UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCINCIAS DEPARTAMENTO DE ENERGIA NUCLEAR

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM TECNOLOGIAS ENERGTICAS E NUCLEARES

Deteco de Microncleo em Hemcitos de Biomphalaria glabrata exposto a Radiao Gama de 60Co

LUANNA RIBEIRO SANTOS SILVA

RECIFE PERNAMBUCO BRASIL AGOSTO 2010

Deteco de Microncleo em Hemcitos de Biomphalaria glabrata exposto a Radiao Gama de 60Co

LUANNA RIBEIRO SANTOS SILVA

Deteco de Microncleo em Hemcitos de Biomphalaria glabrata exposto a Radiao Gama de 60Co

Dissertao de Mestrado submetido ao Programa de Ps-graduao em Tecnologias Energticas e Nucleares, do Departamento de Energia Nuclear, da Universidade Federal de

Pernambuco, para obteno do ttulo de Mestre em Cincias. rea de Concentrao: Dosimetria e

Instrumentao Nuclear.

Orientador: Prof. Dr Edvane Borges da Silva (CAV/DEN-UFPE) Co-orientadora: Prof. Dr. Ana Maria M. De Albuquerque Melo (DBR-UFPE)

RECIFE-PERNAMBUCO-BRASIL AGOSTO-2010 5

Dedico minha famlia e meus amigos que sempre me acompanharam em todos os momentos.

AGRADECIMENTOS

A todas as foras celestiais que me ajudaram na minha jornada da vida. Nossa Senhora da Conceio, por nunca ter me faltado quando precisei. Aos meus pais, Antonio Ribeiro Silva Filho e Severina Ceclia dos Santos, por toda dedicao, amor e educao a mim dada. minha Orientadora, Ana Maria Mendona de A. Melo, pela pacincia, amor e companheirismo e por TODOS esses anos juntos no laboratrio. Porque sem ela no sei o que eu seria. minha Orientadora, Edvane Borges da Silva, pelo carinho e toda pacincia durante todo o mestrado. Ao professor Amncio, pelos ensinamentos e por ser meu pai cientifico. minha amada av Alice Anunciao (in memorian) por ter simplesmente ter sido tudo na minha vida e ter me ensinado que o amor o maior trofu que um homem pode carregar. Aos meus avs que mesmo sem perceber me ajudam muito. A meu irmo Luann Ribeiro, por ter me apoiado em todos as momentos que precisei. Aos meus amigos que sempre estavam ao meu lado em todos os momentos da minha vida. A todos do laboratrio de Radiobiologia da UFPE, Cris, Mona, Fabrcio, Gustavo, Pedro, Edvaldo, Will, Samia, Karine e todos que me ajudaram direta e indiretamente. A minha amiga Rebeca Cantinha, pelo carinho e pela parceria. Ao departamento de Biofsica e Radiobiologia do CCB/UFPE, pelo suporte e ajuda na minha jornada cientifica. seu Fredson pelo apoio e pelos incentivos que me foi dado durante todo o estagio. Ao Laboratrio de Metrologia das Radiaes Ionizantes (DEN/ UFPE), na pessoa da Prof Helen Koury, por ter cedido gentilmente a fonte radioativa para realizao de meus trabalhos. Ao LAMBDA, na pessoa do Prof Ademir Amaral, pelo suporte de equipamentos e insumos para realizao dos experimentos. 8

 Ronaldo e Clarissa, pelo o amor, pois isso que nos une. Ao meu grande amigo Luiz Reinuax (in memorian), por ter vibrado a cada conquista e por todo carinho que me foi dado. Te amo, jamais esquecerei a sua alegria. todas amizades cultivadas na graduao, que nunca esquecerei. Carlos Eduardo (Dola), pelo companheirismo, PACINCIA e amor cultivado. A todos os membros das bancas examinadoras Prof. Dr. Francisco Fernandes Amancio, Profa. Dra. Vlaudia Costa, Prof. Dr. Ademir Amaral, Prof. Dr. Thiago de Salazar e Fernandes e Prof. Dr. Cristiano Aparecido Chagas por suas valiosas contribuies para o enriquecimento deste trabalho. Ao Departamento de Energia Nuclear na pessoa do Prof. Dr. Andr Maciel Netto. Aos professores do DEN, pelo suporte cientfico que me concederam neste mestrado A todos os funcionrios do DEN, em especial a Magali e Nilvnia, pela amizade e por tornarem minha jornada muito mais agradvel. Aos colegas do GERAR, pela companhia e pelos momentos agradveis que passamos juntos. Aos colegas do DEN pela amizade e companhia neste caminho. minha pequenina cunhada Natalia Mirrely, por ter aquentado meus estresses. s minhas filhas, Sasha, Lecca e Raquely por terem alegrado todos os meus dias. CAPES (Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior) pelo suporte financeiro para a execuo deste trabalho.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Esquema da ao da radiao na molcula de DNA. www.cnen.gov.br 5 Figura 2 Classificao taxonmica de Biomphalaria glabrata, segundo Rey (2001) 10 Figura 3 (A) Biomphalaria glabrata (SAY, 1818) melnico. (B) Concha do molusco B. glabrata1. Fonte: http://www.elrincondelmalacologo.com 11 Figura 4 Hemcito de B. glabrata, corados com DAPI e observados no microscpio de fluorescncia. (aumento 1000X) 13 Figura 5 (A) Hialincitos corados com Giemsa.(1000 X); (B) Granulcitos corado com Giemsa.(1000 X) 14 Figura 6 Aqurios de criao de moluscos B. glabrata do moluscrio do Departamento de Biofisica e Radiobiologia-UFPE 18 Figura 7 (A) Recipientes individuais de B. glabrata; (B) Molusco, demonstrando o dimetro da concha 19 Figura 8 (A) Fonte Gammacell 220 Excel-MDS Nordion. (B) Tubos Falcon com os B. glabrata que sero irradiados 21 Figura 9 Microscpio ptico Medilux do laboratrio de Radiobiologia (DBRUFPE) 23 Figura 10 Microscpio de Fluorescncia Leica CW4000 do Lambda (DENUFPE) 24 Figura 11 Esquema com os critrios de identificao de MN; (A) Dimetro menor que 1/3 do tamanho do ncleo; (B) Cor e textura semelhante ao ncleo; (C) No estar em contato direto com o ncleo. 25 Figura 12 Alteraes encontrados na hemolinfa de B. glabrata irradiados nas doses de 35, 45 e 55 Gy. (A) Ncleo bilobulado; (B) ncleos interligados 28 Figura 13 Apoptose em hemcitos de Biomphalaria glabrata submetidos a 55Gy de radiao gama de 60Co 29 Figura 14 (A) Hemcito corado com Giemsa; (B) Hemcito corado com Hoechst 33258. A seta vermelha indica MN 34

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Hemcitos originrios dos moluscos irradiados e no irradiados Tabela 2 Dados da Frequncia de Microncleo de B. glabrata submetidos a radiao gama de 60Co Tabela 3- Vantagens e limitaes das tcnicas de colorao Giemsa e Hoechst 33258

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

B. glabrata
60

Biomphalaria glabrata Cobalto-60 Comisso Nacional de Energia Nuclear Departamento de Biofsica e Radiobiologia cido Desoxirribonucleico Departamento de Energia Nuclear Gray KiloGray Microncleo

Co

CNEN DBR DNA DEN Gy kGy MN

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Deteco de Microncleo em Hemcitos de Biomphalaria glabrata exposto a Radiao Gama de 60Co Autor: Luanna Ribeiro Santos Silva Orientador: Prof. Dr Edvane Borges da Silva Co-orientadora: Prof. Dr. Ana Maria M. De Albuquerque Melo RESUMO As radiaes ionizantes podem induzir mutaes gnicas, aberraes cromossmicas e morte celular. Recentemente, comeou a haver grande empenho no desenvolvimento de tcnicas que auxiliem na compreenso desses possveis danos biolgicos surgidos aps exposies dos organismos a certas doses de radiao ionizante. Dentre estas tcnicas, o teste do microncleo tem se mostrado um timo biomarcador de efeitos de genotoxicidade do dano ao DNA. Esta tcnica tambm pode ser utilizada para deteco de genotoxicidade ambiental, na biomonitorao. O molusco Biomphalaria glabrata, devido s suas caractersticas biolgicas e ambientais, tem se apresentado como um timo modelo experimental, possibilitando a avaliao de efeitos produzidos por agentes fsicos e qumicos. Diante disso, o presente trabalho visou detectar os efeitos genotxicos da radiao gama de 60Co em hemcitos de Biomphalaria glabrata, por meio do teste do microncleo, bem como estabelecer este ensaio como um novo biomarcador ambiental. Os moluscos foram divididos em grupos e submetidos a dose de 0 (controle), 25, 35, 45 e 55 Gy de radiao gama. Aps 48 horas da irradiao, a hemolinfa dos moluscos foi coletada e analisada em microscpios ptico e de fluorescncia. As lminas foram coradas com Giemsa e hoechst 33258, posteriormente foram analisadas quanto ao nmero de hemcitos, alteraes nucleares e frequncia de microncleos. A anlise estatstica foi realizada por meio do Teste do 2, ANOVA e teste de Tukey, com p<0,05. Os resultados obtidos demonstram que moluscos adultos de B. glabrata se mostraram sensveis aos efeitos da radiao gama de 60Co. Na dose 35 Gy apresentaram um nmero menor de hemcitos, enquanto que os expostos a 55 Gy uma maior quantidade de hemcitos. Os hemcitos dos moluscos irradiados apresentaram alteraes morfolgicas e ateraes celulares nas doses de 35, 45 e 55 Gy, sendo a dose de 55 Gy a mais radiotxica. A freqncia de microncleos no foi dose-dependente, porm apresentou diferena significativa entre o grupo controle e os grupos irradiados. Pode-se concluir que a anlise morfolgica e a frequncia de microncleo de hemcitos de Biomphalaria glabrata so parmetros confiveis na avaliao da ao de agentes genotxicos em ambientes aquticos. Palavras-chave: genotoxicidade ambiental, microncleo, hemcitos,

biomonitoramento, Biomphalaria glabrata, Radiao, 60Co

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Detection of Micronuclei in Haemocytes from Biomphalaria glabrata exposed to 60Co Gamma Radiation Author: Luanna Ribeiro Santos Silva Adviser: Prof. Dr Edvane Borges da Silva Co-adviser: Prof. Dr. Ana Maria M. De Albuquerque Melo ABSTRACT Ionizing radiation can induce genetic mutations, chromosomal aberrations and cellular death. Recently, a large effort has been done for the development of several techniques that help with the comprehension of possible biological damages that occur after some organisms exposure to certain doses of ionizing radiation. Among these techniques, the micronucleus test has proved an excellent biomarker of genotoxic effects from DNA damage. This technique can also be used for the detection of environmental genotoxicity in biomonitoring. The mollusk Biomphalaria glabrata, due to their biological characteristics and environmental factors, has emerged as an excellent experimental model, enabling the evaluation of effects produced by physical and chemical agents. Therefore, this study aims to detect the genotoxic effects of gamma radiation from 60Co in haemocytes from Biomphalaria glabrata through micronucleus tests, and set this as a new biomarker test environment. The snails were divided into groups and subjected to doses of 0 (control), 25, 35, 45 and 55 Gy of gamma radiation. After 48 hours of irradiation, the mollusks haemolymph were collected and examined in optical and fluorescence microscopes. The slides were stained with Giemsa and Hoechst 33258, and analyzed according to the haemocytes number, nuclear changes and micronuclei frequency. The statistical analysis was performed using the 2Test, ANOVA and Tukey test with p<0.05. The results showed that adult snails B. glabrata were sensitive to effects of 60Co gamma radiation. The 35 Gy dose showed a lower number of haemocytes, whereas the exposed to 55 Gy showed greater amounts of haemocytes. The haemocytes of irradiated mollusks showed morphological and cellular abnormalities at doses of 35, 45 and 55 Gy and the dose of 55 Gy was more radiotoxic. The micronuclei frequency was not dosedependent, but there is significant difference between control and irradiatedgroups. It can be concluded that morphology analysis and the micronuclei frequency in haemocytes of Biomphalaria glabrata are reliable parameters to evaluate the effects of genotoxic agents in aquatic environments. Keywords: micronucleus, haemocytes, biomonitoring, Biomphalaria glabrata, radiation, 60Co

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SUMRIO

1. INTRODUO 2. REVISO DE LITERATURA 2.1. Radioecologia 2.2. Biomonitoramento 2.2.1. Teste do microncleo 2.3. Biomphalaria e sua utilizao como bioindicador 3. METODOLOGIA 3.1. Criao e Manuteno dos Moluscos 3.2..Seleo dos moluscos 3.3. Irradiao de Moluscos Adultos 3.4. teste de Microncleo dos moluscos B. glabrata 3.4.1. Colorao Giemsa (convencional) 3.4.2. Colorao para fluorescncia 3.5. Anlise das lminas 3.6. Anlise estatstica 4. RESULTADOS E DISCUSSO 4.1. Anlise da radiosensibilidade celular dos hemcitos B. glabrata. 4.2. Anlise da freqncia de microncleo 4.3. Comparao entre Metodologias de Colorao 5. CONCLUSES 6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS de

1 4 4 7 9 10 18 18 19 20 21 22 23 24 25 26 26

30 33 36 37

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1. INTRODUO

Os organismos vivos esto expostos naturalmente ao das radiaes, sejam elas provenientes de fontes naturais ou artificiais (MELO, 1994 & MELO, 1998). Sabe-se que as radiaes ionizantes tambm podem induzir a mutaes gnicas, aberraes cromossmicas e morte celular (SEGRETO, 2005; HALL, 1994). As clulas irradiadas apresentam ainda uma tendncia ao aumento ou diminuio do nmero de cromossomos e muitos dos efeitos celulares so decorrentes de mudanas durante a duplicao ou reparo de danos do DNA. Estas alteraes podem causar instabilidades cromossmicas transmissveis, resultando em efeitos variados, mesmo depois de vrios ciclos mitticos (GREENSTOCK, 1986; COSTA; MENK, 2000). Recentemente tem havido grande empenho no desenvolvimento de tcnicas que auxiliem na compreenso desses possveis danos biolgicos que surgem aps exposies dos organismos a certas doses de radiao ionizante. So elas: o teste do letal dominante (NAKANO, 2003; BATEMAN, 1971; TALLARICO, 2004), ensaio do cometa (GRAZEFFE, 2008; VILELLA, 2006a); teste do microncleo (FERNANDES, 2005; BRAGA, 2006, PAVLICA, 2000; GODOY, 2008, CARVALHO, 2005) e aberraes cromossmicas (BAUCHINGER, 1995; RAMALHO, et al, 1988; LLOYD, 1997; FERNANDES, 2008a;

FERNANDES, 2008b). Os microncleos (MN) so estruturalmente pequenos ncleos representando o material gentico que foi perdido pelo ncleo principal, como consequncia de um dano gentico que pode ser causado por agentes fsicos, qumicos ou biolgicos, capazes de interferir no processo de ligao do cromossomo s fibras do fuso ou que possam induzir a perda de material gentico, como cromossomos inteiros ou fragmentos de cromossomos

(SCHMIDT, 1975; VILLELA, 2006).

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O ensaio do microncleo tem se mostrado um timo biomarcador da ao de agentes genotxicos ou mutagnicos. Por esta razo utilizado no estudo da genotoxicidade ambiental, com o propsito de biomonitoramento (VILLELA, 2006). O estudo da monitorao dos ambientes importante, devido aos diversos agentes fsicos e qumicos que so lanados no ambiente, provenientes de diversas atividades humanas (ARAUJO et al., 2001). Organismos vivos, como os moluscos Biomphalaria glabrata, que esto nesses ambientes podem sofrer danos em suas biomolculas. Por esta razo, o desenvolvimento de tcnicas sensveis e de baixo custo para deteco destes efeitos de grande importncia. O molusco, Biomphalaria glabrata, devido s suas caractersticas biolgicas e ambientais, tem-se apresentado como timo modelo experimental, possibilitando a avaliao de efeitos produzidos por agentes fsicos e qumicos (ESTEVAM, 2006; CANTINHA, 2010; SILVA, 2008, TALLARICO, 2004). Por sua ampla distribuio geogrfica e interferncia sobre a sade humana, como vetor intermedirio da esquistossomose mansnica, ganha interesse no apenas como modelo de alteraes fisiolgicas induzidas por estmulos externos, mas tambm por viabilizar a padronizao de metodologias de controle populacional, ou como bioindicadores e biomarcadores de interferentes ambientais. Com isso, o objetivo geral deste trabalho fornecer subsdios para a padronizao do ensaio do microncleo em hemcitos de Biomphalaria glabrata como nova ferramenta na biomonitorao da ao de agentes fsicos e qumicos lanados em ambientes aquticos. Neste contexto, esta pesquisa busca especificamente: Estudar a radiossensibilidade dos moluscos adultos da espcie Biomphalaria glabrata; Avaliar alteraes celulares nos hemcitos destes moluscos submetidos a diferentes doses de radiao gama de 60Co; Analisar a frequncia de microncleos em moluscos B. glabrata submetidos a radiao gama de 60Co.

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 Comparar qual a melhor metodologia de colorao, entre o Giemsa e Hoechst, a ser utilizada no ensaio do microncleo em hemcitos de B. glabrata.

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2. REVISO DA LITERATURA

2.1. Radioecologia

Didaticamente, radioecologia ou ecologia da radiao pode ser considerada uma cincia multidisciplinar, que visa a compreenso das interrelaes entre a radiao ionizante ou de substncias radioativas com o meio ambiente. Portanto, podemos dizer que esta cincia desempenha um papel cada vez mais importante no controle das diferentes fontes de poluio ambiental (ANJOS, et al., 2004; ANJOS, 2006). Sabe-se que a radiao energia que se propaga atravs da matria ou do espao em forma de onda (radiao eletromagntica) ou partcula (radiao corpuscular) (CNEN, 2005). A radiao eletromagntica, dependendo de sua energia e interao com a matria, pode ser classificada em ionizante (radiao gama e os raios-X), quando possuir energia suficiente para arrancar eltrons de um tomo, produzindo pares de ons, e no ionizante que interage com o meio podendo interferir nas biomolculas excitando, os eltrons promovendo de sua camada de origem para uma camada mais externa. So exemplos de radiao no ionizante os raios ultravioletas, infravermelhos, as ondas de radiofrequncia, o laser, as microondas e a luz visvel (CNEN, 2005; BITELLI, 2006). A radiao corpuscular representada por partculas carregadas, como alfa, beta, prtons e eltrons, que podem interagir com o meio causando grande ionizao das molculas (CNEN, 2005; BITELLI, 2006). Os efeitos da radiao em nvel celular so decorrentes de mudanas ocorridas durante a duplicao ou no reparo de danos do DNA, causando instabilidade cromossmica transmissvel. Os efeitos podem ocorrer quando o DNA sofre ao direta das radiaes (ionizao) ou indireta, por meio do ataque de radicais livres que so produzidos pela radilise da molcula da gua (Figura 19

1). O DNA expe-se basicamente a dois tipos de danos: mutaes gnicas e quebras, acarretando falhas na diviso celular podendo levar a morte celular ou a efeitos variados mesmo depois de vrios ciclos mitticos (SABATIER et al., 1995).

Figura 1 Esquema da ao da radiao na molcula de DNA. www.cnen.gov.br

Ao interagir com o sistema biolgico, a radiao ionizante pode provocar nas clulas diversas respostas que acabam ou no as levando morte. Os efeitos dependem do tipo de estrutura atingida e da eficincia do mecanismo de reparo celular (BARACAT, 2000; MOORE, 2002). Outros aspectos inerentes s radiaes ionizantes e interferentes sobre seus efeitos biolgicos devem ser observados, tais como: o tipo de radiao empregada, a quantidade de energia liberada no percurso desta, a atividade da fonte radioativa, a taxa de dose da fonte, a presena de oxignio e a dose absorvida (POUGET; MATHER, 2001).

Pode-se observar ainda que o dano biolgico produzido pela radiao ionizante aumenta com o incremento da dose ou com a quantidade de energia absorvida da radiao. Podemos conceituar dose absorvida como a energia

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mdia depositada pela radiao em um volume elementar de matria (CNEN, 2005). Segundo Okuno (1988) e Segreto (2000), os efeitos biolgicos da radiao so comumente classificados em somticos e genticos. Os efeitos somticos afetam apenas a pessoa irradiada e podem ser divididos em imediatos e tardios. Os efeitos imediatos aparecem nos indivduos que foram expostos radiao ionizante e apresentaro sinais e sintomas em at 60 dias (eritemas, sndrome aguda da radiao etc). Os efeitos tardios caracterizam-se por surgirem aps este perodo ou at anos depois da exposio, podendo induzir cancerizao. Os efeitos genticos (hereditrios) podem ocorrer quando clulas germinativas so irradiadas, dessa forma os efeitos resultantes podem provocar modificaes. O homem, no possui sensores biolgicos capazes de detectar este tipo de energia ionizante; logo, diferentes equipamentos foram desenvolvidos para esta finalidade, tais como: Geiger-Mller, caneta dosimtrica, contador

proporcional, dosmetro termoluminescente e emulso fotogrfica. No entanto, os detectores fsicos so capazes de aferir quantitativamente a dose recebida pelo sistema material ou biolgico, porm so imprecisos na determinao dos danos que podem surgir no meio ambiente e consequentemente no homem. Isto tem sido motivo para o desenvolvimento de diferentes estudos nas diversas reas relacionadas energia nuclear, inclusive na radioecologia (ICRP, 2003). Estudos anteriores utilizaram bactrias (MORAES et. al, 1998), culturas de clulas (COSTA et al, 2002), peixes (CHATY et al, 2004), conchas de moluscos (FRANTSEVICH et al, 1995), ghost de hemcias (AMANCIO, 1998) e cultura de linfcitos (FERNANDES, 2005) como modelos para mensurar os danos provocados pela radiao nos sistemas biolgicos. Os modelos animais ideais para o estudo dos efeitos biolgicos das radiaes ionizantes devem possuir como caractersticas um curto ciclo vida, fcil manuteno em laboratrio, baixo custo de manuteno, resposta rpida e precisa e boa reprodutibilidade. O molusco Biomphalaria glabrata (B. glabrata) por 21

reunir todas estas caractersticas vem se tornando alvo de estudo para uma futura utilizao como bioindicador, no apenas da ao de agentes qumicos, mas tambm de agentes fsicos presentes no meio ambiente (MNZINGER, 1987; MOTTA et al., 1997; CANTINHA, 2008).

2.2. Biomonitoramento

Com o crescimento da industrializao e da urbanizao ocorrido nas ltimas dcadas, os ecossistemas aquticos passaram a sofrer grandes impactos decorrentes destes processos. Atividades industriais, agrcolas e domsticas so responsveis pelo uso de mais de um tero da gua doce acessvel, alm disso, estas atividades so grandes responsveis pela contaminao destas guas por numerosos compostos qumicos. Estas guas atingem os rios, lagos e oceanos contendo uma infinidade de contaminantes em diversas concentraes (FENT, 2004). Para o estabelecimento da condio homeosttica destes ambientes naturais, necessrio que seja realizado monitoramento destas reas o que possibilitaria tomada de aes corretivas (MONSERRAT et al., 2007). Entretanto, o monitoramento e a avaliao do risco dos ambientes impactados no podem ser baseados exclusivamente em anlises qumicas de amostras ambientais, pois no so apropriadas na indicao e predio dos efeitos deletrios causados por contaminantes na biota (BARSIENE et al., 2006, CAJARAVILLE et al., 2000). Desta forma, para avaliar os impactos dos poluentes na qualidade ambiental pertinente que sejam mensurados os efeitos que estas substncias causam nos organismos vivos destes ecossistemas (WELLS et al., 2001). Logo, biomonitoramento pode ser definido como o uso sistemtico das respostas de organismos vivos para avaliar mudanas ocorridas no ambiente, geralmente causadas por aes antropognicas (BUSS, et al., 2003).

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Dentre as diversas metodologias utilizadas para biomonitorao ambiental, tm-se utilizado ensaios in vitro como o teste de AMES e in vivo, por exemplo, o teste do MN e aberraes cromossmicas (VILLELA, 2006). O teste do MN utiliza organismos vivos expostos a um agente mutagnico em um determinado ambiente, os dados coletados podem nos fornecer uma resposta complexa entre a atividade genotxica e a eficincia dos mecanismos de defesa do organismo. Por esta razo, representa uma ferramenta de grande relevncia ecotoxicolgica (VILLELA, 2006). A dosimetria citogentica foi utilizada na biomonitorao ambiental no acidente nuclear de Chernobyl. Cristaldi et al. (1991) investigaram o impacto ambiental do acidente de Chernobyl sobre roedores (Clethrionomys glareolus Schreb) de diferentes idades que habitavam quatro regies do sudeste sueco. O experimento empregou
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testes

para

determinao

dos

radionucldeos

(principalmente

Cs) e testes de mutagenicidade (teste do microncleo de

medula ssea e ensaio da anormalidade do esperma). Os resultados obtidos mostraram uma correlao positiva entre o aumento de microncleos em eritrcitos policromticos e a dose absorvida. Ao final dos experimentos observaram que o teste do microncleo se mostrou eficaz na anlise dos efeitos biolgicos da contaminao por radionucldeo. No Brasil, a aplicao prtica da dosimetria citogentica foi realizada nas vtimas do acidente de Goinia (1987), quando uma parcela da populao foi contaminada por Csio (137Cs). Nesse caso, detectou-se a freqncia de seis aberraes cromossmicas instveis (cromossomos dicntricos, em anel e fragmentos acntricos) permitindo o clculo da dose de radiao absorvida por cada indivduo estudado (RAMALHO; NASCIMENTO, 1991). Pode-se afirmar que a dosimetria citogentica, to utilizada para mensurar dose absorvida de radiao em humanos expostos, pode ser utilizada para medir os efeitos da radiao ou de substncias qumicas sobre outros indivduos ou espcies, mostrando ser uma excelente ferramenta nos estudos da radioecologia.

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2.2.1. Teste do Microncleo (MN)

Microncleos so corpsculos similares em estrutura ao ncleo, constitudo de uma pequena massa nuclear delimitada por membrana e separada do ncleo principal. Podem ser formados a partir de perdas de fragmentos acntricos; por uma variedade de consequncias mecnicas de quebra e troca cromossmica e por perda de cromossomos inteiros (HEDDLE et al., 1991). Assim sendo, o microncleo representa perda da integridade da cromatina em consequncia de dano cromossmico estrutural (fragmento) ou dano no aparelho mittico, sendo agentes genotxicos um dos provveis causadores destes danos. (VILLELA, 2006b) O teste do MN um ensaio tecnicamente simples que permite a deteco da ao de agentes clastognicos (que quebram cromossomos) e aneugnicos (que induzem aneuploidia ou segregao cromossmica anormal), sendo considerado um excelente biomarcador. Amplamente utilizado h vrios anos, sendo, portanto, bem validado para um grande nmero de substncias testadas. uma tcnica de triagem rpida e de baixo custo, adequada para avaliar a exposio de peixes marinhos e de gua doce a contaminantes (CLUS et al., 2002). O aspecto mais importante do teste do microncleo que ele permite identificar eventual aumento na frequncia de danos genticos em clulas que so expostas variados agentes genotxicos, sendo capaz de expressar os danos nos cromossomos na forma de MNs. Assim, esse teste originalmente, entre os testes citogneticos, o que fornece uma medida de confiana da perda do cromossomo e da ruptura do fuso mittico (FENECH, 1998).

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O teste do microncleo, ao lado da anlise de aberraes cromossmicas e o ensaio do Cometa, considerado o padro-ouro dentre os mtodos citogenticos. Tem sido amplamente utilizado em programas de biomonitoramento, e considerado uma valiosa ferramenta para avaliar exposies de organismos aquticos a substncias genotxicas. O teste do microncleo um importante sinalizador precoce de danos com consequncias irreversveis (FREIRE, 2008). Diante do que foi mostrado e da escassez de trabalhos utilizando animais dulccolas, v-se necessrio a padronizao de uma tcnica sensvel, como o teste do MN, para detectar a ao de agentes mutagnicos qumicos e fsicos.

2.3 Biomphalaria e sua utilizao como bioindicador

O caramujo Biomphalaria tem sua classificao taxonmica descrita segundo Rey (2001) como demonstrado no fluxograma a seguir:

Figura 2 Classificao taxonmica de Biomphalaria glabrata, segundo Rey (2001).

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Os moluscos Biomphalaria glabrata so de gua doce, possuem conchas grandes em geral discides, enroladas em espiral plana, sem oprculo, na qual se forma de cada lado uma depresso que lembra um umbigo (Figura 3A). Nos criadouros naturais so encontrados exemplares com tamanho entre 1 a 2,5 cm, apresentando conchas com 4 a 6 giros (Figura 3 -B) (REY, 2001)

Figura 3 (A) Biomphalaria glabrata (SAY, 1818) melnico. (B) Concha do molusco B. glabrata1. Fonte: http://www.elrincondelmalacologo.com. Dentre os invertebrados, o filo Mollusca mostra evolues nos sistemas que no aparecem nos outros filos. Fazendo uma breve descrio dos sistemas desses animais, podemos citar o sistema excretor que composto de uma estrutura alongada denominada rim que tem um curto ureter. Ao longo de todo o rim observa-se uma prega mucosa, saliente e pigmentada, denominada crista renal (REY, 1991; NEVES, 2004). A respirao feita por dois rgos: o saco pulmonar e as pseudobrnquias, embora o rgo respiratrio principal seja o saco pulmonar (PESSA; MARTINS, 1988; REY, 1991; CIMERMAM;

CIMERMAM, 2001; NEVES, 2004). A principal evoluo do filo mollusca o desenvolvimento de um sistema nervoso primitivo, ausente nos demais filos de invertebrados (BARNES, 1996). Nos gastrpodes, o sistema nervoso formado por gnglios que ficam dispostos em torno do esfago, atrs do saco bucal. Os rgos dos sentidos so: um par de olhos, um receptor olfativo (osfrdia), um par de rgos do equilbrio e 26

orientao locomotora (otocistos), receptores de contato sob a forma de elementos sensitivos (ex.: tentculos); alm de quimioreceptores

morfologicamente diferenciados ou no, denominados rinforos (REY, 1991; CIMERMAM; CIMERMAM, 2001). O aparelho digestivo desses animais comea com a abertura bucal, localizada, por vezes, na extremidade da tromba; espessamentos cuticulares denominados mandbulas, e um par de glndulas salivares que se abrem na cavidade bucal (REY, 1991). No interior do saco bucal encontra-se a rdula, fita alongada e revestida de numerosos dentes quitinosos, cujos dentculos, em forma de ganchos, tm as pontas dirigidas para trs (PESSA; MARTINS, 1988). A rdula faz com que os alimentos sejam ralados e ao mesmo tempo dragados em direo ao esfago (REY, 1991). Alguns autores consideram a rdula como estrutura responsvel pela ecloso dos ovos embrionados, sendo assim classificada como um rgo radiossensvel (MELO, 1998). Os resduos da digesto so evacuados pelo intestino, onde ocorre tambm a reabsoro de gua (REY, 1991). Essa evacuao ocorre ao nvel da pseudobrnquia (PESSA; MARTINS, 1988). Esses moluscos so seres hermafroditas, com gnada nica em forma de cacho, providas de numerosos cinos, denominadas ovoteste, onde vulos e espermatozides formam-se lado a lado (PESSA; MARTINS, 1988; REY, 1991; MONTEIRO; KAWANO, 1998; CIMERMAM; CIMERMAM, 2001). Experimentos realizados por Paraense (1970) e Rozemberg (1989) demonstraram que quando estes moluscos esto em colnia a forma de reproduo preferencial a fecundao cruzada, porm podem mudar sua forma de reproduo para autofecundao, principalmente quando as circunstncias ambientais so severas. Poucos relatos so encontrados na literatura sobre a presena de um rgo hematopoitico especializado nos moluscos gastrpodes e bivalves, 27

existindo uma indicao de que nestes animais as clulas da hemolinfa so formadas por todo o corpo. A presena de amebcitos (hemcitos) est dividida entre a circulao sangunea e o tecido conectivo, o que favorece o grande sucesso adaptativo destas espcies, que ocupam posio de destaque no filo Mollusca (SOUZA, 2006; GEORGE; FERGUSON, 1950; BROWN; BROWN, 1965). O sistema circulatrio desses animais composto por corao com duas cavidades: aurcula e ventrculo. O sangue ou hemolinfa compe-se de elementos amebides (hemcitos), plasma rico em gua, cloreto de sdio, bicarbonatos e hemoglobina dissolvida, contendo ferro que permite a utilizao do oxignio dissolvido baixa tenso (PESSA; MARTINS, 1988; REY, 1991; VERRENGIA GUERRERO et al., 1997). Os hemcitos (Figura 4) so as principais clulas efetoras do sistema de defesa do caramujo, fagocitando, encapsulando e destruindo agentes infecciosos (JEONG et al., 1983). Como o sistema circulatrio aberto, os hemcitos podem se mover livremente para dentro e fora dos tecidos (VAN DER KNAAP; LOKER, 1990).

Figura 4 Hemcito de B. glabrata, corados com DAPI e observados no microscpio de fluorescncia (aumento 1000X). 28

Os

hemcitos

so

clulas

morfolgica

bioquimicamente

heterogneas e podem ser dividas em hialincitos que tm ncleo proprocional ao tamanho do citoplasma, possuem poucas estruturas lisossomais e mostram baixa tendncia de formar pseudpodes ou fagocitar partculas (Figura 5 A). Outro tipo so os chamados de granulcitos que tem mais citoplasma e lisossomos, formam pseudpodes e fagocitam ativamente (Figura 5 B) (KNAAP & LOKER, 1990).

Figura 5 (A) Hialincitos corados com Giemsa (1000 X); (B) Granulcitos corados com Giemsa (1000 X).

Podemos citar ainda outra caracterstica destes moluscos, que o poder de adaptao a variaes ambientais, ou seja, vivem em regies de florestas tropicais e em zonas ridas, sobrevivem em baixas e altas altitudes, porm, geralmente habitam cursos dgua de pouca velocidade, lagos e colees de gua parada; suportando variao de pH entre 5,8 e 9,0 (JUBERG et al., 1987) O gnero Biomphalaria encontrado em vrios pases do mundo e no Brasil j foram estudadas e identificadas 10 espcies, so elas: B. glabrata, B. tenagophila, B. straminea, B. amaznica, B. peregrina, B. occidentale, B. intermedia, B. schrammi, B. oligoza e B. kuhniana. (CARVALHO, 1992; REY, 29

2001). Dentre estas destacamos as trs primeiras como principais hospedeiras intermedirias do S. mansoni, agente causador da esquistossomose mansnica, doena endmica no Brasil e em 70 pases do mundo (PARAENSE, 1972). Vrios estudos mostraram que uma opo para eliminar ou diminuir a populao de moluscos utilizar a radiao ionizante com o objetivo de esterilizar estes animais, diminuindo consequentemente o nmero de espcimes no meio, reduzindo assim a proliferao da esquistossomose (PERLOWAGORA-

SZUMLEWICZ, 1966; FARVAR; CEMBER, 1969; CANTINHA, 2008). Aps estes estudos, vrios achados sobre a biologia de B. glabrata foram desvendados, dando origem a novas linhas de pesquisas. Dentre elas vem recebendo destaque a utilizao destes moluscos como indicadores de poluio ambiental qumica ou causada por agentes fsicos, como a radiao ionizante (ESTEVAM et al., 2006, SILVA et al., 2008; NAKANO et al., 2003) Podemos citar primeiramente o trabalho de Okazaki et al. (1996), que utilizando embries destes moluscos, verificou que, aps a exposio a radiao gama de
60

Co, foi possvel verificar malformaes especficas da presena de tal

agente. Melo (1998), tambm irradiando embries de B. glabrata demonstrou que os mesmos respondem de forma diferente a crescentes doses de radiao ionizante. Portanto, o desenvolvimento de tcnicas mais sensveis tornou-se um objetivo entre os pesquisadores da rea. Nakano et al. (2003) adaptou o teste do letal dominante, utilizado primeiramente em mamferos, para moluscos adultos de B. glabrata. Neste experimento foram utilizados agentes qumicos, mitomicina c e ciclofosfamida, sendo utilizadas as linhagens albina e pigmentada do B. glabrata, para deteco de mutaes ligadas ao alelo dominante nos cruzamentos. Com este experimento, foi comprovado que os espcimes adultos tambm apresentam sensibilidade a substncias mutagnicas. O teste do letal dominante passou a ter diversificadas aplicaes, como a deteco da ao da radiao
60

Co (TALLARICO et al, 2003), e ao de 30

herbicidas utilizados na agricultura e testados em laboratrio (ESTEVAM et al. 2006, SILVA et al, 2008; S, 2008) demonstrando a possibilidade do uso do molusco adulto da espcie B. glabrata como biondicador de poluio ambiental por agentes mutagnicos. Porm esta tcnica possui como limitao a demora para a obteno dos resultados, o que torna necessrio procurar tcnicas mais eficazes, de baixo custo e de resposta mais rpida. Outro teste de mutagenicidade padronizado foi o ensaio cometa em caramujos de gua doce Biomphalaria glabrata (GRAZEFFE, 2008). O experimento foi realizado objetivando detectar danos nos DNA de hemcitos circulantes. Para isto, caramujos adultos foram irradiados com doses nicas de 2,5; 5; 10 e 20 Gy de radiao gama de
60

Co. Os resultados demonstraram que

os efeitos genotxicos da radiao ionizante foram detectados em todas as doses utilizadas. O ensaio cometa em B. glabrata demonstrou ser mais uma ferramenta na avaliao desses efeitos genotxicos no ambiente (GRAZEFFE, 2008). No entanto, essa tcnica possui como principal limitao s ser possvel realizar a anlise pontual do dano no DNA da clula, no mensurando danos de uma gerao celular para outra. O teste do MN foi realizado in vivo e in vitro com a ostra Crassostrea gigas para avaliar a efeitos genotxicos do meio ambiente aqutico. Os testes in vitro foram realizados em adultos e jovens expostos ao benzo [a] pireno (BaP) e a gua de um efluente do rio Sena nas concentraes de 5, 50, 75 e 100%, um dos locais mais contaminados da Frana. A freqncia de MN foi observada aps 48 horas de exposio, para os dois poluentes. Observou-se que a frequncia de microncleos no foi muito sensvel a diferentes graus de poluio, mas mostrou alta variabilidade interindividual (BURGEOT, 1995). Godoy (2008) utilizou os mexilhes Perna perna na regio da ilha de Cabo Frio, Arraial do Cabo, cerca de 100 km a nordeste da cidade do Rio de Janeiro, como indicador de poluio por metais pesados
210 210

Po/210Pb. Os

resultados demonstraram que a hemolinfa apresentou uma concentrao mdia de Po de 155 Bq.kg-1 na rea contaminada. A dose de radiao no teve

qualquer efeito observvel sobre a frequncia de MN e quebra do DNA no 31

mexilho, provavelmente devido baixa taxa de dose utilizada, j que o limite de dose sugerido foi de 10 mGy e o utilizado foi de 0,02 mGy. Pavlica (2000) analisou a freqncia de MN, induzida por

pentaclorofenol em hemcitos do mexilho zebra, Dreissena polymorpha e nos gastropodas Planorbarius corneus. Os resultados obtidos sugeriram que hemolinfa das duas espcies proporcionam um bom teste tecidual para avaliao ambiental de genotoxicidade. Villela (2006a) analisou a sensibilidade do mexilho dourado, Limnoperna fortunei, expondo as clulas radiao ultravioleta, sulfato de cobre e pentaclofenol. Todos os compostos utilizados induziram danos, gerando uma curva dose-resposta. Os testes de genotoxicidade, como o estudo das aberraes cromossmicas e o teste do microncleo, j so utilizados como biomarcadores da ao da radiao em clulas de mamferos (AGER et al., 1990; FORAY; MALAISE, 1995; ZHOU et al.,1997) e vm se mostrando como boa alternativa para anlise da ao dos agentes fsicos e qumicos sobre moluscos marinhos (MAJONE et al., 1990; BOLOGNESI et al., 1999), porm nenhum dado foi encontrado na literatura especializada sobre estes testes em moluscos dulccolas expostos a radiao ionizante ou a agentes qumicos. Esta lacuna nos motivou a investigar a possibilidade de se utilizar B. glabrata como um bioindicador de poluentes qumicos e fsicos ambientais. Isto de suma importncia para a monitorao de meios ambientais que sejam circunvizinhos de reas onde haja risco ambiental, como indstrias qumicas, indstria petrolfera e usinas nucleares.

32

3. METODOLOGIA

3.1. Criao e Manuteno dos Moluscos

Os moluscos utilizados nos experimentos foram Biomphalaria glabrata (melnicos) oriundos de So Loureno da Mata PE e mantidos no moluscrio do Departamento de Biofsica e Radiobiologia da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), em aqurios plsticos, com volume de aproximadamente 20 litros de gua filtrada, declorada (filtro Bellaforte), pH em torno de 7,0 e temperatura de 25oC 2oC. A limpeza dos recipientes ocorreu 3 vezes por semana e a alimentao foi realizada diariamente com alface fresca orgnica, cultivada livre de agrotxicos (Figura 6).

Figura 6 Aqurios de criao de moluscos B. glabrata do moluscrio do Departamento de Biofisica e Radiobiologia-UFPE.

33

3.2. Seleo dos moluscos

Para realizao dos experimentos foram selecionados moluscos B. glabrata pigmentados e adultos jovens. Os animais primeiramente foram acondicionados em aqurios individuais, com capacidade de 180 mL (Figura 7A), e observados por cinco dias consecutivos, para comprovao de maturidade sexual por meio da oviposio. Durante este perodo foram selecionados os moluscos que apresentaram as seguintes caractersticas: a) Adulto jovens, sexualmente maduros, constatado pela

produo de desovas com embries saudveis sem malformaes; b) Dimetro da concha superior a 10 mm, medidos com

paqumetro (Figura 7 B); c) Idade mnima de 2 meses.

Ao trmino destas etapas, foram selecionados 50 animais.

Figura 7 (A) Recipientes individuais de B. glabrata; (B) Molusco, com dimetro da concha superior a 10 cm.

34

3.3. Irradiao de Moluscos Adultos

Os moluscos selecionados foram separados em grupos com 10 animais para cada dose de radiao. A exposio foi realizada na fonte Gammacell
60

Co (modelo 220 Excel- MDS Nordion) do Departamento de

Energia Nuclear da UFPE, com a taxa de dose de 6,912 kGy/h (Janeiro de 2010) (Figura 8-A). As doses utilizadas no experimento foram, 25, 35, 45 e 55 Gy e o controle no irradiado. As doses aplicadas foram estabelecidas levandose em considerao trabalhos anteriores realizados no Laboratrio de Radiobiologia do Departamento de Biofsica e Radiobiologia da UFPE (SILVA, 2008; CANTINHA, 2008; CANTINHA, 2010), onde os efeitos observados no foram letais nem possveis de serem analisados morfologicamente. Para proceder s irradiaes os moluscos foram acondicionados em tubos de ensaio plstico de 50 mL (tipo: FALCON) (Figura 8 B), separados por finas camadas de gazes midas, para evitar a dessecao dos animais, e em seguida levados fonte Gammacell. Todos os grupos experimentais inclusive o grupo controle foram mantidos nas mesmas condies de temperatura, umidade e estresse. Aps a irradiao, os grupos de moluscos foram acondicionados em recipientes contendo 250 ml de gua.

35

Figura 8 (A) Fonte Gammacell 220 Excel-MDS Nordion. (B) Tubos Falcon contendo B. glabrata para exposio s doses de radiao.

3.4 Teste do Microncleo em moluscos B. glabrata

O procedimento de preparao das lminas para anlise de microncleo foi realizado de acordo com o padronizado por Pavlica (2000) com algumas modificaes. Decorrido 48 horas aps a irradiao dos animais, procedeu-se a coleta da hemolinfa do molusco B. glabrata. Para a coleta da hemolinfa, foram feitos sucessivos toques com uma micropipeta na regio podal do animal. A manipulao desta regio causa uma reao de retrao do corpo do animal para a regio interna da concha. Com essa retrao o animal libera a hemolinfa que prontamente coletada com o auxlio de uma micropipeta (PAVLICA, 2000).

36

A hemolinfa coletada foi gotejada sobre a lmina de microscopia (marca Bioslide) e em seguida foi adicionado o mesmo volume de soluo de EDTA a 10 mM com Ringer e incubadas por 30 minutos em cmara mida. Decorrido o tempo de espera, as clulas foram fixadas com uma soluo de glutaraldeido a 1% com Ringer, ficando nessa soluo por 5 minutos. Em seguida as clulas foram enxaguadas com Ringer. Para proceder a observao das clulas foi utilizado os mtodos de colorao Giemsa e por fluorescncia.

3.4.1. Colorao Giemsa (convencional)

Utilizou-se uma soluo de corante Giemsa (Merck) em tampo fosfato de pH 6.8, com concentrao final de 5%. As lminas foram submersas nesta soluo por 5 minutos, posteriormente lavadas com gua destilada e colocadas para secagem em temperatura ambiente. A observao das lminas j coradas foi realizada no microscpio ptico (Medilux) (Figura 9) com aumento de 1000 vezes.

37

Figura 9 Microscpio ptico Medilux do laboratrio de Radiobiologia (DBR-UFPE)

3.4.2. Colorao por fluorescncia

Para realizar a anlise dos hemcitos por fluorescncia as lminas observadas na microscopia ptica foram descoradas com soluo de etanol e cido actico (3:1). Em seguida as lminas descoradas foram coradas por corante Hoechst 33258 na concentrao de 1g/ml. Primeiramente foram gotejadas 20 L da soluo do Hoechst sobre a lmina e, em seguida, a lmina foi coberta com uma lamnula que proporcionou 38

um espalhamento uniforme do corante sobre a lmina. Aps estes procedimentos, as lminas foram colocadas em cmara escura por 30 minutos. Terminado este perodo a lamnula foi retirada e a lmina lavada com gua destilada. As lminas foram montadas com meio de montagem Glycerol-Mcilavaine (1:1), sendo colocadas novamente em cmara escura a 4 por trs dias. Decorridos os trs C dias as lminas foram analisadas no microscpio de fluorescncia (Leica CW4000) (Figura 10) utilizando os comprimentos de onda de 358 nm (excitao) e 461 nm (emisso).

Figura 10 Microscpio de Fluorescncia Leica CW4000 do Lambda (DEN-UFPE).

3.5. Anlise das lminas

A avaliao da Freqncia de MN foi realizada de acordo com o descrito por PAVLICA et al. (2000), com algumas adaptaes. A freqncia de 39

MN foi obtida visualmente, por meio de microscpio com auxlio de um contador de clulas. Foram analisadas em mdia 780 clulas por lmina, sendo realizadas cinco rplicas de cinco animais. Os microncleos foram identificados segundo critrios demonstrados na Figura 11.

Figura 11 Esquema com os critrios de identificao de MN; (A) Dimetro menor que 1/3 do tamanho do ncleo; (B) Cor e textura semelhante ao ncleo; (C) No estar em contato direto com o ncleo.

3.6. Anlise estatstica

A anlise estatstica da frequncia de MN entre os grupos foi realizada por meio do teste do qui-quadrado, nvel de significncia de 5% e p<0,05, utilizando o programa BioEstat, verso 5.0 (AYRES et al., 2007). As anlises entre as mdias dos nmeros de hemcitos por dose foram realizadas utilizando a ANOVA e o teste de Tukey com nvel de significncia de 5% e p<0,05.

40

4 Resultados e Discusso

A hemolinfa de Biomphalaria glabrata expostos a alta dose de radiao gama microncleos.

60

Co foi analisada quanto a radiossensibilidade e a frequncia de

4.1 Anlise da radiossensibilidade celular dos hemcitos de B. glabrata

Pode-se observar na Tabela 1, o nmero total de hemcitos originrios dos moluscos B. glabrata expostos as doses de 25, 35, 45 e 55 Gy de radiao gama de 60Co e no expostos (controle).

Tabela 1 - Hemcitos originrios dos moluscos irradiados e no irradiados.

Dose (Gy) 0 25 35 45 55

Nmero total de Hemcitos 5042 4442 3334 4799 5678

Conforme demonstrado na Tabela 1, a hemolinfa dos animais irradiados com as doses de 25, 35 e 45 Gy apresentaram nmero de hemcitos inferior ao grupo controle (0 Gy), sendo a dose de 35 Gy a que apresentou o menor nmero de clulas por lminas analisadas ( 1000 por lminas). A hemolinfa dos animais expostos a dose de 55 Gy apresentou aumento do nmero 41

de hemcitos em relao aos demais grupos experimentais e controle. Utilizando o teste estatstico ANOVA percebemos que as mdias do nmero de clulas para Dose de 35 e 55 Gy so significativamente diferentes a nvel de 5%. Os resultados sugerem a existncia de um comportamento de defesa diferenciado entre os grupos de moluscos irradiados com altas doses de radiao gama de
60

Co. Cantinha et al. (2010), analisando os efeitos de altas doses de

radiao gama sobre a fecundidade B. glabrata observou que o nmero de embries produzidos por moluscos irradiados variavam de forma independente da dose. Outro aspecto observado por Cantinha (2010) foi que a exposio a dose de 40 Gy apresentou o menor nmero de embries em relao ao controle, enquanto que na exposio dose de 60 Gy aconteceu o inverso, ou seja, essa dose apresentou o maior nmero de clulas do grupo experimental em relao ao controle. Estes dados se assemelham aos encontrados no presente trabalho que apresentou aumento no nmero de hemcitos na dose de 55 Gy e uma diminuio na dose de 35 Gy. Pode-se observar nos presentes experimentos que apesar do aumento do nmero de hemcitos aps a exposio dos moluscos a dose de 55 Gy, a viabilidade destas clulas pode ser questionada, pois foram encontradas diversas alteraes morfolgicas que a inviabilizam. Cantinha (2010) em seus experimentos tambm demonstrou que a dose de 60 Gy, prxima a utilizada em nosso experimento, tambm apresentou maior nmero de embries e maior inviabilidade celular. Segundo Segreto (2000) os diferentes tipos de tecidos possuem respostas distintas radiao ionizante. A comparao da radiossensibilidade de diferentes linhagens celulares indica que as clulas que se dividem rapidamente so mais radiosensveis que as de reproduo lenta (lei de Bergoni e Tribondeau), embora esta regra tenha excees (linfcitos e alguns melanomas). Quando analisamos a radiossensibilidade dos hemcitos de B. glabrata irradiados podemos verificar que todos os grupos experimentais mostraram alteraes no nmero de clulas e alteraes estruturais das clulas. Estas modificaes seguem o princpio da lei mencionada anteriormente. 42

Durante a anlise dos resultados foram observadas diferentes alteraes morfolgicas nos hemcitos dos moluscos submetidos s doses de 35, 45 e 55Gy de radiao gama. Estas modificaes consistem na formao de ncleo bilobulado e pontes nucleoplasmticas, como vistos na Figura 12

Figura 12 Alteraes encontrados na hemolinfa de B. glabrata irradiados nas doses de 35, 45 e 55 Gy. (A) Ncleo bilobulado; (B) pontes nucleoplasmticas (evidenciada pela seta vermelha).

Experimentos realizados por Zafalon-Silva (2008), com peixes dulccolas da especie Astyanax spp., Teleostei: Characidae expostos a poluentes presentes no Arroio Padre Doutor (RJ) demonstraram que as clulas eritrocitrias, presentes no sangue perifrico apresentaram ncleo bilobulado, semelhantes as clulas encontradas no nosso trabalho. Martins (2003) encontrou anormalidades nucleares e aumento da frequncia de microncleo em clulas da mucosa bucal de indivduos fumantes e no- fumantes e observou que 96% dos fumantes apresentaram deformidades nucleares, como clulas binucleadas, brotos nucleares e pontes

nucleoplasmticas, resultados esses tambm encontrados no presente trabalho. Fenech (2000) descreveu a formao de pontes nucleoplsmaticas em linfcitos, originadas provavelmente quando os centrmeros de cromossomos dicntricos so puxados para plos opostos durante a anfase e o DNA resultante 43

da ponte recoberto pelo envoltrio nuclear. Essa alterao celular descrita pelo autor pode ter sido o mesmo fator que acarretou a formao de pontes nucleoplsmaticas nos hmocitos de B. glabrata. Sugere-se que estas alteraes nucleares sejam decorrentes da ao de agentes fsicos e qumicos sobre as clulas causando mutagenicidade. Outra alterao celular foi exclusivamente observada durante a anlise microscpica dos hemcitos originrios dos caramujos expostos a dose de 55 Gy. Os hemcitos apresentaram ncleo disforme e inmeros vacolos no citoplasma celular alm de marginalizao da cromatina formando densos agregados (Figura 13).

Figura 13 Apoptose em hemcitos de Biomphalaria glabrata submetidos a 55 Gy de radiao gama de 60Co.

Estas caractersticas so sugestivas de induo de apoptose celular. Estudos realizados por Pavlica et al. (2000) com bivalve (D. polymorha) e o gastropoda (P. corneus) expostos ao pentaclorofenol (PCP) nas concentraes de 450 e 600 g/l, tambm detectou clulas com as mesmas caractersticas, sugerindo, tambm, que se tratava de apoptose celular. Pavlica (2000) sugeriu que a apoptose dos hemcitos ocorreu devido a ao do PCP inibindo as bomba

44

de Ca2+. Sabe-se que uma das causas da apoptose est ligada aos nveis de clcio dentro da clula (FAWTHROP, 1991; TRUMP, 1996). O estmulo para apoptose radioinduzida parece estar relacionado ao nmero de quebras produzidas no DNA, a taxa com que elas ocorrem e a rapidez e eficincia do sistema de reparo (CARSON et al., 1986). Presumindo que o DNA seja o alvo inicial para apoptose radioinduzida, a resposta celular ao dano na forma de reparo do DNA pode levar morte celular (STORY et al., 1992; KANE et al., 1995). Desta forma, sugere-se que a apoptose surgida nos hemcitos irradiados ocorreu devido a ao da radiao sobre o DNA da clula. As diversas alteraes nucleares citadas, no foram os nicos achados experimentais neste trabalho. Observamos tambm que a radiao ionizante induziu outras alteraes no DNA, demonstrada a seguir, pela anlise da frequncia de MN.

4.2. Anlise da frequncia de microncleo

Na tabela 2 observa-se a frequncia de MNs detectada nos hemcitos dos moluscos irradiados e no-irradiados. Tabela 2 Dados da Frequncia de Microncleos de B. glabrata submetidos a radiao gama de 60Co
Dose (Gy) 0 25 35 45 55 Frequncia de Microncleo 0,007019 0,024802 0,024583 0,036279 0,023070

45

Foi observado um aumento da frequncia de microncleo em todos os moluscos expostos a radiao gama em relao ao controle. O teste do quiquadrado (2) demonstrou diferenas estatisticamente significativas (p<0,05) entre a freqncia de microncleos dos hemcitos controle e os irradiados. A dose de 45 Gy apresentou a maior freqncia de microncleo quando comparada s outras doses de radiao, mostrando maior significncia em relao ao controle (p = 0,0002). Apesar de ficar demonstrado que aps a irradiao observou-se um aumento da freqncia de MN em relao ao grupo controle, este aumento no ocorreu de maneira dose-dependente. Estudos realizados por Wojcik (2000), irradiando cultura de linfcitos humanos com doses de 0; 0,1; 0,25; 0,5; 1 Gy em fonte Co60, com taxa de dose de 0,25 Gy/min, observou que houve aumento da frequncia de microncleo de maneira dose-dependente, comportamento diferente do encontrado no presente trabalho. Este fato pode ter ocorrido devido a utilizao de fontes com diferentes taxas de dose. No presente trabalho foi usada uma fonte de
60

Co com taxa de

dose de 6,912 kGy/h, enquanto que no experimento de Wojcik (2000) a taxa de dose foi de 0,25 Gy/min (0,015 kGy/h). Existem princpios que regem a radiobiologia que esclarecem os fatos acontecidos, ou seja, existe uma relao dose-efeito, onde o surgimento de uma radioleso depende da

radiossensibilidade da estrutura biolgica e o tempo de exposio radiao, ou seja, quanto menor o tempo de exposio, menores sero os efeitos causados pela radiao. A cultura de linfcito apresentou maior sensibilidade a radiao quando comparada aos hemcitos, porm os hemcitos foram coletados de indivduos expostos e no de cultura de clulas. Podemos concluir que os hemcitos apresentaram radiossensibilidade a exposio a radiao ionizante, porm mostraram-se incapazes de detectar diferena entre as doses de radiao utilizada. Sabe-se que o sistema hematopoitico um dos mais

radiossensveis, por isso a exposio de indivduos a irradiao de corpo inteiro pode apresentar diferentes efeitos biolgicos. Estudos de dosimetria biolgica utilizam linfcitos para verificar os efeitos biolgicos sofridos por indivduos 46

expostos acidentalmente ou ocupacionalmente radiao (FERNANDES, 2005; BRAGA, 2006; FERNANDES, 2008b). Observou-se no presente trabalho que os moluscos apresentaram um comportamento semelhante, pois as clulas de defesa (SOUZA, 2006), os hemcitos, tambm sofrem mudanas morfolgicas e presena de MNs quando expostas a radiao ionizante, sugerindo assim viabilidade da sua utilizao no biomonitoramento ambiental. Nenhum dado sobre freqncia de MN em B. glabrata irradiado foi encontrado na literatura. Porm estudos realizados com outras espcies de moluscos expostos a diferentes agentes qumicos avaliaram que a freqncia de MN pode ser utilizada na monitorao de ambientes aquticos (SCARPATO et al., 1990; BATEL et al., 1994 ; AL-SABTI, 1995).

O trabalho realizado por Pavlica (2000) exps moluscos bivalves D. polymorpha e o gastropoda P. corneus ao agente mutagnico pentaclorofenol, na concentrao de 150 g/L. Os resultados demonstraram que aps 4 dias de exposio, a frequncia de MN em D. polymorpha e P. corneus aumentou significativamente; concluindo que a hemolinfa de ambas as espcies representou um teste eficaz na avaliao de genotoxicidade ambiental.

Villela (2006 b ), utilizando Limnoperna fortunei (mexilho dourado) para deteco da poluio (genotoxicidade) ambiental de diferentes substncia qumicas na bacia do lago Guaba no Rio Grande do Sul, percebeu em suas anlises que a frequncia de microncleo variou entre 0,003 a 0,006 microncleos, concluindo que Mexilho Dourado tem potencial para ser utilizado como bioindicador de contaminao ambiental.

David (2007) utilizou moluscos bivalves da espcie Mytella falcata como bioindicador de poluio, j que esse molusco encontrado em trs pontos do esturio de Santos com diferentes nveis de substncias potencialmente poluidoras. Os moluscos foram analisados com a finalidade de caracterizar os danos causados pela poluio nesses pontos. Foram utilizados diversos testes, entre eles o teste do microncleo, que detectou nos trs pontos altos nveis de 47

poluio. O trabalho demonstrou como a ao antrpica bastante prejudicial ao meio ambiente. Por isso existe a necessidade de dispormos de organismos bioindicadores de genotoxicidade em diversos habitats para a avaliao dos danos causados para o homem e o meio ambiente.

Outros trabalhos foram realizados utilizando o B. glabrata como bioindicador de radiao ionizante em ambientes aquticos, no entanto esses trabalhos avaliaram os aspectos macroscpicos como alteraes na fecundidade, fertilidade e mortalidade dos moluscos (MELO, 1998; SILVA, 2008; CANTINHA, 2010), porm alteraes celulares no foram percebidas por estes testes. Portanto, os resultados encontrados em nossos experimentos utilizando hemcitos de B. glabrata sugerem uma nova ferramenta que anlise efeitos biolgicos sofridos pela molcula do DNA aps a exposio a radiao e provavelmente a outros agentes genotxicos presentes em ambientes aquticos.

4.3. Comparao entre Metodologias de Colorao

As metodologias de colorao com o corante convencional Giemsa e o corante de fluorescncia Hoechst 33258, tiveram a finalidade de identificar e confirmar a presena de MN na hemolinfa do B. glabrata. (Figura 14).

Observamos que ambas as metodologias de colorao apresentaram imagens que nos permitiram analisar microncleo e anormalidades celulares de forma precisa. Porm, os resultados obtidos pela colorao com Giemsa foi mais eficaz, pois alm de identificar as clulas de forma clara, a tcnica de fcil manuseio, baixo custo e rapidez na preparao e anlise das clulas.

Para a confirmao de que as clulas observadas com a colorao Giemsa eram de fato microncleos, as lminas foram novamente coradas com o corante Hoechst 33258. A colorao com Hoechst 33258 confirmou que os 48

corpsculos encontrados se tratavam de microncleos, como mostrado na Figura 14 B.

Figura 14 (A) Hemcito corado com Giemsa; (B) Hemcito corado com Hoechst 33258. A seta vermelha indica MN.

Um dos principais motivos de utilizar a metodologia de fluorescncia que estes corantes se ligam a molculas especficas dos tecidos (Dietz, 2000). O corante Hoechst 33258 cora, especificamente, as ligaes de adenina-timina do DNA, fazendo com que essa colorao sirva de comprovao do teste, j que o DNA est presente no ncleo das clulas e os MN so originrios do ncleo (www.sigmaaldrich.com).

Na tabela 3 so apresentadas as vantagens e limitaes dos corantes utilizados no teste.

49

Tabela 3 - Vantagens e limitaes das tcnicas de colorao Giemsa e Hoechst 33258; Tcnica Giemsa Vantagens Baixo custo Fcil manuseio Eficincia nas anlises de MN DNA especfico Teste confirmativo Tcnica dispendiosa Manuseio laborioso As anlises causam fadiga ocular Limitaes No DNA especfico Forma grnulos

Hoechst 33258

Pavlica (2000) utilizou tambm o corante Hoechst 33258, para deteco de MN em bivalves e gastrpodes, obtendo resultados semelhantes ao do presente trabalho. Dietz (2000), em sua pesquisa para deteco de MN na mucosa esofgica humana e sua relao com fatores de risco ao cncer de esfago, utilizou o corante fluorescente acridine orange, que cora especificamente DNA e RNA. Em seu experimento o corante de fluorescncia foi bastante eficaz, corando as estruturas requeridas pelo autor e apresentando imagens satisfatrias, demonstrando que a utilizao de corantes fluorescncia foi uma boa tcnica para testes de confirmao de MN. Fernandes (2008a), em estudo comparativo de coloraes utilizadas na dosimetria biolgica, utilizando os mtodos de colorao de Giemsa, bandeamento C, DAPI e FISH, concluiu que os mtodos mais eficazes para ser utilizado na rotina laboratorial so o mtodo de colorao de Giemsa e o DAPI.

50

Portanto podemos observar que as coloraes utilizadas neste trabalho se mostraram eficazes na identificao dos MNs sendo a colorao com Giemsa a mais simples de ser realizada e menos dispendiosa.

5 CONCLUSO Os dados obtidos com a irradiao dos moluscos Biomphalaria glabrata adultos com doses de 25, 35, 45 e 55 Gy de radiao gama de permitiu concluir que Moluscos adultos de B. glabrata se mostraram sensveis aos efeitos da radiao gama de 60Co; Moluscos irradiados com 35 Gy apresentaram menor nmero de hemcitos, enquanto que os expostos a 55 Gy uma maior quantidade destas clulas; Os hemcitos dos moluscos irradiados apresentaram alteraes morfolgicas e celulares nas doses de 35, 45 e 55 Gy. A dose de 55 Gy foi a mais radiotxica, j que apresentou alteraes nucleares e a presena de apoptose; A freqncia de microncleo foi maior para todos animais irradiados quando comparado ao controle, podendo ser utilizada como indicador de radiao ambiental. Ambas as coloraes utilizadas no presente trabalho se mostraram eficazes na identificao dos MNs, porm a colorao com Giemsa mais simples de ser aplicada e de menor custo. Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram o incio da padronizao da tcnica do microncleo em Biomphalaria glabrata como um bioindicador ambiental da ao de agentes fsicos e qumicos.
60

Co,

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