microRNAs E CÂNCER

Genética Humana Molecular

Profa. Dra. Ana Elizabete Silva
 CLASSES DE RNA
RNA RNA não codificadores
codificador (ncRNA)

RNA RNA pequenos

Codifica proteínas:
funcionais

mRNA (3%) snRNA(small nuclear):

Não traduzidos:
tRNA (15%)
rRNA (70%)
lncRNA: 200 nt ~100 kb,
expressão tecido-especifica,
regulação alterada em várias
doenças e câncer
processamento de RNA transcritos
(spliceossomo)
snoRNA (small nucleolar):
modificação do rRNA
miRNA (micro): regulação da
expressão gênica
siRNA(small interfering): defesa do
genoma contra vírus e transposons
 ncRNA longos
lncRNA: conteúdo no genoma
humano varia de ~7000 - 23,000
•Função: imprinting e inativação
do X (XIST)
•Processos de desenvolvimento,
resposta ao estresse celular e
doenças humanas
•Regulação da expressão gênica
transcricional e pós-
transcricional.
•Inibição da atividade da
acetiltransferase de histona;
remodelagem da cromatina

Gibb et al. Molecular Cancer 2011, 10:38

 Compreende um grupo de vias
relacionadas mecanisticamente que
produzem moléculas de ncRNA pequenas,
as quais modulam a expressão protéica via
degradação do mRNA ou repressão da
tradução.

SILENCIAMENTO GÊNICO
 RNA de interferência
iRNA

mecanismo exercido por moléculas de RNA

complementares a mRNA, o qual inibe a
expressão gênica na fase de tradução (PTGS)
ou dificulta a transcrição de genes específicos
(TGS)

miRNA
(microRNA) siRNA (small
interfering RNA)
 microRNA - Histórico

•Ambros et al (1993): descobriram o gene lin-4 (small non-protein-

coding RNA) → se liga ao RNAm lin-14 → regulação do
desenvolvimento larval de Caenorhabditis elegans
•Presentes em: C. elegans, D. melanogaster, plantas, insetos e
mamíferos (humanos)
•Identificação: de 2.588 microRNAs (miRNAs) maduros em
humanos → não codificadores de proteínas
•Correspondem a 1-5% genoma humano
•Reguladores negativos da expressão gênica
•Regulam >60% de RNAm: função em processos como
desenvolvimento, diferenciação, proliferação celular, apoptose e
resposta ao estresse
•miRNA: implicados em várias doenças e cânceres humanos → tanto
perda como ganho de miRNA → contribuem para o desenvolvimento
do câncer
Andrew Fire e Craig C. Mello (2006): Prêmio Nobel em Fisiologia ou
Medicina sobre RNA interference em C. elegans, publicado em 1998.
 O que são microRNAs?

•Pequenos RNAs endógenos fita simples não

codificadores de proteínas, com tamanho de ~ 19-25
nucleotídeos.
•Potentes reguladores pós-transcricionais.
•Função:
-proliferação
-diferenciação
-apoptose
-carcinogênese: duplo papel (oncogênese e supressor
tumoral)
 miRNA x siRNA
siRNA
miRNA
•Derivam de mRNA de
•Derivam de loci genômico distintos, transposons, vírus ou DNA
agrupados em cluster: (introns, exons, heterocromático
regiões intergênicas) •Processados a partir de grandes
•Processados a partir de RNAs em duplexes
grampos (palindrômicas): precursor •Ambas cadeias são aproveitadas
forma alças → dupla hélice c/hairpin; no RISC
forma madura: linear (fita sem alças)
•Raramente conservados
•Apenas a fita madura 3’ incorporada •siRNA endógenos especificam
ao RISC, a outra 5’ degradada (???) autosilenciamento (silenciamento
•Permanece intacto após cisão do do mesmo locus) que o originou
mRNA alvo (pode se ligar em outras
regiões) Não se distinguem pela sua
composição química ou mecanismo de
•Conservado entre os organismos ação, diferenciam pela origem e alvos.
Comparação entre miRNA x siRNA

http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n101007/100705.pdf
 NOMENCLATURA dos miRNA
miRBase (Griffitis-Jones et al., 2006)
•Os genes que codificam os miRNA são denominados com o prefixo de
três letras maiúsculas, hifenização (-) e itálico, seguida de um único
número de identificação
Ex: MIR -156 no Arabidopsis e mir-1 na Drosophila.
Humanos: hsa-mir-605
•Os precursores miRNA (pré-miRNA) também recebem a designação mir
(letras minúsculas, sem itálico)
• As formas maduras dos miRNA são designadas miR (sem itálico)
Ex: miR-1, miR-89, miR-278
•miRNA originados de cópias parálogas, com sequencias maduras
idênticas, acrescenta-se um hífem e um número
Ex.: miR-7-1, miR-7-2 e miR-7-3 (localizados nos cromossomos
9, 15 e 19)
•miRNA maduros cuja sequência difere em uma ou em duas posições
(homólogos) são designados com sufixos com letras pequenas
Ex: miR-1a e miR-1b
 BIOGÊNESE DO miRNA
Gene miRNA (localizado em introns,
região intergênica, exons)
Alveja pri-RNA
miRNA: gerado pela transcrição de um e lnc-RNA
longo precursor (pri-miRNA) → pela RNA
pol II/III
Processado
RNase III
(pre-miRNA) (Drosha: produz
um segundo
~70 nt.
precursor

Transportado (Exportina 5) →
citoplasma processado RNase
III(Dicer) → remoção hairpin

miRNA duplex Ligação 3’UTR

(~22nt) → complexo
RNAm → inibição
RISC → fita simples
linear tradução
Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 842; doi:10.3390/ijms17060842
 PRODUÇÃO E PROCESSAMENTO DO miRNA
Apenas uma fita madura (guia 3’) é incorporada ao
RISC, outra (passenger 5’) degradada. (???)
Sequência seed: região de 2-8nt do final 5’ do
miRNA, importante p/ reconhecimento e
silenciamento do mRNA
Ambas as fitas podem se ligar ao
RISC, usa-se os sufixos -5p ou -3p
has-miR-133a-5p
has-miR-133a-3p
Beezhold et al. Molecular Cancer 2010, 9:134
miRNA x siRNA

Drosha
 ANIMAÇÃO miRNA - NATURE

http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html

http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm
REGULAÇÃO POR miRNA
•1 miRNA pode regular ~200 mRNA (múltiplos
alvos)
•1/3 dos genes estão sob controle dos miRNA.
Ex.: genes de fatores de transcrição
•Genes de miRNA: banco de dados
www.sanger.ac.uk/
> 2.588 miRNA em humanos
•70% dos genes de miRNA localizados em introns
e exons
•30% localizados em regiões intergênicas
•Alta estabilidade e detecção não invasiva: saliva,
fezes e plasma
Mecanismos de Regulação pelos miRNA

Três processos:
1- clivagem endonucleolítica: requer
complementaridade perfeita ou quase
perfeita ao mRNA (observado em plantas,
raro em mamíferos, devido interação
incompleta entre miRNA-mRNA)
2- degradação do mRNA por deadenilação:
repressão da tradução da proteína;
3- inibição do início da tradução
(característico de animais)
 MECANISMOS DE
SILENCIAMENTO GÊNICO
PTGS
(Postranscriptional gene silencing)
•Atua em nível do mRNA através do
mecanismo dependente de Argonauta-2
(Ago-2)
•Referido como RNA de interferência
(RNAi)
•siRNA atua para recrutar Ago-2 para o
mRNA alvo pela complementaridade da
sequência
•Resulta na clivagem ou repressão
traducional do mRNA alvo
•Consequente diminuição da expressão
gênica
•Depende da presença continua do siRNA
TGS
(Transcriptional gene silencing)
•Atua em nível de DNA e pode resultar
em silenciamento a longo tempo
(plantas e animais)
•Envolve mudanças na cromatina
mediada por ncRNA na região
promotora resultando em transcrição
reduzida de genes alvos
•Modificações da cromatina: metilação
do DNA e histonas nas regiões do
lócus-alvo (alveja promotor gene)
•Observado em plantas, drosophila,
levedura e humanos
•Utilização com siRNA sintéticos
 NATURE|Vol 457|22 January 2009|doi:10.1038/nature07758

MECANISMOS DE SILENCIAMENTO GÊNICO

Mecanismos: ligação na região

3’UTR do RNAm (a)
•pós-transcricional (PTGS):
-clivagem direta do RNAm:
miRNA é complementar ao
RNAm → degradado após
clivagem p/RISC

-repressão da tradução e
degradação RNAm: miRNA com
pareamento incompleto

DGCR8: cofator de DROSHA

XPO5: exportinA-5 (transporte ao citoplasma)
RISC (RNA-induced silencing complex)
 PROCESSOS DE INIBIÇÃO DA TRADUÇÃO
1- Competição pelo 5’ CAP: miRNAs podem interferir no reconhecimento do
5’CAP. A proteína AGO apresenta domínio semelhante ao da proteína de ligação ao
5’CAP, assim competindo com 5’CAP

2-Inibição da montagem dos ribossomos: AGO2 pode associar-se a eIF6 (fator de

iniciação da tradução) e a unidade ribossomal maior, impedindo a montagem do
ribossomo (subunidade maior e menor)

3-Deadenilação seguida pelo bloqueio da iniciação da tradução: impede a

circularização do mRNA (pela interação do 5’CAP e cauda poli –A), que é essencial
para a iniciação da tradução

4-Dissociação prematura de ribossomos: miRNAs levam a desmontagem

antecipada dos ribossomos

5-Redução da velocidade de elongação durante a síntese proteica: miRNA reduz

o número de ribossomos interagindo com o mRNA

6-Proteólise durante a fase de elongação: miRNAs promovem a degradação da

cadeia polipeptídica nascente no ribossomo, durante a fase de elongação
 Mecanismos regulatórios dos miRNAs
1-Degradação do miRNA:
quando o RNAm alvo não esta
disponível

2- Remoção do capuz 5’ e
deadenilação: o complexo
miRISC (miRNA, proteína AGO
e complexo de silenciamento
GW182), se liga à 3′-UTR do
mRNA. A complementariedade
imperfeita entre eles
desestabiliza a calda
3′ poly(A) e capuz 5′ do mRNA e
leva a degradação.

3- A ligação de miRISC com a

proteína auxiliar poly(A)-binding
protein (PABP) ao mRNA pode
causar inibição da tradução via
repressão da atividade do
complexo do fator de iniciação da
tradução (eIF4F) e o complexo
Outros mecanismos de atuação dos miRNAs: 43S pre-initiation (PIC). Os
-podem se ligar na região 5’UTR, promotor e região codificadora do P-body (processing body) podem
RNAm também sequestrar o mRNA alvo
-podem também ativar a tradução do processo de tradução.
- Não estão confinados ao citoplasma, podem estar presentes no núcleo 4- Em poucos casos: a tradução
- miRNAs regulam diretamente miRNA: alvejam o transcrito primário do mRNA nos ribossomos é
ativada em vez de inibida.
Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 842;
 Modelo de silenciamento gênico do tipo TGS

Recrutamento de
siRNA sintético Ago-1→promotor Plasmídeo
ou miRNA expressando shRNA
endógeno ou RNA antisense

Recrutamento de HDAC-1,
DNMT3A, HMT

cromatina fechada
transcrição inativa

BioTechniques 48:ix-xvi (The RNA World June 2010) doi 10.2144/000113442

 microRNA e Câncer
Descoberta de miRNA câncer: Calin et al. (2002)
LLC (leucemia linfocítica crônica): del(13q14) → dois genes de
miRNA: miR-15-a e miR-16-1 → perda em 70% de LLC →
evento precoce (iniciador) → função de gene supressor de
tumor
•Maioria dos miRNA localizados em regiões envolvidas em
alterações cromossômicas:
-deleções,
-Amplificação,
-mutação (afeta o processamento dos miRNA),
-Metilação DNA e modificações histonas: função na regulação
da expressão dos miRNAs (Ex.: miR-127 geralmente silenciado
em células cancerosas)
 www.nature.com/reviews/geneticsOCTObER 2009 | VOLuME 10

Mapa de miRNA envolvidos em alterações em câncer: 13q14 (miR-15-a e miR-16-

1)- deletada em LLC; 7q32 (miR-29-a e miR-29b) deletada em SMD e LMA; 3p2 (let-7g-
let-7a1); 9q22.3 (let-7f-1, let-7d) em tumores sólidos (pulmão, urotelial, mama, etc.
 Função dos miRNA como supressor tumoral x oncogene
(oncomir)
Sequenciamento dos miRNA: evidencia deleções, mutações
(inclusive na linhagem germinativa → forma familial de LLC)
Membros da família let-7
(supressor tumoral) regula Perda de let-7 → expressão > de RAS
negativamente Oncogene RAS e
outros oncogenes: CDK6, Câncer de pulmão
CCND2, CICLINA D

miR-15-a e miR-16-1 Perda desses miRNAs → disfunção de

(supressor tumoral) alveja
oncogene BCL2 (inibidor
apoptose)
miR-155 e miR-17-92
(oncogene): amplificados
em vários linfomas de
células B, câncer pulmão,
mama, etc
miRNAs encontrados na circulação (nanovesículas – exossomos): biomarcador não invasivo
oncogenes celulares
miR-17-92 (13q31)→ promove proliferação,
inibe apoptose, induz agiogênese, e coopera
c/ MYC → desenvolvimento de linfomas e
câncer pulmão
super expressão miR-155 → pobre
prognóstico em adenocarcinoma pulmão
www.nature.com/reviews/geneticsOCTObER 2009 | VOLuME 10
 miRNA: Reguladores de Mudanças
Epigenéticas
miRNA miR-29, miR
199 e miR-148
alvejam

Regula enzimas DNMT3A, DNMT3B e

envolvidas na DNMT1
metilação DNA de
genes supressores causando desmetilação

Células AML: introdução de miR- Linhagem de câncer de pulmão:

29 causou perda de expressão das introdução de miR-29 causou
DNMTs, do oncogene MCL1 e desmetilação do promotor de genes
reativação de p16 supressores → reativação gênica e
perda de tumorigenicidade
 Expressão de microRNA em Câncer

Profile MicroRNAs from Cancer and Normal Tissues.

A susbset of the MicroRNA primers were used in this study to confirm published
findings of 9 different MicroRNAs in 5 separate tumor vs. Normal RNA samples.

Aplicação no prognóstico, progressão da doença e resposta a terapia

mir-Test: método não invasivo para detectar câncer de pulmão precoce em grupo de alto
risco (fumantes, idade >50anos): painel de 13 miRNA detectados no soro (70%
sensibilidade)
 Terapia baseada em miRNA ou anti-
miRNA
miRNA podem estar deletados ou hiper expressos no câncer

-miRNA (ou siRNAs) podem ser consideradas drogas para

silenciamento gênico: induzir apoptose e /ou parada do ciclo
celular em células cancerosas com desregulação de miRNA
-anti-miRNA (antagomir): bloquear a atividade de miRNA
endógenos

Introdução de miRNA nos tumores:

-diretamente nos tumores (fígado, medula, baço e rim)
- ou utilização de vetores
 RNA interferência – Terapia por miRNA
-introduzidos em vetores: adenovírus, vírus adeno-
associados (AAV), retrovírus, lipossomos, injeção do
RNA, nanopartículas
Camundongos: Triagem clínica: alvos
-miR-15a e miR-16-1: tratamento da -IL-10: tratamento da
leucêmia preeclâmpsia
-miR-26a: inibição da proliferação -VEGF e VEGFR-1:
celular e indução de apoptose em degeneração macular
hepatocarcinoma
-BCR-ABL: LMC
-família miR-29: suprimir câncer de
- miR-34 (MRX34): melanoma
pulmão e leucêmia (LMA)

Riscos: miRNA/siRNA introduzidos exogenamente podem sequestrar

componentes da maquinaria celular envolvidos no silenciamento gênico →
reduzindo acessibilidade da maquinaria p/os miRNA endógenos
→ Acúmulo no fígado e medula óssea
 Estratégias de introdução dos siRNA in vivo para terapia

devido o tamanho e carga negativa, não atravessam

facilmente a membrana celular

Vetores não virais: Vetores virais:

-conjugados de colesterol -lentivírus: contra Ras câncer de

-nanopartículas de polications
ligadas a transferrina
-Anticorpos carregados
positivamente
-SNALP: bicamada lipídica
conjugada com polietileno glicol
difusível
-MEA: partículas
policonjugadas dinâmicas
pulmão; doenças
neurodegenerativas
-Adenovírus: sistema nervoso
central → injeção direta contra
transcrito de ataxia espinocerebelar
AAV: mais seguro e menor risco de
rejeição imune: carcinoma
hepatocelular
Riscos: imunogenicidade viral;
mutações insercional
Estratégias de introdução dos siRNA in vivo para terapia
-grupos de colesterol aumenta
estabilidade do siRNA.
Ex: entrega intravaginal
(camundongo) siRNA contra
HSV-2
Nanopartículas de polication podem
introduzir os siRNA em células específicas
através de ligantes de superfície
(transferrina) → ao receptor das células
alvos. Ex.: sarcoma Ewing (Ews-Fli1,
mice); contra CCND1 em leucócitos
camundongo
Anticorpos especificos com
protaminas (carga +) → entrega dos
siRNA p/células específicas via
receptor. Ex.: contra gene gag HIV
Estratégias de introdução dos siRNA in vivo para terapia

SNALPs: Permite siRNA ser

absorvido pelas células e
liberado por endossomos. Ex.:
siRNA contra APOB → fígado
(primatas)

Similar aos SNALPS, mas

menores, contêm um ligante
que permite entrega para as
células alvos
 Triagens clínicas para tratamento de doenças

-Bevasiranib: contra VEGF → degeneração macular (crescimento de vasos atrás

da retina) → perda visual. Tratamento → melhora da visão sem efeito colateral.
Também em fase II para tratamento de edema macular diabética
-Alnylan Pharmaceuticals: contra genes implicados na hipercolesterolemia,
doença de Huntington, hepatite C
-Doenças alvo p/tratamento: AIDS, Parkinson, degeneração macular, diabetes
tipo 2, obesidade, hipercolesterolemia, artrite reumatóide, doenças respiratórias e
câncer
 TERAPIA – ANTAGONISTAS DE miRNA (AMOs)

-inibir miRNA oncogênicos utilizando antagonistas de miRNA:

•anti-miRs, locked-nucleic acids (LNA) ou antagomiRs: são
oligos com sequencias complementares aos miRNAs endógenos

•Alteram a configuração do miRNA impedindo o processamento

por RISC, ou degradam miRNA endógenos
•Substituição do miRNA: reintrodução de um “miRNA mimético”
supressor tumoral para restaurar uma perda de função

Cancer Res. Author manuscript; available in PMC 2011 September 15.

 TERAPIA – ANTAGONISTAS DE miRNA (AMOs)

- Miravirsen (SPC3649): antagonizar miR-122 → para tratar

hepatite C crônica → redução dos níveis de colesterol do
plasma, sem toxicidade.
- liga-se a alça do precursor do miR-122 bloqueando o
processamento pelas enzimas Dicer e Drosha
-2010: foi a primeira droga alvejando miRNA em triagem
clínica e atualmente encontra-se em fase II

2010: antagomir alvejando o pró-metastático miR-10b →

antagonizar metástase em modelo murino de câncer de mama
- antagomir alvejando miR-155 em modelo murino de linfoma

Cancer Res. Author manuscript; available in PMC 2011 September 15.

 APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS
Terapêutica baseada na
inibição miRNAS:
-uso de drogas inibidoras:
-empresa Regulus e Sanafi-
Aventis: mólécula moduladora
do oncomiR miR-21, que tem
como alvo os genes supressores
PTEN e PDCD4 (glioblastoma,
câncer de pâncreas, mama)
-Miravisen (teste clínico fase
3): tratamento da hepatite C –
inibição do miR-122 em células
do fígado (alveja duas regiões
do RNA viral, levando a
redução da contagem viral)
Terapêutica baseada na
reposição de miRNAs:
-empresa Mirna Therapeutics:
modulador que mimetiza o
miR-16 (alveja BCL2, controle
da apoptose)
-droga MRX34: modulador
mimetizador do miR-34 (alveja
genes reguladores do ciclo
celular, como MYC, MET KRAS,
CCND1). Modelo animal de
câncer pulmonar (única dose
induziu apoptose e redução da
massa tumoral em 60%).
Próxima fase, teste clínico em
pacientes com câncer hepático
 Potencial Terapêutico - Doenças, como câncer, doenças respiratórias,
inflamação, doenças neurológicas, autoimunes e processos infecciosos

Injeção intraocular
siRNA contra VEGF
Doença Macular

Inalação

Injeção
intravenosa

Ex-vivo
Células do
paciente -AIDS

Estudos Avançados 24 (70), 2010

 miRNA E DOENÇAS NEUROLÓGICAS
exercem papel importante no desenvolvimento de muitas doenças: marcadores
progressão, prognóstico e avaliação da resposta ao tratamento

Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 842

 miRNA E DOENÇAS NEUROLÓGICAS

-diminuição de miRNAs expressos no hipocampo: falha na

maquinaria de maturação dos miRNAs e diminuição na
expressão da enzima Dicer (formação dos miRNAs maduros).
Epilepsias Ex.:miR-206, miR-347
-Enquanto outros apresentam expressão aumentada após a
crise epilética: Ex.: miR-132, miR-134

-desregulação dos miRNAs em cérebros de pacientes

relacionados com a progressão da doença: miR-9, miR-29,
miR-34, miR-106, miR-107 (regulam genes chaves envolvidos
na DA).
-miR-107: ( mais relevante) baixa expressão nos estágios
Doença de iniciais da doença no lobo temporal, correlacionado com alta
Alzheimer expressão de BACE1 (enzima beta secretase 1)
-miR-29: casos esporádicos de DA - tem sítios de ligação para
o gene BACE1 (sua perda é correlacionada com alta expressão
desse gene)
-miR-153: contribui para a regulação pós-transcricional dos
genes APP/APLP2
 miRNA E DOENÇAS NEUROLÓGICAS

-distúrbio neurodegenerativo, perda da cognição e

alterações psiquiátricas, perda progressiva de neurônios do
córtex e corpo estriado
-expansão do códon CAG no gene HTT (proteína
huntingtina)
Doença de
-miR-200: alterado no córtex de camundongos mutantes de
Huntington
HTT nas fases iniciais da doença (comprometimento de genes
envolvidos na plasticidade e sobrevivência neuronal)
-hopexpressão : miR-146a, miR-125b, e miR-150
-hiperexpressão: miR-34b
-desregulação: Dicer, Drosha e Exportina-5

Outras Doenças
-Esquizofrenia
-Autismo
-Doenças Cardiovasculares
Doenças autoimunes ou inflamatórias
crônicas
 miRNA COMO BIOMARCADORES DE
DIAGNÓTICO E PROGNÓSTICO

Padrão de expressão dos miRNAs: -Utilização de biópsias, fluidos

assinatura potencial para a biológicos como soro, plasma,
classificação, diagnóstico, prognóstico urina, escarro, etc
e resposta terapêutica

•Diabetes: níveis séricos do miR-23a (sensibilidade de 79,2% e

especificidade de 75%) capaz de discriminar pacientes com
diabetes do tipo 2
•Epilepsia: níveis séricos do miR-106-b-5p (melhor preditor com
sensibilidade de 80,3% e especificidade de 81,2%)
•Esclerose múltipla: desregulação de miRNAs em linfócitos T
isolados do sangue
•Doença de Alzheimer: níveis séricos do miR-342-3p apresentou
melhor sensibilidade 81,5% e especificidade 70,1%
 PRINCIPAIS MODULADORES DE miRNAs EM
DESENVOLVIMENTO

-273 testes clínicos registrados na plataforma clinicaltrials

-49% das patentes relacionadas a tecnologias para modulação
de miRNAs e novas técnicas de administração dos moduladores
de miRNAs.
 Segurança da Terapia
-Um único miRNA pode regular os níveis de centenas de
proteínas → consequências de hipoexpressão ou expressão
ectópica
-relatos de mortes em camundongos → devido em parte a
saturação do fator de transporte” exportina 5”, que transporta o
miRNA do núcleo p/ citoplasma
-utilização de menor concentração possível de siRNA que
forneça eficácia terapêutica
-siRNA alteram a expressão de genes alvos e não alvos
-Outras barreiras: toxicidade associada a entrega; pobre
transfecção, pouco conhecimento da biodistribuição, liberação
sistêmica, degradação na circulação, sequestração endossomal e
estimulação da resposta imune celular