Práticas em

Parasitologia Clínica
Protozoários do Sangue e Tricomoníase

Responsável pelo Conteúdo:

Prof.ª Dr.ª Niara da Silva Medeiros

Revisão Textual:
Prof.ª Dr.ª Selma Aparecida Cesarin
 Protozoários do Sangue e Tricomoníase

• Hematozoários;
• Infecção Sexualmente Transmissível (IST) – Tricomoníase;
• Diagnóstico de Hematozoários;
• Técnicas Imunológicas e/ou Sorológicos
Aplicadas no Diagnóstico de Parasitoses Humanas;
• Procedimentos para Detecção de Parasitos do Sistema Gênito-Urinário.

OBJETIVOS DE APRENDIZADO
• Diferenciar as formas evolutivas encontradas nos hematozoários;
• Conhecer e diferenciar os métodos imunológicos utilizados no diagnóstico de hematozoários;
• Caracterizar a tricomoníase, identificando a forma evolutiva e técnicas de pesquisa ou isola-
mento do agente etiológico.
UNIDADE Protozoários do Sangue e Tricomoníase

Hematozoários
No sangue periférico e em tecidos, podemos encontrar diferentes estágios (formas
evolutivas) de variadas espécies de parasitas.

Podemos destacar como hematozoários de maior prevalência no Brasil: Trypanossoma

cruzi, Plasmodium sp., Leishmania sp. e Toxoplasma gondii.

É importante destacarmos que o diagnóstico desses parasitas implica a aplicação de

diferentes métodos e que em determinadas parasitoses são necessários dois métodos
com princípios diferentes para que se tenha um diagnóstico definitivo.

Fique atento(a), pois, nesta unidade, veremos os diferentes métodos empregados na

rotina laboratorial para o diagnóstico dos hemoparasitas.

Recomenda-se repetir os exames de sangue em intervalos de 6 a 12 horas no decor-

rer de 5 dias, quando o resultado se apresentar negativo e ainda houver a suspeita
de infecção.

Importante!
Resultados negativos não devem ser definitivos, quando se analisa apenas uma única
amostra!

Doença de Chagas
A Doença de Chagas é causada pelo parasita Trypanossoma cruzi. Seu ciclo é
­heteroxeno, portanto, necessita de um hospedeiro intermediário que, nesse caso, são os
Triatomídeos (Triatoma infectans), mais conhecidos como barbeiros.

A contaminação acontece no momento da hematofagia (alimentação), que é quando­

o inseto defeca. Nas fezes, são encontradas as formas tripomastigostas, que são as
­formas evolutivas infectantes.

Atualmente, a forma mais comum de transmissão de Doença de Chagas no Brasil é

via alimentar, ou seja, o consumo de alimentos (açaí, cana de açúcar, por exemplo)
contaminados pelas fezes do barbeiro contaminado com Trypanossoma cruzi.

Na fase aguda da doença, o diagnóstico de Doença de Chagas é dado pela presença

das formas tripomastigotas na corrente sanguínea (Figura 1).

Mais adiante, ainda nesta Unidade veremos, os métodos de diagnóstico utilizados

na rotina.

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 Figura 1 – Formas Tripomastigotas de Trypanossoma cruzi
encontradas entre as hemácias na corrente sanguínea
Fonte: chagas.fiocruz.br

Para saber mais detalhes sobre a Doença de Chagas, suas causas, sintomas, tratamento e
prevenção, acesse o link: https://bit.ly/3i4pFVS

Revise os conceitos aprendidos na Disciplina Parasitologia Básica relendo os capítulos 3 – Tri-

panossomíase por Trypanosoma cruzi: Doença de Chagas, p. 37-51 e capítulo 4 – Tripa-
nossomíase por Trypanosoma cruzi: Epidemiologia e Controle, p. 52-61 do livro REY, L. Bases
da Parasitologia médica. 3.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2010, disponível em sua
Biblioteca Virtual, em: https://bit.ly/3nrpN2M

Leishmanioses
A Leishmaniose é considerada uma zoonose e é transmitida por espécies do gênero
Leishmania. De acordo com a natureza clínica da doença, a Leishmaniose pode ser
dividida em dois grandes grupos: Leishmaniose cutânea e/ou mucosa (tegumentar ou
cutânea) e a Leishmaniose visceral ou calazar.

Embora essas doenças sejam causadas por espécies do gênero Leishmania, há

diferenças quanto às espécies de Leishmania que causam cada uma delas (mais de 20
espécies) quanto aos sintomas apresentados pelo paciente, quanto aos sinais clínicos,
métodos de diagnóstico e conduta terapêutica.

Mas o que as espécies de Leishmania têm em comum?

Todas as espécies apresentam ciclo heteroxeno (hospedeiro intermediário – fêmea

do mosquito flebotomíneo) e no diagnóstico são encontradas as formas evolutivas de
amastigotas, na maioria das vezes, internalizadas nos macrófagos (Figura 2).

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UNIDADE Protozoários do Sangue e Tricomoníase

Figura 2 – Amastigotas de Leishmania spp. encontradas em macrófagos

Fonte: ufrgs.br

Para saber mais detalhes sobre a Leishmaniose, ciclo biológico, distribuição geográfica e
apresentação clínica da Leishmaniose acesse o link: https://bit.ly/38wOCX0

A Leishmaniose cutânea, cutâneo-mucosa e cutâneo difusa têm características de

formar feridas na pele ou mucosas (nariz, boca, faringe) (Figura 3).

O diagnóstico desse tipo de Leishmaniose implica a pesquisa de amastigotas de

Leishmania sp. nas bordas das lesões.

Para isso, são considerados aspectos clínico-epidemiológicos, a aplicação da Intra-

dermorreação de Montenegro (positiva), testes parasitológicos positivos ou testes que
utilizam a biologia molecular para a identificação das espécies.

Nesta unidade, veremos as técnicas utilizadas para a realização desse diagnóstico.

Figura 3 – Lesões características de Leishmaniose cutânea

Fonte: Adaptado de dbbm.fiocruz.br

As formas amastigotas se encontram nas bordas da lesão, que é o alvo da

coleta de amostra para diagnóstico.

A Leishmaniose visceral (ou calazar) caracteriza-se pela afinidade que o parasita tem
por tecidos como baço, fígado, medula óssea e tecidos linfoides (Figura 4).

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 O diagnóstico é realizado, geralmente, por meio de amostras de medula óssea (pun-
ção do esterno, tíbia ou crista ilíaca), já que a realização de biópsias de baço e fígado são
consideradas de alto risco.

Após a coleta pode ser realizado um esfregaço com coloração de Giemsa, entre ou-
tros métodos.

Figura 4 – Exame microscópico de uma amostra de

medula óssea de um paciente com Leishmaniose visceral
Fonte: cdc.gov

Visualização de um macrófago com vários amastigotas. Observe os núcleos

(seta vermelha) e o cinetoplasto (seta preta).

A visualização do cinetoplasto nas amostras utilizadas para diagnóstico é de extre-

ma importância, pois por meio desta observação se tem a certeza de que o paciente
tem Leishmaniose.

Revise os conceitos aprendidos na Disciplina Parasitologia Básica relendo os capítulos 5 –

Leishmaníases Cutâneas e Mucocutâneas do Novo Mundo, p. 62- 74 e capítulo 6 – Leishma-
níase visceral, p. 75-83 do livro REY, L. Bases da Parasitologia médica. 3.ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2010, disponível em sua Biblioteca Virtual.
Disponível em: https://bit.ly/3nugdfD

Toxoplasmose
A toxoplasmose é uma parasitose que tem como agente etiológico o parasita
Toxoplasma gondii. Ao entrar em contato com os oocistos do parasita, o indivíduo é
infectado. Os parasitas formam cistos que podem atingir variados tecidos, como, por
exemplo, músculo esquelético, miocárdio, cérebro (Figura 5) e olhos.

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UNIDADE Protozoários do Sangue e Tricomoníase

Figura 5 – Cisto de Toxoplasma gondii no tecido

cerebral corado com hematoxilina e eosina
Fonte: cdc.gov

Para saber mais sobre a Toxoplasmose e sua epidemiologia, fatores de risco, ciclo biológico,
doença, diagnóstico, sintomas e tratamento, acesse o link: https://bit.ly/2LJc3TL

Você sabe como podemos realizar o diagnóstico de Toxoplasmose?

Geralmente, o diagnóstico é realizado por sorologia pela busca de anticorpos es-

pecíficos no sangue, além disso, pode ser realizada a biopsia corada com Giemsa dos
tecidos acometidos.

Para mulheres gestantes (suspeitas) pode ser realizada a detecção por meio do método
de DNA do líquido amniótico pelo método da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

Fique atento(a): veremos os métodos a seguir, ainda nesta Unidade!

Os cistos formados nos tecidos do

Toxoplasma gondii podem perma-
necer por anos ou por toda a vida
do hospedeiro.

Revise os conceitos aprendidos na Disciplina Parasitologia Básica relendo o capítulo 11 –

­Toxoplasmose”, p. 115-24 do livro REY, L. Bases da Parasitologia médica. 3.ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2010, disponível em sua Biblioteca Virtual, em: https://bit.ly/2XnPl6q

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Malária
O gênero responsável por desenvolver a malária é o Plasmodium sp. Em humanos,
podemos encontrar 4 espécies responsáveis pelo seu desenvolvimento: Plasmodium
vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae.

Indivíduos infectados apresentam febre alta, calafrios e sintomas que se assemelham

à gripe.

Na malária, a destruição das hemácias e liberação dos esquizontes e seus metabólitos

na corrente sanguínea desencadeiam uma resposta inflamatória.

O diagnóstico é realizado por meio da pesquisa do parasita na corrente sanguínea

em diferentes estágios (Figura 6), principalmente, na forma de gametócito, que é a forma
evolutiva utilizada para diferenciar as espécies de Plasmodium sp.

Além disso, pode ser utilizada a pesquisa de antígenos no sangue periférico.

Veja mais adiante, nesta Unidade, os métodos utilizados no diagnóstico de Malária.

Figura 6 – Formas evolutivas encontradas do Plasmodium sp. na corrente sanguínea.

A e B: Plasmodium falciparum; C e D: Plasmodium vivax
Fonte: Adaptado de Getty Images

Para saber mais detalhes sobre a Malária, acesse o link: https://bit.ly/3nkAHax

Revise os conceitos aprendidos na Disciplina Parasitologia Básica, relendo os capítulos

12 – Malária: os plasmódios humanos, p. 125-34, capítulo 13 – Malária: a doença, p. 135-
46 e capítulo 14 – Malária: Epidemiologia e Controle, p. 147-58 do livro REY, L. Bases da
Parasitologia médica. 3.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2010, disponível em sua
Biblioteca Virtual, em: https://bit.ly/2XnPl6q

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UNIDADE Protozoários do Sangue e Tricomoníase

Infecção Sexualmente
Transmissível (IST) – Tricomoníase
Trichomonas vaginalis é um parasita flagelado que habita o trato genital de homens
e mulheres e sua Infecção é Sexualmente Transmissível (IST), pois a fonte de contami-
nação principal é por via sexual. Vale lembrar que esta parasitose também pode ser
transmitida por fômites, que são objetos contaminados, como toalhas, roupas íntimas
compartilhadas e espéculos vaginais não estéreis, entre outros.

Nos últimos anos, há um movimento no sentido de mudar a terminologia “Doenças Sexual­

mente Transmissíveis (DSTs)” para Infecções Sexualmente Transmissíveis (ISTs), vez
que o conceito de “doença” implica sinais e sintomas. Entretanto, a maioria das pessoas
infectadas pelos patógenos transmitidos sexualmente não apresenta sinais ou sintomas,
mas transmite o patógeno em questão para seus parceiros sexuais. No sentido de conscien-
tização sobre esses aspectos, o termo IST é mais apropriado.

Geralmente, os sintomas são aparentes em mulheres, e homens, na sua maioria,

são assintomáticos.

Trichomonas vaginalis apresenta apenas uma única forma evolutiva: trofozoíto (Fi-
gura 7) e seu diagnóstico é realizado por meio do exame direto de secreção vaginal ou
uretral, como veremos a seguir, nesta Unidade.

Figura 7 – Trofozoíto de Trichomonas vaginalis em esfregaço permanente

Fonte: cdc.gov

Revise os conceitos aprendidos na Disciplina Parasitologia Básica relendo o capítulo 7 – Flagela-

dos das Vias Digestivas e Geniturinárias: Tricomoníase e Giardíase – Item Trichomonas vaginalis
e tricomoníase, p. 84-8 do livro REY, L. Bases da Parasitologia médica. 3.ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2010, disponível em sua Biblioteca Virtual, em: https://bit.ly/38ru6a3

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 1. Quais formas evolutivas podemos encontrar no diagnóstico de Doença de Chagas,
Leishmaniose, Toxoplasmose e Malária?
2. Explique como ocorre a transmissão das hemoparasitoses;
3. Como podemos dividir a Leishmaniose? Quais sinais clínicos cada uma pode apresen-
tar? E qual amostra utilizamos para o diagnóstico?
4. Quais técnicas podem ser utilizadas no diagnóstico de Toxoplasmose?
5. Na Tricomoníase, comente como pode ser contraída? Qual a forma evolutiva encontra-
da no diagnóstico?
6. Por que a terminologia IST é mais apropriada do que DST? Qual sua opinião sobre isso?

Diagnóstico de Hematozoários
Veremos a seguir que o Laboratório de Parasitologia compreende, dentre outras téc-
nicas, o diagnóstico direto e as técnicas imunológicas/sorológicas para detecção de algu-
mas espécies de parasitas.

Alguns parasitas habitam a corrente sanguínea e tecidos e são necessárias técnicas

específicas para detecção deles.

Os métodos que veremos a seguir auxiliam o diagnóstico dos hematozoários. Vale

ressaltar que alguns desses métodos podem distinguir se a parasitose está na fase aguda
ou crônica e auxiliar no tratamento do paciente.

As técnicas utilizadas no diagnóstico

de hematozoários podem ser quali-
tativas ou quantitativas. A escolha vai
depender da parasitose investigada.

Método direto a fresco: esfregaço em

camada delgada e em gota espessa
As parasitoses que podemos diagnosticar por meio do exame de sangue (métodos
direto a fresco) são a Filariose (causada por helminto), Malária, Doença de Chagas (na fase
aguda da Doença) e Leishmaniose, pois as formas evolutivas podem estar circulando na
corrente sanguínea ou na medula óssea, que é o caso da Leishmaniose visceral.

Na fase crônica da Doença de Chagas, não são encontrados parasitas circulando na

corrente sanguínea, ou seja, o método direto a fresco vai resultar em falso-negativo,
caso o paciente esteja contaminado na fase crônica da Doença.
Outros métodos diagnósticos devem ser utilizados nessa fase, tais como os métodos
imunológicos ou sorológicos.

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UNIDADE Protozoários do Sangue e Tricomoníase

Para a realização do método direto a fresco podem ser utilizados dois tipos de amos-
tra sanguínea.

Podemos usar o sangue por meio da perfuração da ponta do dedo (coleta de sangue
capilar) (Figura 8) ou sangue venoso obtido por meio da coleta em Tubo com Anticoa-
gulante EDTA (Figura 9).

Figura 8 – Exemplo de perfuração da ponta do dedo para coleta de sangue

para detecção de formas evolutivas de parasitas na corrente sanguínea
Fonte: Freepik

Figura 9 – Sangue venoso colhido em tubo de coleta com anticoagulante EDTA (sangue total)
Fonte: Getty Images

Após a coleta da amostra de sangue, podem ser feitos dois métodos: o esfregaço em
camada delgada e a gota espessa.

O esfregaço em camada delgada (Figura 10) é uma técnica utilizada para a visualiza-
ção de parasitas no sangue e é indicada para determinar as espécies dos parasitas, pois
a visualização é mais nítida, por exemplo, nos casos de Malária.

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 Esse método é realizado da seguinte forma:
1. Após a coleta do sangue, é colocada uma gota sobre uma lâmina de microscopia;
2. Segurando uma segunda lâmina em ângulo de aproximadamente 40° sobre
a primeira, realiza-se a distensão do sangue. O sangue deve se espalhar pela
lâmina formando uma fina camada;
3. Seque ao ar e core com corante (usualmente, é utilizado corante hematoló-
gico Giemsa);
4. A lâmina corada é analisada em microscopia óptica nos aumentos de 40X
e 100X.

Figura 10 – Esfregaço sanguíneo em camada delgada utilizado para

diagnóstico diferencial de hemoparasitas, por exemplo, a Malária
Fonte: Wikimedia Commons

Já o método de gota espessa (Figura 11) pode ser utilizado como triagem, especial-
mente em casos de Malária. Também em casos em que se suspeita de baixa carga pa-
rasitária ou quando não se encontram formas evolutivas no método de camada delgada.

A metodologia de gota espessa é utilizada para a realização da quantificação, a veri-

ficação da carga parasitária, pois possui maior sensibilidade.

A grande desvantagem desse método é que as formas evolutivas ficam indefinidas,

pois há ruptura das hemácias no processo de remoção de hemoglobina ocorrida nele.

O método da gota espessa é realizado da seguinte maneira:

1. Após a coleta do sangue, colocam-se 3 gotas em uma lâmina de microscopia;
2. Utilizando o canto de outra lâmina de microscopia, homogeneíze completa-
mente as três gotas, até formar um círculo em torno de 2cm de diâmetro;
3. Deixe secar ao ar e depois mergulhe a lâmina em uma solução tampão para
remover a hemoglobina e depois realize a coloração com Giemsa;

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4. A Lâmina é visualizada em microscopia óptica nos aumentos de 40x e 100X.

Figura 11 – Lâmina de microscopia com gota de sangue

para realização do método de gota espessa
Fonte: Getty Images

Método de coloração por May-Grunwald-Giemsa

A coloração de May-Grunwald-Giemsa, conhecida como coloração de Giemsa, é a
coloração hematológica permanente de escolha para identificação de formas evolutivas
de parasitas no sangue, pois ela permite a evidenciação de características importantes
para a diferenciação das espécies.

Por exemplo, os núcleos dos Plasmodium sp. Leishmania sp. e Trypanossoma sp se

coram em tom avermelhado/arroxeado, o citoplasma se apresenta azulado e os Grânulos
de Schüffner (encontrados na malária) avermelhados/arroxeados também (Figura 12).

Figura 12 – Coloração de Giemsa

Fonte: Adaptado de ufrgs.br e cdc.gov

Quer saber o passo a passo da coloração de Giemsa? Então, veja o Quadro a seguir:

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 Quadro 1

• Core com corante de Giemsa (diluição de 1:50 da solução estoque

de Giemsa com água tamponada pH 7,0) por 30-60 minutos;
Gota espessa • Lave brevemente por meio de imersão das lâminas na água
tamponada por 3-5 minutos e drene;
• Seque ao ar em posição vertical e examine no aumento de 100X.

• Mergulhar as lâminas preparadas por 1 minuto em álcool me-

tílico absoluto;
• Escorra e deixe secar ao ar;
Camada delgada • Core com corante de Giemsa (diluição 1:20) por 20 minutos;
• Lave mergulhando as lâminas em água tamponada uma ou
duas vezes;
• Seque ao ar em posição vertical e examine no aumento de 100X.

Fonte: Adaptado de ZEIBIG, 2014

Método de Coloração por Leishman

Além da coloração por Giemsa, na rotina laboratorial, também pode ser utilizada a
coloração por Leishman (solução metanólica de azul de metileno e eosina).

É um corante hematológico que pode ser utilizado para o diagnóstico de hemo-

parasitas. O resultado final dessa coloração (Figura 13) permite identificar as células
sanguíneas e as formas evolutivas de parasitas como o Plasmodium sp. (Malária) e
Trypanossoma cruzi (Doença de Chagas).

Figura 13 – Microscopia de um esfregaço corado com o método de coloração de

Leishman mostrando o estádio esquizonte do parasita da malária Plasmodium vivax
Fonte: Wikimedia Commons

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UNIDADE Protozoários do Sangue e Tricomoníase

No tópico a seguir, você encontra detalhes sobre a técnica de coloração por Leishman e o
passo a passo do procedimento:
Tópico Coloração de Leishman, p. 309-530 do seguinte livro disponível em sua Biblioteca
Virtual: DE CARLI, G. A. Parasitologia clínica: seleção de métodos e técnicas de laboratório
para o diagnóstico das parasitoses humanas. 2.ed. São Paulo: Atheneu, 2010.

Imprint – Exame de lâminas com material obtido

de biópsia e de cultura de Leishmania sp.
Imprint, também chamadas “lâminas por impressão”, é uma técnica de histopato-
logia. São utilizadas para o diagnóstico de parasitas nos tecidos como por exemplo
­Leishmania sp. e Toxoplasma gondii (Toxoplasmose).

Para realização dessa técnica, é necessária a retirada de um fragmento de tecido

por meio de cirurgia (biopsia). Essas amostras são preparadas (lavadas com solução
salina), fixadas (metanol) em lâmina de microscopia e coradas com corante Giemsa ou
­Leishman (Figura 14).

A análise é realizada em microscopia óptica no aumento de 100x.

Figura 14 – Análise histopatológica para o diagnóstico de Leishmaniose cutânea.

Seta mostra as formas de amastigotas (aspecto de “grânulos”)
Fonte: cdc.gov

Na técnica de Imprint, o analista deve ser treinado e experiente, pois, nos tecidos,
a identificação das formas evolutivas é dificultada, especialmente, nos casos de
­Leishmaniose, por conter baixa carga parasitaria.

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Técnicas Imunológicas e/ou
Sorológicos Aplicadas no
Diagnóstico de Parasitoses Humanas
Intradermorreação de Montenegro
A Intradermorreação de Montenegro é utilizada no diagnóstico de Leishmaniose
cutânea e tem por finalidade avaliar a hipersensibilidade tardia. É similar ao Teste de
Tuberculina (utilizado no diagnóstico de Tuberculose) e consiste em avaliar e mensurar a
inflamação, eritema ou erupção cutânea após a inoculação de antígenos de Leishmania
na região anterior do antebraço.

Este método consiste no seguinte: 0,1ml do antígeno padronizado (antígenos inope-

rantes ou partes destes) é inoculado na região intradérmica na face anterior ao antebraço.

A leitura do exame é realizada após 48 a 72 horas. Quando se observa um halo de

inoculação igual ou maior que 5mm o exame é considerado positivo (Figura 15), ou seja,
o indivíduo possui resposta imunológica rápida contra o antígeno injetado indicando que
ele tem ou teve contato com o parasita Leishmania sp.

Essa resposta imunológica é mantida por toda a vida do paciente, não sendo possível
detectar se a infecção foi recente ou aconteceu há muitos anos.

Temos de ressaltar que esse método, apesar de ser sensível e específico, apresenta
algumas limitações.

Os exames cujos resultados sejam negativos devem ser repetidos após alguns dias
em caso de suspeita de Leishmaniose, pois se o paciente foi infectado recentemente, a
resposta imunológica pode não acontecer de forma rápida.

Os testes de indivíduos infectados com Leishmaniose podem se tornar positivo

somente 4 meses após o aparecimento das lesões cutâneas.

Por isso, esse método deve ser utilizado apenas para diagnóstico de indivíduos com
Leishmaniose cutânea.

Figura 15 – Intradermorreação de Montenegro. Teste reativo

(positivo) para Leishmaniose. Leitura realizada após 72h da inoculação
Fonte: Wikimedia Commons

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UNIDADE Protozoários do Sangue e Tricomoníase

O resultado do exame de Intradermorreação de Montenegro para o diagnóstico de

Leishmaniose vai se apresentar como positivo, caso o paciente esteja com a doença
ativa (fase aguda), curado ou se algum dia ele teve contato com o parasita.
Em casos em que os pacientes são assintomáticos ou foram curados, este teste também
se torna positivo. Este método não diferencia uma contaminação recente ou tardia.

Importante!
Nas infecções por Leishmania (L.) amazonenses, uma das espécies responsáveis pela
Leishmaniose cutânea, o teste de Intradermorreação de Montenegro é negativo.

Em indivíduos com leishmaniose vis-

ceral ativa, a reação de Montenegro
se torna positiva somente após o
tratamento bem-sucedido.

Xenodiagnóstico
Você já ouviu falar deste método?

Então, vamos verificar como é feito.

O xenodiagnóstico foi desenvolvido por Émile Brumpt, em 1914, é um método antigo

utilizado para o diagnóstico de Doença de Chagas.

Os insetos barbeiros (Triatomídeos) sabidamente isentos de doenças, são criados em

Laboratório em caixas teladas.

Estes Triatomídeos são colocados em contato com o paciente com suspeita de Do-
ença de Chagas, para a realização da hematofagia (alimentação do sangue do paciente).

Após a ingestão de sangue, as fezes do inseto são analisadas após 30 a 40 dias para veri-
ficar se são encontradas as formas tripomastigotas, que são as formas evolutivas infectantes.

A grande desvantagem desse método é a demora na liberação dos resultados.

Para saber mais detalhes sobre a técnica de xenodiagnóstico, leia a p. 49 do livro do livro
REY, L. Bases da Parasitologia médica. 3.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2010, dis-
ponível em sua Biblioteca Virtual, em: https://bit.ly/38q0Ksx

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Reação de Imunofluorescência Direta e Indireta
Inicialmente, vamos diferenciar o que acontece nas reações de Imunofluorescência Di-
reta e Indireta. Esses métodos consistem na reação (ligação) entre antígenos e anticorpos
e podem ser utilizadas para diagnóstico de variadas doenças, inclusive as parasitárias.

Na imunofluorescência direta, temos a presença de um anticorpo primário que reage

especificamente com um antígeno. Esse anticorpo primário está ligado a um fluóforo ou
fluorocromo, que emite fluorescência sob estimulação de certo comprimento de onda,
sendo que a intensidade pode ser observada e medida (Figura 16).

Esse teste é muito empregado em análises parasitológicas utilizando amostras fecais

na pesquisa por antígenos específicos. Quanto mais intensa a intensidade da fluorescên-
cia, maior a quantidade de antígenos presente na amostra (soro sanguíneo ou fezes, por
exemplo). Essa técnica possui grande sensibilidade e especificidade.

Na imunofluorescência indireta, além da presença do anticorpo primário que reage

especificamente o antígeno, temos anticorpos secundários que reconhecem (reagem)
com os anticorpos primários.

Nessa técnica, o fluoróforo (ou fluorocromo) está acoplado ao anticorpo secundário

(Figura 16).

Quando se utilizam anticorpos secundários, ocorre a amplificação do sinal, pois vários

anticorpos secundários (que contêm o fluorocromo) podem se ligar ao anticorpo primário.

Figura 16 – Ilustração das reações antígeno – Anticorpo

nos métodos de imunofluorescência direta e indireta
Fonte: Wikimedia Commons

A Reação de Imunofluorescência Indireta é amplamente utilizada na rotina laborato-

rial para diagnóstico de diversas doenças (Figura 17), incluindo parasitoses como, por
exemplo, a Toxoplasmose e a Leishmaniose.

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UNIDADE Protozoários do Sangue e Tricomoníase

Figura 17 – Demonstração de uma reação positiva de imunofluorescência

indireta, apresentado a presença de promastigotas de Leishmania sp.
Fonte: Divulgação

Quer saber mais sobre os métodos de imunofluorescência?

Então, acesse o link: https://bit.ly/2XuRGwx

Revise os conceitos aprendidos sobre Microscopia e Fluorescência relendo o Tópico Micros­

copia de fluorescência, p. 56-8 do livro TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. Microbiologia.
12.ed. Porto Alegre: Grupo A, 2017 disponível em: https://bit.ly/2JW6HUM

Reações de Aglutinação
Reações de Aglutinação podem ser utilizadas no diagnóstico de diferentes parasitoses
em casos de infecção aguda por agentes infecciosos. Nesse método, ocorre uma rea-
ção de precipitação quando o antígeno entra em contato com o anticorpo presente na
amostra de sangue do paciente. Essa reação é visualizada a olho nu, pois há formação
de agregados (Figura 20).

Quando o paciente não possui anticorpos contra determinado antígeno, não ocorre
a precipitação e o resultado é negativo.

O método de aglutinação pode ser do tipo direta ou indireta:

• O método de aglutinação direta é utilizado quando há uma grande quantidade de
antígenos celulares na superfície de patógenos (bactérias, fungos, protozoários),
células ou vírus;
• Já no método indireto, os antígenos estão acoplados a superfícies inertes (por
exemplo: látex, sepharose, gelatina) ou a hemácias sensibilizadas previamente. Esse
acoplamento acontece por adsorção (com a utilização de agentes químicos solúveis)
ou por conjugação (por ligações químicas covalentes).

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 Figura 18
Fonte: TORTORA, 2017

Método de aglutinação indireta, em que antígenos (representados por esfe-

ras amarelas) estão acoplados a esperas de látex (representados por esferas
azuis). Quando anticorpos específicos (em verde) reconhecem esse antígeno,
ocorre a reação de precipitação ou aglutinação.

É necessário reforçar que, para o diagnóstico de determinada doença, devem ser

utilizados antígenos específicos do parasita que se quer pesquisar.

O método de aglutinação direta pode ser do tipo qualitativo ou quantitativo. No tipo

qualitativo, a resposta é “resultado positivo” ou “resultado negativo”.

No tipo quantitativo, mede-se a quantidade de anticorpos presentes em uma deter-

minada amostra. Esse teste é feito realizando diluições seriadas utilizando uma amostra
não diluída no primeiro poço e diluições progressivas até que o último poço não conte-
nha mais anticorpos. Essa concentração é o título.

Quanto maior a quantidade de anticorpos, maior é a resposta imunológica do paciente

contra determinada doença.

Esse teste pode ser aplicado quando se quer pesquisar se o paciente teve (ou tem)
uma infecção por determinado patógeno. Também é utilizado para verificar se a memó-
ria imunológica contra determinado antígeno foi ativada após protocolos de vacinação.

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UNIDADE Protozoários do Sangue e Tricomoníase

Figura 19 – Método de aglutinação do tipo quantitativo

utilizando diluições seriadas de anticorpo
Fonte: TORTORA; et al. 2017

Reação de Hemaglutinação
A Reação de Hemaglutinação envolve antígenos presentes na superfície de hemácias
(ou eritrócitos).

Quando o soro do paciente contém anticorpos que reconhecem esses antígenos,

ocorre a ligação seguida de precipitação (aglutinação). Como a aglutinação envolve he-
mácias, o termo correto é Hemaglutinação:
• Na Reação de Hemaglutinação Direta, os antígenos fazem parte da superfície da
própria hemácia (ou eritrócitos);
• Na Reação de Hemaglutinação Indireta, antígenos são acoplados a superfície de
hemácias (ou eritrócitos). Podemos citar como exemplo, a pesquisa por anticorpos
anti-Trypanosoma cruzi em pacientes com suspeita de Doença de Chagas. Esse

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método é muito importante, pois detecta anticorpos que estão presentes na fase
crônica da Doença de Chagas, quando já não existem parasitas circulando na cor-
rente sanguínea.

O Método de Hemaglutinação também é utilizado para tipagem sanguínea. Antígenos dos

diferentes grupos sanguíneos são adicionados separadamente em locais previamente deter-
minados de placas que apresentam poços rasos. Em seguida, o sangue do paciente é colocado
em contato com cada antígeno (separadamente). Onde ocorrer aglutinação, significa que o
paciente tem anticorpos contra determinado antígeno sanguíneo, logo, esse não é seu tipo
sanguíneo. O local onde não ocorrer aglutinação é o local que possui o antígeno do grupo
sanguíneo do paciente, pois ele não deve ter anticorpos contra seus próprios antígenos.

Figura 20 – Reação de Hemaglutinação

Fonte: Wikimedia Commons

Neste caso, foi realizada para detectar os grupos sanguíneos. Observe que há
gotas com aglutinações (precipitações), típicas de reações positivas. Essas aglu-
tinações ocorrem de forma semelhante no diagnóstico de hemoparasitoses.

Para saber mais detalhes sobre a técnica de aglutinação e hemaglutinação e saber algumas
doenças podem ser diagnosticadas por esse método, leia:
• Tópicos Reação de Aglutinação e Reação de Hemaglutinação, p. 528-30 do seguinte
livro, disponível em sua Biblioteca Virtual: DE CARLI, G. A. Parasitologia clínica: sele-
ção de métodos e técnicas de laboratório para o diagnóstico das parasitoses humanas.
2.ed. São Paulo: Atheneu, 2010;
• Tópico “Reações de Aglutinação”, p. 504-5 do seguinte livro, disponível em sua Biblio-
teca Virtual: TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. Microbiologia. 12 ed. Porto Alegre:
Grupo A, 2017.

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UNIDADE Protozoários do Sangue e Tricomoníase

Enzyme Linked Immunosorbent Assay – ELISA

O método de ELISA é uma das técnicas mais utilizadas para o diagnóstico de doenças
a partir da pesquisa de antígenos ou anticorpos específicos em amostras biológicas.

A utilização de anticorpos e antígenos marcados (imunoensaios enzimáticos) facilita a

identificação, a quantificação e a titulação da espécie e o agente etiológico causador da
doença em investigação.

A escolha correta da enzima conjugada, do antígeno e do anticorpo utilizados no

método são fundamentais para uma boa execução da técnica. Atualmente, existem
variados kits comerciais que auxiliam na rapidez dessas escolhas.

Para a execução deste método, utilizam-se microplacas de 96 poços, contendo antí-

genos específicos do parasita (ou anticorpos monoclonais específicos) que se ser investi-
gar impregnados previamente.

Ao adicionar a amostra contendo os anticorpos (ou os antígenos), há uma ligação es-

pecífica formando um complexo. Esse complexo pode ser detectado por meio da adição
de anticorpos secundários acoplados a uma enzima, que são responsáveis por catalisar
uma reação produzindo uma cor característica (Figura 21).

A intensidade da cor varia de acordo com a ligação ao antígeno, quanto mais intensa
a coloração, mais antígenos estão presentes na amostra. A coloração resultante dessa
reação é lida por absorbância e, com isso, pode-se fazer tanto a análise qualitativa quanto
a quantitativa.

Figura 21 – Microplaca de 96 poços

Fonte: Freepik

Observe que existem poços com colorações mais intensas e menos intensas,
mostrando a diferença de concentração de antígenos presentes na amos-
tra analisada.

O ensaio de ELISA pode ser indireto ou direto (Figura 22).

• No ELISA indireto, os antígenos já estão impregnados nos poços da microplaca.­
­O anticorpo­específico é adicionado à placa e é realizada uma lavagem para remover­
os anticorpos não ligados. Em seguida, é adicionado o anticorpo secundário­

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 conjugado com uma enzima. Após a lavagem para remover as moléculas que não
foram ligadas, é adicionado um substrato. Ao entrar em contato com o substrato,
a enzima acoplada ao anticorpo secundário vai promover uma reação e clivar o
substrato liberando luz. Nesse momento é que ocorre o aparecimento da cor que
será quantificada espectrofotometricamente (leitura da absorbância):
» Caso o paciente não possua anticorpos contra determinado antígeno, não acon-
tecerá a ligação entre o antígeno e o anticorpo primário (ausente) e, consequen-
temente, o anticorpo secundário acoplado à enzima não irá se ligar. Nesse caso,
não haverá emissão de luz e o resultado será negativo;
» Caso o paciente possua anticorpos, poderá ser realizada uma diluição seriada
para conhecer a titulação desse anticorpo na amostra do paciente. Cada poço
terá uma intensidade de cor diferente, de acordo com a diluição;
• No ELISA direto, anticorpos monoclonais específicos estão impregnados nos poços
da microplaca (e não os antígenos, como no tipo anterior). A amostra contendo o
antígeno é adicionada à placa e é realizada uma lavagem para remover os antígenos
não ligados. Em seguida, é adicionado o anticorpo conjugado com uma enzima que
vai reconhecer outros epítopos do antígeno. Após a lavagem para remover as molé-
culas que não foram ligadas, é adicionado um substrato. Ao entrar em contato com
o substrato, a enzima acoplada ao segundo anticorpo vai promover uma reação e
clivar o substrato liberando luz. Nesse momento é que ocorre o aparecimento da
cor que será quantificada espectrofotometricamente (leitura da absorbância):
» Caso a amostra do paciente não possua antígenos que sejam reconhecidos pelo
anticorpo acoplado à placa, não acontecerá a ligação entre o antígeno (ausente)
e o anticorpo. Consequentemente, o segundo anticorpo acoplado à enzima não
irá se ligar. Nesse caso, não haverá emissão de luz e o resultado será negativo;
» Caso o paciente possua antígenos, poderá ser realizada uma diluição seriada para
conhecer a concentração desse antígeno na amostra do paciente. Cada poço terá
uma intensidade de cor diferente de acordo com a diluição. Esse método é ampla-
mente realizado em testes antidoping.

Figura 22 – Diferenças das reações que ocorrem nos diferentes tipos de ELISA
Fonte: TORTORA, 2017

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UNIDADE Protozoários do Sangue e Tricomoníase

Para saber mais detalhes sobre a técnica de método de ELISA, princípio e tipos, leia:
Tópico “Ensaio imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA)”, p. 509-10 do seguinte livro dispo-
nível em sua Biblioteca Virtual: TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. Microbiologia. 12.ed.
Porto Alegre: Grupo A, 2017.

Reação em Cadeia da Polimerase – PCR

O PCR vem do nome em inglês Polymerase Chain Reaction, é uma técnica utilizada
nos Laboratórios de Biologia Molecular para amplificação (multiplicação) e detecção
de DNAs ou RNAs de organismos em geral. Portanto, pode ser utilizada para detectar
­moléculas de parasitas responsáveis pelo desenvolvimento de doenças parasitárias.

Essa técnica amplifica as unidades de DNA ou RNA por meio de ciclos repetidos
várias vezes, com oscilações de temperatura, resultando na multiplicação em milhares
de vezes da sequência de nucleotídeos alvo (DNA ou RNA).

Para a execução dessa técnica, são necessários alguns reagentes básicos que podem
variar de acordo com o alvo e a técnica utilizada.

Então, quais são estes reagentes que não podem faltar em uma reação de PCR?
• Primers: são Oligonucleotídeos iniciadores (sequências pequenas de DNA que são
sintetizadas para serem complementares as sequencias do DNA-alvo);
• dATP, dCTP, dGTP e dTTP (desoxirribonucleotídios trifosfatados);
• Taq DNA polimerase (enzima termoestável), sintetiza as cópias do DNA;
• Solução tampão com magnésio (participa como cofator da enzima Taq afetando as
temperaturas de desnaturação das fitas de DNA e a ligação dos primers).

Com todos esses elementos adicionados na reação e em concentrações adequadas,

começam ciclos repetitivos e alternados de aquecimento e resfriamento.

Esses ciclos ocorrem em um equipamento chamado termociclador (Figura 23):

Figura 23 – Aparelho Termociclador utilizado para

amplificação (sintetizar cDNA) na técnica de PCR
Fonte: Wikimedia Commons

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 Durante os ciclos de oscilação da temperatura, ocorrem as seguintes etapas: desna-
turação (abertura da fita), anelamento (ligação dos primers na fita molde) e extensão ou
polimerização (a enzima TAq polimerase sintetiza uma nova fita de DNA complementar
a cadeia matriz, adicionando os nucleotídeos no sentido 5’ a 3’).

Veja os passos e as temperaturas de cada etapa que compreendem a reação de PCR

na Figura 24:

Figura 24 – Etapas da reação em Cadeira da Polimerase (PCR)

Fonte: Wikimedia Commons

Para saber mais detalhes sobre a técnica de PCR, seus pontos principais, as etapas de execu-
ção e suas aplicações, não perca tempo. Acesse o link: https://bit.ly/2LMs2QY

Procedimentos para Detecção de

Parasitos do Sistema Gênito-Urinário
Para detectar parasitoses do trato genito-urinário, como é o caso da Tricomoníase, reali-
za-se a coleta da secreção genital, exsudato vaginal ou a primeira urina matinal em mulheres.

Em homens, utiliza-se a secreção uretral, a primeira urina matinal, secreção prostá-

tica ou sêmen, raspado da mucosa uretral ou, ainda, lavado prepucial. Geralmente, o
exame é realizado a fresco (exame direto), ou pode ser realizado o método de cultura
para que ocorra o isolamento do parasita.

Veja, a seguir, essas técnicas utilizadas no diagnóstico de Tricomoníase.

Pesquisa direta de Trichomonas vaginalis

Para o exame direto de Trichomonas vaginalis, é necessário que a coleta da amos-
tra e a análise aconteçam o mais rápido possível, pois os parasitas são muito sensíveis
à desidratação.

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UNIDADE Protozoários do Sangue e Tricomoníase

Esse método consiste em diluir a amostra em solução salina isotônica (0,15M) e ler
em microscopia óptica.

Como resultado, podem ser visualizados os trofozoítos se movendo, com o batimento

dos seus flagelos.

A desvantagem desse método é a degradação rápida dos trofozoítos, aumentando a

probabilidade de resultados falso-negativos. Para evitar que isso ocorra, a amostra deve
ser analisada em até 10 minutos após a coleta.

Figura 25 – Trofozoítos de Trichomonas vaginalis em torno de células epiteliais

Fonte: amenajari.org

Cultura para isolamento de Trichomonas vaginalis

O método considerado mais sensível e “padrão ouro” para detecção de Trichomonas
vaginalis é a cultura, principalmente, para aqueles pacientes que possuem baixa carga
parasitária. Porém, a grande desvantagem desse método é que o resultado leva em
­média de 3 a 4 dias para ser liberado.

Trichomonas vaginalis é um parasita anaeróbio facultativo, ou seja, não gosta da

presença do oxigênio.

Além disso, esse parasita necessita de um pH ácido (5,0-6,0) e temperaturas entre

20°C e 40°C.

No Mercado, existem variados meios de cultura que podem ser utilizados para cultivo
e manutenção axênica de Trichomonas vaginalis.

Todos eles contêm nutrientes, agentes de redução, fonte de energia (carboidratos),

sais tampões (para manter o pH), soro de cavalo ou bovino, estimulação da multiplica-
ção celular e ágar, fundamentais para o cultivo desse parasita.

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 Você Sabia?
Você sabe o que significa uma cultura axênica?
No material clínico utilizado para diagnóstico de Tricomoníase, pode-se encontrar bac-
térias e fungos que interferem no crescimento do parasita.
Para isso, é necessária uma cultura axênica, que é uma cultura livre desses microrga-
nismos. Para isso, adicionam-se antibióticos ao meio, por exemplo, penicilina e sulfato
de estreptomicina.
Caso as bactérias sejam resistentes a esses antibióticos, eles são substituídos por outros
que sejam eficazes. Para evitar o crescimento de fungos, pode ser adicionada canamicina,
tirosina, histamina, anfotericina B ou nitrato de histamina. A escolha dos antibióticos e
fungicidas fica a critério do analista e do protocolo que está sendo adotado.

Então, como pode ser feita a cultura de Trichomonas vaginalis?

Cabe ressaltar que existem inúmeros protocolos, que podem variar de Laboratório
para Laboratório.

• Quais parasitoses podem ser diagnosticadas por meio do método direto a fresco e esfregaço
em camada delgada? Qual método é mais adequado para identificar as espécies?
• Quais são as colorações hematológicas utilizadas no diagnóstico de hemoparasitas? Quais
as principais diferenças entre elas?
• Porque na técnica de Imprint é necessário um analista treinado?
• Qual a diferença entre tipos de ELISA? Explique;
• Qual molécula é amplificada na técnica de PCR. Como é realizada essa amplificação?

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UNIDADE Protozoários do Sangue e Tricomoníase

Material Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:

Vídeos
The Enzyme-linked Immunosorbent Assay – ELISA
Ative a legenda e assista ao vídeo que mostra o que acontece no método de ELISA.
https://youtu.be/1iNwFNinhQo
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
https://bit.ly/3byHOKf
Trichomonas Vaginalis
Assita o vídeo e veja como é realizada a vizualização dos trofozoítos no exame a
fresco de Trichomonas vaginalis.
https://youtu.be/SYd4lLed3CI

Leitura
Tripanossomíase americana
https://bit.ly/3si9Zmu
Parasitas – Leishmaniose
https://bit.ly/39t3nJM
Toxoplasmose
https://bit.ly/3bs4wnd
Malária
https://bit.ly/3q9VP59
Tricomoníase
https://bit.ly/3bt01sL
Tricomoníase
https://bit.ly/2LnE9nV

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Referências
DE CARLI, G. A. Parasitologia clínica: seleção de métodos e técnicas de laboratório
para o diagnóstico das parasitoses humanas. 2.ed. São Paulo: Atheneu, 2010.

FREITAS, E. O.; GONÇALVES, T. O. F. Imunologia, parasitologia e hematologia

aplicadas à Biotecnologia. São Paulo: Érica/Saraiva, 2015.

REY, L. Bases da Parasitologia Médica. 3.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2010.

SIQUEIRA-BATISTA, R.; GOMES, A. P.; SANTOS, S. S.; SANTANA L. A. Parasitologia:

fundamentos e prática clínica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2020.

ZEIBIG, E. Parasitologia Clínica – Uma abordagem Clínico Laboratorial. 2. ed. Rio

de Janeiro: Elsevier, 2014.

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