Diagnóstico em laboratório de microbiologia - bactérias

AU09100046_52_58
Área curricular – Fundações da medicina 2
Docentes: Alexandra Fraga, Agostinho Carvalho, Cláudia Nóbrega, Egídio Torrado, Gil
Castro, Margarida Correia-Neves, Paula Ludovico

Relativamente ao diagnóstico laboratorial de infeções bacterianas encontra neste documento:

- os objetivos de aprendizagem e bibliografia recomendada;
- o trabalho prático a realizar durante as aulas de laboratório;
- protocolos que poderá usar para classificar a bactéria presente na sua amostra;
- exercícios extra para realizar ao longo destas sessões.

Objetivos gerais de aprendizagem

Reconhecer e aplicar técnicas laboratoriais de trabalho em segurança e em assepsia, para a classificação de
bactérias patogénicas, assim como determinação da suscetibilidade/resistência de bactérias aos antibióticos.

Objetivos específicos de aprendizagem

-Descrever os seguintes conceitos: técnicas laboratoriais de assepsia; trabalho laboratorial em segurança e em
assepsia; esterilização; desinfeção; antissepsia e cultura pura.
-Reconhecer os diferentes métodos de esterilização, desinfeção e antissepsia (autoclavagem, estufa, bico de
Bunsen, lamparina, álcool etílico a 70 e a 95%, iodopovidona, radiações, filtração, etc.) de maior relevância
clínica e laboratorial. Associar cada um destes a diferentes procedimentos da prática laboratorial (manipulação
de amostras biológicas e de culturas bacterianas, elaboração de técnicas de diagnóstico de infeções bacterianas,
etc.), assim como a sua aplicabilidade em materiais de uso na clínica/cirurgia;
-Executar a técnica do estriamento e gerar uma cultura pura para isolamento da bactéria de interesse;
reconhecer a importância da obtenção de uma cultura pura para os métodos de diagnóstico e suscetibilidade a
agentes antimicrobianos.
-Explicar o princípio do método de Kirby-Bauer, interpretar os resultados e enumerar as diferentes
características do meio de cultura que podem influenciar o resultado do antibiograma por este método.
Identificar e distinguir outros métodos de determinação da suscetibilidade a antibióticos, como o método do
Epsilómetro;
-Descrever o princípio dos métodos da coloração de Gram, de Ziehl-Neelsen e de esporos. Associar estes
métodos de coloração à estrutura bacteriana, em particular à composição da parede bacteriana e parede dos
esporos;
-Reconhecer a importância dos métodos de coloração de Gram, de Ziehl-Neelsen e de esporos no contexto do
diagnóstico de doenças causadas por bactérias. Comparar estes métodos de colorações diferenciais e de
estrutura com métodos de coloração simples, identificando vantagens e desvantagens de cada um deles;
-Explicar de que forma a observação da forma, dimensão e organização das bactérias pode ajudar no
diagnóstico de uma doença infeciosa;
-Executar e analisar testes de diagnóstico bacteriano baseados em reações bioquímicas utilizando galerias de
identificação (Api), meios de cultura seletivos e/ou diferenciais assim como testes isolados tais como o teste da
catálase, oxidase e coagulase;
-Aplicar as técnicas laboratoriais e os resultados obtidos de forma a classificar uma espécie bacteriana numa
hipotética amostra biológica de um doente com suspeita de infeção.
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Bibliografia

Para estudar métodos de desinfeção/esterilização – usar preferencialmente sites como o do CDC e

UpToDate.

Sterilization - https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/index.html
Skin antisepsis. - UptoDate – https://www.uptodate.com/contents/overview-of-control-measures-for-
prevention-of-surgical-site-infection-in-
adults?sectionName=Skin%20antisepsis&search=antissepssi&topicRef=17042&anchor=H24969720&so
urce=see_link#H24969720

Para estudar métodos de classificação de espécies bacterianas – usar preferencialmente:

Os seguinte livros:

- Medical Microbiology. Murray, Rosenthal e Pfaller. Editora Mosby Elsevier. 7ª ou 8ª (2016) edição.
- Atlas de Diagnóstico em Microbiologia. Maza, Pezzlo e Baron. Editora Artmed. 1997.
- Bailey e Scott’s Diagnostic MIcrobiology. Forbes, Sahm e Weissfeld. Editora Mosby. 12ª Edição (2007).

Sites de Associações Científicas de referência e/ou Empresas que comercializam os testes.

Alguns exemplos:

Protocolos de forma geral - American Society for Microbiology

https://www.asm.org/Browse-By-Content-Type/Protocols
Teste da oxidase - https://www.asm.org/getattachment/00ce8639-8e76-4acb-8591-
0f7b22a347c6/oxidase-test-protocol-3229.pdf
Teste da catalase - https://www.asm.org/getattachment/72a871fc-ba92-4128-a194-
6f1bab5c3ab7/Catalase-Test-Protocol.pdf
Antibiograma - Kirby-Bauer - https://www.asm.org/getattachment/2594ce26-bd44-47f6-8287-
0657aa9185ad/Kirby-Bauer-Disk-Diffusion-Susceptibility-Test-Protocol-pdf.pdf

Api – Biomerieux
Api20E - http://biomanufacturing.org/uploads/files/587872707301898351-api20einstructions.pdf
Api 20 Strep - https://www.mediray.co.nz/media/15816/om_biomerieux_test-kits_package_insert-
20600.pdf
Api Staph - https://www.mediray.co.nz/media/15784/om_biomerieux_test-kits_ot-
20500_package_insert-20500.pdf

Geral - Microbe Online - https://microbeonline.com/culture-media/

Este site tem também informação bem estruturada por exemplo dos meios de cultura
(Agar Sangue; MacConkey; Manitol Salgado; Nutrient Agar; Löwenstein–Jensen medium)
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Trabalho a realizar durante as aulas práticas de microbiologia

Classificação de uma espécie bacteriana numa hipotética amostra biológica de um doente com suspeita de
infeção (cada grupo deve tomar atenção ao seu caso clínico e amostra).
3.1. Realizar uma cultura pura.
3.2. Realizar os testes laboratoriais que consideram relevantes para classificar a espécie bacteriana presente
na amostra.
Para a correta classificação da bactéria é necessário obter informação quanto à sua forma e dimensões
aproximadas; se é de Gram positivo ou de Gram negativo ou outra; se é uma bactéria álcool-ácido-
resistente ou não; se é uma bactéria produtora de esporos, se é catalase + ou - e características
bioquímicas determinadas por outros métodos de diagnóstico.
3.3. Determinar a sensibilidade/resistência da espécie bacteriana a antibióticos, realizando e interpretando um
antibiograma pelo método de Kirby-Bauer.

Pretende-se que os estudantes sejam capazes de explicar de que forma realizaram o trabalho laboratorial para
chegar à classificação da bactéria responsável pelo caso clínico, como interpretaram cada resultado obtido e
como foram escolhendo os métodos que foram utilizados. Os estudantes serão também questionados quanto à
forma de realizar os testes de diagnóstico. A classificação de cada estudante terá também em conta a
participação nas sessões laboratoriais.
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Protocolos experimentais

Nota: Seguem-se alguns protocolos em que se podem basear para realizar

as vossas tarefas. Antes de começarem a trabalhar conversem entre os
membros do grupo como vão organizar o trabalho e quais as técnicas que
devem realizar.

O procedimento para a produção de uma cultura pura pode encontrar no material da primeira aula de
laboratório.

A. Preparações de amostras bacterianas para observação a fresco.

B. Preparações de amostras bacterianas em lâmina para coloração (esfregaço).
C. Colorações.
D. Avaliação da suscetibilidade/resistência bacteriana a antibióticos pelo método Kirby-Bauer.

Há ainda disponível no laboratório:

- teste da oxidase
- teste da catálase
- teste da coagulase
- Apis: Api20E; ApiStaph e Api20Strep

A. Preparações de amostras bacterianas para observação a fresco

Material
- Lâminas, lamelas, ansa de inoculação, esguicho com água destilada.

Procedimento
1. Prepare as lâminas que vão ser usadas limpando-as com álcool etílico a 95% e identificando-as (com lápis na
zona esmerilada da lâmina).
2. Coloque uma pequena gota de água sobre a lâmina.
3. Retire respeitando a técnica asséptica uma amostra da cultura que pretende analisar (utilizando um inóculo
pequeno) com uma ansa de inoculação (previamente esterilizada e arrefecida) espalhando a suspensão
numa área de aproximadamente 1 cm2.
4. Volte a esterilizar a ansa à chama antes de guardar.
5. Coloque uma lamela sobre a amostra.
6. A sua preparação está pronta para ser observada ao microscópio.
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B. Preparações de amostras bacterianas em lâmina para coloração (esfregaço)

Material
-Lâminas, ansa de inoculação, esguicho com água destilada.

Procedimento
1. Prepare as lâminas que vão ser usadas limpando-as com álcool etílico a 95% e identificando-as (com lápis na
zona esmerilada da lâmina).
2. Coloque uma pequena gota de água (cerca de 5 µl - se colocar grande quantidade de água esta vai demorar
muito tempo a secar e o que vai tornar a técnica muito demorada) sobre uma lâmina;
3. Retire, respeitando a técnica asséptica, uma amostra da cultura que se pretende analisar (para obter bons
resultados, prepare o esfregaço utilizando um inóculo pequeno) com uma ansa de inoculação (previamente
esterilizada e arrefecida) espalhando a suspensão numa área de aproximadamente 1 cm2.
ATENÇÃO: pode preparar vários esfregaços na mesma lâmina pelo que, dependendo da coloração que vai
executar, deve incluir controlos positivos e negativos.
4. Volte a esterilizar a ansa à chama antes de guardar.
5. Deixar secar a lâmina ao ar.
6. Depois de seca, passe a lâmina três vezes pela chama de modo a fixar o material biológico.
7. O esfregaço está pronto para coloração.

Imagem retirada de: https://microbeonline.com/simple-staining-principle-procedure-results/

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C. Colorações

Material geral para colorações

- Tina de coloração
- Lâminas com amostra - esfregaço
- Esguicho com água
- Bico de Bunsen
- Ansa de inoculação
- Álcool etílico a 95%
- Lápis

C.1. Coloração simples

Material necessário especificamente para a coloração simples

- Um corante: azul de metileno (1-1,5 min), fucsina básica (30 s) ou violeta de cristal (20-30 s).

Procedimento
1. Coloque a lâmina com o esfregaço sobre a tina de coloração.
2. Cubra o esfregaço com um dos corantes disponíveis: azul de metileno (1-1,5 min), fucsina básica (30 s) ou
violeta de cristal (20-30 s).
3. Lave o excesso de corante com um esguicho de água.
4. Deixe secar ao ar ou secar cuidadosamente com papel (não é necessário colocar lamela).

C.2. Coloração de Gram (coloração diferencial)

Material necessário especificamente para a coloração de Gram:

- Violeta de cristal
- Solução de lugol
- Solução descolorante (etanol a 95%)
- Safranina

Procedimento:
1. Coloque a lâmina com o esfregaço sobre a tina de coloração;
2. Cobra com violeta de cristal durante 1 min;
3. Lave com água até deixar de sair corante;
4. Cobra com solução de lugol durante 1 min;
5. Lave com água até deixar de sair corante;
6. Descore com solução descolorante (ou etanol a 95 %) durante 20-60 s;
7. Lave com água até deixar de sair corante;
8. Cobra com safranina durante 1 min;
9. Lave com água até deixar de sair corante;
10. Deixe secar ao ar ou secar cuidadosamente com papel.

C.3. Coloração de Ziehl-Neelsen (coloração diferencial)

Material necessário especificamente para a coloração de Ziehl-Neelsen

- Fucsina de Ziehl
- Soluto de Ebner (solução descolorante - álcool acidificado)
- Azul de metileno
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Procedimento
1. Coloque a lâmina com o esfregaço sobre a tina de coloração.
2. Cubra com fucsina de Ziehl e deixar o máximo tempo possível, aquecendo de vez em quando
3. Lave com água destilada 3 s.
4. Lave com Soluto de Ebner tempo suficiente para remover o corante.
5. Lave com água destilada 3 s.
6. Cubra com azul de metileno 1 min.
7. Lave com água destilada 3 s.
8. Deixe secar ao ar ou secar cuidadosamente com papel.

C.4. Colorações estruturais – coloração de esporos

Material necessário especificamente para a coloração de esporos

- Verde malaquite
- Safranina

Procedimento
1. Coloque a lâmina com o esfregaço sobre a tina de coloração;
2. Cubra o esfregaço com verde malaquite;
3. Passe uma mecha de algodão (humedecida com álcool etílico a 96%) em chama por baixo do esfregaço até
começar a sair fumo do corante (faça a mecha com a pinça e tenha o cuidado para que durante este tempo o
verde de malaquite nunca chegue a ferver nem a secar, este deve apenas libertar algum fumo);
4. Deixe atuar durante 15-20 min;
5. Repetir os passos 3 e 4 duas vezes;
6. Lave com água tempo suficiente para remover o corante;
7. Cubra com safranina 30 s;
8. Lave com água destilada para remoção do excesso de corante;
9. Deixe secar ao ar e observar ao microscópio.

Nota: O verde de malaquite é de muito difícil remoção das mãos e da roupa; por isso deve ter o máximo cuidado na sua
manipulação.
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D. Avaliação da eficácia de antibióticos pelo método Kirby-Bauer

Material

- Placas de Petri com meio de Agar de Muller-Hinton

- Discos de antibióticos
- Bico de Bunsen ou lamparina
- Espalhador de vidro (ou pipetas de Pasteur de vidro)
- Pinça
- Ansa de inoculação (metálica)
- Álcool etílico a 96%
- Recipiente com água estéril
- Pipetas automáticas
- Pontas estéreis para pipetas automáticas
- Vortex

Meio de Agar de Muller-Hinton:

30 g de extrato de carne
17,5 g de caseína hidrolisada
1,5 g de amido
15 g de agar
1000 ml de água destilada

Procedimento

Dia 1
1. Selecione os discos de antibióticos que vai testar para a bactéria em causa.
2. Marque o número de placas de Petri de Agar de Muller-Hinton suficiente para colocar todos os discos de
antibióticos que quer testar, com a referência do seu grupo, turno, data de inoculação e designação da
bactéria a utilizar.
3. Prepare 5 ml de uma suspensão bacteriana e transfira 1-2 ml desta suspensão para uma das placas de Petri
com meio de Muller-Hinton. Incline a placa de modo a distribuir a suspensão por toda a superfície.
Suavemente retire por aspiração com uma pipeta o excesso de líquido; repita este procedimento para as
outras placas de Petri.
4. Deixe secar a(s) placa(s) durante algum tempo (10-15 min), junto da chama.
5. Aplique assepticamente os discos impregnados com antibióticos na superfície do agar, com a ajuda de uma
pinça esterilizada (passe as pontas da pinça por álcool e depois pela chama, com muito cuidado). Pressione
ligeiramente com a pinça, de modo a fixar os discos à superfície do agar. Os discos devem distar entre si 3
cm e 1 cm do bordo da placa de Petri.
6. Incubar as placas inoculadas a 37 ºC, durante um dia.

Dia 2 – Análise/Interpretação dos resultados:

Após incubação meça com uma régua o diâmetro das zonas de inibição de crescimento bacteriano e, com
base na Tabela apropriada, avalie a sensibilidade das bactérias aos diferentes antibióticos utilizados.
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Algumas perguntas para procurar responder durante as suas aulas de laboratório

1. Qual a necessidade do passo de fixação na coloração de bactérias em esfregaços?

2. Para que serve o mordente na coloração de Gram?

3. Explique se faz sentido fazer uma coloração de esporos numa amostra de bactérias Gram negativo.

4. Explique a necessidade de aquecer a sua preparação durante a coloração de esporos.

5. Diga o que entende relativamente ao processo de fixação e quais os métodos que conhece.

6. Ao fazer uma coloração de esporos numa amostra bacteriana fresca não encontra esporos. Dois dias depois
volta a fazer a mesma coloração na mesma cultura e observa esporos em abundância. Como explica?

7. Imagine que ao receber uma amostra bacteriana faz uma coloração de Gram e observa que todas as
bactérias da amostra são bacilos Gram negativo. Pode assim prosseguir diretamente para a realização de
testes bioquímicos de classificação da espécie? Justifique a sua resposta.

8. Diga se os meios de cultura que usou, ou que foram usados por colegas, são diferenciais e/ou seletivos:
Nutrient Agar (NA);
Meio Manitol Salgado,
MacConkey

9. Para observar bactérias não coradas, ao microscópio, utilizaria o diafragma aberto ou fechado? Justifique.

10. Qual a necessidade de usar óleo de imersão quando usa a objetiva de maior ampliação?

11. Para que coloca parafina em alguns dos poços do teste API?

12. Como funciona o teste da oxidase?

13. Como funciona o teste da catalase?

14. Identifique um método de desinfeção e/ou esterilização adequado para cada material que utilizou nas
aulas práticas (desde o material de vidro, os meios de cultura, a zaragatoa, etc)

15. Que resultado espera na coloração de Gram com uma amostra de bactérias álcool-ácido resistentes?

16. Que resultado espera obter com uma amostra de bactérias Gram negativo se se esquecer do passo da
descoloração?

17. Pode um teste de suscetibilidade a antibióticos ser determinado numa cultura mista? Justifique.

18. Para realizar um antibiograma pelo método de Kirby-Bauer deve ter em conta o meio de cultura utilizado
assim como a espessura do agar? Explique.

19. Que fatores determinam o tamanho da zona de inibição em placas de agar num antibiograma pelo método
de Kirby-Bauer?
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Alguns exercícios para realizar relativos ao trabalho laboratorial em bacteriologia

1. No trabalho laboratorial é necessário trabalhar respeitando as regras de segurança e a técnica

asséptica. Diga o que entende por este conceito exemplificando com algumas regras laboratoriais
neste contexto. Para tal observe os vídeos nos links indicados em baixo e identifique:
- medidas que visam proteger a pessoa a trabalhar (regras de segurança);
- medidas que diminuem o risco de contaminação da amostra (trabalhar respeitando a técnica
asséptica)
- imprecisões/erros
- https://www.youtube.com/watch?v=u84bTjqrt7k
- https://www.youtube.com/watch?v=oPl4ETb3vMg

2. Comente a seguinte frase “Desinfeção consiste na remoção, de um determinado objeto ou

superfície, da totalidade ou de parte dos microrganismos patogénicos”

3. Relativamente a processos de desinfeção e/ou esterilização. Indique uma vantagem e uma

desvantagem de cada um dos seguintes pares:
- Iodopovidona (Betadine) versus álcool etílico a 70%;
- Filtração versus autoclave (por exemplo para líquidos);
- Álcool etílico a 95% versus álcool etílico a 70%;
- Autoclave versus esterilização a seco;
- UV versus radiação gama;
- Óxido de etileno versus autoclave.

4. O que entende pela abreviatura HEPA relativamente a filtros? Sabendo que os filtros HEPA tem
poros de 0,2 a 0,1 µm pode considerar a filtração um processo de esterilização?

Filtros HEPA – “High efficiency particulate air (HEPA), originally called high-efficiency particulate
absorber but also sometimes called high-efficiency particulate arresting or high-efficiency
particulate arrestance” (https://en.wikipedia.org/wiki/HEPA).

(Imagem retirada de: https://www.howorthgroup.com/information-centre/learn-

about-our-technologies/air-technology/in-operating-rooms)
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(imagens retiradas de: https://www.onboardsolutions.com.au/clean-room/flow-cabinets/laminar-flow-cabinets/laminar-flow-cabinet/;

https://www.cleatech.com/product-category/laminar-flow-hoods/vertical-laminar-flow-hood-clean-bench/)

5. Observe a figura e leia a informação no site

“Up-to-Date” sobre o uso da Clorohexidina na
aplicação de cateteres – ver em “SITE CARE” no
seguinte link:
https://www.uptodate.com/contents/intravasc
ular-catheter-related-infection-
prevention?search=skin%20desinfection&sourc
e=search_result&selectedTitle=4~150&usage_t
ype=default&display_rank=4#H564183335

6. A clorohexidina também pode ser aplicada

quando é feita recolha de sangue para análise
microbiológica no caso de suspeita de
septicemia?
Para responder a esta questão poderá também
consultar o site “Up-to-Date”, especificamente
em:
https://www.uptodate.com/contents/blood-
cultures-for-the-detection-of-
bacteremia?search=septocemia%20blood%20c
ollection%20%20for%20microbiology&source=search_result&selectedTitle=6~150&usage_type=d
efault&display_rank=6

7. O primeiro passo no diagnóstico de uma doença bacteriana é frequentemente a produção de uma

cultura pura. Explique o que entende por cultura pura; como a realiza e a sua importância.

8. Para realizar uma cultura pura é necessário elaborar um estriamento para obtenção de colónias
isoladas. Das seguintes imagens estriamentos identifique as que poderia usar para realizar uma
cultura pura.
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9. Em galerias de testes bioquímicos, como por exemplo o APi20E, é solicitado em alguns casos que
se coloque parafina sobre a cultura. Qual a utilidade de colocar parafina?

10. Como interpreta um teste de catalase ou de oxidase positivos?

11. No laboratório de Microbiologia são utilizados vários meios de cultura. Diga o que entende por:
11.1. Meio de cultura seletivo
11.2. Meio de cultura diferencial
11.3. Meio de cultura enriquecido

12. Relativamente à pergunta anterior dê exemplos de meios de cultura para cada um dos casos.

13. Um teste de aglutinação foi produzido

para identificar bactérias causadoras de
meningite que permite a distinção entre:
- Streptococcus do grupo B,
- Haemophilus influenzae b
- Streptococcus pneumoniae
- Neisseria meningitidis WACY
- Neisseria meningitidis B

Interprete o resultado apresentado do teste

realizado com uma amostra de líquido
cefalorraquidiano.
(https://www.thermofisher.com/order/cata
log/product/R30859502?ICID=search-
product)

14. O diagnóstico de tuberculose apresenta algumas dificuldades inerentes ao metabolismo da

própria bactéria.
Indique vantagens e desvantagens dos seguintes métodos usados no diagnóstico de tuberculose:
- cultura em meio sólido;
- cultura em meio liquido;
- quantiferon (ELISA e ELISOPT);
- teste direto – coloração de Ziehl-Neelsen de uma expetoração;
- teste direto – coloração de auramina-rodamina de uma expetoração;
- PCR a partir de uma expetoração.