Ion Torrent

Introdução Ion Torrent

• Um dos métodos de sequenciamento de nova geração;

• A plataforma Ion Torrent PGM™ (Life Technologies,Thermo Scientific)

foi lançada em 2011;

• Sequenciador de bancada(benchtop), direcionado para

sequenciamento de pequenos genomas e/ou grupos de genes;

• A identificação das bases se dá unicamente por pH, e não por ddNTPs

ou reações luminosas.
• Foi a primeira a apresentar uma química de sequenciamento
totalmente independente de moléculas modificadas, sem uso de
nucleotídeos fluorescentes:

➢dispensa o uso de aparatos ópticos;

➢equipamento e reagentes mais baratos.

• O fluxo de bancada completo inclui três etapas:

1. Construção da biblioteca;
2. Preparo de template;
3. Sequenciamento em chip de semicondutor.
Método de sequenciamento
 1. Fragmentação

a) A construção de biblioteca inicia-se com a fragmentação do DNA de

interesse:
➢ via enzimática ou mecânica.

b) Os fragmentos recebem em suas extremidades dois adaptadores de

DNA com sequência conhecida (denominados A e P1), essenciais para
garantir o seu sequenciamento.

❖Caso haja intenção de se processar mais de uma amostra por corrida

de sequenciamento, são utilizados juntos a esses adaptadores
sequências denominadas barcodes.
 2. Preparo de Template

a) A principal etapa é a PCR em emulsão (emPCR): amplificação clonal

dos fragmentos dentro de micelas geradas em uma solução
emulsionada.
b) Dentro de cada microrreator há um grânulo magnético (bead) com
sequências de DNA na superfície, no qual um fragmento se acoplará
através de seu adaptador P1 .
c) A amplificação clonal dos fragmentos ocorre através do
pareamento dos sítios de ligação dos primers presentes nos
adaptadores e com a extensão de uma nova fita de DNA.

d) Fim da emPCR
➢ fase de enriquecimento: separação dos beads acoplados à
fragmentos dos não acoplados;

➢ fragmentos selecionados serão inseridos no chip semicondutor e

encaminhados para o equipamento, onde acontecerá a reação de
sequenciamento.
 3. Sequenciamento

a) A amostra devidamente preparada é inserida em um chip semicondutor

(constituído por poços de diâmetro micrométrico), nos quais as beads
com DNA serão depositados para sequenciamento;

b) Cada poço recebe uma bead e embaixo de cada um há um aparato

semicondutor capaz de detectar variações elétricas.

c) O equipamento passa a fornecer às beads os quatro nucleotídeos (A,C, T

ou G) soltos (um de cada vez) nunca misturados.
d) Quando há a incorporação de algum nucleotídeo em algum fragmento
de DNA, a ligação fosfodiéster gerada libera íons de hidrogênio no
meio, alterando o pH e fazendo com que essa variação seja detectada
pelos semicondutores.

e) Sempre que houver o fornecimento de um nucleotídeo seguido de

variação de pH

base incorporada e geração de sequências ao final do processo

Vantagens e Desvantagens
Ion Torrent
 Vantagens

• Corrida rápida – menor tempo de sequenciamento em relação aos

demais;

• Não utiliza-se polimerase;

• Maquinário simples;

• Chips descartáveis – atualização da tecnologia pela compra de novos

chips.
 Desvantagens

• Maior taxa do erro que o Illumina;

• Maior custo por Mb em relação ao Illumina;

• Alta taxa de INDELs em regiões homopoliméricas.

 Tamanho das Sequências Ion Torrent

Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM)

• 3 chips para sequênciamento:

• Ion 314™ Chip v2 com rendimento de até 100 Mb,
• Ion 316™ Chip v2 com rendimento de até 1Gb
• Ion 318™ Chip v2 com rendimento de até 2Gb
 Tamanho das Sequências Ion Torrent

Ion Proton System

• 2 chips para sequênciamento:

- Ion Proton Chip I – 10 Gb

- Ion Proton Chip II – 100 Gb

• Proton System
 Tamanho das Sequências Ion Torrent

• Tamanho das leituras pode alcançar até 400 pb, exibindo o

comprimento médio em torno de 200 pb

• Tempo de corrida: 2 horas

 Tamanho das Sequências Ion Torrent

Recomendações:

✓Amplicons (produtos de PCR),metagenomas, genomas de

microrganismos procariotos e genomas de vírus.

✓Genomas de tamanho pequeno a médio

 Saída do Software

BAM File
 Referencias Bibliográficas

CARVALHO, Mayra Costa da Cruz Gallo et al. Sequenciamento de DNA de nova geração e suas aplicações na genômica
de plantas. Ciência Rural, p. 735-744, 2010.

Glenn, TC. 2011. Field Guide to Next Generation DNA Sequencers. Molecular Ecology Resources. doi: 10.1111/j.1755-
0998.2011.03024.x

MYLLYKANGAS, Samuel; BUENROSTRO, Jason; JI, Hanlee P. Overview of sequencing technology platforms.
In: Bioinformatics for high throughput sequencing. Springer New York, 2012. p. 11-25.

VARUZZA, L. Introdução à análise de dados de sequenciadores de nova geração. Versão 2.0.1. 2013