UNIVERSIDADE DO ESTADO DO PARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

CURSO DE BIOMEDICINA
BACTERIOLOGIA CLÍNICA

CARLOS EDUARDO DOS SANTOS ALMEIDA

LAINNE SILVA NASCIMENTO
SAMIR MOURAO BAYDE

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA – BACILOSCOPIA E TESTES

BIOQUÍMICOS

MARABÁ – PA
2022
 CARLOS EDUARDO DOS SANTOS ALMEIDA
LAINNE SILVA NASCIMENTO
SAMIR MOURAO BAYDE

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA – BACILOSCOPIA E TESTES

BIOQUÍMICOS

Relatório apresentado como requisito

para obtenção de nota parcial na
disciplina de Bacteriologia Clínica do
curso de Biomedicina da
Universidade do Estado do Pará –
Campus VIII (Campus Universitário
de Marabá).

Profª. Eveline Bezerra Sousa

MARABÁ – PA
2022
 SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................3
2 MATERIAL E MÉTODO....................................................................................................5
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................6
3.1 BACILOSCOPIA ........................................................................................................6
3.2 TESTES BIOQUÍMICOS ..........................................................................................7
3.2.1 AGAR BILE ESCULINA EM TUBO .................................................................7
3.2.2 PROVA DE CRESCIMENTO EM CALDO NACL 6,5% ................................8
3.2.3 TESTE DE CATALASE .....................................................................................8
4 CONCLUSÃO ....................................................................................................................9
5 REFERÊNCIAS ...............................................................................................................10
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1 INTRODUÇÃO
O exame baciloscópico do escarro é o método "mais importante, tanto para
o diagnóstico, como para o controle de tratamento" da tuberculose pulmonar no
país, metodologia usual para este exame é a de Zeel-Neelsen, com o esfregaço
do escarro fixado em lâmina, uso de um corante vermelho (fucsina) absorvido
pelo bacilo pelo calor, seguido de limpeza da lâmina com álcool-ácido (álcool
absoluto+ácido fenólico), corando-se o fundo com azul de metileno. O resultado
de BAAR, vermelho em fundo azul, é firmado pela leitura de 100 campos e o
resultado fornecido em "cruzes", conforme o número de bacilos encontrados.
O Mycobacterium tuberculosis é um bacilo reto ou ligeiramente curvo,
imóvel, não esporulado, não encapsulado, que mede de 1 a 10 µm de
comprimento por 0,2 a 0,6 µm de largura. O bacilo da tuberculose é um patógeno
intracelular aeróbico estrito que necessita de oxigênio para crescer e se
multiplicar. Por ser capaz de sobreviver e de se multiplicar no interior de células
fagocitárias, é considerado um parasito intracelular facultativo, de virulência
variável. Seu tempo de geração é longo, podendo variar de 14 a 20 horas,
dependendo do meio de cultura empregado para seu crescimento. Dentro do
macrófago, habitualmente, multiplica-se a cada 25- 32 horas. É, de modo geral,
resistente à ação de agentes químicos e sensível à ação de agentes físicos,
como o calor e a radiação ultravioleta.
A baciloscopia de escarro é um exame de fundamental importância para o
diagnóstico e controle do tratamento da tuberculose, sendo considerado o
método padrão-ouro, por apresentar elevada especificidade e sensibilidade. A
realização correta do exame permite identificar de 70 a 80% dos casos de
tuberculose. O escarro é uma secreção líquida e espessa produzida nos
pulmões, nos brônquios e traqueia (BRASIL, 2008).
Para tal análise, utiliza-se a metodologia de coloração de Ziehl-Neelsen no
intuito de visualizar os bacilos causadores da tuberculose, bem como suas
características peculiares. Sendo assim, para a realização da baciloscopia do
escarro é necessário realizar alguns procedimentos de coleta e análise
propriamente dita. Inicialmente, o material é obtido por expectoração, com a
supervisão e orientação do profissional de saúde, a fim de ter certeza que o
material é o escarro e não a saliva.
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A coleta é feita pela manhã, de preferência em jejum para garantir exatidão.

O paciente deve escovar os dentes apenas com água e vários enxágues, após
isso ele deve tossir com bastante intensidade para expelir a amostra que vai ser
recolhida pelo profissional responsável, em um pote identificado com nome
completo do paciente e a data da coleta, e depois o envolver em um papel limpo.
É importante realizar duas coletas para ter garantia do resultado, se caso a
amostra não seja o suficiente, e o paciente não consegue expectorar, é possível
utilizar de outros métodos para obtenção da mesma. Com a amostra coletada,
está será levada ao laboratório para ser analisada.
A coloração de Ziehl-Neelsen é utilizada para a visualização de bactérias
que não são coradas pela técnica de Gram por possuírem uma espessa camada
lipídica formada por ácidos micólicos como os agentes etiológicos da
Hanseníase e da tuberculose. Para a realização do procedimento, é feito o
esfregaço do material a ser investigado e posicionado em uma lâmina de vidro
para microscopia e posterior fixação a calor; utiliza-se o fucsina de Ziehl, técnica
agressiva de coloração de bactérias, que é adicionada por toda a lâmina, e
submetida a temperaturas altas até evaporar, onde o processo é repetido 5
vezes, estando atento paga não ferver o corante. As bactérias situadas na lâmina
são coradas de vermelho;
É feita a lavagem do material com água corrente, bem como é adicionado
em seguida o substrato para descolorir a amostra, o qual é constituído de
solução de ácido clorídrico 3% em álcool etílico, e tirando o excesso com água
em seguida. Após isso, as bactérias álcool-ácido-resistentes (BAAR) ficarão
coradas em vermelho, uma vez que são aquelas resistentes a descoloração, já
o restante das bactérias não serão visualizadas por não adquirem cor, pois não
conseguem reter o corante.
Para a observação das demais bactérias é acrescentado à lâmina uma
solução de azul de metileno (corante azulado) por um período de três minutos.
Nessa fase, as bactérias que anteriormente estavam incolores ganham a
coloração azul.
Mais uma lavagem é realizada com água corrente na lâmina, e em seguida
feita a secagem da mesma. Para a observação no microscópio se utiliza uma
objetiva de grande aumento (1000X) com auxílio de óleo de imersão, a lâmina é
analisada com intuito de procurar bacilos retos ou curvados, avermelhados, com
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0,2 a 0,6 micrômetros de largura e 1 a 10 micrômetros de comprimento, os quais

se mostrarão como faixas, contas ou filamentos.
Nos hospitais e unidades de saúde (UBS), o paciente cuja a baciloscopia de
escarro deu positiva, que estiver enquadrado nos itens 1 e 2 descritos a seguir
deverá receber cuidados imediatos:
1 - O paciente será positivado para tuberculose pulmonar se seus exames dispor
de: Dois esfregaços diretos positivos; Esfregaço positivo e cultura positiva;
Esfregaço direto e imagem radiográfica positivas sugerem infecção por pelo
agente etiológico da tuberculose.
2- Se uma das amostras for positiva e a outra negativa e não houver radiografia
de tórax no sistema único de saúde, é preciso solicitar a 3ª amostra com cuidado,
a fim de evitar saliva ao invés de escarro. Se a 3ª amostra for positivada, deve
ser adotado os comandos dispostos no primeiro item.
Se o resultado for negativo, o paciente deve ser encaminhado para uma
unidade de referência Investigação e diagnóstico. Quando há período disponível
para um exame de imagem como a radiografia de tórax, deve-se ser realizada a
solicitação de investigação, bem como buscar o parecer da unidade de saúde
responsável.
Em caso de mais de duas amostras forem negativadas, o paciente com
suspeita diagnóstica de doença respiratória deverá ser levado para consulta
médica na unidade de referência.
Em situações de suspeita de tuberculose extrapulmonar, é necessário que os
pacientes sejam encaminhados para uma unidade de referência para a apuração
diagnóstica e tratamento.
Todos os indivíduos que apresentarem sintomas respiratórios deverão ser
levados para consulta com um médico ou enfermeiro.

2 MATERIAL E MÉTODO
• Colônias de Streptococcus sp. em meio de cultura ágar sangue;
• Colônias de Staphylococcus aureus em meio de cultura ágar chocolate;
• Colônia de Enterococcus faecalis em meio de cultura ágar sangue;
• Ágar bile-esculina em tubo (em meio inclinado);
• Caldo NaCl 6,5% em tubo;
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• Frasco de peróxido de hidrogênio e água purificada para o Teste de

Catalase;
• Lâmina;
• Estante para tubos;
• Papel toalha.
• Estufa bacteriológica;
• Cabine de segurança biológica nível 2;
• Bico de Bunsen;
• Alça bacteriológica de platina;
• Agulha bacteriológica de platina
• Jaleco;
• Touca descartável;
• Luvas descartáveis.
A aula prática foi realizada no Laboratório de Bacteriologia e
Neuropatologia – Universidade do Estado do Pará, Campus Universitário de
Marabá. A aula prática realizada no dia 27 de junho de 2022, foi orientada pela
Prof. Eveline Bezerra Sousa. Nesta aula foi realizada a metodologia de
baciloscopia, além do desenvolvimento de alguns testes bioquímicos para
identificação de outras bactérias, como Staphylococcus, Streptococcus e
Enterococcus.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 BACILOSCOPIA
A amostra analisada foi considerada positiva, tendo em vista a contagem dos
bacilos nos campos serem elevadas.
A contagem do exame é realizada da seguinte forma: Quando não são
localizados BAAR (bacilo álcool-ácido resistente) em 100 campos = descreve-se
o resultado como NEGATIVO;
Quando são localizado de 1 a 9 BAAR em 100 campos = descreve-se
apenas a porção de BAAR encontrada;
Quando são localizados de 10 a 99 BAAR, em 100 campos = descreve-se o
resultado como POSITIVO +;
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Quando é localizada em média de 1 a 10 BAAR por campo, nos primeiros

50 campos observados = relata-se o resultado como POSITIVO ++;
Quando é localizada em média mais de 10 BAAR por campo, nos primeiros
20 campos observados = relata-se o resultado como POSITIVO +++.

Assim, o resultado da amostra analisada pode ser considerado positivo 3+++

tendo em vista que na leitura microscópica a amostra apresentava mais de 10
BAAR por campo em 20 campo observado.

3.2 TESTES BIOQUÍMICOS

3.2.1 AGAR BILE ESCULINA EM TUBO
PRINCÍPIO: O Ágar Bile-Esculina em tubo é um teste de identificação bioquímica
de bactérias cocos gram-positivos. O ágar bile-esculina consiste em um meio de
cultura indicado para isolamento e diferenciação Enterococcus sp. de
Streptococcus grupo D. Neste teste ocorre a hidrólise de esculina na presença
de bile. No qual a esculina presente no meio é hidrolisada, formando esculetina
e dextrose. A esculetina reage com os sais de ferro que estão presentes no meio
de forma que os torna enegrecido.

PROCEDIMENTO: Na cabine de segurança, acender a chama no bico de

Bunsen; esterilizar na chama a agulha bacteriológica; com a agulha
bacteriológica coletar a colônia de Enterococcus sp. a ser analisada; abrir a
tampa do tubo de ágar bile-esculina (em meio inclinado), esterilizar a superfície
do tubo na chama; realizar o semeio do inóculo no tubo ágar bile-esculina (em
meio inclinado) por estriamento com a agulha bacteriológica, em movimento de
zig-zag, partindo da base para a extremidade do bizel (superfície inclinada do
meio); esterilizar a superfície do tubo e deixar semi aberto a tampa do tubo;
colocar o tubo na estante; esterilizar a agulha bacteriológica; após, levar o tubo
a estufa bacteriológica para incubar entre 35-37ºC por 24-48h; após, realizar a
leitura.

INTERPRETAÇÃO: A presença de cor enegrecida no meio é indicativa da

presença de hidrólise, isto é, uma prova positiva de crescimento bacteriano.
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3.2.2 PROVA DE CRESCIMENTO EM CALDO NACL 6,5%

PRINCÍPIO: consiste na capacidade de o microrganismo crescer em altas
concentrações de sal. A finalidade é diferenciar Enterococcus sp. de
Streptococcus sp.

PROCEDIMENTO: Na cabine de segurança, acender a chama no bico de

Bunsen; esterilizar na chama a agulha bacteriológica; com a agulha
bacteriológica coletar a colônia de Enterococcus sp. a ser analisada; abrir a
tampa do tubo de caldo NaCl 6,5% (em meio inclinado), esterilizar a superfície
do tubo na chama; realizar o semeio do inóculo no tubo de caldo NaCl 6,5% (em
meio inclinado) com a agulha bacteriológica uma picada no centro do meio de
cultura, penetrando até a metade da sua altura; esterilizar a superfície do tubo e deixar
semi aberto a tampa do tubo; colocar o tubo na estante; esterilizar a agulha
bacteriológica; após, levar o tubo a estufa bacteriológica para incubar entre 35ºC
por 18-24 horas; após, realizar a leitura.

INTERPRETAÇÃO: A turvação ou mudança de cor (no caso de adição de

indicador) é indicativa de crescimento bacteriano.

3.2.3 TESTE DE CATALASE

PRINCÍPIO: O teste de catalase consiste em um teste bioquímico, indicado para
confirmar a presença da enzima catalase, presente nas células de alguns
microrganismos. A solução é composta por peróxido de hidrogênio e água
purificada. A enzima catalase presente em alguns microrganismos converte o
peróxido de hidrogênio em oxigênio e água, que é observada através da
formação de bolhas. Dessa forma, a presença da enzima permite classificar
bactérias do gênero Streptococcus sp. (catalase negativa) de outros cocos gram-
positivos produtores de catalase, como as bactérias do gênero Staphylococcus
sp. (catalase positiva).

PROCEDIMENTO: Identificar a lâmina com o gênero de bactérias a serem

utilizadas (Streptococcus sp. e Staphylococcus sp.); esterilizar a alça
bacteriológica na chama do bico de Bunsen; coletar com a alça bacteriológica
uma colônia de Streptococcus sp. depositar na lâmina, em movimento circular;
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esterilizar a alça bacteriológica; após, coletar com a alça bacteriológica uma

colônia de Staphylococcus sp. formando um círculo na mesma lâmina, de forma
separada e espaçada a colônia anterior; esterilizar a alça bacteriológica; pingar
uma gota de peróxido de hidrogênio em cada dos círculos das colônias de
bactérias; observar se ocorre a formação de bolhas.

INTERPRETAÇÃO: A formação de bolhas indica a presença da enzima catalase.

O gênero Streptococcus sp. não produz a enzima catalase, sendo, portanto,
catalase negativa. Enquanto que o gênero Staphylococcus sp. produz a enzima
catalase, sendo, portanto, catalase positivo.

4 CONCLUSÃO
Sabemos que para distinguir e detectar espécies e gêneros de cocos
Gram-positivos não móveis, alguns testes são necessários. Dentre eles, pode-
se citar primeiro o teste da catalase, no qual os cocos gram-positivos da família
Staphylococcus podem ser distinguidos nas famílias Staphylococcus e
Micrococcus catalase-positivas, enterococos catalase-negativos e
Streptococcus. Além disso, um teste útil para distinguir os membros de
Enterococcus de outros cocos Gram-positivos catalase-negativos é a hidrólise
da esculina na presença de bile e crescimento em meio contendo altas
concentrações de NaCl (6,5%). Além disso, para detectar M. tuberculosis, a
bacterioscopia ou o exame de baciloscopia de escarro para BAAR podem ser
usados para o diagnóstico.
Por meio da aula prática, podemos observar que as técnicas de
identificação e identificação bacteriana são extremamente importantes para
fazer diagnósticos microbiológicos e prescrever tratamentos mais benéficos para
os pacientes.
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5 REFERÊNCIAS
BRASIL. Ministério da Saúde. Manual Nacional de Vigilância Laboratorial da
Tuberculose e outras Micobacterias. Brasília, 2008.