UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI – UFSJ

INSTITUÍDA PELA LEI NO 10.425, DE 19/04/2002 – D.O.U. DE 22/04/2002

CAMPUS CENTRO-OESTE

Práticas em Biologia Molecular

Prof. Israel José Pereira Garcia 2023

Roteiro de aula prática

Assunto: Reação em cadeia da DNA polimerase (PCR)

1- Introdução

A Reação em cadeia da polimerase (PCR) do inglês ou Polymerase Chain Reaction , é uma

técnica utilizada na biologia molecular para amplificar uma única cópia ou algumas cópias de
um segmento de DNA em várias ordens de grandeza, gerando milhares a milhões de cópias de
uma determinada sequência de DNA. A PCR, técnicqa descoberta em 1980 por Kary Mullins,
permite a amplificação in vitro de segmentos de DNA, utilizando-se duas sequências de
nucleotídeos iniciadores (ou primers) que hibridizam com as fitas opostas, em regiões que
flanqueiam o segmento a ser amplificado. Três eventos distintos ocorrem durante um ciclo de
PCR:
(I) o DNA é desnaturado,
(II) os primers ou iniciadores hibridizam com as fitas do DNA;
(III) a síntese do DNA complementar à fita-molde de DNA é realizada pela polimerase
termoestável com a incorporação de desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dNTPs).
O resultado final de múltiplos ciclos é o acúmulo exponencial de um fragmento específico.
Uma vez que os primers se tornam incorporados ao produto final de amplificação e que a
inserção no início ou final do primer não alteram a amplificação, novas informações como sítios
de enzimas de restrição podem ser incorporadas ao produto final.
Utilizando-se a PCR pode-se detectar: polimorfismos genéticos, mutações pontuais, deleções,
inserções, entre outros.
2. Metodologia
2.1 Material
Microtubos de 200 μl (0.2)
Enzima taq DNA polimerase
Primers específicos: foward e reverse (estoque 10 μM = 10 pmol/μl)
dNTPs (estoque 1 mM)
Tampão de reação 10 x (100 mM Tris-HCl (pH8.5), 500 mM KCl)
MgCl2 (estoque 50 mM)
Água miliQ (autoclavada)
DNA
Termociclador

Primers:
F: 5’- GGA TCC AGA CCC CCA CAG TTT ACG AG – 3’ TM=59.06º C
R: 5’- CTC GAG GAT GGT GGT ATC CAG GTG AAC – 3’ TM= 59.1º C

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2.2 Preparação do pré-mix

É extremamente importante existir no laboratório uma área para a manipulação dos reagentes
da PCR, que deve ser mantida limpa e livre de qualquer fonte de contaminação. Alguns
cuidados especiais devem ser tomados:
1- O operador deve usar sempre avental e luvas.
2. Usar somente material estéril, livre de DNases e RNases.

2.3 Antes de Iníciar a PCR

-Antes de dar início à PCR, veja sempre se está fazendo os controles (controle positivo e
negativo).
-Colocar todos os tubos contendo os reagentes no gelo.
-A reação de PCR deverá conter 20 μL, antes de prepará-la faça as contas dos volumes a
serem usados levando em conta a concentração do estoque e a concentração final da reação.
- Caso seja necessário dilua as amostras.

2.4. A PCR
Adicione a um tubo de 200 μL:
1. Primers: concentração final = 1 μM
2. dNTP: concentração final = 0,2 mM
3. Tampão: concentração final 1x
4. MgCl2: concentração final= 2,5 mM
5. Enzima: 0,5 ui (0.5 μl)
6. DNA: concentração final = 10 ng/μl
7- Após adicionar o DNA, coloque imediatamente o tubo no gelo.
8- Centrifugue por aproximadamente 10 segundos e coloque o tubo no termociclador.
Use a tabela abaixo para fazer os cálculos de volumes.

Primer 1
Primer 2
dNTP
Tampão
MgCl2
Água
Taq
DNA
Volume final 20 μl
2.5 Termociclagem
Programe o termociclador com as condições de PCR apropriadas para cada par de primers:

1. Desnaturação inicial: 10’- 94º C

2. Desnaturação: 1’ - 94º C
3. Anelamento: 1’- 59º C
4. Extensão: 2’- 72º C
5. No Ciclos: 30x
6. Extensão final: 10’ a 72º C

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