado, de forma que ao receber os
elétrons oxidam-se provocando uma reação colorida visível.
 Teste de Oxidase
Prova da citocromo-oxidase

• Este sistema enzimático está relacionado com os citocromos

da cadeia respiratória de alguns microrganismos. A prova
consiste em colocar uma gota do reagente incolor tetrametil
p-fenileno de amina, recém preparado e protegido da luz, em
um papel de filtro. Em seguida, várias colônias do
microrganismo em estudo são espalhadas sobre a área do
papel de filtro contendo o reagente, utilizando uma alça de
platina ou um bastão de vidro.
 Teste de Oxidase
Prova da citocromo-oxidase

• A prova é considerada positiva quando na mistura do

reagente com a massa bacteriana desenvolve-se a cor
púrpura em até 1 minuto. Na reação negativa não há
desenvolvimento de cor púrpura. As enterobactérias são
oxidase negativas e podem ser diferenciadas de outros
bacilos Gram negativos. A prova pode ser feita também em
culturas em meios sólidos, adicionando-se o reagente oxalato
de p-aminodimetilanilina.
 Teste de Oxidase
Prova da citocromo-oxidase

• A reação inicia-se com o desenvolvimento de cor rósea,

marrom e finalmente uma coloração negra na superfície
das colônias é indicativa da produção de citocromo-
oxidase, representando um teste positivo. O teste é
negativo se não ocorrer alteração da cor ou houver o
desenvolvimento de uma cor rósea pálida.
 Teste de Oxidase

Utilizando tiras de oxidase

Utilizando o Reativo de oxidase

 Teste do Indol
• O teste de indol objetiva verificar se a bactéria é capaz de degradar
o aminoácido Triptofano cuja molécula ao ser degradada libera o
indol no meio de cultura.
• A degradação do triptofano depende da disponibilidade pelas
bactérias do complexo enzimático triptofanase, resultando em
indol, ácido pirúvico, amônia e energia. O indol liberado para o
meio de cultura pode ser detectado por ser uma reação química
com aldeído presente no Reagente de Kovacs para teste de Indol
(p-dimetilaminobenzaldaído) que resulta em produtos de
condensação coloridos. Esses compostos de cor vermelha-violeta
ficam concentrados na fase alcoólica do reagente formando um
anel na superfície do meio de cultura liquido.
 Teste do Indol
• Este teste permite qualificar este tipo de bactérias segundo a sua
capacidade de utilizar o aminoácido triptofano como fonte de
carbono e, ou energia.
• A produção de indol, a partir de triptofano, pode então ser
detectada cultivando os microrganismos num meio rico no
aminoácido; triptona (digerido pancreático de caseína) é
constituída por inúmeros polipeptideos que contêm muitos
resíduos de triptofano. A acumulação de indol no meio pode ser
depois detectada adicionando reagente de Kovac, que reagindo
com o indol forma na superfície do meio um composto vermelho,
não solúvel em água
 Teste do Indol
Procedimento:
- Com uma ança estéril, inocular cada uma das enterobactérias em
meio de
triptona 1,5%.
- Incubar as culturas a 37° C, durante 48 h.
- Adicionar 0,5 ml de reagente de Kovac ao meio de cultura.
- Agitar suavemente.
Resultado positivo (presença de indol) - composto vermelho /
violeta
Resultado negativo (ausência de indol) - reagente de Kovac não
altera a sua cor.
 Teste do Indol

Indol Positivo Indol Negativo

Estrutura celular das bactérias
 Estrutura celular das bactérias
• As bactérias são organismos simples, formados por apenas
uma célula, sendo chamados, portanto, de seres unicelulares.
Seu material genético (DNA) é encontrado disperso no
citoplasma, pois não possuem carioteca delimitando seu
núcleo (seres procarióticos).
• A maioria das células bacterianas possui parede celular,
localizada externamente à membrana plasmática, formada por
peptideoglicano ou mureína, que garante proteção e forma à
célula. Além da parede, algumas bactérias possuem
uma cápsula polissacarídica que envolve essa estrutura.
 Estrutura celular das bactérias

• No citoplasma observa-se a ausência de organelas

membranosas e a presença de ribossomos, estruturas
relacionadas com a síntese de proteínas. Os ribossomos
estão presentes em grande quantidade e são menores
que aqueles encontrados nas células eucarióticas. Nas
células bacterianas podemos encontrar
também grânulos de reserva, que variam de natureza
química.
 Estrutura celular das bactérias
• O cromossomo bacteriano caracteriza-se por ser uma única
molécula de dupla fita circular de DNA. Além do DNA
cromossômico, as células bacterianas apresentam moléculas
menores de DNA circular, que possuem genes que não são
essenciais para a sobrevivência da bactéria. Essas moléculas
são chamadas de plasmídeos.

• As bactérias podem ainda apresentar flagelos, estruturas

locomotoras formadas principalmente por uma proteína
denominada flagelina. As bactérias que não apresentam essa
estrutura são denominadas atríquias.
 Estrutura celular das bactérias
• Outra estrutura encontrada nas bactérias são as fimbrias, que
lembram os flagelos, porém, atuam auxiliando na fixação das
bactérias. Essas estruturas são formadas pela proteína pilina e se
assemelham a pequenos pelos. São encontradas fimbrias
principalmente nas bactérias chamadas de Gram negativas.
• A coloração de Gram é um importante teste
realizado nos laboratórios de microbiologia,
sendo um recurso auxiliar no diagnostico de Coloração
doenças bacterianas. de Gram
• A técnica recebeu este nome em homenagem ao
médico dinamarquês Hans Cristian Joaquin Gram
que em 1884, descobriu que as bactérias podiam
ser divididas em dois grandes grupos, partindo da
capacidade que as células quando coradas
resistem ou não a descoloração.
• No entanto verificou que nem todas as bactérias
coravam com esse método o que levou a sugerir a
possibilidade de ser utilizado um contrastante.
 Coloração de Gram
• Hans Cristian Joaquin Gram morreu em 1935 sem ter conseguido que
fosse reconhecida a devida importância ao seu método de coloração.
• Atualmente essa técnica é fundamental tendo como finalidade a
classificação de microrganismos com base em suas características
tintoriais, tamanho forma e arranjo celular, sendo bastante utilizada
como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia. As bactérias
são classificadas em dois grandes grupos: Gram-positivas e Gram-
negativas.
• O advento da coloração representa em grande parte o fundamento dos
principais avanços produzidos em microbiologia clínica e em outros
campos da microscopia diagnostica durante os últimos 100 anos.
O Google comemorou o
aniversário de 166 anos do
microbiologista dinamarquês
Hans Christian Gram com um
novo Google Doodle. Grams
nasceu em 13 de setembro de
1853 em Copenhagen e
desenvolveu o método
amplamente utilizado de
coloração de células
bacterianas para estudo
microscópico. A descoberta
ficou conhecida como ‘Gram
Stain’ e a técnica de coloração
mais tarde ajudou na
classificação das bactérias.
 Coloração de Gram

Bactérias Gram Positivas

• As bactérias Gram-positivas apresentam uma parede uma parede
espessa, homogênea geralmente não estratificada e
predominantemente constituída por peptidioglicano e algumas
também possuem uma camada de ácido teicóico externo a camada de
peptidioglicano.
• Deste modo o precipitado insolúvel que se forma por ação do
mordente, fica retido no interior pela camada espessa de
peptidioglicano, logo, estas células não são descoradas permanecendo
com a coloração conferida pelo corante primário.
 Coloração de Gram
Bactérias Gram Negativas
• As bactérias Gram-negativas apresentam uma parede estratificada constituída
por uma membrana externa e por uma camada interna mais fina que contém
peptidioglicano. Possui membrana externa composta por lipopolissacarideos
(LPS), lipoproteínas e fosfolipideos. Há o espaço periplasmático entre a
membrana e o citoplasma e a camada de peptidioglicano que em algumas
espécies contém β-lactamases (degrada penicilina) e β-Lactâmicas.
• Deste modo, o precipitado insolúvel, que se forma por ação do mordente é
removido (Camada de peptidioglicano é mais fina que a das Gram-positivas e a
membrana externa é parcial ou totalmente solubilizada pelo agente
descorante) pelo que as células ficam descoradas, corando de vermelho pelo
contrastante.
 Coloração de Gram
Características do Ácido Teicóico

A ácido teicóico é uma estrutura antihigienica importante,

reconhecida pelo sistema imunológico (induz a formação de
anticorcos específicos). São encontrados na camada externa da
parede celular de bactérias Gram-positivas.
Alguns polímeros de ácido teicóico penetram através da camada de
peptidioglicano, ligando-se covalentemente aos lipodeos da
membrana citoplasmática, sendo agora denominada dé áido
lipotéóico, enquanto outros se ligam ao ácido murâmico do
peptidioglicano.
 Coloração de Gram
Características do Peptidioglicano.

O peptidioglicano é um heteropolimero rígido e insolúvel na água

constituído por cadeias lineares de dois açucares aminados.
NAG (ácido n-acetilglucosamina)
NAM (ácido n-acetilmurâmico)
São ligados entre si por ligações glicosídicas. As cadeias lineares
ligam-se entre si através de cadeias de quatro aminoácidos.
 Coloração de Gram
Características do Peptidioglicano.
 Coloração de Gram
Características do Peptidioglicano.
A coloração de Gram envolve uma série de procedimentos antes de chegar à
etapa final de leitura da lâmina preparada: envolve a confecção do esfregaço,
sua fixação e passa pela coloração propriamente. A técnica de coloração de
Gram consiste em expor as células bacterianas as seguintes soluções:

• Cristal Violeta
• Iodo - Lugol
• Álcool
• Safranina - Fuscina
 Coloração de Gram
Corantes e Reagentes

Corante primário: O cristal violeta cora o citoplasma de purpura (roxo),

independente do tipo de célula.

Mordente: A solução de iodo ou lugol aumenta a afinidade entre o violeta de

cristal e a célula e forma com o corante um complexo insolúvel dentro da célula.

Agente descorante: O álcool ou acetona o ambos são solventes lipídicos que

proporcionam a descoloração.

Contrastante: Safranina ou fucsina básica cora o citoplasma de vermelho.

 Coloração de Gram
• Na Microbiologia, existem diferentes tipos de colorações, e uma das
mais famosas é a coloração de Gram, que diferencia as bactérias em
Gram-negativas e Gram-positivas, de acordo com as características
químicas do envoltório celular.

Na figura abaixo, podemos observar as diferenças entre bactérias

Gram - e as bactérias Gram +. É muito importante ressaltar a
presença de uma espessa camada de peptideoglicano nas bactérias
Gram-positivas, o que confere a essas bactérias o potencial de reter o
corante cristal violeta nessa estrutura bacteriana.
Classificação das bactérias quanto a forma e arranjo.
Obrigada a todos pela atenção.

Fim...