Introdução à Microbiologia

Clínica
 Fases do Ciclo Diagnóstico:

• Fase Pré-analítica (60% -70%):

➢ Começa na coleta de material,
➢ Seja ela feita pelo paciente (urina, fezes e escarro)/seja feita no ambiente
laboratorial;
• Coleta
• Transporte

• Fase analítica (20% - 30%):

➢ Corresponde à etapa de execução do teste propriamente
dita;

• Fase pós-analítica (10%):

➢ Inicia-se no laboratório clínico e envolve os processos de validação e liberação
de laudos, encerrando-se após o médico receber o resultado final, interpretá-lo e
tomar sua decisão.
COLETA, TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO DE AMOSTRA

✓ Todo resultado liberado pelo laboratório de microbiologia é conseqüência

da qualidade da amostra recebida;
✓ A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no
isolamento do agente etiológico e favorecer o desenvolvimento da flora
contaminante, induzindo a um tratamento não apropriado;
✓ Portanto, procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para
evitar o isolamento de um “falso” agente etiológico, resultando numa
orientação terapêutica inadequada;
 O profissional responsável pela coleta será também responsável por
identificar de forma legível e correta o material a ser encaminhado ao
laboratório de microbiologia.
Na amostra devem estar identificados:

▪ Nome e registro do paciente (se for o caso);

▪ Leito ou ambulatório e especialidade
▪ Material colhido
▪ Data, hora e quem realizou a coleta
 ASPECTOS BÁSICOS DA COLETA E DO TRANSPORTE DE
AMOSTRA

COLETA
▪ Quem coleta o material deve ser devidamente treinado e
periodicamente reciclado nesta atividade.;
▪ Deve saber que o material deverá ser destinado, o mais brevemente
possível, ao laboratório;
▪ Deve conhecer ou obter instruções sobre conservação e/ou transporte
do material caso este não possa ser realizado imediatamente.
 Considerações gerais da coleta microbiológica

▪ Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível;

▪ Instruir claramente o paciente sobre o procedimento;
▪ Observar a antissepsia na coleta de todos os materiais clínicos;
▪ Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser
isolado;
▪ Considerar o estágio da doença na escolha do material:
ex. Patógenos entéricos causadores de diarreia, estão presentes em maior
quantidade e são mais facilmente isolados durante a fase aguda ou diarreica do
processo infeccioso intestinal.
Considerações de segurança

▪ Utilizar as barreiras de proteção necessárias a cada procedimento;

▪ Toda amostra deve ser tratada como potencialmente patogênica;
▪ Usar frascos e meios de transporte apropriados;
▪ Não manusear a amostra em trânsito: paciente e laboratório;
▪ Não contaminar a superfície externa do frasco de coleta e verificar se ele está
firmemente vedado: (caso ocorram respingos ou contaminação na parte externa
do frasco, fazer descontaminação com álcool 70% ou outra solução
descontaminante disponível);
▪ Não contaminar a requisição médica que acompanha o material;
▪ As amostras deverão ser transportadas em sacos plásticos fechados;
▪ Identificar claramente a amostra coletada, com todos os dados necessários;
▪ Colocar a identificação no frasco de coleta e nunca na tampa ou sobre rótulos;
▪ Encaminhar os materiais imediatamente ao laboratório.
TRANSPORTE DAS AMOSTRAS

➢ Transportar as amostras IMEDIATAMENTE ao laboratório para:

▪ Assegurar a sobrevivência e isolamento do microrganismo, pois o laboratório

de microbiologia trabalha basicamente em função da viabilidade dos
microrganismos;

▪ Evitar o contato prolongado dos microrganismos com anestésicos utilizados

durante a coleta, pois eles poderão exercer atividade bactericida;

▪ Evitar erros de interpretação nas culturas quantitativas;

▪ Consultar o laboratório para verificar a disponibilidade dos meios

de transporte.
 CRITÉRIOS DE REJEIÇÃO PARA AMOSTRAS CLÍNICAS

✓ O recebimento criterioso das amostras clínicas pelo laboratório de

microbiologia garante uma melhor correlação clínico/laboratorial;
✓ O microbiologista ou responsável pela rotina deverá verificar se a
amostra está apropriadamente identificada, se a quantidade de
material é suficiente e observar o aspecto da amostra - purulento,
límpido, hemorrágico, etc.
Principais erros de identificação
▪ Discrepância entre a identificação da amostra e o pedido médico;
▪ Falta de identificação da amostra;
▪ ƒ
Origem da amostra ou tipo de amostra não identificada;
▪ Teste a ser realizado não especificado;
▪ Amostras Inadequadas;
▪ Material clínico recebido em solução de fixação (formalina);
▪ Ponta de cateter de Foley;
▪ Material conservado inadequadamente com relação a temperatura
(urinas colhidas há mais de 24 horas, que ficaram guardadas em
geladeira, ou colhidas há mais de duas horas, sem refrigeração);
 Inadequações
▪ Frascos não estéreis;
▪ Presença de vazamentos, frascos quebrados ou sem tampa, com
contaminação na superfície externa;
▪ Mais de uma amostra de urina, fezes, escarro, ferida colhida no mesmo
dia e da mesma origem;
▪ Swab único com múltiplas requisições de testes microbiológicos;
▪ Swab seco;
▪ Culturas para anaeróbios recebidas em condições não apropriadas;
▪ Amostras com as características acima descritas são inadequadas e
demandam um contato prévio com o médico solicitante para melhores
esclarecimentos.
HEMOCULTURAS

▪ Lavar as mão e EPI;

▪ Remover os selos da tampa dos frascos de
hemocultura e fazer assepsia prévia nas tampas com álcool 70%;
▪ Garrotear o braço do paciente e selecionar uma veia adequada. Esta área não
deverá mais ser tocada com os dedos;
▪ Fazer a antissepsia com álcool 70% - de forma circular e de dentro para fora e
solução de iodo (t1% a 2%);
▪ Coletar a quantidade de sangue e o número de amostras recomendados de
acordo com as orientações descritas ou se discriminadas no pedido médico;
▪ Remover o iodo do braço do paciente com álcool 70% para evitar reação
alérgica;
▪ Identificar cada frasco com todas as informações padronizadas e enviar ao
laboratório juntamente com a solicitação médica devidamente preenchida.
HEMOCULTURA ▪ Amostra - 10% do volume do frasco de coleta;

▪ ANVISA – frascos que permitem a coleta de 10mL;

▪ anticoagulante recomendado é o SPS (Polianetolsulfonato

sódico) ;

▪ Número de frascos varia de acordo com a Patologia;

- 3 culturas (coletas #) bacteremia ou endocardite microbiana

▪ Crianças - Coletar amostras com 0,5 ml a 3 ml

- 2 culturas - as para diagnóstico de bacteremias em recém-
nascidos.
HEMOCULTURA
INSTRUÇÕES PARA PONTA DE CATETER INTRAVASCULAR

▪ Mesma assepsia para retirada;

▪ Manusear assepticamente;
▪ Cortar ~ 5 cm do cateter;
▪ Colocar em frasco estéril contendo meio de cultura.
 ESCARRO

▪ Não é considerado ideal para avaliação microbiológica do trato respiratório

hemocultura, lavado brônquico ou aspirado transtraqueal

podem fornecer resultados mais confiáveis (equipe médica).

▪ Coletar escarro – não saliva;

Tuberculose
Aspirado traqueal e secreção obtida por broncoscopia:
▪ Procedimento realizado por médico treinado. O material colhido deve ser
colocado em recipiente estéril.

Lavado Bronquio-Alveolar -
▪ Utilizado para obtenção etiológica das pneumonias associadas a ventilação
mecânica e em paciente imunodeprimidos, sendo considerado o método
mais fidedigno para investigação microbiológica do trato respiratório inferior.
 MUCOSA ORAL E OROFARINGE

▪ Coletar com “swab” estéril;

▪ Fazer esfregaços sobre as amígdalas e faringe posterior, evitando tocar na língua
e na mucosa bucal – a contaminação com saliva, que contém uma flora bacteriana
variada, pode dificultar o isolamento do verdadeiro agente infeccioso;
▪ Procurar o material nas áreas com hiperemia próximas aos pontos de supuração
ou remover o pus ou a placa, colhendo o material abaixo da mucosa – coletar da
área inflamada;
▪ Colher dois swabs.
▪ Mergulhar o “swab” umedecido em salina estéril e enviar o tubo ao laboratório;
INSTRUÇÕES PARA FLUIDOS ORGÂNICOS ESTÉREIS
(Líquidos: Pleural, Ascítico, Biliar, de Articulações e outros)

▪ Promover a antissepsia com álcool 70%, iodo;

▪ Punção percutânea ou cirúrgica - Procedimento realizado por médicos;

▪ Direto no frasco de hemocultura ou em frasco estéril.

 LÍQUOR
▪ Procedimento realizado por equipe médica especializada.

▪ Fazer assepsia rigorosa no local da punção;

▪ Recomenda-se jejum;

▪ Caso a coleta permita somente a disponibilidade de um tubo, o laboratório de

microbiologia deverá ser o primeiro a manipulá-lo;

▪ Caso haja coleta de dois ou mais tubos, o Laboratório de Microbiologia deverá

ficar com o tubo que contiver menos sangue;

▪ Ao transportar a amostra,
nunca refrigerar – imediatamente para o
laboratório.
 INSTRUÇÕES PARA FERIDAS, ABSCESSOS E EXSUDATOS

▪ O termo “secreção de ferida” não é apropriado como informação da origem do

material coletado – definir o sítio anatômico;

▪ Descontaminação das margens e superfície da lesão - solução de povidine

iodine (PVPI) e soro fisiológico;

▪ Coletar o material purulento localizado na parte mais profunda da ferida -

aspirado com seringa e agulha – ou seringa de insulina;

▪ Swabs (menos recomendados) serão utilizados quando outros procedimentos

não forem possíveis.
INSTRUÇÕES PARA AMOSTRAS DE TECIDO SUBCUTÂNEO E AMOSTRAS DE
PELE

▪ Antissepsia com álcool 70% e iodo;

▪ Coletar amostra de punção de biópsia (3 mm a 4 mm) para cultura;

▪ Colocar num recipiente estéril contendo NaCl 0,85% estéril (solução fisiológica)
ou recipiente com meio de cultura líquido fornecido pelo laboratório;

▪ Não usar formalina.

Staphylococcus aureus - Osteomielite/pé diabético - Professor, Department of

Medicine, University of Washington.
INSTRUÇÕES PARA LESÕES SUPERFICIAIS - coleta para fungos -
micológico direto

▪ Limpar a superfície com água destilada ou soro fisiológico estéreis; não utilizar
iodo;
▪ Usando um bisturi, raspar as bordas da lesão;
▪ Amostra do couro cabeludo inclui cabelo, que é seletivamente coletado para
exame;
▪ Amostra de unha - obter raspado e/ou material abaixo da unha;
▪ Os materiais obtidos podem ser colocados em placa de Petri estéril e
identificados separadamente para cada sítio a ser investigado (por exemplo, unha
da mão direita, raspado do pé esquerdo, raspado da região plantar, etc.).
INSTRUÇÕES PARA SECREÇÃO DE OUVIDO

▪ Procedimento realizado por médico.

▪ Enviar ao laboratório no meio de transporte (Stuart).

 INSTRUÇÕES PARA SECREÇÃO OCULAR

▪ Antes da aplicação de antibióticos, soluções, colírios ou outros medicamentos;

▪ Desprezar a secreção purulenta superficial e, com swab colher o material da
parte interna da pálpebra inferior;
▪ Identificar corretamente a amostra e enviar imediatamente ao laboratório,
evitando a excessiva secagem do material.
 INSTRUÇÕES PARA MATERIAL GENITAL

Preparo da paciente:
Recomenda-se:
▪ Não estar menstruada;
▪ Evitar ducha e cremes vaginais na véspera da coleta;
▪ Três dias de abstinência sexual.

▪ Coleta realizada pelo médico – espéculo.

INSTRUÇÕES PARA MATERIAL GENITAL
INSTRUÇÕES PARA MATERIAL GENITAL
 INSTRUÇÕES PARA MATERIAL GENITAL

Secreção Uretral

▪ N. gonorrhoeae - muito sensível e pode morrer rapidamente se não for

semeada imediatamente após a coleta;
▪ Desprezar as primeiras gotas da secreção;
▪ Coletar a secreção purulenta, de preferência pela manhã, antes da
primeira micção ou há pelo menos duas horas ou mais, sem ter urinado;
▪ Coletar com alça bacteriológica descartável ou swab estéril fino;
▪ Colocar a amostra em meio de transporte e realizar as lâminas para
bacterioscopia da secreção fresca;
▪ Encaminhar imediatamente para o laboratório.
INSTRUÇÕES PARA MATERIAL GENITAL
 INSTRUÇÕES PARA SECREÇÃO ANAL

▪ Inserir o swab cerca de 1 cm do canal anal e fazer movimentos de lado a lado

para coletar material;

▪ Colocar a amostra em meio de transporte e enviar o swab imediatamente ao

laboratório.
 INSTRUÇÕES PARA URINA

▪ Fazer limpeza prévia da região perineal com água e sabão, desprezar o

primeiro jato de urina da manhã, e colher 3 a 5 ml de urina em tubo de ensaio
estéril;
▪ Em crianças - lactentes – usar o saco coletor (trocar de 30 e 30 minutos);
 INSTRUÇÕES PARA FEZES

• Fazer lavagem prévia da região anal com água e sabão, coletar porções de
fezes em recipiente estéril com tampa ou “swab” anal, mergulhar o “swab” em
salina estéril e enviar o tubo ao laboratório.
QUAL O TEMPO MÁXIMO PERMITIDO ENTRE A COLETA E O
PROCESSAMENTO INICIAL DE MATERIAIS COLETADOS PARA EXAMES
MICROBIOLÓGICOS?

✓ A definição do tempo máximo permitido entre a coleta e o

processamento de um determinado material clínico é um fator
importante para um resultado confiável do exame;

✓ A temperatura de transporte é outro fator importante;

✓ Amostras de secreções do trato respiratório inferior, entre outras,

são consideradas de urgência e devem ser processadas o mais
rápido possível.
Transporte

▪ Swab para Coleta e Transporte de Amostras com Meio AMIES com

Carvão Estéril

 coletas em orofaringe,
secreções, pele e feridas.

▪ Swab para Coleta e Transporte de Amostras com Meio STUART Estéril

 Coleta de amostras
da garganta,
secreções vaginais,
pele e feridas.
Fase Analítica

• Seleção de meios de cultura primários;

• Transferência e cultura das amostras clinicas;

• Interpretação das culturas e análise dos resultados.

MEIO DE CULTURA

▪ Conjunto de substâncias, formuladas de maneira adequada, capazes de

promover o crescimento bacteriano, em condições laboratoriais;

▪ Para isso um meio de cultura necessita conter características básicas que

incluem:

✓Fonte de carbono e nitrogênio;

✓Fonte de energia - carboidratos;

✓Sais minerais;

✓Fatores de crescimento;

✓Indicadores de pH;

✓Inibidores;

✓Condições Físicas;

✓Esterilização.
MEIO DE CULTURA
Estado físico

▪ Líquidos – Também chamados de caldos;

Crescimento indiscriminado com turvação do meio;
▪ Sólidos - Produzidos com o acréscimo de ágar ao meio líquido;
Crescimentos de colônias isoladas, muito utilizado para culturas puras;
▪ Semi-sólidos – Adição de menor quantidade de ágar,
Mobilidade bacteriana – série de provas bioquímicas.
MEIO DE CULTURA
 Classificação dos meio de cultura

1. Meio de Enriquecimento:

▪ Geralmente líquido, de composição química rica em nutrientes, com a

finalidade de permitir que as bactérias contidas em uma amostra clínica
aumentem em número.

Ex.: Caldo Brain Heart Infusion (BHI) e Caldo Tetrationato.

▪ + 6,5% NaCl - enterococos e estreptococos;

▪ microrganismos fastidiosos ou não, incluindo
bactérias aeróbicas e anaeróbicas e fungos
Classificação dos meio de cultura

Meio de Enriquecimento:

Caldo Tetrationato

Peptona de caseína: 2,5 g/L; (FN)

Peptona de carne: 2,5 g/L; Sais biliares: 1 g/L;
Carbonato de cálcio: 10 g/L;
Tiossulfato de sódio: 30 g/L;
Água purificada: 1000mL

▪ fezes, urina, alimentos e outros

materiais
▪ para o isolamento de Salmonella.
Meio de Transporte:

▪ Consiste em um meio pouco nutriente;

▪ Geralmente mantém o pH favorável, previne a desidratação de secreções
durante o transporte e evita a oxidação (agente redutor) e autodestruição
enzimática dos patógenos presentes.

Ex.: Meio de Stuart, Meio de Cary-Blair e Caldo Tioglicolato.

Meio de cultura não seletivos
Ágar sangue: meio não seletivo, crescimento de
bactérias gram – e +
Cled- Ágar cystine lactose eletrolyte deficient: meio que
permite o crescimento de gram + e gram - ,

▪ Quantitativo

FL - amarelo ou NFL
• Ágar Mueller-Hinton é um meio de cultura frequentemente usado
para testes de susceptibilidade antimicrobiana.
 Meio Diferencial

▪ Possibilita a distinção entre vários gêneros e espécies de microrganismos,

por possuir substâncias que permitem uma diferenciação presuntiva,
evidenciada na mudança de coloração ou na morfologia das colônias.
▪ Enterobactérias* , Bacilos G-*
Ex.: Agar Eosin Methilene Blue (EMB), Agar McConkey e Agar Hektoen

Cor verde: fermentação

da lactose e/ou sacarose

Inibe o crescimento
de G+
Agar McConkey
 Agar Hektoen ▪ Enterobactérias* , Bacilos G-*

Seletivo: inibem o
crescimento das bact. G+
 Meio Seletivo

▪ A finalidade deste tipo de meio é selecionar as espécies que se deseja isolar

e impedir o desenvolvimento de outros germes (adição de corantes,
antibióticos e outras substâncias com capacidade inibitória para alguns
germes.

Staphylococcus aureus de amostras

biológicas como urina, secreções, feridas e
exudatos
 amostras biológicas como urina, secreções, feridas e exudatos

Além de líquidos e produtos lácteos, carnes e derivados, incluindo conservas e pescados

Procedimento
Inocular a amostra por estrias através de esgotamento da alça de platina.
Interpretação
Não havendo crescimento bacteriano, constata-se amostra isenta de bactérias. Staphylococcus
aureus fermentadores de manitol produzem colônias grandes e rodeadas de uma zona
amarela. Os estafilococos não-patogênicos produzem colônias pequenas e rodeadas de uma
zona vermelha. O Staphylococcus epidermidis e Bacillus subtillis produzem colônias brancas.
Ágar Salmomella Shigella (SS)
Tissulfato de sódio e o citrato férrico – H2S
Ágar chocolate: meio nutritivo maioria bactérias, é adicionado
sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que
faz com que as hemácias lisem, liberando hematina....
Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp.,
Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.
 5. Meio Indicador
▪ É utilizado no estudo das propriedades bioquímicas das bactérias,
auxiliando, assim, sua identificação;
▪ O mais simples é aquele usado no estudo das reações de fermentação;

Ex.: Agar Triple Sugar Iron (TSI) e Agar Citrato de Simmons

Agar Citrato de Simmons

▪ Indicador de pH – azul de bromotimol - A mudança da cor verde para azul -

indica que o microrganismo utiliza o citrato como fonte de carbono.
 SELEÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA

▪ A escolha dos meios de cultura, para o processamento inicial das amostras é

muito importante e está condicionada à flora patogênica desse local;
▪ Em geral é usado mais de um tipo de meio, no sentido de fornecer condições de
crescimento a todos os patógenos possíveis de estarem presentes;
▪ Para cada caso em particular, existem os meios utilizados rotineiramente na
semeadura primária;
 SELEÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA

▪ Atualmente, o procedimento mais utilizado é a aquisição de

meios pré-fabricados e fornecidos de forma desidratada, onde é
necessário apenas a pesagem criteriosa da quantidade
necessária ao volume desejado, seguido de dissolução e
esterilização...
Meio de cultura seletivos

• Ágar Manitol
• Ágar Mac Conkey, EMB
• Ágar Salmomella Shigella
• Ágar Sabouraud
• Ágar Bili-Esculina
• Ágar Dnase
• Ágar TSI
• Ágar Lowestein Jensen
• Ágar Manitol - Famílias Micrococcaceae

• Ágar Mac Conkey, EMB - Crescimento de bactérias Gram negativas e indicar a

fermentação de lactose

• Ágar Salmomella Shigella

• Ágar Sabouraud - Identificação de fungos patogênicos e leveduras.

• Ágar Bili-Esculina - Isolamento e identificação de estreptococos.

• Ágar Dnase - Recomendado para a detecção da atividade desoxiribonuclease de

bactérias e fungos. Staphylococcus aureus.

• Ágar TSI - Diferenciação de patógenos entéricos (E. coli) pela capacidade de

determinar a fermentação do carboidrato.

• Ágar Lowestein Jensen - Mycobacterium tuberculosis

Azul de Toluidina
Caldos :

• Caldo tetrationato
• Caldo selenito
• Caldo nitrato
• Caldo malonato
• Caldo triptona e SIM
• Caldo BHI
• Caldo tetrationato Meio de enriquecimento para uso com Salmonella spp.- Cosposto
por sais de bile impede o crescimento de bactérias Gram-positivas e o iodo
proporciona o impedimento de crescimento de espécies fecais.

• Caldo selenito. Diferenciar e identificar vários tipos de bactérias especialmente a

família Enterobacteriaceae. Inibem coliformes e outras espécies da flora intestinal
como estreptococos.

• Caldo malonato usado para a diferenciação de bactérias gram-negativas com base na

habilidade de utilizar malonato e produzir ácido pirúvico.

• Caldo triptona e SIM Metabolizar o triptofano em indol. Diferenciar gêneros e

espécies de enterobactérias, não fermentadores, Haemophilus e anaeróbios.

• Caldo BHI. Caldo infusão de cerebro e coração e um meio altamente nutritivo

empregado para a propagação de cocos.
Meios de cultura:
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO

 Ágar Nutriente
 Salina tamponada
 Clary Blair
 Meio Stuart
 Água peptonada
• Lag: período variável, onde ainda não há um aumento significativo da população.

• Log ou exponencial: nesta etapa, as células estão plenamente adaptadas, absorvendo

os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. A taxa de
crescimento exponencial é variável, de acordo com o tempo de geração do organismo
em questão.

• Estacionária: Nesta fase, os nutrientes estão escasseando e os produtos tóxicos estão

tornando-se mais abundantes. Nesta etapa não há um crescimento líquido da
população, ou seja, o número de células que se divide é equivalente ao número de
células que morrem.

• Declínio: A maioria das células está em processo de morte

• O tempo de geração pode ser calculado quando uma cultura encontra-se em
fase exponencial, pela fórmula abaixo:

• N=No.2n, onde N= número final de células, No= número inicial de células,

n= número de gerações.

• n= log(N) - log(No)/0.301

• g = t/n , onde g= tempo de geração, t= tempo de crescimento e

n= determinado acima.
Cultura das amostras clínicas:
Avaliação das colônias

• Tamanho: diâmetro em milímetros

• Forma
• Elevação
• Margem
• Cor: branca, amarela, preta, camurça, laranja...
• Superfície: brilhante, opaca
• Densidade: opaca, translúcida, transparente
• Consistência: viscosa, butirácea, membranosa
Avaliação das colônias

• Odores: tênis sujo (citrobacter spp.), pútrido ( Clostridium difficile),

pêlo molhado
( Haemophillus spp), chocolate queimado ( Proteus spp)

• Mudanças de cor no meio: indicadores de pH

Avaliação das colônias
Avaliação das colônias
Avaliação das colônias
Uso de corantes biológicos

• Coloração de Gram
• Coloração ácido resistente
• Coloração fluorescente (UV) – fluorocromos (ag/ac)
• Laranja de acridina
• Azul de Toluidina – biópsia de pulmão e secreções respiratórias
Bacterioscopia

Gram Negativa
• Gram positiva
TÉCNICA DE GRAM

• Identificação das características bacterianas referente a coloração da

parede celular e sua diferenciação em bactérias Gram positivas e
Gram negativas;

• Verificação da forma, arranjo e tamanho das bactérias .

Composição dos corantes utilizados:

• Solução de cristal violeta

• Cristal violeta 1g
• Ácido fênico 2 g
• Álcool absoluto 10 mL
• Água destilada 100 mL

• Lugol
• Iodo 1 g
• Iodeto de potássio 2 g
• Água destilada 300 mL
Composição dos corantes utilizados:

• Álcool cetona
• Álcool 800 mL
• Acetona 200 mL

• Fucsina
• Fucsina 2,5 g
• Álccol etílico 100 mL
• Água destilada 90 mL
• Os corantes devem ser armazenados em frasco de vidro âmbar em
locais onde as condições do ambiente sejam favoráveis, com
temperaturas entre 20 e 25ºC (temperatura ambiente) e sem teor de
umidade.
Recebimento das amostras

 Amostras recebidas em Swab

◦ Rolar delicadamente o swab sobre a superfície de uma lâmina limpa

◦ Se o swab estiver seco, colocar um pequeno volume de solução fisiológica

estéril, agitar vigorosamente, comprimindo-o contra a parede do tubo e
utilizar essa suspensão para o preparo do esfregaço.

◦ Deixar secar ao ar e fixar ao calor.

◦ Corar pelo método de Gram

 Amostras de aspirado, exsudatos e escarro.
 As amostras recebidas em seringa devem ser transferidas para um
tubo estéril, homogeneizadas para a execução de um esfregaço em
lâmina;
 Se a amostra for muito espessa, diluir em solução fisiológica estéril
antes de fazer o esfregaço;
 Para as amostras recebidas em frascos ou tubos estéreis, selecionar
a parte mais purulenta e confeccionar o esfregaço em lâmina.
Espalhar a amostra em ¾ da lâmina e formar o esfregaço fino;
 Deixar secar ao ar e fixar com calor;
 Corar pelo método de Gram
Esfregaço de colônias

 Colocar uma pequena gota de solução fisiológica sobre a lâmina.

 Com a alça bacteriológica, tocar a superfície de uma colônia isolada

e emulsionar gentilmente na gota de solução fisiológica colocada
sobre a lâmina.

 Deixar secar ao ar e fixar no calor

 Corar pelo método de Gram.

Amostras que requerem centrifugação

 Após centrifugação (3.000 a 5.000 rpm / 15 min.) remover o

sobrenadante e deixar aproximadamente 0,5 mL do sedimento.

 Homogeneizar e confeccionar o esfregaço (+/- 50 uL do material – 1

gota)

 Deixar secar ao ar e fixar no calor.

 Corar pelo método de Gram

Técnica de coloração de gram

• Flambar rapidamente uma lâmina de microscopia limpa, nos dois

lados, “cortando” lentamente a chama do bico de Bunsen;
• Flambar a alça de platina até o rubor e esfriá-la.
• Tomar o tubo de cultura com a mão esquerda e com os dedos
mínimo e anelar da mão direita remover a tampa do tubo;
• Flambar a boca do tubo de cultura;
• Introduzir a alça de platina, apreendida entre o polegar e o indicador da
mão direita, no interior do tubo até tocar o meio de cultura
• Flambar novamente a boca do tubo de cultura;
• Fechar o tubo e colocá-lo na estante;
• Tomar uma lâmina (anteriormente preparada) com a mão esquerda e
depositar no centro da mesma uma amostra de suspensão bacteriana;
• Espalhar o material com movimentos de rotação da alça de platina, para
se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme, secar
naturalmente;

• Manter o esfregaço nas proximidades da chama.

Fixação:

• Fixar o esfregaço, próximo a chama por 3 vezes, a fim de que o

material fique bem aderente à lâmina. A fixação é sempre feita do
lado contrário ao esfregaço bacteriano.
Técnica:

• Cobrir com cristal violeta e deixar agir por 1 minuto;

• Cobrir com solução de lugol por 1 minuto;
• Lavar com água tomando cuidado pra que o jato não incida
diretamente no material a ser analisado.
• Descorar com álcool acetona;
Técnica

• Lavar com água;

• Corar com fucsina fenicada por 30 segundos;

• Lavar com água, secar e observar em objetiva de 100 x com óleo de

imersão.
Resultado:

• Bactéria Gram positiva – roxo escuro

• Bactéria Gram negativa – avermelhadas (rosada)

Princípio da técnica

• O cristal violeta cora tanto a parede celular das bactérias Gram +

quanto Gram -.

• O lugol tem ação de fixador, sendo absorvido por ambas, formando

assim o complexo cristal violeta-iodo ( CV-I) corando a bactéria de
roxo.
Princípio da técnica

O álcool cetona funciona como um solvente atuando na porção

lipídica da parede celular das bactérias Gram -, resultando numa
porosidade e permeabilidade aumentada, extraindo desta forma o
complexo CV-I, descorando as células.
• O álcool cetona, desidratando a espessa camada de peptideoglicano das
bactérias Gram +, provoca a contração dos poros, retendo desta forma
o CV-I, mantendo as células coradas.

• A última etapa do processo é tratamento com o corante fucsina que cora

a parede celular das Gram -, tornando-as avermelhadas ou rosa.
• Gram positiva
• Gram negativa