RELATÓRIO DAS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA

Aula do dia 17/04 e 24/04

ASSUNTO: Identificação de microrganismos

PRODUTO: Técnica de Coloração de Gram

INTRODUÇÃO:

O método tintorial predominante utilizado em bacteriologia é o método de Gram. A

bacterioscopia, após coloração pelo método de Gram com diagnóstico presuntivo, de triagem, ou
até mesmo confirmatório em alguns casos, constitui peça importante e fundamental na
erradicação e no controle das Doenças Sexualmente Transmissíveis(DST).
Essa técnica é simples, rápida e tem capacidade de resolução,permitindo o correto diagnóstico
em cerca de 80% dos pacientes emcaráter de pronto atendimento em nível local.Os custos com
investimento e manutenção são consideravelmentebaixos diante da eficácia alcançada com os
resultados imediatos dostestes. (BARON 1990)

Essa técnica requer instalação simples, necessitando apenas de uma sala pequena com
disponibilidade de água e gás, onde deverá serinstalado um balcão com pia e um bico de Busen,
eventualmente substituído por uma lamparina ou espiriteira. São ainda necessários: microscópio
com objetiva de imersão ebateria para a coloração de Gram. Os corantes devem ser preparados
pelo próprio laboratório ou por um laboratório habitado que assegure aqualidade do produto.
Finalmente, e mais importante, são necessários técnicos de laboratóriotreinados,
responsáveis e conscientes do valor do seu trabalho. (FRANCHINI 1983)

A coloração de Gram recebeu este nome em homenagem a seudescobridor, o médico dinamarquês

Hans Cristian Joaquim Gram. Em1884, Gram observou que as bactérias adquiriram cores
diferentes,quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificá-las em
dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Grampositivas, e as que
ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas.
Após descrição do método, inúmeras propostas de modificaçãoforam feitas. Neste manual, você
vai conhecer a técnica, os corantes eos procedimentos para a correta realização da coloração
de Gram,recomendados pelo Programa Nacional de Doenças Sexualmente
Transmissíveis e Aids do Ministério da Saúde. (TEIXEIRA 1996)

Objetivos
- Aprender a realizar o método da coloração de GRAM.

- Observar e classificar os microrganismos com base em seu comportamento diante dos

corantes a qual foram expostos, pelo método de Gram.

- Observar os microrganismos no microscópio e classifica-los com base na sua morfologia

celular.

Metodologia
Os integrantes do grupos executarão as aulas práticas, realizando os procedimentos
tecnológicos, desenvolvendo habilidades laboratoriais para o aprendizado sobre os principais
Microrganismos presentes nas superfícies corporais e nos utensílios de trabalho em
 enfermagem. Método proposto, semeadura em ágar. Posteriormente a este realizará as
técnicas de coloração de Gram e Classificação dos microrganismos.

Materiais e reagentes:
Placa de Petri contendo meio de cultura Agar BDA Bico de Bunsen

Álcool 70%

Swab estéril

Alça de Platina

Lâmina de vidro

Lamínulas

Solução de Cristal violeta (com conta-gotas)

Solução de lugol (com conta-gotas)

Solução de Safranina

Solução de álcool: acetona (em pisseta)

Microscópio

Conta gotas

Solução salina estéril

Tubo de ensaio e galeria
Placas de meio de cultura já utilizados na aula anterior (geladeira)

EQUIPAMENTOS :
- Bico de Bunsen
- Microscópio com lente de imersão
- Papel toalha
Óleo de imersão com conta gotas- álcool gel 70%

EPI (Equipamento de Proteção Individual)

Jaleco branco (com manga longa, comprimento até o joelho), calça comprida e calçado fechado.
Aula do dia 17/04

Iniciamos a aula fazendo o Preparo do esfregaço que é feito da seguinte ordem:

Preparo do esfregaço.
1) Pegar uma lâmina limpa;
2) Pingar na lâmina uma gota de solução salina fisiológica;
3) Flambar a alça de platina no bico de Bunsen, deixar esfriar no tubo de solução
salina estéril,
4) abrir a placa de Petri e coletar com a alça estéril pequena fração de colônia.
5) D. Esfregar o material com movimentos circulares, para obter um esfregaço de
forma oval, bem fino euniforme;
6) Fixar o esfregaço passando a lâmina (lado oposto ao esfregaço) 5 vezes na
chama do bico de Bunsen(rapidamente).Só pra fixar.

Logo em seguida fizemos o preparo da coloração:

Preparo da Coloração:

7) Cubra o esfregaço com cristal violeta e deixe por 1 minuto;

8) Escorra o corante e lave com um pouco de água corrente;
9) Cubra a lâmina com lugol e deixe agir por 1 minuto;
10) Escorra o lugol e lave com um pouco de água corrente;
11) Adicione álcool-acetona sobre a lâmina até que não desprenda mais corante;
12) Lave em um filete de água corrente;
13) Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por 30 segundos;
14) Lave com um pouco de água corrente;
15) Deixe secar ao ar livre.
Aula do dia 24/04

Nessa aula nós utilizamos as lâminas preparadas na aula passada (Método de

GRAM). Identificamos as bactérias presentes nas lâminas, utilizando o microscópio e
as classificamos com base na sua morfologia celular.

Primeiro começamos com a objetiva de 10x para aproximar a amostra e ter uma
visualização nítida, onde ajustamos o micrométrico para ter enfoque fino, depois
mudamos para a objetiva de 40x onde utilizamos o óleo de imersão para melhor
vizualizar a amostra, fazendo com que a lente deslize sobre a lâmina sem quebrá-la.

RESULTADO:

Ao observar as lâminas, notamos uma coloração roxa, o que é uma característica

das bactérias gram- positivas, e com base na morfologia celular das bactérias nós as
identificamos como estreptococos pois estão dispostas em longas cadeias, com o
formato esférico, como um colar de pérolas.

CONCLUSÃO:
A coloração de Gram é um passo muito importante na caracterização e classificação
inicial das bactérias. Afinal, esse método de coloração permite que as bactérias
sejam visualizadas no microscópio óptico, uma vez que sem a coloração é
impossível observá-las ou identificar sua estrutura.

REFERÊNCIAS
BARON, E.J. & FINEGOLD, S.N,, Appendix B, Formúlas for commonly used stains.
In: Bailey and Scott’s diagnostic microbiology, 8º ed. St. Louis, 1990. Mosby.

FRANCHINI, MIRIAM, Procedimentos Laboratoriais no Controle das Doenças

Sexualmente Transmissíveis, Brasília, 1983, Senado FederalCentro Gráfico.

TEIXEIRA, PEDRO & VALLE, SILVIO. Biossegurança – Uma

abordagemMultidisciplinar. Rio de Janeiro , 1996, Editora FIOCRUZ.