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Material Teórico
Objetivos da Unidade:
Neste setor, trabalhamos com diferentes tipos de amostras biológicas que são potencialmente
contaminadas com bactérias, fungos ou vírus. Além disso, alguns desses microrganismos são
capazes de liberar aerossóis e contaminar o ambiente e o pro ssional através do ar.
Vale lembrar que necessitamos utilizar os EPIs (equipamentos de proteção individuais) como
jaleco, luvas, máscara e óculos de proteção, sempre que houver manipulação de amostras
biológicas. Além disso, o laboratório deve estar equipado com os EPCs (Equipamentos de
proteção coletivos), que todos os pro ssionais devem compartilhar. Um exemplo de EPC
utilizado no laboratório de microbiologia, é a Cabine de Segurança Biológica (CSB), também
chamada de Cabine de Fluxo Laminar, que no setor de microbiologia é fundamental (Figura 1).
A CSB é utilizada para proteção do pro ssional durante a manipulação de materiais biológicos
altamente infectantes, substâncias tóxicas e culturas de células. Esse tipo de equipamento
deve estar em local de pouco trânsito e distante de portas. Os principais tipos de cabines de
segurança biológica são divididos em três classes: I, II e III.
Devemos sempre considerar que cada tipo de amostra deve ser coletado em frascos adequados
e transportados ao laboratório ou até o setor de análise de maneira que não inter ra no
resultado. Vamos ver na Tabela 1 a seguir as amostras utilizadas no setor de microbiologia, em
qual frasco deve ser coletada e como é realizado o seu transporte
Importante!
Frasco para
Amostra Volume adequado
coleta/transporte
Cultura bacteriana: 1 a 5
Saiba Mais
Como o diagnóstico é diretamente in uenciado pela coleta, transporte
e processamento das amostras, leia no Capítulo 16, o item “Material
Clínico Transporte e Processamento” do livro Microbiologia Médica, o
detalhamento de cada tipo de amostra biológica e quais bactérias
geralmente são encontradas em cada sítio.
Como as questões de coleta de amostra e transporte são críticas quando falamos de
diagnóstico microbiológico, devemos considerar alguns aspectos importantes:
2 O ideal é que o paciente não tenha feito o uso de terapias antimicrobianas antes da
coleta, pois pode interferir no crescimento bacteriano in vitro;
4 Amostras coletadas há muito tempo, por exemplo 24h, não têm valor de
diagnóstico, pois podem estar potencialmente contaminadas;
5 A quantidade de amostra coletada deve ser su ciente para realização das técnicas,
evitando resultados falso-negativos ou recoletas;
12 Toda amostra que chega ao laboratório deve ser considerada como contaminada e,
portanto, deve ser manuseada com cuidado.
Exercício
Etapa 2: Análise microscópica da amostra. Nesta etapa, pode estar incluída a análise a fresco
com colorações especí cas, como coloração de Gram e Ziehl-Neelsen, por exemplo.
Etapa 4: Provas bioquímicas de identi cação (provas realizadas de acordo com a morfologia
da bactérias).
O diagnóstico microbiológico é demorado. Os resultados levam pelo menos 18h para serem
liberados. Este tempo mínimo é necessário, pois os métodos tradicionais de diagnóstico
dependem do crescimento bacteriano e identi cação, que vai depender do tempo de
crescimento de cada bactéria. Este tempo de crescimento pode variar de 18h até várias
semanas, que é o caso das micobactérias. Por isso, pode-se ter alternativas de diagnóstico
para agilizar o processo e tratar o paciente mais rapidamente. Veja a seguir as vias de
diagnóstico que podem ser utilizadas na rotina (Figura 4).
Figura 4 – Visão geral do uxo de amostra até o
diagnóstico microbiológico
Fonte: GOERING, 2020
Os meios de cultura podem variar em sua composição química e concentração, de acordo com
a sua nalidade (veremos a seguir como os meios de cultura são classi cados). O fatores
químicos mais importantes para o crescimento de bactérias são água, fontes de carbono, de
nitrogênio, de fósforo, de enxofre e sais minerais, além de possuírem fatores de crescimento
para aqueles microrganismos que são mais exigentes.
Importante!
Já sabemos que os meios de cultura são materiais que favorecem o crescimento bacteriano e
que possuem ingredientes indispensáveis para esse crescimento. E como podemos classi cá-
los? Existem diferentes tipos?
Os meios de cultura podem ser classi cados, quanto ao seu estado físico em líquidos,
semissólidos ou sólidos (Figura 6). Nos meios líquidos é adicionada água destilada ou
deionizada, nos meios semissólido e sólidos é adicionado um composto solidi cante, o ágar.
A adição do ágar aos meios de cultura dão um aspecto de gelatina. Quanto maior a
concentração de ágar, mais sólido será o meio de cultura. Portanto, nos sólidos, há em torno
de 1 a 2% de ágar e nos meios semissólidos de 0,3% a 0,5%.
Os meios de cultura também podem ser classi cados quanto a sua constituição química
(função), que são os meios de cultura simples, os enriquecidos, seletivos e os diferenciais e os
de manutenção.
Os meios de cultura simples são compostos por elementos essenciais para o crescimento de
bactérias que são pouco exigentes, podemos citar como exemplo o caldo simples “LB broth”.
Os meios de cultura enriquecidos podem estar no estado líquido (caldos) ou sólidos. São
chamados assim pois possuem grande quantidade de nutrientes promovendo o crescimento
de microrganismos mais exigentes, e ainda mantendo as bactérias viáveis (vivas) em
determinadas amostras. Neste tipo de meio de cultura crescem variadas espécies de bactérias.
Um exemplo de meio de cultura enriquecido é o ágar sangue e o ágar chocolate
Figura 7
Fonte: Adaptada de Pixnio
No dia a dia do laboratório, podemos trabalhar com diversos tipos de meios de cultura que são
fundamentais para realização do diagnóstico. A seguir (Tabela 2), podemos ver alguns
exemplos de meios de cultura amplamente utilizados na rotina e sua utilização.
Saiba Mais
Os meios de cultura podem ser adquiridos comercialmente, podem
estar prontos para o uso, ou podem ser preparados no laboratório,
conforme a demanda. Saiba mais detalhes sobre os meios de cultura e
como são preparados no vídeo a seguir:
3 Quais são os fatores químicos e físicos que devem ser considerados para o
crescimento microbiano in vitro?
4 Como os meios de cultura podem ser classi cados? Qual a nalidade de cada um?
Técnicas de Semeadura
Existem variadas técnicas para semear as amostras para pesquisa microbiológica. A escolha
da técnica para o cultivo de bactérias varia de acordo com o tipo de meio de cultura e a
nalidade do cultivo. Veremos a seguir os métodos de semeadura que são mais utilizados na
rotina.
Técnica de Semeadura Semiquantitativa
A técnica de semeadura quantitativa, ou semiquantitativa, é utilizada para amostras colhidas
com swab, diluídas em solução siológica ou amostras de urina. A realização desta técnica
ocorre da seguinte maneira: após pincelar a alça calibrada no material, faça uma estria vertical
no centro do meio de cultura, de um lado ao outro; Com a mesma alça, estrie o material
carregando-o até o nal, conforme a Figura 9.
Além disso, a análise semiquantitativa é utilizada para amostras de urina, na qual são
utilizadas alças de platina ou descartáveis calibradas (0,01 ou 0,001mL) para estimar a
quantidade de UFC (unidade formadora de colônia) por mL de amostra.
Você Sabia?
Na microbiologia, UFC signi ca “Unidade Formadora de Colônia”. Na
maioria dos casos, é interessante quanti car o número de células
(bactérias) viáveis. A maneira mais utilizada é a contagem de células
viáveis que são capazes de formar uma colônia (vista a olho nu).
Então, considera-se que cada colônia é originada a partir de uma
única célula viável. Contudo, nem sempre isso ocorre, duas ou mais
células podem formar agregados e dar origem a uma única colônia.
Por isso, os resultados normalmente são expressos na unidade de
medida UFC (FIGURA 11).
Técnica de Esgotamento
A técnica de esgotamento tem a nalidade de obter colônias isoladas, permitindo distinguir os
diferentes microrganismos em um material ou cultura polimicrobiana (com mais de um
microrganismos) através da sua morfologia colonial. Portanto, esta técnica tem o objetivo de
isolar as espécies de bactérias de uma amostra (Figuras 10 e 11).
Para realizar esta técnica é necessário a utilização da agulha de níquel cromo, realizando uma
picada no centro do meio de cultura e penetrando até a metade da sua altura. Após incubação,
veri ca-se a motilidade da bactéria. Se é móvel, o meio de cultura ca todo turvo. Se não é
móvel, a turvação só aparecerá no local da picada (Figura 13).
Figura 13 – Técnica de semeadura em picada. Prova de
motilidade
Fontes: Reprodução
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Ficou curioso(a) sobre como são realizadas estas técnicas na prática?
Então assista ao vídeo a seguir e observe como é a execução das
diferentes técnicas de semeadura utilizadas na microbiologia.
O protocolo de qualidade para laboratórios de análises clínicas estão dispostos na RDC 302 de
Outubro de 2005 e a sua implantação tem como objetivo a acurácia, con abilidade e
reprodutibilidade dos testes realizados. O programa de qualidade tem como papel monitorar
continuamente todos os fatores envolvidos no processo de diagnóstico e assim conseguir
identi car, constantemente, os processos que devem ter melhorias.
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A implantação do Controle de qualidade no laboratório de
microbiologia é obrigatória e, portanto, devemos conhecer quais são
as exigências e como deve ser colocado em prática. Para saber mais
acesse o Manual elaborado pela ANVISA no link:
Exercício
O TSA pode determinar se uma bactéria é sensível ou resistente aos diferentes antibióticos
auxiliando na escolha destes para o tratamento na prática clínica. Além disso, o TSA pode
detectar a quantidade mínima necessária de antibiótico para inviabilizar aquela bactéria,
evitando que se use doses maiores do que necessário.
A maioria dos métodos de teste de sensibilidade aos antimicrobianos é realizada com culturas
de bactérias vivas puras (extraídas da amostra do paciente), usando uma variedade de
métodos padrão. Existem diferentes métodos para determinar a sensibilidade das bactérias na
presença de antibióticos. Alguns métodos são qualitativos, ou seja, determinam se as bactérias
são sensíveis, resistentes ou intermediárias aos antibióticos, outros métodos são
quantitativos, pois determinam a quantidade necessária de antibiótico para matar aquela cepa.
Vale ressaltar que os testes realizados e suas interpretações são estabelecidos por diretrizes.
As diretrizes mais comumente usadas são produzidas pelo Comitê European Committee on
Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) e pelo Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI). Essas diretrizes são comparáveis e é essencial que cada laboratório de diagnóstico
escolha uma diretriz aprovada para a interpretação dos resultados de seus testes de
sensibilidade aos antimicrobianos. Cada vez mais, métodos moleculares com tempos de
resposta rápidos estão sendo usados para detectar mecanismos de resistência antimicrobiana
especí cos.
Saiba Mais
No Brasil, temos o BrCAST (Brazilian Committe on Antimicrobial
Susceptibility Testing), que tem como objetivos determinar e rever
constantemente os testes de sensibilidade realizados nos laboratórios,
a m de padronizar estes testes, desenvolver controle de qualidade e
buscar um consenso internacional e/ou harmonização com o European
Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) e o Clinical
and Laboratory Standards Institute (CLSI). Acesse o site do BrCast e veja
quais são os padrões estabelecidos para realização dos testes de
sensibilidade.
BR Cast
02/07/2021 Prezados colegas da área de saúde, Conforme estabelecido pelo
Termo de Cooperação Técnico Cientí co do BrCAST, a cada dois anos, o Comitê
Gestor do BrCAST deve ser substituído por novos membros em 50% de sua
totalidade.
LEIA MAIS BRCAST
A quantidade de antibióticos a serem testados deve ser limitada, existem drogas que têm
prioridade nos testes e outras alternativas. No entanto, os laboratórios devem testar pelo
menos um agente microbiano de cada classe de antibiótico e, além disso, deve-se testar os
antibióticos que estão nos formulários padronizados nos hospitais.
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Existem variadas classes de antibióticos e cada uma delas possuem
determinados mecanismos de ação. No artigo “Antibióticos:
importância terapêutica e perspectivas para a descoberta e
desenvolvimento de novos agentes”, você vai veri car que existem
antibióticos de origem natural e semissintéticos que compreendem os
β-lactâmicos, tetraciclinas, aminoglicosídeos, macrolídeos, peptídicos
cíclicos; estreptograminas, entre outros (lincosamidas, cloranfenicol,
rifamicinas etc.) e os antibióticos de origem sintética, que são as
sufonamidas, uoroquinolonas e oxazolidinonas. Leia o artigo e veja o
mecanismo de ação de cada um:
É o método qualitativo mais utilizado nos laboratórios de microbiologia por ser simples,
con ável, ter baixo custo, maior reprodutibilidade, e ainda poder ser aplicado para quase todas
as bactérias. No entanto, este método não é quantitativo (não determina a dose do
antibiótico), deve ser utilizado para bactérias de crescimento rápido e se deve ter cuidado com
a interpretação dos resultados, que é manual.
5 Com uma pinça estéril, colocar os discos sobre a superfície de meio de cultura,
colocando uma leve pressão com a ponta da pinça para aderência (Figura 15).
Figura 15 – Deposição dos discos de antibióticos
Fonte: VERMELHO, 2019
7 Observar e medir os halos formados ao redor dos discos de papel (Figura 17).
Figura 17 – Visualização da placa do teste de antibiograma
Fonte: VERMELHO, 2019
Os resultados obtidos são lidos com o auxílio de uma régua ou paquímetro para medir o
diâmetro dos halos de inibição de cada disco. Estas medidas são comparadas com tabelas
padrão que determinam se aquela bactéria é sensível, intermediária ou resistente ao
antibiótico testado.
Para análise do tamanho do halo formado, deve ser consultada a tabela padrão, pois para cada
antibiótico é esperado um tamanho especí co de halo para concluir se a bactéria é sensível,
intermediária ou resistente àquele antibiótico.
Saiba Mais
Você sabe o que signi ca uma bactéria ser sensível, intermediária ou
resistente a um antibiótico? Abaixo você verá as novas de nições
dispostas pelo EUCAST. Acesse o link a seguir e clique no item “3 -
Rede nição Das Categorias Dos Testes De Sensibil S, I E R”
BR Cast
LEIA MAIS BRCAST
Cada bactéria terá a sua CIM para determinado antibiótico. E esta será determinada para cada
tipo de amostra.
Método da diluição em tubo
Este método também pode ser chamado de macrodiluição em tubos. Foi uma das primeiras
técnicas a serem adotadas para avaliar a sensibilidade aos antimicrobianos. Para que esta
técnica seja realizada, utiliza-se meio de cultura líquido que permitirá o crescimento
bacteriano e diluições seriadas e logarítmicas de agentes antimicrobianos.
Vejamos os passos de como é realizado este método:
Observe abaixo como podemos veri car o crescimento microbiano nos tubos. Quanto maior a
concentração de antimicrobiano, menor a turvação e menor quantidade de colônias que
crescem no ágar, ou ausência de crescimento (Figura 18).
Figura 18 – Representação esquemática do teste de
macrodiluição em tubo, após a inoculação e incubação
Fonte: anvisa.gov.br
x 104 a 105 UFC/mL. As placas, após inoculação, são incubadas a 35±2°C num período de 16 a
20 horas (vai depender da espécie bacteriana e do antimicrobiano testados). Após o período de
incubação, é realizada a leitura visual (olho nu) e veri cada a turvação de cada poço. A
concentração mínima inibitória (CIM) será o primeiro poço que não apresenta turvação,
observe a Figura 20.
Este método ocorre da seguinte forma: existem diferentes placas de ágar, sendo que cada
placa contém uma concentração de antimicrobiano. Geralmente testam-se de 6 a 12
concentrações diferentes dentro de uma escala de diluições logarítmicas. Cada placa possui
uma diluição especí ca, logo, o número de placas é igual ao número de concentrações
testadas. Cada placa pode ser utilizada para testar até 32 bactérias diferentes (mesmo
antibiótico e mesma concentração).
Entre as infecções simples estão a cistite ou pielonefrites agudas em mulheres jovens sem
lesões das vias urinárias ou doença sistêmica coexistente. Já entre as infecções complicadas,
estão a cistite ou pielonefrite em homens e crianças, em pacientes com cateteres de longa
permanência ou em mulheres com infecções repetidas, anomalias urológicas ou doenças
coexistentes. Para todos esses casos, o exame de urina e a urocultura são su cientes para o
diagnóstico.
Coleta
O sucesso de um bom exame de urocultura está relacionado à coleta adequada do material.
Para isso, é necessário orientar o paciente corretamente. Em condições normais, a urina deve
ser estéril. Porém, ela pode ser facilmente contaminada no momento da coleta com a
microbiota da região genital (períneo, vagina, próstata ou uretra).
A amostra de urina deve ser colhida em frasco estéril de boca larga com tampa de rosca. O
paciente deve reter a urina por pelo menos 2 a 3 horas antes da coleta ou coletar a primeira
urina da manhã. A amostra geralmente utilizada para realização do exame é a de jato médio.
Mas pode ser utilizada amostra de urina de qualquer jato, urina de paciente com cateterismo
vesical, urina coletada por sonda de alívio, urina coletada por punção suprapúbica, amostra de
urina de primeiro jato, ambas amostras coletadas de jato médio.
Procedimentos de coleta da amostra de urina de jato médio para urocultura:
Deve ser realizada a higiene prévia da região genital com água e sabão ou
clorexidina aquosa a 0,2%;
Importante!
Análise microbiológica
A análise microbiológica da amostra compreende a análise de Gram e cultura da amostra, que
pode ser por semeadura quantitativa em placa ou por laminocultivo.
≥105 UFC/mL. Além disso, se forem encontradas células epiteliais e/ou mais de um tipo de
microrganismos no Gram, sugere-se contaminação da amostra no momento da coleta.
Quanto ao meio de cultura para semeadura, pode-se utilizar o ágar CLED e o ágar MacConkey,
mas há também meios com substratos cromogênicos como CHROMagar, CPS ID2 e CPS ID3,
que permitem uma identi cação de nitiva ou presuntiva dos principais gêneros de bactérias
isoladas em uroculturas.
Imergir a alça calibrada de 10µL ou de 1µL na urina de forma vertical duas a três
vezes. Retirar a alça veri cando se essa contém a amostra;
Obs. 1: Se após o período de incubação o resultado for negativo e no Gram foi observado
presença de microrganismos ou número elevado de leucócitos, incubar por mais 18 a 24h.
Sempre correlacionar com a leitura do Gram.
Outra maneira de realizar a urocultura é pelo laminocultivo (Figura 23), que consiste em uma
embalagem plástica, cilíndrica, transparente e com a tampa conectada a um suporte plástico
com duas faces. A face larga contém meios de cultura como o ágar CLED, e a outra face,
dividida em dois, contém o meio de citrato e um meio seletivo para bacilos gram negativos,
permitindo a realização do teste de indol.
Importante!
Explore
Para saber mais sobre os Antibióticos (visão geral) e O que é
resistência a antibióticos, acesse:
No organismo humano, a microbiota se encontra geralmente nas partes do corpo que estão
em contato com o meio externo como a pele, mucosas e trato gastrointestinal. Cada região
possui uma colonização própria de microrganismos.
As lágrimas e o ato de
piscar também eliminam
alguns micróbios ou
inibem a colonização por
outro
Os atos de morder,
mastigar, movimentar a
língua e salivar desalojam
os micróbios. A saliva
contém várias substâncias
antimicrobianas
O muco e a descamação
Escherichia coli, Bacteroides,
periódica previnem que
Fusobacterium, Lactobacillus,
muitos microrganismos
Intestino Enterococcus, Bi dobacterium,
colonizem o revestimento
grosso Enterobacter, Citrobacter,
do trato gastrintestinal.
Proteus, Klebsiella e Candida
Além disso, a mucosa
(fungo)
produz uma série de
substâncias
antimicrobianas
A diarreia também
elimina parte da
microbiota normal
Staphylococcus, Micrococcus,
Sistemas Enterococcus, Lactobacillus, A parte proximal da
Bacteroides, difteroides uretra em ambos os sexos
reprodutivo aeróbicos, Pseudomonas, contém uma micro- biota
e urinário Klebsiella e Proteus na uretra; residente; a vagina tem
lactobacilos, Streptococcus, uma população de
Clostridium, Candida micróbios ácido-
albicans (fungo) e Trichomonas tolerantes em virtude da
vaginalis (protozoário) na natureza de suas secreçõe
vagina
O muco e a descamação
periódica previnem que
muitos microrganismos
colonizem o revestimento
do trato urogenital; o
uxo de urina remove os
micróbios
mecanicamente. Além
disso, o pH da urina e a
ureia são antimicrobianos
Os cílios e o muco
expelem os micróbios da
cérvice uterina para a
vagina, e a acidez da
vagina inibe ou mata os
micróbios
Saiba Mais
É importante conhecer a microbiota normal e seus sítios, pois
devemos considerar na hora do diagnóstico quais microrganismos são
naturalmente encontrados em determinada região, para não liberar
um resultado equivocado. Acesse na sua biblioteca virtual o livro
Microbiologia médica de Jawetz et al., 26. ed. 2014, Capítulo 10, p. 165.
Ácido lipoteicoico
Flagelos
Invasão
Enzimas (colagenase, hialuronidase, condroitina,
sulfatase, brinolisina, fosfatase ácida e Dnase)
Exopolissacarídeos (cápsula)
IgA, IgC, IgM, C3 e C5 proteases
Sobrevivência (evasão de Lipopolissacarídeo (porção antige-O)
defesas de hospedeiro ou Flagelos
aquisição ou nutrientes) Exotoxinas
Proteínas de choque térmico
Produtos nais metabólicos
Exotoxinas
Enzimas (colagenase, hialuronidase, sulfato de
condroitina, gingipains, aminopeptidases,
Dano Direto fosfolipase, neuraminidase e fosfatase ácido)
Produtos nais metabólicos (ácidos graxos de
cadeia curta, poliaminas, compostos voláteis de
enxofre, indol, amônia)
Material Complementar
Livros
VERMELHO, A. B. et al. Práticas de microbiologia. [2. ed.] Grupo GEN, 2019.
Capítulo 5: Técnicas de isolamento e contagem de microrganismos, p. 89.
GOERING, Richard V. et al. Mims Microbiologia médica. [6. ed.] Grupo GEN, 2020. Capítulo
20: Infecções do trato urinário, p. 236.
PROCOP, Gary W. et al. Diagnóstico microbiológico-Texto Atlas. [7. ed.] Grupo GEN, 2018.
Leitura
Princípios de biossegurança aplicados aos laboratórios de ensino universitário de
microbiologia e parasitologia
Princípios de biossegurança aplicados aos
laboratórios de ensino universitário de
microbiologia e parasitologia
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA PARASITOLOGIA Princípios de biossegurança
aplicados aos laboratórios de ensino universitário de microbiologia e
parasitologia Principles of biosafety applied to microbiology and parasitology
laboratories in universities Luis Antônio SangioniI ; Daniela Isabel Brayer
PereiraII ; Fernanda Silveira Flores VogelI ; Sônia de Avila BottonI,
IDepartamento de Medicina Veterinária Preventiva, Centro de Ciências Rurais
(CCR), Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Avenida Roraima, 1000,
prédio 44, sala 5007, 97105-900, Camobi, Santa Maria, RS, Brasil.
LEIA MAIS SCIELO
Referências
BROOKS, G. F.; CAROL, K. C.; BUTEL, J. S.; MORSE, S. A.; MIETZNER, T. A. Microbiologia
médica de Jawetz, Melnick e Adelberg. 26 ed. Porto Alegre: AMGH, 2014.
TORTORA, G. J. FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 12 ed. Porto Alegre: Artmed, 2017.