MTODOS PARA ESTUDO DAS CLULAS

INTRODUO

Os mtodos para estudo das clulas so bastante diversificados e o conhecimento sobre elas
progridem com o aperfeioamento das tcnicas de estudo.

Somos levados a novas descobertas cada vez que aparece um novo instrumento de trabalho ou o
aperfeioamento de um j utilizado.

O estudo da clula comeou atravs do microscpio ptico (eficiente, mas limitado).

Com o surgimento do microscpio eletrnico, houve um grande impulso para o conhecimento

das funes celulares. Sua influncia foi to grande que levou a uma reviso dos conceitos
morfolgicos de seus constituintes (tanto que, hoje a forma e a estrutura das organelas so
descritas conforme nele aparecem).

Muitos outros instrumentos e tcnicas de estudo como cultura de clulas, radioautografia, o

microscpio de fluorescncia, o microscpio eletrnico de varredura, tcnicas de criofratura e
bioqumicas, ou seja, todo o arsenal tcnico disponvel, contribuiu para ampliar o estudo das
clulas.

Os conhecimentos sobre as clulas progridem paralelamente ao aperfeioamento dos mtodos de

investigao. Inicialmente, o microscpio ptico possibilitou o descobrimento das clulas e a
elaborao da teoria de que todos os seres vivos so constitudos por clulas.

Posteriormente foram descobertas tcnicas citoqumicas que possibilitaram a identificao e a

localizao de diversas molculas constituintes das clulas. Com o advento dos microscpios
eletrnicos, que tm grande poder de resoluo, foram observados pormenores da estrutura
celular que no poderiam sequer ser imaginados pelos estudos feitos com o microscpio ptico.

FIXAO
Embora seja possvel o estudo microscpico de clulas vivas, muitas vezes h vantagem em
obter um preparado permanente (lmina) no qual as clulas ficam preservadas, isto , fixadas e
coradas para melhor demonstrar seus componentes.

Todos os preparados apresentam artefatos que so alteraes produzidas nas clulas pelas
tcnicas utilizadas.
A primeira etapa na preparao de uma amostra para exame ao microscpio a fixao. Suas
finalidades so de evitar a destruio das clulas por suas prprias enzimas (a autlise), evitar a
proliferao e atividades de bactrias, endurecer as clulas para que resistam s etapas seguintes,
aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos corantes utilizados na microscopia ptica e
aumentar o contraste na microscopia eletrnica.

Numerosas substncias qumicas e misturas so utilizadas como fixadores, um dos melhores e

mais utilizado o formaldedo.

Cada um dos fixadores simples apresenta certos inconvenientes, ao lado de algumas qualidades
desejveis. Por isso foram elaboradas as misturas fixadoras que contm propores variveis dos
fixadores simples com a finalidade de compensar-lhes as deficincias.

MICROTOMIA

Em sua maioria as clulas fazem parte de tecidos que precisam ser cortados em fatias finas. Para
obteno dos cortes a serem estudados nos microscpio ptico, os tecidos devem ser embebidos
e envolvidos por uma substncia de consistncia firme. As mais usadas so a parafina e as
resinas plsticas.

Depois de protegidos e envolvidos nesse material o tecido colocado em um instrumento

(aparelho) de corte chamado Micrtomo, nele o tecido infludo seccionado por uma navalha,
obtendo-se geralmente cortes de 1 a 6 m de espessura. Para o microscpio ptico usado o
corte com navalhas de ao.
Os cortes so colocados sobre uma lmina com pequena quantidade de albumina que serve como
adesivo. Neste ponto as amostras ainda no esto prontas para o exame ao microscpio, j que o
tecido est impregnado com parafina e o corte incolor. Remove-se ento a parafina, e o tecido
reidratado, sendo em seguida corado.

Quando se deseja estudar lipdios, evita-se o emprego de solventes graas ao uso do Micrtomo
de congelao, no qual o tecido endurecido por congelao,o que permite seu corte. Este tipo
de micrtomo e outro tipo mais elaborado e mais eficiente denominado Criostato, permitem a
obteno rpida de cortes, sem passar pelas etapas de quando se usa a parafina. So muito
utilizados em hospitais, quando se necessita de um diagnstico rpido em material patolgico.

COLORAO

Quase todas as organelas e incluses so transparentes e incolores, o que dificulta sua

observao ao microscpio. Devido a isso, foram criados numerosos processos de colorao que
tornam visveis e destacados os diversos componentes celulares.

A maioria dos corantes comporta-se como cido ou base. Nos corantes bsicos, o agrupamento
qumico responsvel pela cor ou grupamento cromforo catinico combinando com os
grupamentos cidos, os componentes dos tecidos que se coram com corantes bsicos so
chamados de basfilos. Nos corantes cidos, o cromforo aninico e tende a se combinar com
grupamentos bsicos sendo chamados de acidfilos.
chamado de metacromasia o fenmeno em que determinado corante muda de cor aps reagir
com determinado componente tecidual.

Depois de corado, o tecido deve ser desidratado novamente e coberto com uma lamnula. Assim,
a amostra est pronta para o exame microscpico.

A MICROSCOPIA PTICA
O microscpio ptico compe-se de uma parte mecnica, que serve de suporte e uma parte ptica
constituda por trs sistemas de lentes: o condensador, a objetiva e a ocular.

1. Microscpio de Campo Claro ou de Luz - basicamente composto por uma fonte de luz; um
condensador que focaliza os raios de luz sobre a amostra; um plano sobre o qual a amostra
colocada; uma lente objetiva e uma lente ocular atravs da qual a amostra pode ser visualizada
(esta, precisa ser suficientemente delgada para que a luz possa atravess-la).

Como o sistema ptico desse tipo de microscpio no revela muito contraste nas amostras no
coradas, o contraste intensificado com o uso de corante.

O fator mais significativo para uma boa imagem o poder de resoluo, que sua capacidade de
separar detalhes.

O que determina a riqueza de detalhes da imagem fornecida seu limite de resoluo e no seu
poder de aumentar o tamanho dos objetos.

2. Microscpio de Contraste de Fase - esse microscpio possibilita examinar clulas e tecidos

no corados, dotado de um sistema ptico especial que transforma diferenas de fase dos raios
luminosos em diferenas de intensidade. Assim, as diferenas de fase, tornam-se visveis, pois
so traduzidas em diferenas de intensidade luminosa facilmente perceptveis. Ele pode ser
usado de modo que as estruturas celulares apaream escuras ou claras.

Outras duas modificaes de microscpio de fase so o Microscpio de Interferncia, que

permite tambm a qualificao da massa tecidual e o Microscpio de Interferncia Diferencial
que especialmente til para avaliar as propriedades de superfcie das clulas e de outros
elementos biolgicos.

empregado em especial para o estudo de clulas vivas.

3. Microscpio de fluorescncia - Este microscpio detecta molculas com fluorescncia de

ocorrncia natural (autofluorescentes), como a Vitamina A, ou seja, as substncias fluorescentes
tm capacidade de emitir luz quando excitadas por radiaes (luz ultravioleta). Elas aparecem
como estruturas brilhantes sobre um fundo escuro. Entretanto, como as molculas fluorescentes
no so to numerosas, sua aplicao mais generalizada na revelao de fluorescncia
introduzida como na deteco de antgenos ou anticorpos nos mtodos de colorao
imunocitoqumica.

4. Microscpio de Varredura Confocal - O preparado iluminado por um delgado feixe de raios

laser que varre o corte, iluminando apenas ponto por ponto de um determinado plano da clula
realizando um "corte ptico". No somente a imagem muito ntida como tambm a clula pode
ser "cortada" durante a microscopia e as "fatias" obtidas podem utilizadas de vrias maneiras.
Geralmente as clulas so submetidas a um composto fluorescente e a luz emitida processada
num computador que envia sinais para formao da imagem na tela do monitor de vdeo. As
imagens dos "cortes" podem ser armazenadas no disco do computador e utilizadas para construir
um plano tridimensional, ou para clculos de comprimento, rea, volume e outras anlises de
acordo com a finalidade do estudo. Essas imagens podem ser arquivadas para estudos
posteriores.

5. Microscpio de Polarizao - uma modificao simples do microscpio ptico, permite

estudar certos aspectos da organizao molecular dos constituintes celulares. Nele a luz
polarizada (que vibra numa nica direo) passa atravs da amostra e detecta orientao
molecular no seu interior. As substncias cristalinas e as molculas fibrosas bem ordenadas
alteram o plano da luz polarizada que entra e esse plano notado com lente detectora. A rotao
da luz polarizada, devida orientao molecular dos componentes do tecido, conhecida como
birrefringncia.

6. Microscpio Ultravioleta - O microscpio ultravioleta usa uma fonte de luz ultravioleta e

depende da absoro desta pelas molculas da amostra. Em princpio no muito diferente do
espectrofotmetro, sendo seus resultados registrados fotograficamente. A amostra no pode ser
inspecionada diretamente atravs de uma lente ocular j que a luz UV no visvel e lesvel
para o olho. O mtodo til na deteco de cidos nuclicos e protenas que contenham certos
aminocidos.
A MICROSCOPIA ELETRNICA

O microscpio eletrnico tem alta resoluo e as imagens obtidas mostram uma riqueza de
detalhes. H dois tipos de microscpio eletrnico, o de transmisso e o de varredura.

1. Microscpio Eletrnico de Transmisso - Utiliza um feixe de eltrons em lugar de luz na

produo de uma imagem. Os eltrons passam por uma bobina ou lente magntica, tambm
chamada condensadora, que os dirige em feixe uniforme na direo do objeto, depois o feixe
passa por outra bobina tambm chamada objetiva que forma uma imagem. Esta imagem ainda
ampliada por uma ou duas lentes que projetam (lentes projetoras) a imagem final sobre uma tela
fluorescente ou um filme fotogrfico.

Devido ao fato de serem os eltrons desviados facilmente pelo objeto, necessrio utilizar cortes
muito finos de tecidos. A preparao das clulas para a microscopia eletrnica requer cuidado,
necessrio usar fixadores que preservem ao mximo a estrutura. A fixao em geral feita em
soluo de aldedo glutrico. Usa-se tambm a fixao em soluo de tetrxido de smio. Na
maioria das vezes os dois so empregados em seqncia: primeiro fixa-se o tecido em
glutaraldedo e depois, em smio. O smio alm de fixador, atua como contraste, por ser um
elemento de nmero de massa elevado, que desvia os eltrons. As estruturas que combinam com
o smio aparecero escuras.

Alm do smio, outros tomos so empregados para fixar e aumentar o contraste entre os
componentes celulares, pois as diversas estruturas tm afinidades diferentes por esses metais. O
contraste melhora quando mais de um deles usado.

Para o exame no microscpio eletrnico, os tecidos devem ser includos em resinas mais duras,
como as do tipo epxi. Os cortes para o microscpio Eletrnico so feitos com navalhas de vidro
ou diamante num ultramicrtomo. Ao contrrio do mtodo utilizado em microscopia ptica na
qual a parafina deve ser removida antes da colorao, a preparao com plstico no exige
remoo.
Criofratura - Um mtodo especial de preparo da amostra para o MET, especialmente importante
no estudo ultra-estrutural de membranas, o mtodo da criofratura. O tecido a ser examinado
pode ser fixado ou no; se for fixado, o fixador retirado por lavagem do tecido antes de
prosseguir. O tecido infiltrado com um crioprotetor, como o glicerol, e colocado para congelar
rapidamente, at cerca de -71 C. A formao de cristais de gelo evitada com o uso de
crioprotetores, congelao rpida e tamanho extremamente pequeno da amostra do tecido. O
tecido congelado colocado no aparelho de criofratura. Este aparelho contm uma cmara no
qual o tecido congelado pode ser mantido a vcuo, sendo em seguida fraturado, geralmente com
um dispositivo para corte sobre um brao giratrio. Na verdade o tecido no cortado, mas
fraturado ao longo de um plano que aproximadamente o plano dispositivo de corte. Pode-se
deixar o tecido fraturado no aparelho durante um perodo varivel de tempo, mas curto, durante o
qual a gua congelada evapora, permitindo que certos detalhes estruturais sobressaiam em
relevo. A amostra ento coberta (costumeiramente com platina) para se criar um molde
sombreado. Fundamentalmente, a platina passa a ser uma rplica da superfcie fraturada. O
tecido removido e a rplica da superfcie, e no o prprio tecido, colocada sobre a grade para
ser examinada com o Microscpio Eletrnico de Transmisso. Tal rplica mostra detalhes em
nvel macromolecular.

2. Microscpio Eletrnico de Varredura - Este microscpio tambm utiliza um feixe de eltrons

mas difere-se do MET pelo fato dos eltrons no atravessarem a amostra como parte do processo
de formao da imagem.
O trajeto do feixe de eltrons modificado por um conjunto de bobinas defletoras que o fazem
percorrer a amostra ponto por ponto e ao longo de linhas paralelas (fazendo uma varredura). Ao
atingirem a amostra, os eltrons causam diversos efeitos, entre os quais a emisso de eltrons
secundrios pelo prprio espcime. Os eltrons secundrios so colhidos por um coletor, passam
por um sistema de amplificao e so transformados em pontos de maior ou menor luminosidade
num monitor de vdeo. As micrografias so obtidas pela fotografia da imagem no monitor na tela
do computador, e no pela ao dos prprios eltrons sobre um filme fotogrfico, como acontece
no MET.

Geralmente, os espcimes no precisam ser cortados para serem examinados no MEV. Objetos
de 1cm ou mais podem ser examinados inteiros.
O microscpio de varredura tem sido muito usado para o estudo da superfcie de clulas
mantidas em cultivo.

CITOQUMICA

A citoqumica estuda a localizao intracelular das diversas substncias que compem as clulas.
Pode ser aplicada em nvel de microscopia ptica e de microscopia eletrnica. No primeiro, o
produto da reao citoqumica deve ser corado e no segundo, deve dispersar eltrons.

Os mtodos citoqumicos tm por base reaes qumicas especficas, ou a interao

macromolecular de alta afinidade. Nos dois casos, o resultado final usualmente, a produo de
compostos insolveis, corados, ou eltron-densos, que possibilitam a localizao de substncias
especficas nos cortes de tecidos atravs do uso do microscpio ptico ou eletrnico.

Os lipdios so geralmente localizados por "corantes" que so mais solveis nos lipdios
do que no lquido em que o "corante" est dissolvido.
O cido desoxirribonuclico (DNA) demonstrado citoquimicamente pela reao de
Feulgen, tcnica que consiste em duas etapas, na primeira, mergulha-se a lmina em
soluo aquosa de cido clordrico que promove a retirada das bases pricas e a formao
de grupamentos aldedicos na dexirribose, na segunda etapa, trata-se o preparado pelo
reativo de Shiff, que, ao se combinar com os grupamentos forma um complexo de cor
vermelha. Como a intensidade da cor vermelha que se forma proporcional
concentrao de DNA, ela permite o estudo quantitativo deste cido nuclico. Esta
tcnica especfica para o DNA.
O estudo citoqumico do cido ribonuclico (RNA) baseado em sua basofilia (
demonstrado graas sua acentuada afinidade pelos corantes bsicos). Como o RNA no
a nica substncia basfila dos tecidos, necessrio incubar uma lmina controle, antes
de sua colorao, com ribonuclease, que digerir o RNA presente. As estruturas que
perdem a sua basofilia devido ao tratamento prvio com a ribonuclease contm RNA.
O formaldedo reage com as catecolaminas produzindo compostos fluorescentes. Deste
modo, possvel a localizao citoqumica das catecolaminas adrenalina e noradrenalina
 A tcnica de PAS (periodic acid Schiff) uma tcnica para evidenciao do glicognio, a
reao baseia-se na oxidao, pelo cido peridico, formando grupamentos aldedicos
que do cor vermelha com o reativo de Shiff. A reao no especfica para o glicognio,
de modo que se aplica semelhantemente para descrio do RNA: toma-se duas lminas
com cortes do mesmo tecido, uma previamente tratada pela enzima alfa-amilase. Esta
enzima hidrolisa e remove o glicognio. Portanto a estrutura que aparecer corada pelo
PAS na lmina no tratada e no aparecer corada na lmina tratada pela enzima
glicognio.
Muitas enzimas podem ser estudadas por tcnicas citoqumicas. Algumas vezes, para
impedir que o fixador inative a enzima, preciso usar cortes de tecidos no fixados,
obtidos por congelao. As desidrogenases e as fosfatases so exemplos de enzimas
demonstrveis citoquimicamente. Um dos mtodos enzimticos mais teis o destinado
fosfatase cida, uma vez que a enzima localizada no interior dos lisossomos, portanto
serve para identificar lisossomos tanto em microscopia ptica quanto eletrnica.
As reaes para demonstrao das protenas totais das clulas so baseadas em tcnicas
que identificam aminocidos. As diversas protenas celulares so constitudas pelos
mesmos aminocidos; por isso, as tcnicas baseadas na identificao de aminocidos no
permitem individualizar as protenas, o que pode ser feito com mtodos de
imunocitoqumica.

IMUNOCITOQUMICA

Se uma substncia estranha for injetada em um animal, haver a produo de anticorpos em

resposta a essa substncia. O anticorpo reage especificamente com a substncia estranha
(antgeno). A reao entre o antgeno e o anticorpo a base fundamental da imunocitoqumica.

A tcnica da imonucitoqumica utiliza a possibilidade de acoplar substncias marcadoras a

anticorpos sem que estes percam a capacidade de se combinar com o antgeno.
CENTRIFUGAO

As tcnicas que permitem o fracionamento celular e a obteno de fraes relativamente puras de

organelas contriburam muito para o desenvolvimento da biologia celular.

As organelas so separadas pela centrifugao de um homogeneizado de clulas em que as

membranas plasmticas so rompidas e os constituintes celulares dispersos em um meio lquido,
geralmente contendo sacarose (este glicdio muito utilizado porque mantm a integridade dos
componentes celulares e evita a tendncia de as organelas aglutinarem-se quando as clulas se
rompem).

O isolamento de uma organela atravs de centrifugao depende de seu coeficiente de

sedimentao, isto , do seu tamanho, forma e densidade, bem como da densidade e a
viscosidade da soluo em que est sendo centrifugada.

1. Centrifugao Fracionada - consiste em uma srie de centrifugaes a velocidades

crescentes. As organelas ou incluses maiores e mais densas sedimentam primeiro, o
sobrenadante de cada centrifugao centrifugado de novo, porm em maior velocidade. Desse
modo, os componentes celulares vo sendo sucessivamente separados.
Em geral o sobrenadante que permanece aps a ltima centrifugao denominado frao
solvel.

2. Centrifugao Contragradiente - Nela as partculas so separadas por suas diferenas de

densidade. O gradiente consiste em uma soluo cuja concentrao mxima na parte profunda
do tubo de centrifugao e mnima na superfcie, apresentando um aumento gradual de
concentrao de cima para baixo. Sobre esse gradiente estabilizado coloca-se o homogeneizado
celular e faz-se a centrifugao. As partculas migram em direo centrfuga e param onde ocorre
um equilbrio entre a ao da fora centrfuga e a tendncia de flutuao da partcula. Tal tcnica
permite a obteno de fraes mais puras.
Tais etapas e tcnicas so realizadas em baixas temperaturas, para impedir que os sistemas
enzimticos funcionem, o que lesaria as organelas durante sua separao.

CROMATOGRAFIA EM COLUNA

As protenas e os cidos nuclicos isolados das clulas so freqentemente separados por esta
tcnica. Ela baseia-se no fato de que, quando se faz uma mistura de protenas dissolvidas em
gua passar por uma coluna constituda por uma matriz slida e porosa, contida num tubo de
vidro, a velocidade de migrao das diferentes protenas varia conforme a interao de cada uma
delas com a matriz. Mandando-se um fluxo contnuo de protenas, que sai pela parte inferior da
coluna, pode-se coletar separadamente as protenas contidas na amostra inicial.

A tcnica muito usada para purificao de anticorpos.

AUTORADIOGRAFIA

A autoradiografia pode ser aplicada como uma tcnica citoqumica para a deteco de istopos
radioativos no interior do tecido. Baseia-se na sensibilidade das emulses fotogrficas s
radiaes ionizantes. Como no existem tomos radioativos nas clulas, pode-se seguir, pela
autoradiografia, a incorporao e a migrao de compostos radioativos introduzidos nas clulas
com finalidades experimentais.

ELETROFORESE EM GEL

A tcnica de eletroforese em gel tem diversas variantes para esclarecer diversos problemas. Uma
delas, por exemplo, para determinar o tamanho das molculas proticas. Coloca-se a mistura de
protenas (previamente carregadas negativamente) sobre o gel e submete-se a um campo eltrico,
todas as molculas migraro na direo do plo positivo e a velocidade desta migrao
depender exclusivamente do tamanho da molcula de cada cadeia polipeptdica.
ESTUDO DE CLULAS VIVAS E CULTURA DE CLULAS ANIMAIS E VEGETAIS

As clulas retiradas do corpo de um animal ou de uma planta podem ser estudadas, por algum
tempo, enquanto esto vivas.

O estudo de clulas vivas, por tempo prolongado, pode ser realizado por meio dos cultivos em
solues que contm os nutrientes necessrios e nos quais as clulas se matem vivas e proliferam
por longos perodos de tempo. A soluo que mantm as clulas vivas, ou meio de cultura, deve
ser renovada com freqncia, pois os nutrientes esgotam-se, ao mesmo tempo em que produtos
txicos do metabolismo se acumulam no meio.
As culturas tm sido usadas para os estudos do metabolismo de clulas normais e cancerosas e
sido teis, alm disso, para experincias com vrus, os quais somente proliferam no interior das
clulas.

As culturas de clulas so essenciais tambm para as tcnicas de biologia molecular e para a

tecnologia da engenharia gentica.

CONCLUSO

Estas so s algumas das tcnicas utilizadas nos variados estudos sobre as clulas, muitas delas
tm contribudo de modo significativo para o progresso desses estudos.

Cada tcnica empregada com o propsito de resolver um "problema" diferente e avaliar os

resultados com eles obtidos.

BIBLIOGRAFIA

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MICHAEL H. Ross & LYMM J. Romrel. HISTOLOGIA TEXTO E ATLAS. 2 Edio.