Biotecnologia Aplicada

à Biomedicina
Introdução à Biotecnologia

Responsável pelo Conteúdo:

Prof. Dr. Fabio Mitsuo Lima

Revisão Textual:
Prof.ª Dr.ª Selma Aparecida Cesarin
 Introdução à Biotecnologia

• Aspectos Históricos da Biotecnologia;

• Tecnologia do DNA Recombinante;
• Como Gerar Uma Molécula de Dna Recombinante?
• Expressão e Purificação de Proteínas Recombinantes.

OBJETIVOS DE APRENDIZADO
• Apresentar ao aluno as bases da Biotecnologia, o avanço histórico e como ela se relaciona
com as demais Áreas da Ciência;
• Apresentar características gerais dos principais organismos alvos;
• Abordar as principais técnicas relacionadas a processos-chave dentro da Biotecnologia.
UNIDADE Introdução à Biotecnologia

Aspectos Históricos da Biotecnologia

Antes de iniciarmos um estudo mais aprofundado sobre essa importante Disciplina,
é importante definirmos o que se entende, atualmente, por “Biotecnologia” e abordar-
mos brevemente sua história e evolução, sua abrangência e possíveis aplicações.

Existem diversas definições para o termo e ficaremos com duas.

Segundo a Enciclopédia Britânica, Biotecnologia é o uso da Biologia para solu-

cionar problemas e desenvolver produtos úteis.

Já o Ministério da Saúde do Brasil estabeleceu, em 2010, a seguinte definição:

“Qualquer aplicação tecnológica que usa sistemas biológicos, organismos vivos ou
seus derivados para criar ou modificar produtos e processos para usos específicos”.

A Biotecnologia é, portanto, uma Área Multidisciplinar, contando com importan-

tes contribuições da Genética, Biologia Molecular, Microbiologia, Bioquímica, Quí-
mica e Engenharias.

Desde a Antiguidade, muitos anos antes da Era Cristã, há registros do uso de

microrganismos em processos fermentativos para a produção de bebidas alcoólicas
a partir de cereais e para a produção de pão.

Os sumérios, os babilônicos e os egípcios realizavam tal tarefa, contudo, sem um

conhecimento estritamente científico sobre o tema.

Na maioria das vezes, não era um processo em larga escala e controlado, e sim
um conhecimento familiar, passado de geração a geração, baseado na observação.

Figura 1
Fonte: Getty Images

Somente em 1876, com os estudos de Louis Pasteur, foi revelada a real causa das
fermentações: a ação de microrganismos.

Pasteur comprovou que cada tipo de fermentação era realizado por um tipo es-
pecífico de microrganismo.

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 Mais tarde, dois químicos alemães, chamados Hans e Eduard Buchner, mostra-
ram que extratos de levedura, na ausência de células vivas, eram capazes de conver-
ter glicose em etanol. Concluíram, portanto, que se trata de um processo enzimático.
Esses achados foram fundamentais para o estabelecimento da Bioquímica mo-
derna, que é um dos pilares da Biotecnologia, que teve um avanço significativo no
século XX, consequência da evolução científica característica desse momento.
Um dos primeiros marcos biotecnológicos desse período foi a descoberta da Penicili-
na, em 1928, por Alexander Fleming.
O impacto do uso desse antibiótico na saúde pública foi enorme, reduzindo dras-
ticamente a mortalidade da população, inclusive durante a Segunda Guerra Mundial.
A partir de então, outros antibióticos foram desenvolvidos, como a Estreptomicina
e muitos outros.
A Biotecnologia da primeira metade do século XX foi baseada, principalmente, no
uso de enzimas e reações químicas controladas em Laboratório, como os exemplos
citados anteriormente.

O grande marco do século XX foi a descoberta da estrutura tridimensional do DNA, por James
Watson e Francis Crick, em abril de 1953. Por esse motivo, ambos foram agraciados com o Prê-
mio Nobel de Medicina em 1962.

Watson e Crick propuseram a base genética da hereditariedade baseada na estru-

tura do DNA e isso foi extremamente importante para se chegar aos estudos de tera-
pia gênica e à manipulação genética de microrganismos observados nos dias atuais.
A descoberta da estrutura do DNA mudou a história da Ciência e, em especial, da
Biotecnologia. A partir de 1953, houve uma explosão no número de estudos visando
a conhecer melhor o comportamento da molécula de DNA e meios para manipulá-la.
Outro marco muito importante foi estabelecido pelo bioquímico americano Arthur
Kornberg, que foi capaz de sintetizar uma molécula de DNA em Laboratório, a partir
da enzima DNA polymerase, isolada de bactéria. Esses estudos renderam a Kornberg
o Prêmio Nobel de Medicina, em 1959.
A segunda metade do século XX termina com avanços nunca antes pensados,
como a produção de insulina em bactérias, o Projeto Genoma Humano, a clonagem
de animais e plantas, a manipulação genética de células vivas, a terapia gênica e
muitas outras aplicações que veremos nas Unidades seguintes.
Atualmente, as aplicações da Biotecnologia podem ser vistas nas mais diferentes
áreas e não somente para a saúde humana: incluem-se as áreas Agrícola, Pecuária,
Industrial e do Meio Ambiente.

Teste Seu Conhecimento

1. O que é Biotecnologia? Quais Disciplinas contribuem para o conheci-
mento nessa Área?

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UNIDADE Introdução à Biotecnologia

2. Explique o fato de que extratos de levedura são capazes de converter gli-

cose em etanol. Por que não é necessário que as leveduras estejam vivas?
3. Por que a descoberta da Penicilina foi um importante marco para a Bio-
tecnologia? Relacione essa descoberta com a área;
4. Como a descoberta da estrutura do DNA influenciou drasticamente os
rumos da Biotecnologia?
5. Quem foi a primeira pessoa a sintetizar a molécula de DNA em Labora-
tório? Qual a importância desse fato para a Biotecnologia?
6. Além da Medicina, quais outras Áreas têm sido beneficiadas com as
aplicações da Biotecnologia? Como você, futuro profissional biomédico,
pode atuar nesse Setor?

Tecnologia do DNA Recombinante

Antes de aprendemos como modificar a molécula de DNA, é necessário relem-
brar como é sua estrutura. O DNA é uma macromolécula formada por nucleotídeos.
Esse, por sua vez, são constituídos de três partes: base nitrogenada, açúcar do
tipo pentose (desoxirribose) e grupamento fosfato.

Figura 2
Fonte: Adaptado de ZAHA, 2014

Estrutura de um nucleotídeo. O grupamento fosfato está ligado ao carbono 5

da pentose, enquanto a base nitrogenada está ligada ao carbono 1. As dife-
renças entre as pentoses que compõem os nucleotídeos do DNA e do RNA
estão marcadas em rosa na Figura B: a pentose do RNA possui uma hidroxila
na posição 2, enquanto a do DNA não a possui. Por isso, a pentose do DNA
chama-se desoxirribose. Além da diferença da ribose, o RNA possui a base
nitrogenada uracila e não a timina

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 Os nucleotídeos se ligam entre si por meio de ligações fosfodiéster, estabelecidas
entre o grupo fosfato situado no carbono 5’ da pentose de um nucleotídeo com a
hidroxila situada no carbono 3’ do nucleotídeo vizinho.

Figura 3
Fonte: Adaptado de WATSON, 2015

Nucleotídeos ligados por ligações fosfodiéster em uma fita simples de DNA.

As extremidades 5’ e 3’ da cadeia estão assinaladas. As pentoses dos nucle-
otídeos adenina, citosina, guanina e timina estão mostradas por losangos
roxos e os grupamentos fosfato estão dentro de círculos cinza. A ligação
fosfodiéster ocorre entre a hidroxila do carbono 3’ da pentose com o gru-
pamento fosfato ligado ao carbono 5’ da pentose do nucleotídeo seguinte

Muitos nucleotídeos são ligados, um após o outro, formando a molécula de DNA.

À extremidade na qual se iniciou a polimerização dá-se o nome de extremidade 5’,
por haver um grupamento fosfato livre nela. Chamamos a extremidade oposta de 3’,
pois há hidroxila livre nesse local.

Note que, independentemente do número de nucleotídeos que são incorporados

à molécula de DNA, sempre haverá uma extremidade 5’ e outra 3’, com os grupa-
mentos fosfato e hidroxila, respectivamente.

Importante!
O crescimento da fita de DNA sempre ocorre do sentido 5’ em direção à extremidade 3’.
Essa direção é importantíssima no estudo e na manipulação do DNA.

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UNIDADE Introdução à Biotecnologia

A estrutura de Watson e Crick revelou, ainda, que a forma mais estável do DNA na
natureza é formando uma dupla hélice. Assim, duas moléculas de DNA interagem entre si
por meio de ligação do tipo ponte de hidrogênio entre as bases nitrogenadas das duas fitas.

As duas fitas ficarão dispostas de modo antiparalelo, ou seja, a extremidade 5’ de

uma fita se ligará à extremidade 3’ da fita complementar.

Figura 4
Fonte: Adaptado de WATSON, 2015

Estrutura do DNA em formato de dupla-hélice (helicoidal). As bases nitrogena-

das estão voltadas para a parte central da molécula, sendo que as bases com-
plementares de cada fita estão ligadas por pontes de hidrogênio. O esqueleto
da fita é formado pelos grupamentos fosfato e pelas pentoses

Teste Seu Conhecimento

1. Do que são compostos os nucleotídeos?
2. Como os nucleotídeos são ligados entre si em uma fita simples de DNA?
3. O que é extremidade 5’? E extremidade 3’? Qual a importância dessa
informação para o crescimento da fita de DNA? E para a manipulação
de DNA?
4. Como as fitas de DNA estão ligadas entre si?

Para manipular uma molécula de DNA em Laboratório, é necessário utilizar

enzimas que alteram a estrutura dessa molécula. As mais importantes e as que
veremos a seguir são: endonuclease ou enzima de restrição, DNA ligase e
DNA polimerase.

Endonuclease
As endonucleases são enzimas que reconhecem uma sequência específica no
DNA (sítios de restrição) e cortam a dupla fita, rompendo as ligações fosfodiéster.

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 Essas enzimas, em geral, têm origem bacteriana e funcionam na defesa desses
microrganismos contra infecções por bacteriófagos. Na Biotecnologia, elas são utili-
zadas para cortar fragmentos de DNA de interesse. Pode ser um gene inteiro, parte
de um gene, apenas um éxon etc.

Uma determinada endonuclease reconhece apenas um único sítio de restrição.

Portanto, dizemos que ela é sítio-específica. Uma outra característica importante é
que esse sítio é palindrômico. Vamos entender esse conceito.

Observe a palavra ARARA. Se você ler da esquerda para direita ou da direita

para a esquerda, tem o mesmo significado. Um sítio de restrição funciona de
modo semelhante.

Veja, por exemplo, o sítio reconhecido pela enzima EcoRI. Fazendo a leitura, no
sentido 5’ > 3’, lemos GAATTC. Se realizarmos a leitura, no mesmo sentido, na fita
complementar, temos o mesmo: GAATTC.
As enzimas de restrição reconhecem apenas sítios palindrômicos. Isso é muito im-
portante quando estamos analisando um fragmento de DNA que desejamos manipular.

5’ – G A A T T C – 3’
3’ – C T T A A G – 5’

Figura 5
Sítio reconhecido pela enzima EcoRI. Note que o sítio é palindrômico, ou
seja, se você fizer a leitura da fita superior no sentido 5’- 3’ lerá GAATTC. Se
fizer a leitura da fita complementar no sentido 5’- 3’ também lerá GAATTC.
A enzima EcoRI corta entre o G e o primeiro A tanto na fita superior como
na fita complementar gerando extremidades coesivas

Quando uma enzima de restrição reconhece seu sítio em determinada molécula de

DNA ela pode realizar dois tipos de corte. Um corte simétrico ou um corte assimétrico.

Veja três exemplos na Figura a seguir:

EcoRI Pstl Pvull

GAATTC CTGCAG CAGCTG

CTTAAG GACGTC GTCGAC

P- AATTC C T G C A -OH C A G -OH P- CTG

+ HO- G G -P + G T C -P + HO- GAC
G -OH P- G
CTTAA -P HO- A C G T C

Figura 6

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UNIDADE Introdução à Biotecnologia

A seta vermelha mostra o local do corte que será realizado pelas enzimas. Per-
ceba que as três reconhecem sítios compostos por 6 nucleotídeos (mas que são
diferentes entre si).
A enzima da direita, chamada PvuII, reconhece a sequência 5’-CAGCTG-3’ e corta
entre o terceiro e quarto nucleotídeos, exatamente no meio do sítio de restrição. Note
que, após o corte, temos duas extremidades simétricas, também chamadas de extre-
midades cegas.

Agora, veja o que acontece com a enzima EcoRI. Como destacado acima, ela re-
conhece um sítio 5’-GAATTC-3’. No entanto, ela corta entre o primeiro e o segundo
nucleotídeos na fita de cima e entre o primeiro e o segundo nucleotídeos na fita de
baixo (oriente-se pelo sentido 5’ > 3’ da fita).

Observe que, após o corte, temos extremidades diferentes daquelas geradas pela
enzima PvuII. As extremidades EcoRI ficam com quatro nucleotídeos simples fita.
Damos a esse tipo de extremidade o nome de coesiva.

O mesmo fenômeno acontece quando usamos, por exemplo, a enzima PstI, que
reconhece o sítio de restrição 5’-CTGCAG-3’ e corta entre o quinto e sexto nucle-
otídeos em ambas as fitas. Perceba que, semelhante à EcoRI, a PstI também forma
extremidade coesiva, embora em sentido oposto.

É importante ressaltar que o sítio e a forma de cortar são características de cada enzima.

A enzima EcoRI sempre irá reconhecer 5’-GAATTC-3’ e sempre irá cortar na

mesma posição, bem como qualquer enzima de restrição.

Dessa forma, conhecendo o comportamento de cada enzima, é possível planejar

a manipulação de uma molécula de DNA de interesse.

Figura 7
Fonte: Adaptado de Khan Academy

O sítio reconhecido pela enzima EcoRI está presente em uma determinada

região do DNA (acima), quando a enzima entra em contato com essa sequ-
ência (a seguir à esquerda), a enzima cliva entre os nucleotídeos G e A tanto
da fita senso como da fita antisenso (fita complementar)

No Laboratório, em experimentos de manipulação do DNA, alguns fatores in-

fluenciam na atividade dessas enzimas, visto ser uma condição in vitro, tais como:
composição dos tampões, concentração da enzima, temperatura e metilação do
DNA alvo.

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 Todos esses fatores devem ser considerados conjuntamente, antes da realização
de um experimento.

Teste Seu Conhecimento

1. O que é enzima de restrição? Qual a importância dessa molécula para a
manipulação do DNA?
2. Por que se diz que as enzimas reconhecem sítios palindrômicos?
3. Qual a importância de conhecer quais são as extremidades 5’ e 3’ para
entender os cortes das enzimas de restrição?
4. Diferencie extremidade cega e extremidade coesiva após o corte por
enzimas de restrição
5. Qual a importância do fato de determinada enzima reconhecer única e
exclusivamente um sítio específico?

O nome da enzima de restrição se refere ao gênero e a espécie da bactéria de onde foi

isolada da enzima.
Algumas vezes, essa sigla é seguida pela linhagem da bactéria.

Tabela 1
E Escherichia (gênero)
co coli (espécie)
R RY13 (estirpe)
I Primeira identificada (ordem de identificação da bactéria)
Fonte: Wikipedia.org

Tabela 2
Sítio de restrição de Estrutura dos produtos cortados
Enzimas Organismo fonte
DNA bifilamentar
→

(a) 5’-G-A-A-T-T-C- -G 5’A-A-T-T-C

Escherichia coli
EcoRI -C-T-T-A-A-G-5’ -C-T-T-A-A 5’ G-
→ →

5’-C-T-G-C-A-G- -C-T-G-C-A 3’ G-
Pstl Providencia stuartii
-G-A-C-T-C-5’ -G 3’ A-C-G-T-C-
→

-C-C-C G-G-G-
→

5’-C-C-C-G-G-G- -G-G-G C-C-C

Smal Serratia marcescens
-G-G-G-C-C-C 5’
→

-G-G 5’ G-G
→

5’-G-G-C-C -G-G ‘5 G-G-

(b) Haelll Haemophilus aegyptius
-C-C-G-G- 5’
→

Fonte: Wikipedia.org

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UNIDADE Introdução à Biotecnologia

DNA Ligase
DNA Ligase é uma enzima com função oposta à das enzimas de restrição, ou seja,
como o nome sugere, elas “ligam” duas moléculas de DNA pelo estabelecimento de
ligação fosfodiéster entre o grupo fosfato de uma molécula com a hidroxila de outra.

Essa é a condição básica para a ação de uma DNA Ligase. Diferentemente das
enzimas de restrição, elas não são sítio-específicas.

Figura 8
Fonte: Adaptado de Khan Academy

Enzima ligase promove a restauração das ligações fosfodiéster quebradas pela

enzima EcoRI. Note que as extremidades coesivas geradas pela enzima EcoRI
possuem nucleotídeos complementares que se ligam por pontes de hidrogê-
nio. Mas a complementaridade de bases não restaura a ligação fosfodiéster,
sendo necessária a ação da enzima ligase

Essas enzimas estão presentes em todas as células vivas, participando de impor-

tantes processos, como a replicação do DNA durante a fase “S” do ciclo celular e em
mecanismos de reparo de DNA, quando esse sofre algum dano.

No Laboratório, costuma-se utilizar a DNA Ligase isolada do vírus T4. Como toda
enzima, é necessário cuidado na manipulação, obedecendo rigorosamente as condi-
ções de temperatura, tempo e pH, para maximizar sua atividade.

Teste Seu Conhecimento

1. Qual a função da enzima ligase?
2. Compare a ação da ligase com a função das enzimas de restrição;
3. Você consegue prever porque as ações das enzimas de restrição e da
ligase; são COMPLEMENTARES na manipulação de DNA?

Dna Polimerase
A DNA Polimerase é outra enzima muito importante para a Biotecnologia. Vere-
mos mais detalhadamente sua ação no Módulo II, quando estudaremos a técnica de
PCR (Polymerase Chain Reaction), muito utilizada na clínica, mas também funda-
mental na manipulação gênica.

Essa enzima, como o nome sugere, polimeriza o DNA ao incorporar novos nu-
cleotídeos à cadeia pré-existente. Para que ela consiga exercer adequadamente sua
função, é necessária uma fita simples de DNA como molde.

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 Assim, ela “lê” o molde e incorpora, na nova fita de DNA, um nucleotídeo com-
plementar obedecendo à Regra de Chargaff, que diz que uma Adenina (A) pareia
com Timina (T) e uma Citosina (C) pareia com Guanina (G).

Em outras palavras, quando houver um G no DNA molde, a DNA polimerase

incorporará um C na molécula a ser replicada, e assim por diante.

Importante!
Regra de Chargaff – em uma dupla fita, Adenina (A) pareia com Timina (T) por duas
pontes de hidrogênio e Citosina (C) pareia com Guanina (G) por ter pontes de hidrogênio.
Quando você encontrar a representação “A. T”, significa que a Adenina está pareada com
a Timina e a ligação ocorre pela presença de duas pontes de hidrogênio, cada uma sim-
bolizada por um ponto.
Quando você encontrar a representação “C...G”, significa que a Citosina está pareada com
a Guanina e a ligação ocorre pela presença de três pontes de hidrogênio, cada uma sim-
bolizada por um ponto.

Outro requisito importante para a atividade dessa enzima é a presença obrigatória

de uma pequena sequência iniciadora.

Nas nossas células, quando o DNA é replicado, essa sequência é de RNA. Entretanto,
in vitro, utilizamos um iniciador de DNA, o qual também chamamos de primer. Ele é ne-
cessário, pois a DNA polimerase é incapaz de iniciar a polimerização sem uma região de
dupla fita de DNA. Ela precisa reconhecer tal estrutura e, assim, “andar” sobre a fita molde.

Figura 9
Fonte: Adaptado de Khan Academy

Por fim, é fundamental entender que a DNA polimerase age em apenas uma única
direção, que é da extremidade 5’ para a extremidade 3’, isto é, haverá ligação fosfodi-
éster entre o fosfato do nucleotídeo livre com a hidroxila do DNA pré-existente.

Isso se dá até o final do molde de DNA a ser replicado.

Confira esta imagem. Disponível em: https://bit.ly/3dW9nfk

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UNIDADE Introdução à Biotecnologia

Teste Seu Conhecimento

1. O que é e o que faz a enzima DNA polimerase?
2. Em que sentido ocorre a polimerização da fita de DNA?
3. Se a fita molde possui um C, qual nucleotídeo será incorporado na nova
fita de DNA? E se for um A?
4. O que é primer ou iniciador? Qual a importância dessa molécula na sín-
tese de DNA?

Como Gerar Uma Molécula

de Dna Recombinante?
Agora que aprendemos a função de algumas enzimas modificadoras do DNA,
seremos capazes de entender como gerar uma molécula recombinante.
Esse conhecimento é fundamental para as aplicações que veremos adiante, tais
como: clonagem gênica, produção heteróloga de proteínas recombinantes, produção
de vacina e imunobiológicos recombinantes e terapia gênica.
Iniciaremos com o raciocínio mais simples possível para depois entendermos os
mais complexos. Para isso, precisamos relembrar o conceito de plasmídeo, encon-
trados largamente nas bactérias.
Os plasmídeos são moléculas de DNA circular, extracromossomal, que carregam
genes que conferem resistência a um determinado antibiótico.
Na Natureza, esse evento é fundamental para que as bactérias sobrevivam na
presença desses antimicrobianos. Esses plasmídeos podem ser transferidos de
bactéria a bactéria por meio do processo conhecido como conjugação bacteria-
na. Eles são reconhecidos pela célula receptora e exercem a mesma função nesse
novo hospedeiro.
A Biotecnologia, ou mais especificamente, a Biologia Molecular, utiliza essas mo-
léculas como vetores, ou seja, como carreadores de um DNA de interesse.
O primeiro caso de sucesso foi a produção de insulina humana recombinante em
bactérias, em 1978. No tubo de ensaio, os pesquisadores introduziram o gene da
insulina humana em um plasmídeo bacteriano.
Posteriormente, essa molécula recombinante (composta por parte de DNA bac-
teriano e parte de DNA humano) foi introduzida em uma bactéria, que expressou o
gene humano de interesse. A esse processo, dá-se o nome de clonagem gênica.
A Figura a seguir mostra um gene de interesse (azul) sendo introduzido em
um plasmídeo:

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 Gene

DNA
recombinante

Plasmídeo
Figura 10
Fonte: Adaptado de Khan Academy

O racional dessa metodologia é cortar o gene humano com uma enzima de res-
trição para isolá-lo em um tubo de ensaio à parte. Paralelamente, cortamos um
plasmídeo com a mesma enzima, por exemplo a EcoRI.
Na Figura a seguir, é possível observar que tanto o gene quanto o plasmídeo apre-
sentam sítios de restrição para a referida enzima:

Figura 11
Fonte: Adaptado de Khan Academy

Após a ação da enzima Eco RI, teremos extremidades compatíveis entre o gene
alvo e o plasmídeo:

Figura 12
Fonte: Adaptado de Khan Academy

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UNIDADE Introdução à Biotecnologia

O próximo passo é adicionar, em um tubo novo, o produto da digestão enzimática

do gene alvo, o produto da digestão do plasmídeo e a enzima DNA Ligase. As extre-
midades compatíveis serão unidas covalentemente pela enzima. Veja a seguir:

Figura 13
Fonte: Adaptado de Khan Academy

Se houver a ligação do plasmídeo (em cinza, na Figura acima) com o gene da insu-
lina, por exemplo (em azul, na Figura acima), teremos um plasmídeo recombinante:

Figura 14
Fonte: Adaptado de Khan Academy

Na Figura a seguir, é possível ter a visão geral de todo o processo:

Gene-alvo
Plasmídeo (por exemplo, o gene
da insulina)

Digestão com
enzima de
restrição

Liga-se à
DNA ligase
Plasmídeo
recombinante

Figura 15
Fonte: Adaptado de Khan Academy

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Teste Seu Conhecimento
1. O que são plasmídeos e onde eles são encontrados, normalmente, na
Natureza?
2. Como os plasmídeos são utilizados nos Processos da Tecnologia do DNA
recombinante e clonagem gênica?
3. Explique a função de cada uma dessas moléculas no processo de clonagem:
a) DNA humano, por exemplo, gene da insulina;
b) DNA plasmidial;
c) Enzima de restrição;
d) Enzima ligase.
4. Pergunta Desafio: É possível ligar um DNA cortado pela enzima PvuII
com um DNA cortado pela enzima EcoRI? Explique;
5. Pergunta Desafio: É possível ligar um DNA cortado pela enzima PstI
com um DNA cortado pela enzima EcoRI? Explique;
6. Pergunta Desafio: A partir das respostas das perguntas 4 e 5 explique
o qual são extremidades compatíveis e qual a importância desse conhe-
cimento no processo de clonagem.

Para finalizar o processo de clonagem, faz-se necessário introduzir esse plasmí-

deo recombinante em um hospedeiro adequado.
Pode-se utilizar diferentes hospedeiros, tais como bactérias, fungos, células de
insetos e células de mamíferos, dentre outros.
Para cada aplicação, há um hospedeiro preferencial e, com ele, modificações no
plasmídeo devem ocorrer para que a célula-alvo possa reconhecê-lo.
As bactérias são, sem dúvida, os hospedeiros mais utilizados na clonagem. Isso
se deve à facilidade de manipulação dessa célula, boa taxa de crescimento celular,
diversas cepas e plasmídeos comercialmente disponíveis e sistema de expressão e
purificação da proteína recombinante bem conhecidos.
Entretanto, é importante ter em mente que há vantagens e desvantagens na uti-
lização dos outros organismos citados acima. Tudo vai depender do interesse e da
aplicação do pesquisador. Aqui, continuaremos nosso estudo focando nas bactérias.
Para introduzir o plasmídeo recombinante na bactéria, é necessário submetê-la a
um processo denominado transformação.
Nele, bactérias competentes são misturadas ao plasmídeo recombinante e incuba-
das em gelo por alguns minutos. Em seguida, essa mistura é submetida a um choque
térmico (de zero a 42°C), que promoverá uma desestabilização da membrana celular
bacteriana, formando poros transitórios, suficientes para permitirem a entrada do
plasmídeo na célula.

Uma vez interiorizado, esse plasmídeo passa a conferir resistência a um determi-

nado antibiótico por carregar um gene que codifica para tal característica (ampicili-
na, por exemplo).

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UNIDADE Introdução à Biotecnologia

Figura 16
Fonte: Adaptado de Khan Academy

É importante notar que o processo de transformação não é totalmente eficiente,

de forma que poucas bactérias recebem o plasmídeo recombinante em comparação
ao número inicial de células.
Para selecionar as bactérias que contêm o plasmídeo daquelas que não contêm,
semeia-se todo o conteúdo da transformação em placas de Petri contendo meio de
cultura com o antibiótico para quem o plasmídeo confere resistência (Ampicilina,
nesse exemplo).
Após algumas horas sob temperatura adequada, é possível identificar colônias
bacterianas no meio de cultura. Elas são provenientes de uma única bactéria resis-
tente, ou seja, que recebeu o plasmídeo no processo de transformação, que se mul-
tiplicou e formou um aglomerado de células geneticamente idênticas.
As bactérias que não receberam o plasmídeo morreram durante esse período de
incubação em meio contendo antibiótico e não crescem na placa de cultura.
Assim, é possível selecionar as bactérias que contêm o plasmídeo recombinante
e utilizá-las para a produção de proteínas recombinantes (insulina, por exemplo) ou
para multiplicar esses plasmídeos que serão utilizados posteriormente na terapia
gênica, por exemplo.
Agora que você aprendeu como funciona o processo de clonagem gênica, vamos
citar e explicar as 3 características essenciais de um plasmídeo:
• Origem da replicação que seja reconhecida pela DNA polimerase da célula hos-
pedeira. Por exemplo, um plasmídeo que vai ser inserido em uma bactéria,
deve ter um sítio que seja reconhecido pela DNA polimerase da bactéria. Afinal,
quando a bactéria vai replicar o próprio DNA, precisa também replicar o DNA
plasmidial contendo o gene de nosso interesse. O mesmo raciocínio é aplicado
quando a célula hospedeira é uma levedura ou outra célula eucariótica;
• Múltiplo sítio de clonagem – Esse local contém diversos sítios que são reconheci-
dos por diferentes enzimas de restrição. Quanto mais sítios, mais fácil é utilizar o

22
 plasmídeo no processo de clonagem. Lembre-se de que você deve escolher uma
enzima de restrição para clivar o DNA de interesse e uma enzima para clivar o
plasmídeo:
» Quando você escolhe uma enzima que gera extremidades cegas para clivar
o DNA de interesse, pode-se utilizar qualquer enzima que gere extremidades
cegas para clivar o plasmídeo;
» Quando você escolhe uma enzima que gera extremidades coesivas, as extremida-
des geradas devem ser compatíveis e complementares para que ocorra a ligação;
• Método de seleção das bactérias que incorporaram o plasmídeo. O método mais
utilizado é a existência de um gene que confere resistência a algum antibiótico.
Dessa forma, basta acrescentar o antibiótico no meio de cultura que é possível
selecionar as bactérias que incorporaram o plasmídeo.

Teste de Conhecimento
1. Por que é necessário inserir o plasmídeo dentro de uma célula hospedeira?
2. Que tipos de células podem ser utilizadas como hospedeiras?
3. Por que as bactérias são os hospedeiros mais utilizados na clonagem gênica?
4. O que é e qual a função do processo de transformação bacteriana?
5. Descreva o processo de transformação bacteriana;
6. Qual a função do antibiótico (por exemplo, Ampicilina) no Processo de
Clonagem Gênica?;
7. Quais as 3 características essenciais de um plasmídeo?
8. Qual a função das seguintes sequências de DNA em um plasmídeo:
• Origem de replicação que seja reconhecida pela DNA polimerase da célula
hospedeira;
• Múltiplo sítio de clonagem;
• Método de seleção das bactérias.

Expressão e Purificação de
Proteínas Recombinantes
Após a clonagem gênica, com o plasmídeo recombinante no interior da bactéria, pode-
-se induzir a expressão do gene de interesse para a produção da proteína recombinante.
Antes de avançarmos nesse tema, é importante voltarmos na estrutura do plas-
mídeo utilizado na clonagem para entendermos como é possível “fabricar” proteínas
humanas, por exemplo, em Sistema Bacteriano.
Anteriormente, havíamos falado que os plasmídeos das 3 características de um
vetor de clonagem.

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UNIDADE Introdução à Biotecnologia

Além dessas características, um VETOR DE EXPRESSÃO também precisa ter:

• Sequência promotora que seja reconhecida pela RNA polimerase da célula.
Essas sequências promotoras determinam onde deve ser iniciada a transcrição,
ou seja, onde a RNA polimerase deve iniciar a leitura do DNA para transcrever
a molécula de RNA e, geralmente, estão localizadas na região 5’ dos genes.
Promotores influenciam a taxa com que esse RNA é replicado;
• Sítio de ligação ao ribossomo – é a região do RNAm que é reconhecida no ri-
bossomo para início da tradução.

Importante!
Nem sempre o objetivo do pesquisador ao fazer uma clonagem é expressar proteínas.
Muitas vezes, deseja-se conhecer alguma região do genoma cujo produto não seja uma
proteína, por exemplo, clonagem de sequências regulatórias, regiões intergênicas (entre
genes), promotores, sequências de DNA repetitivo e genes ribossomais. Nesse caso, o
pesquisador não deve utilizar um vetor de expressão e sim um vetor de clonagem sem
as características adicionais encontradas em um vetor de expressão.

Promotor para
conduzir a expressão
gene-alvo Gene-alvo

Plasmídeo

Gene de resistência ao antibiótico

Figura 17
Fonte: Adaptado de Khan Academy

É importante entender, portanto, que o Sistema de Clonagem e expressão base-

ado em plasmídeos e bactérias é sempre fixo. O que deve variar, de acordo com o
interesse do pesquisador, é o gene que é inserido no plasmídeo.
Assim, se quisermos produzir a proteína insulina para tratamento de diabéticos,
devemos isolar o gene que a codifica e inseri-lo no plasmídeo.
Se, em outro momento, quisermos produzir eritropoietina para tratamento de
anemia associada à falência renal crônica ou da anemia em pacientes com câncer
tratados com quimioterapia, devemos isolar o gene que codifica para eritropoietina
humana e inseri-lo no plasmídeo. O mesmo raciocínio deve ser seguido para a clo-
nagem de qualquer gene.

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 O mRNA gerado é traduzido pelos ribossomos bacterianos, levando à síntese proteica.
A Figura a seguir mostra esse processo, desde a colônia contendo o plasmídeo com o
gene de interesse (à esquerda na Figura) até a produção da proteína (à direita na Figura).

Figura 18
Fonte: Adaptado de Khan Academy

Perceba que nos dois casos exemplificados acima, produção de insulina ou eritro-
poietina em larga escala, há necessidade de remover as proteínas recombinantes do
interior da célula bacteriana.
É preciso purificá-las para o uso biotecnológico. Portanto, o próximo passo é lisar
a bactéria para termos acesso à proteína recombinante. Isso é realizado por meio do
uso de soluções adequadas e sonicação (uso de ultrassom para lisar células).
O rompimento das células provoca o extravasamento de todo o conteúdo celular
e esse lisado contêm, além da proteína recombinante, todas as macromoléculas e
proteínas bacterianas. O desafio seguinte é purifica-la dessa “sopa” de proteínas.
Note que, para o uso terapêutico dessas moléculas, essa purificação deve ser pró-
xima da perfeição. Não se pode administrar insulina ou eritropoietina, ou qualquer
outra proteína, contaminada com proteína bacteriana.

Teste Seu Conhecimento

1. Quais as 5 características essenciais de um vetor de expressão?
2. Qual a importância da existência de um promotor que seja reconhecido pela
DNA polimerase da célula? O que acontece na ausência dessa sequência?
3. O que acontece se o pesquisador inserir um plasmídeo contendo um pro-
motor que seja reconhecido pela DNA polimerase de bactéria em uma
célula de levedura? A proteína será expressa?
4. Qual a importância da existência de sítio de ligação ao ribossomo? Onde deve
estar localizada essa sequência? O que acontece na ausência desse sítio?
5. Cite e descreva cada passo necessário para a expressão do hormônio
de crescimento humano em bactérias. Dica 1: interprete o texto e faça
correlações. Dica 2: faça um mapa mental colorido com todas as etapas
para facilitar a memorização e compreensão do processo;
6. Por que se deve purificar a proteína de interesse após a produção em
larga escala pela bactéria? Quais são os desafios dessa etapa?

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UNIDADE Introdução à Biotecnologia

A maneira mais eficiente para a purificação é a utilização da técnica conhecida

por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
Esse é um método físico de separação no qual os componentes a serem separa-
dos estão distribuídos entre duas fases que estão em íntimo contato. Uma das fases
permanece estacionária, enquanto a outra se move através dela.
A fase estacionária, geralmente, é formada por partículas sólidas ou semirrígidas,
esféricas, nas quais se podem acoplar compostos químicos como uma hidroxila, ca-
deias carbônicas apolares e anticorpos específicos, dentre muitos outros.

Ao fazer isso, é possível conferir uma característica química à partícula. À essa

fase estacionária, dá-se o nome de coluna cromatográfica.

A fase móvel, por sua vez, é o solvente no qual as proteínas estarão dissolvidas e
que tem a função de carregá-las ao longo de toda a coluna cromatográfica.

A intensidade com que as proteínas interagem com a fase estacionária vai deter-
minar o tempo que elas ficarão retidas na coluna. Quem interage mais, fica mais
tempo. Quem interage menos, fica menos tempo.

As proteínas provenientes do extrato bacteriano apresentarão diferentes caracterís-

ticas de polaridade, carga, tamanho, afinidade e essas características é que permitem
a purificação da proteína recombinante daquelas todas outras proteínas da bactéria.

Existem diferentes tipos de cromatografia, sendo as mais comuns: adsorção, troca

iônica, exclusão por tamanho e afinidade. Cada uma delas apresenta diferenças na
maneira pela qual a proteína interage com a fase estacionária (coluna cromatográfica).

Veja a seguir:
• Adsorção: a fase estacionária pode conter sítios de adsorção polares ou apola-
res. Portanto, a purificação da proteína se dará por sua polaridade;
• Exclusão por tamanho: a fase estacionária contém “poros”. Moléculas peque-
nas entram e saem dos poros constantemente, enquanto moléculas maiores
sequer entram. Dessa forma, as moléculas maiores migram mais rapidamente
pela coluna cromatográfica e saem primeiro;
• Troca iônica: a fase estacionária apresenta carga (positiva ou negativa). Assim,
em uma cromatografia de troca iônica com fase estacionária positiva, as proteí-
nas “negativas” irão interagir mais fortemente com a coluna e ficarão mais tem-
po retidas, separando-se das proteínas “positivas”. O inverso se observa quando
se utiliza coluna com fase estacionária negativa;
• Afinidade: a fase estacionária possui moléculas por quem a proteína recombi-
nante apresenta afinidade. Por exemplo: se for produzida uma enzima recombi-
nante, pode-se acoplar à coluna cromatográfica o substrato para essa enzima.
Se a proteína recombinante tiver afinidade a um metal (níquel ou cobalto, por
exemplo), pode-se acoplar à coluna cromatográfica esse metal. Se houver um
anticorpo específico contra a proteína recombinante, pode-se acoplar à coluna
cromatográfica esse anticorpo.

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 A utilização de anticorpos específicos é a forma mais eficiente para purificar uma
proteína recombinante. Na Figura a seguir, temos um esquema desse processo.

No nosso exemplo, insulina ou eritropoietina seriam purificadas após o rompi-

mento das bactérias que as produziram. Todo o extrato proteico seria submetido
à separação cromatográfica em coluna de afinidade com anticorpos anti-insulina
ou antieritropoietina.

Todas as proteínas que não têm afinidade pelo anticorpo não se ligam à coluna e
passam direto. Segue-se a eluição da proteína recombinante, que é o ato de desligá-la
do anticorpo e recolhê-la em um tubo a parte.

Figura 19
Fonte: Adaptado de Khan Academy

Teste Seu Conhecimento

1. “A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é um método físico
de separação no qual os componentes a serem separados estão distribuí-
dos entre duas fases que estão em íntimo contato. Uma das fases perma-
nece estacionária, enquanto a outra se move através dela”. Em que fase
estará a proteína que você quer purificar? O que deve estar presente na
outra fase?;
2. Quais os diferentes tipos de cromatografia para purificação de proteínas?
Existe alguma que seja mais eficiente? Explique.

Em Síntese
Nesta Unidade, vimos o que é Biotecnologia, sua história e algumas áreas onde pode ser
utilizada. Demos maior enfoque à Tecnologia do DNA Recombinante, que é a ferramenta
básica para muitas dessas aplicações.
Aprendemos o processo de clonagem gênica, como expressar e purificar uma proteína
recombinante. Lembre-se de que essa metodologia pode ser aplicada a uma variedade
de genes. Tudo vai depender do interesse e aplicação do pesquisador.

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UNIDADE Introdução à Biotecnologia

Material Complementar
Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade:

Livros
Biologia Molecular da Célula
ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. Porto Alegre: Artmed,
2011. 1396p.
Biologia Molecular do Gene
WATSON, J. D. et al. Biologia Molecular do Gene. Porto Alegre: Artmed,
2015. 912p. Capítulo 8: Manipulação de proteínas DNA e RNA.
Biotecnologia I: Princípios e Métodos
BRUNO, A. N. Biotecnologia I: Princípios e Métodos – Série Teken – Capítulo 1 –
Tendências e perspectivas da Biotecnologia, p. 10.

Leitura
Transformação & seleção bacteriana
https://bit.ly/39BVeR9

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Referências
ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. Porto Alegre: Artmed, 2011. 1396p.

COOPER, G. M. A célula: uma abordagem molecular. 3.ed. Porto Alegre: Artmed,

2007. 736p.

De ROBERTIS, E. M. F.; HIB, J. Biologia Celular e Molecular. 16.ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2014. 372p.

JUNQUEIRA, L. C. U.; CARNEIRO, J. Biologia Celular e Molecular. 9.ed. Rio de

Janeiro: Guanabara, 2015. 376p.

LODISH, H. et al. Biologia Celular e molecular. 7.ed. Porto Alegre: Artmed, 2015.
1244p.

KARP, G. Biologia celular e molecular: conceitos e experimentos. Barueri: Manole,

2005. 832p.

WATSON, J. et al. Biologia Molecular do Gene. 7.ed. Porto Alegre. Artmed, 2015.

ZAHA, A., FERREIRA, H. B., PASSAGLIA, L. M. P. Biologia Molecular básica.

5.ed. Porto Alegre: Artmed, 2014. 416p.

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