Sequenciação de genomas

• A sequenciação convencional permite amostrar apenas alguns milhares de bases por

reação
• A sequenciação de genomas gera uma grande quantidade de sequências derivadas do
genoma que se apresentam de forma desconexa

Clonagem a partir de mRNA

• Requer a sua transformação em cDNA
• Pode ser efetuada em fagos (vetor M13 e ƛ)
• O vírus tem que ter transcriptase reversa

Tecnologia DNA recombinante

• Aplicações: Produção de proteínas humanas de interesse em bactérias, Terapia génica de
algumas doenças hereditárias, Recuperação de espécies extintas [determinação de
paternidade não é]

Mecanismo de Transcrição em procariotas

• A localização das regiões -35 e -10 dos promotores determina qual das cadeias de DNA
é a codificante e de que modo a RNA polimerase liga ao DNA, o que por sua vez
determina o sentido em que decorre a transcrição
• O promotor possui 2 regiões para o início da transcrição, nomeadamente a sequência de
consenso TATAAT (-10 ou Pribnow) e a sequencia TTGACA (-35)
• A síntese do RNA inicia-se com a ligação do primer à cadeia de DNA, que sinaliza à RNA
polimerase onde iniciar a transcrição do DNA em RNA

Enzimas de restrição
• Isosquizómeros – endonucleases de restrição capazes de reconhecer a mesma sequência
de nucleótidos
• As sequências de DNA que a maioria das enzimas de restrição reconhecem são as mesmas
em ambas as cadeias de DNA = palindrómicas
• A hidrolise enzimática por parte das enzimas de restrição dá-se ao nível das ligações
fosfodiéster
Endonucleases tipo II
• Adaptadores – cadeia simples, elevada especificidade, sequencias de elevada homologia

Reação PCR
• Técnica de amplificação exponencial
• Taq polimerase – temperatura prefencial = 72 ºC
• A sua especificidade depende da sequência a amplificar e da seleção cuidadosa dos
iniciadores

Doenças genéticas
• Piebaldismo – autossómica dominante
• Fenilcetonúria – gene mutante codifica proteína não funcional
• Anemia Falciforme e Albinismo – autossómica recessiva
• Hipofosfotemia – heterossomica dominante ligada ao X
• Sindrome de Rett – heterossomica dominante ligada ao X
• Fibrose cística – pleiotropia (1 gene muitos efeitos), autossómica recessiva, a expressão
da doença pode ser causada por genes modificadores
• Hemofilia – heterossómica recessiva ligado ao X
• síndrome de Angelman – Pode ser causado por uma microdelecção na região crítica do
cromossoma 15 materno. Não é transmitido aos filhos de homens afetados pela síndrome

Plantas transgénicas
• + fácil produzir do que animais transgénicos
• Nas plantas não há diferença entre células somáticas e germinativas
• Genes podem ser introduzidos em células somáticas e tecidos

Terapia genética
• Consistem em vírus modificados, de modo a não causarem doenças no organismo recetor,
nos quais se insere o gene de interesse
• Introdução de gene em falta + substituição do gene mutado + inibição da expressão de
um gene
• Adenovírus – ao contrário da maioria dos retrovírus, conseguem infetar células que não
se encontram em divisão. Não se integram no DNA do hospedeiro
• Retovirus – transportam genes de dimensões grandes
 • Sistemas não virais – são alternativas aos vírus por não causarem qualquer tipo de
doença e serem pouco tóxicos. + fácil manipular. Podem ser administrados em
concomitância com outros vetores. Utilizam sistemas lipídicos e não lipídicos. Podem
usar lipossomas, DNA “despido” e polímeros de aminoácidos. São preferíveis no que
respeita à biossegurança
• Lipoplexos – catiónicos são mais usados

Cancro
• Algumas inflamações crónicas podem predispor para o desenvolvimento do cancro
• A carcinogénese ocorre em diferentes estádios onde ocorrem alterações genéticas e
epigenéticas.
• Um proto-oncogene transforma-se num oncogene por mutação com efeito dominante
(mutação com ganho de função) – não é efeito dominante negativo
• O gene retinoblastoma é um gene supressor tumoral, sendo necessário a existência de 2
alelos mutados para ocorrer desenvolvimento do tumor
• gene supressor tumoral – necessário que haja dano nos 2 alelos para ocorrer a
transformação neoplásica (efeito recessivo, mutação com perda de função)
• A alta incidência do cancro no mundo ocidental é devida aos hábitos alimentares
• Há uma diminuição da incidência de cancro do colo uterino
• Há um aumento de cancros relacionados com tabaco
• Indivíduos que apresentam um alelo mutante do gene APC têm risco aumentado para o
desenvolvimento da polipose adenomatosa familiar
• A maioria dos cancros ocorrem em indivíduos com mais de 65 anos
• Há uma diminuição da incidência de cancros relacionados com infeções crónicas nos
países desenvolvidos

Calvície – característica influenciada pelo sexo

Alelos letais – dominantes para a expressão de um dado fenótipo e recessivo para a letalidade

Dominância incompleta – homozigóticos têm doença mais grave que heterozigóticos

Atrofia – redução dos elementos estruturais e das funções celulares com diminuição do volume
das células/órgãos atingidos

Hipertrofia – aumento do volume ou tamanho daas células e da capacidade funcional

Hiperplasia – aumento do número de células de um tecido ou órgão

Mutação sinónima – estrutura e função da proteína não se altera

Durante o protocolo de “extração salina” do DNA, uma solução salina de elevada concentração
utilizada com o objetivo de precipitar contaminantes

Uma solução de DNA ou RNA é considerada como apresentando um grau de pureza elevado Abs
260nm/ Abs 280nm >2.0
Mutação missense – altera 1 codão por outro que determina aminoácido diferente

Dideoxinucleótidos – possuem um grupo hidroxila (-OH) ausente na posição 3' da pentose que
faz com que interrompam o alongamento da fita de DNA durante a síntese, uma vez que a
formação da ligação fosfodiéster não pode ocorrer sem esse grupo. Na sequenciação pelo método
de Sanger, não existem na mesma proporção que os deoxinucleótidos

Origem das células-tronco - Células embrionárias, cordão umbilical e medula óssea

slicing alternativo – permite originar diferentes proteínas, a partir de uma mesma sequência de
DNA (remoção dos intrões). Ocorre depois da adição da cap e antes da adição de poliA

crRNA – possui sequencia guia de RNA no sistema CRISPR

bacteriófagos com um ciclo de vida lítico – não incorporam o seu DNA de fita simples no
genoma do hospedeiro. Podem ser usados na expressão genica, mas não é a principal função

Mutação dominante negativa – devido ao produto do alelo mutante interferir negativamente

com o produto do alelo selvagem, não deixando que este tenha a sua função biológica

As ligações fosfodiéster, numa molécula de DNA, ocorrem entre os carbonos 5 e 3 das pentoses,
de nucleótidos adjacentes.

técnica de qRT-PCR – permite a quantificação e deteção de moléculas específicas de mRNA.

Baseia se na monitorização contínua da reação de PCR

Os fagos são vírus que infetam e se desenvolvem em bactérias. apresentam-se como uma
molécula linear de cadeia dupla local

Os cosmídeos são plasmídeos contendo os locais cos das extremidades do genoma do fago λ

A mutagénese dirigida permite provocar uma mutação pontual num gene a qual pode ser
traduzida por uma substituição de um aminoácido numa proteína

Translocações são alterações genéticas que ocorrem quando um pedaço de um cromossomo se

quebra e se liga a outro cromossomo não homólogo (ou seja, não é um par de cromossomos
idênticos). Como resultado, as informações genéticas que estavam contidas nesses cromossomos
podem se misturar ou se recombinar. Os portadores de translocações recíprocas usualmente têm
fenótipo normal.

Mutações dinâmicas ocorrem devido à instabilidade genómica na região repetitiva de tripletos.

taxa de mutação no DNA mitocondrial é mais elevada comparativamente à taxa de mutação do

DNA nuclear devido aos genes não terem intrões e à proximidade da cadeia fosforilativa e devido
aos genes não estarem associados a histonas e não sofrem crossingover.

Biorremediação – utilização de microrganismos para limpar o meio ambiente

Biotecnologia Vermelha: Saúde;

Biotecnologia Verde: Agricultura;

Biotecnologia Branca: Indústria.

Biotecnologia Azul: marinha. utiliza microrganismo ou biocompostos com aplicação ambiental,

medicinal e agrícola

Biotecnologia Amarela: alimentos

Uma doença genética que ocorre numa dada família pode apresentar penetrancia incompleta
devido a fenocópia (genótipos diferentes com fenótipos iguais/semelhantes).

Gene TP53 – gene supressor tumoral

Vetor de inserção – usados para inserir um novo gene num organismo. Permitem a replicação de
fragmentos de DNA específicos em larga escala

Vetor de substituição – usados para substituir um gene existente num organismo por outro
modificado. Permite a troca de genes mutados por genes saudáveis, impedindo a expressão génica
do gene mutado (terapia génica)

Diferenças entre IonTorrent e Illumina:

• IonTorrent – deteta iões H+ libertados durante a polimerização do DNA, ou seja, a
sequenciação é com base nas alterações do pH. É adequeado para fazer bibliotecas
• Illumina – deteta cada nucleótido individualmente após incorporação. É adequado para
diagnóstico

Processo de capping do RNA

• Remoção de um fosfato na extremidade 5’
 • Adicção de uma guanina metilada na extremidade 5’
• Particularidades: o rRNA e tRNA não possuem. Protege o mRNA da ação de
exonucleases. Serve de ligação aos ribossomas durante a síntese proteica

Métodos de inserção de DNA nas células

• Naturais – transdução, transformação, conjugação
• Artificiais – eletroporação, injeção, fusão de protoblastos

Tipos de terapia genética

• Ex vivo – células são modificadas fora do corpo e transplantadas novamente para o
paciente
• In vivo – genes são modificados nas células dentro do corpo
• Somática – nas células somáticas, não afeta a hereditariedade
• Na linha germinal – ocorre no nível primário do ovo e esperma

Problemas da terapia genética

• Possibilidade de induzir um tumor se o DNA for integrado no lugar errado do genoma
• Desordem de vários genes