A transcrição do DNA conduz à síntese de

transcritos primários de RNA

Processamento de unidades
de transcrição Após processamento originam
RNAs funcionais
• mRNA hnRNA - RNA nuclear heterogéneo
(grande heterogeneidade de dimensões
entre transcritos de um mesmo gene)
• tRNA
• rRNA Frequentemente encontram-se complexados com
proteínas (34 a 120 kDa) formando hnRNPs - Partículas
heterogéneas de ribonucleoproteína
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Processamento de mRNA
• Podem interagir com outras proteínas e
actuar nos vários passos do Procariotas - transcrição e DNA
processamento
• Podem ser importantes no transporte do
tradução acopladas
mRNA para o citoplasma (a sequência de DNA é transcrita rans
directamente na de mRNA) RNA
A transcrição de um gene resulta num
transcrito primário que é processado no
núcleo antes de ser exportado para o
citoplasma
Frequentemente encontram-se complexados com Eucariotas - transcrição e tradução ocorrem em
proteínas (34 a 120 kDa) formando hnRNPs - Partículas
heterogéneas de ribonucleoproteína
compartimentos diferentes
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 Processamento de mRNA Processamento de mRNA
Nos eucariotas, existem muitas sequências internas de um
FIGURE 9.18Intrões
Structure and organization of a eukaryotic
gene que nunca aparecem num mRNA maduro gene. A gene is divided into several functional units. The
…
(nem na sequência de aminoácidos que o gene codifica) Geralmente
transcribed region actsum
as aintrão interrompe
template a integridade
for synthesis of da sequência codificante…
Intrões (100nt -100kb; 70nt-7kb) mRNA, which is then edited and translated into the
… mas,
protein product of the gene. The transcribed region is ela é contínua na sequência de cDNA.
interspersed with noncoding sequences that partition the
region into coding sections (exons) and noncoding sections
(introns). The transcribed region is flanked on either side
by noncoding sequences that play a role in regulation of
the gene. Most of the regulatory sequence elements are in
the 5′ flanking region. The first 1,000 bp or so of the 5′
flanking region is referred to as the gene promoter, as it
contains sequence motifs important for the “promotion” of
transcription. One of the most highly conserved
regulatory elements is the TATA box, which is usually
found within the first 50 bp of the transcription start
site. The TATA box coordinates the recruitment of
… outras prevalecem no mRNA maduro e são expressas
RNAPII to the gene.
Exões (100 a 500 nt)
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Processamento de mRNA Processamento de mRNA
Intrões (algumas verdades) Modificação da extremidade 5´
A maior parte dos genes eucarióticos possuem intrões, mas variam
muito de número (mRNA 0 – 326) e dimensão. Modificação da extremidade 3´
Foram encontrados alguns intrões em bactérias e Excisão de intrões
bacteriófagos, apesar de serem situações extremamente raras.
A sequência dos exões é mais conservada do que a dos intrões.
A estrutura de um gene (exões vs. intrões) é idêntica em
todos os tecidos de um organismo.
A ordem dos exões é idêntica no genoma e no mRNA maduro.
A posição dos intrões geralmente é conservada em genes
homólogos de diferentes espécies.
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 Processamento de mRNA
Modificação da extremidade 5’ (capping)
A extremidade 5’ é bloqueada pela
fixação de um resíduo modificado
de guanina (cap)
guaniltransferase
5’ 5’
Gppp + pppApNpNp……
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Processamento de mRNA
Modificação da extremidade 3’
A maioria dos mRNA
possui na extremidade 3’
uma sequência
poliadenilínica (200-300 nt)
Extremidade (cauda) poli(A)
mRNA poli(A)+
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Processamento de mRNA
Modificação da extremidade 5’ (capping)
Estabiliza os mRNA impedindo a sua Após adição da guanina
degradação enzimática invertida, a extremidade
5’ é ainda alvo de várias
Intervém na formação do complexo de metilações
iniciação da tradução
7-metilguanosina (m7G)
5’ 5’
GpppApNpNp + pp + p
Possui uma orientação inversa
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Processamento de mRNA
Modificação da extremidade 3’
A adição da cauda poli(A) é efectuada num processo independente da
Confere estabilidade ao mRNA, terminação
impedindo a sua degradação (?)
Mas como é adicionada?
Poderá estar relacionado com a
tradução do mRNA (?)
Após clivagem do pré-mRNA ocorre a
Possui um grande interesse prático poliadenilação
(ex: separação de mRNA de outros
RNAs ou amplificação de cDNAs)
Em ambos os casos parece estar envolvido
o reconhecimento de uma sequência de
poliadenilação AAUAAA
10 a 35 nt
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• Estrutura dos mRNAs de plastos e mitococôndria Processamento de mRNA
– Ausência de 5’cap e cauda de adeninas 3’
Excisão de intrões (RNA splicing)
– (mit)mRNA 5’PPP
– (cp)mRNAs 5’P Remoção dos intrões do
transcrito primário
– 5’UTR e 3’UTR podem formar ansas (estabilização e regulação)
– Pequena porção de (cp)mRNA contém caudas curtas poly(A) Existem vários sistemas de splicing:
(degradação eficiente de fragmentos de mRNA modificados) 1. O spliceossoma - que reconhece pequenas sequências
consensus (consiste num complexo de proteínas e
ribonucleoproteínas)
2. O próprio RNA (com a sua estrutura secundária) possui
actividade catalítica - RNA catalítico
Em ambos os casos, a excisão é efectuada por reacções de transesterificação
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Processamento de mRNA Processamento de mRNA
Excisão de intrões (RNA splicing) pelo spliceossoma
O spliceossoma contêm pré-mRNA, RNAs e proteínas
branch site
Existem sequências específicas,
snRNPs bastante conservadas,
que delimitam os intrões e os
Reconhecem sequências consensus exões (splice sites)
A excisão é efectuada devido ao
U4 reconhecimento do par GU-AG
Branch site a montante (20-40 nt) do
splice site 3’
UACUAAC sequência conservada em
leveduras , mas não em plantas ou animais
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 Processamento de mRNA Processamento de mRNA
Excisão de intrões (RNA splicing) pelo spliceossoma Excisão de intrões (RNA splicing) por RNA catalítico
branch site
Ocorrem duas reacções de transesterificação
Processo de excisão menos frequente,
• entre 2’-OH da adenosina do local de encontrado em organelos e bactérias
ramificação (branch point) e a
extremidade 5’ do intrão (upstream do
GU) Estão unicamente dependentes da estrutura
• entre 3’-OH do exão da extremidade 5’ e secundária do RNA a sofrer excisão
a extremidade 3’ do intrão (downstream
do AG)
Podem ser reconhecidos dois tipos de intrões:
 Intrões do grupo II - presentes em alguns
O intrão é libertado na forma de uma pré-mRNAs, pré-rRNAs e pré-tRNAs de
pequena ansa ou laço (lariat) cloroplastos e mitocôndria de plantas e fungos.
 Intrões do grupo I - presentes nos genes
Os dois exões rRNA dos protozoários, mitocôndria de leveduras
são ligados
e outros fungos, plantas e cloroplastos.
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Processamento de mRNA Processamento de mRNA
Excisão de intrões (RNA splicing) por RNA catalítico Excisão de intrões (RNA splicing) por RNA catalítico
 Intrões do grupo II - os splice sites são  Intrões do grupo I - o branch site não
muito semelhantes aos reconhecidos consiste numa adenosina do próprio
pelo spliceossoma e o processo químico RNA, mas sim de uma guanosina que
também ataca o splice site 5’
Sugerem um processo
evolutivo da excisão a partir
de uma reacção autocatalítica
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 Processamento de mRNA Processamento de mRNA
Excisão de intrões (RNA splicing) Excisão de intrões (RNA splicing)
O processo de splicing alternativo permite que uma única sequência O processo de splicing alternativo permite que uma única sequência
de DNA possa codificar diferentes proteínas de DNA possa codificar diferentes proteínas
Variante  Intrões Variante 
Troponina Troponina
Variante ß Variante ß
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Processamento de tRNA Processamento de tRNA
Nos eucariotas existem cerca de 400 genes para os diferentes A excisão dos tRNA não é efectuada por reacções de transesterificação
tRNAs (75 a 80 nt) … Em etapas distintas são efectuadas reacções catalisadas por
… cerca de 10% possuem um pequeno intrão diferentes enzimas
(14 - 46 pb)
Todos os intrões possuem
a sequência complementar
ao anticodão do tRNA
Não existe qualquer tipo de
sequência consensus
Endonuclease RNA ligase
A excisão do intrão depende do
reconhecimento da estrutura
secundária
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 Processamento de tRNA Processamento de rRNA
O processamento dos tRNAs ainda envolve outras modificações Nos eucariotas, vários rRNAs são codificados por uma única
• Clivagem da extremidade 5’ pela RNase P unidade de transcrição (repetida inúmeras vezes em tandem)
RNA 28S (4700 nt)
Subunidade maior 60S RNA 5.8S (160 nt) Pré-rRNA (45S)
• Modificação de algumas bases (edição) RNA 5S (120 nt)
Ribossomas
Substituição de UU por CCA 80S Subunidade menor 40S RNA 18S (1900 nt)
Adição de grupos TC loop
metilo e isopentenilo a
purinas
D loop
Metilação do 2’-OH às Dihidrouridina
riboses anticodão
loop
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O processamento dos precursores 45S produz 3 rRNA Processamento de rRNA
maduros, que requerem várias RNases
A síntese e o processamento do rRNA
ocorre no nucléolo
• Após a sua síntese, o transcrito primário é
imediatamente associado a proteínas
• Durante o seu processamento, além do pré-
rRNA sofrer várias clivagens, vários nucleótidos
(≈110) sofrem metilações nos 2’-OH das suas
riboses
A especificidade destas reacções
ocorre devido à hibridação com
pequenos RNAs nucleolares
(snoRNA), constituintes de snoRNPs
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 Processamento de rRNA Nos cloroplastos as unidades de transcrição são
Nas bactérias, vários rRNAs são codificados por operões que policistrónicas e incluem 2 tRNAs
contém igualmente genes para alguns tRNAs Maioria do cpDNA contém 150 genes, mas cerca de 60 unidades de transcrição
(existe um total de 7 operões em E.coli)
RNA 23S (2904 nt)
Subunidade maior 50S
RNA 5S (120 nt) Pré-rRNA
Ribossomas
(30S)
70S Subunidade menor 30S RNA 16S (1541 nt)
1 kb 1 kb
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Transporte de mRNA Degradação de mRNA
No citoplasma todos os RNAs estão sujeitos à
O transporte de mRNAs eucarióticos é regulado degradação
• ~1/2 dos transcritos primários não saem do núcleo e A estabilidade varia em resposta a sinais
são degradados de regulação (principal ponto de controlo)
• mRNAs maduros saem através dos poros nucleares
tRNAs e rRNAs mRNAs variável
mRNAs armazenados [caudas poli(A) curtas (elevada) (minutos a meses)
(15-90 As vs 100-300 As)] são protegidos por
proteínas que inibem a tradução
Sequências e processos que afectam o mRNA:
– Elementos ricos em AU
– Estrutura secundária
Caudas poli(A) promovem a tradução – Enzimas de desadenilação (remoção de As da cauda)
– Remoção da extremidade 5’ (de-capping)
– Clivagem interna do mRNA e degradação de fragmentos
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 Regulação da transcrição em eucariotas
Existem dois tipos de silenciamento de genes
Silenciamento que inactiva as
regiões promotoras
Silenciamento transcricional
(TGS)
O silenciamento pós-
transcrição do gene da
chalcone synthase (chs)
em Petunia permite a
identificação de
diferentes padrões de
pigmentação
FAC. CIÊNCIAS DA VIDA
Regulação da transcrição em eucariotas
RNAi descoberto em C. elegans (1º animal) na tentativa de
usar asRNA in vivo
(2006 Prémio Nobel de
Craig Mello Andrew Fire
- Testemunho: RNAs "sense" também produziam supressão do
gene alvo!
- RNAs “sense” contaminados com dsRNA.
- dsRNA era o agente supressor.
FAC. CIÊNCIAS DA VIDA
Silenciamento que, apesar de
manter o promotor activo, evita
a acumulação de mRNA
Silenciamento pós-transcrição
(PTGS)
Biotecnologia
Fisiologia e Medicina)
Biotecnologia
TGS: =>Iniciação da transcrição (ex.
factores de transcrição) e
=>Activação estrutural de genes
(complexo remodelador da
cromatina/metilação DNA/ Associação
a proteínas/Modificação histonas:
transposões, genes retrovirais)
Fragmento introduzido de CHS
Used from ~1980 on, to repress Níveis  constantes do transgene
specific genes CHS introduzido
Alternative to gene knock-
outs, which were/are very
difficult to do in higher Fragmento endógeno de CHS
plants and animals
Redução da expressão (50x) em
qualquer fase do desenvolvimento
Theory: by introducing an antisense
gene (or asRNA) into cells, the asRNA
would “zip up” the complementary
Napoli et al. (1990) The Plant Cell (2): 279-289.
mRNA into a dsRNA that wouldDAnot
FAC. CIÊNCIAS VIDA be Biotecnologia
translated
The “antisense effect” was
highly variable, and in light of
the discovery of RNAi, asRNA
probably Interferência induzida
inhibited its target by pelo dsRNA no mRNA mex-3
inducing RNAi
em C.rather than
elegans.
inhibiting translation
Detecção do mRNA mex-3
nos embriões por
hibridação in situ
Testemunho
mex-3 (mRNA) asRNA (c)
ou dsRNA (d) injectado
nos ovários de C. elegans.
(a) Embrião testemunho
(b) Embrião testemunho Antisense RNA dsRNA
hib. com sonda mex-3
Conclusões: (1) a redução do mex-3 mRNA é maior em dsRNA vs asRNA.
(2) o sinal de supressão move-se de uma célula para outra.
Fig. 16.25 Molec. Biology – Weaver 2012
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Regulação da transcrição em eucariotas
Silenciamento pós-transcrição (PTGS) ou RNAi
dsRNA Sinal para o silenciamento
respectivo gene (supressão)
Ocorre a diminuição de hnRNA do gene
suprimido e também uma total ausência do
respectivo mRNA no citoplasma
Degradação do RNA no núcleo e no citoplasma??
FAC. CIÊNCIAS DA VIDA
Mecanismo básico do RNAi
RISC RNA-induced silencing complex
FAC. CIÊNCIAS DA VIDA
Regulação da transcrição em eucariotas
Silenciamento pós-transcrição (PTGS) ou RNAi
• A supressão de determinados genes ocorre em plantas transgénicas ou
pós-transcrição do mecanismo de resistência a vírus
Apenas as regiões • Este tipo de silenciamento pode ocorrer no citoplasma (alguns vírus de
dos exões é que RNA que não entram no núcleo são inibidos por este processo)
podem funcionar
como RNAi e não a • Alguns vírus contêm proteínas que suprimem o silenciamento:
dos intrões HCPro – 1ª identificada, encontrado nos “potyvirus” (hospedeiros das plantas)
P19 – liga-se a siRNAs e evita a formação de RISC, “tomato bushy stunt virus”
Tat - proteína que se liga ao RNA, HIV
• O agente de supressão (siRNA) pode passar para células que não contêm
genes suprimidos
Biotecnologia FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia
• Dicer-like (DCL) endonucleases
(reconhecem e clivam dsRNAs)
• dsRNAs 21nt
• Uma das cadeias dsRNA
(siRNA) é carregada noutra
endonuclease argonauta (AGO)
que a utiliza para encontrar
ssRNAs alvo
Regulam desenvolvimento das plantas Inibem a transcrição
Biotecnologia e respostas a stresses rambientais
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 Resumo das diferenças entre os miRNAs de plantas e animais
Millar & Waterhouse (2005) Plant and animal
microRNAs: similarities and differences. Functional
& Integrative Genomics 5: 129-135
Plantas Animais
# genes miRNA: 100-200 100-500
• miRNAs regulam os níveis de Loc. no genoma: regiões intergénicas regiões intergénicas, intrões
expressão dos genes, em
diferentes tecidos e tempos. Clusters de miRNAs: incomum comum
miRNA biossíntese: Dicer Drosha, Dicer
• Os miRNAs clivam o mRNA
do gene alvo (nas plantas). Mec. de repressão clivagem mRNA repressão tradução
Alvo miRNA no gene: predominante/ ORF predominante/ 3′-UTR
• Os miRNAs reprimem a
tradução (os animais) # locais de ligação
miRNA no gene alvo: geral/ um geral/ vários
Funções genes-alvo Genes reguladores cruciais para o desenvolvimento
conhecidos: enzimas proteínas estruturais, enzimas
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Vários processos de regulação da expressão
actuam a nível da pós-transcrição
 Na estabilização dos mRNAs (taxas de turnover)
Todos estes processos
 Na excisão alternativa de intrões dependem de RNA-binding
proteins
 Na regulação do mecanismo de tradução
 A regulação da tradução também poderá estar associada a
uma tendência de utilização de determinados codões para
traduzir um aminoácido (codon bias)
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