Controle da Expressão

Gênica em Plantas

Humberto Ramos
 Controle da Expresão Gênica
Tipos de Genes:

Proteínas expressas continuamente

em todos as células:
- Funcões metabólicas comuns;
- Expressão constitutiva (Não regulada);
- “Housekeeping genes”

Expressão Regulada: temporal e espacial

- Indução ou Repressão.
- Tecidos específicos;
- Estádios de Desenvolvimento;

Níveis ou estágios de Controle:

1- Remodelamento da Cromatina;
2-Transcricional;
3-Pós-Transcricional;
4-Traducional;
5- Pós-Traducional;
 Remodelagem da Cromatina

Cromatina: complexo DNA-histonas;

 Transcrição: Acesso ao DNA

Descondensar!

Complexo de Remodelamento
da Cromatina:

- Histone acetyl transferase (HAT):

DESCONDENSAMENTO

- Histonas Deacetylases (HDAC):

CONDENSAMENTO
 Controle da Iniciação da Transcrição
1. Maioria dos genes: ao nível da INICIAÇÃO:

- Região promotora: imediatamente a montande

- Ativadores e Intensificadores (“enhancers”): distantes do gene

a. Nível basal:
b. Máxima transcrição: Ligação de proteínas ativadoras:
i. Elementos próximos ao promotor.
ii. Elementos intensificadores “Enhancer”.
2. Ligação de Ativadores:
a. Recrutamento de proteínas para tornar a cromatina acessível;
b. Aumento da taxa de ligação da maquinaria da transcrição ao
promotor.
3. Variações para diferentes genes.
4. Comumente Regulação Positiva:
- Cromatina – genes inativos;
- Mais eficiente (se fosse negativa, teriamos pelo menos um
repressor por gene).
- Genomas grandes: probabilidades de sequências ao acaso.
Reguladores Transcricionais (próximos á regiao promotora):

- Ligam-se a regiões ou sítios gene-específicos: alguns genes são

expressos e outros não;

- Elementos proximais ao promotor.

Sequências Regulatórias Distantes: 10-100 Kb do promotor

- Podem estar “up ou downstream”;

- Intensificadores (100 x de aumento);
- Silenciadores.
 ETAPAS DA INICIAÇÃO:
Exposição do promotor: remodelagem da
cromatina;

 TATA Binding Proteins (TBP) ligam-se ao

TATA box

 Ligação a fatores Transcrionais Basais, que

Interagem com outros fatores regulatórios
transcricionais: intensificadores, silenciadores
ou elementos próximos ao promotor.

Fomação do complexo iniciador:

- Fatores Basais: Interagem com o promotor em uma regiao próxima
a todos os genes eucarióticos. Não regulam, mas são essenciais.

- Fatores Regulatorios: Ligam-se a outras proteínas e

são gene-específicos (ou famílias). Ligam-se a sítios específicos: permitem
expressar genes específicos. (>2.000 genes dos 26.000 em Arabidopsis)
Regulação Pós-Transcricional
 Estabilidade do RNA e Expressão Gênica

 1980s: RNA 100 pb liga-se a RNAm e inibe a tradução em E. coli

 RNA e Expressão Gênica

 1993: RNA anti-sense regulando genes em C. elegans.

lin-4: primeiro miRNA identificado

Lee et. al. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.
Cell. 1993 Dec 3;75(5):843-54.
 RNA e Expressão Gênica
 2000: novos RNA anti-sense regulando genes em C. elegans:
Sequências similares em outros organismos.
 RNA e Expressão Gênica
 1990: Silenciamento gênico pós-transcricional - PTGS

Espressão do gene
endógeno da chalcona
sintase A

Supressão da expressão
gênica: ausência de
pigmentação
 RNA e Expressão Gênica

_ como explicar as observações??

_ inibição por anti-sense parecia improvável?
Efeito fenotípico da injeção de RNA unc-22 em C. elegans

 Fire et al., 1998.

Não é antisense: ??????

Sem Sonda Sem injeção
 Silenciamento:

1- eficiente quando RNAds;

2- específico para RNAm homólogo;
3- específico: RNAm processado - não para intron ou promotor
4- desaparecimento do RNAm: degradado;
5- poucas moléculas de RNAi por células: amplificação;
6- RNA de interferência: responsável pelo PTGS em plantas.
7- RNAi: ferramenta para silenciamento gênico

Mecanismo molecular?????
RNAi - Mecanismo Molecular
Etapas:

1- Geração do RNAi ativo:

siRNA (small interfering RNA) -
endonuclease “Dicer”

2- Formação do Complexo RISC

(Complexo Silenciamento
Induzido por RNA)

3- Reconhecimento do RNAm
alvo: pareamento de bases

4- Clivagem do RNAm
 RNA de interferência: Evolução

 Amplamente distribuído entre os seres vivos;

 Eucariotos: poucas exceções (Saccharomyces cerevisiae)

Saccharomyces castellii (encontrado em 2009)

 Não presentes em Procariotos (RNA antisense)

- “RNAi-like defense system” (sistema análogo)

- Sistema não-conservado
- Proteínas em Bactérias e Archaeas: (evolução para RNAi)
 Significância da descoberta do RNAi

 RNAi envolvidos na manutenção da cromatina condensada:

e supressão da transcrição – TGS (Silenciamento Gênico
Transcricional)

 RNAi como ferramenta experimental para repressão

de genes específicos: determinação da função.

 RNAi como molécula utilizada em terapia gênica

 Substratos para DICER

Vírus RNA e
DNAds Genes codificando
transcritos (RNAm)
(dupla fita interno) para microRNA

RNAds

dsRNA vírus
(21-25 b) microRNA
RdRP
(22 b com loop)

RNAds

RNAds sintetizados in vitro

ou in vivo via vetores
Processamento e Ação de miRNAs e siRNAs

Transcriptional silencing

Pareamento
parcial

Montagem
assimétrica da
RISC

Inibição
Inhibitionda Tradução
of translation Degradação do RNAm
mRNA degradation
Construção de RNAi e introdução nas células alvo

Expressão
transitória
da pertubação

Expressão
permanente

Sintetizados in vitro e
clonados
Fenótipo desejado
 iRNA Como Ferramenta Para Silenciamento Gênico

(300-700 pb)

Sense Anti-Sense

Figure 1-1: Typical organization of a plant RNAi-

inducing transgene.