MÉTODOS IMUNOQUÍMICOS

São métodos que utilizam, como indicador, marcadores como enzimas, substâncias
fluorescentes e isótopos para a detecção de anticorpos ou antigénios.
Os métodos mais usados são a imunofluorescência (FAT, IFA), enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA e EIA) e radioimmunoassay (RIA).

ELISA – ENSAIO DE IMUNOADSORÇÃO ENZIMÁTICA

Esta técnica basea-se no facto de um dos reagentes (antigénio ou anticorpo) ser

imobilizado numa superfície sólida de suporte e permitir a fixação de um reagente
marcado com uma enzima. A degradação enzimática do substrato cromogénico, produz
um factor de amplificação que facilita a detecção da enzima imobilizada na fase sólida.

O teste ELISA pode ser usado para detectar anticorpos, antigénios e outros componentes
do soro/plasma.

Material e reagentes (alguns exemplos)

Microplacas (geralmente de poliestireno); micropipetas; incubadora

Buffer carbonato-bicarbonato pH 9.6: utilizado para cobrir a placa com o antigénio.

PBS-T (Phosphate buffered saline com Tween 20 ou 80): utilizado para lavagens; para
remover reagentes que não se fixaram.

PBS-TM (PBS-T e leite): utilizado para bloquear espaços não ocupados pelo antigénio.

Amostras: diferentes tipos por exemplo soro e plasma para a detecção de anticorpos,
extractos celulares e fezes para a detecção de antigénios.

Conjugado: proteínas marcadas/conjugadas com enzimas. As enzimas mais usadas são a

peroxidase e a fosfatase alcalina. As enzimas devem actuar sobre o substracto que por
degradação enzimática permite o aparecimento de um produto colorido.

Substrato: os mais usados são ABTS (azino 2.2’di-3 ethil-benzothiazoline-sulfonate) em

reacções positivas muda para verde; PAHBA (para-amino-5-hydroxi-2-benzoic acid) em
caso de reacção positiva muda para castanho.
 Método indirecto para a detecção de anticorpos
(ex: detecção de anticorpos contra a Ehrlichia ruminantium)

1. Cobrir as placas com 100 l de antigénio a uma diluição apropriada (1:1000); incubar
a placa 1 hora a 37ºC (ou durante a noite “overnight” a 4oC).

2. Cobrir a placa com PBS-TM (PBS contendo 0.1% de Tween 20 e 1% de leite); incubar
a 37ºC durante 15 minutos;

3. Lavar as placas 3 vezes em PBS-T;

4. Colocar em 2 orifícios da placas, 100 l de cada amostra de soro (1:200); incubar a

37ºC durante 1 hora;

5. Lavar as placas 3 vezes em PBS-T;

6. Cobrir todos os orifícios da placa com o conjugado (anticorpo marcado com peroxidase
contra a espécie animal em teste) diluido 1:2000; incubar 1 hora a 37ºC;

7. Lavar as placas 3 vezes em PBS-T;

8. Cobrir as placas com 100 l do substrato (ABTS+H2O2); incubar 30 minutos à

temperatura ambiente.

Leitura e interpretação dos resultados

A existência da peroxidase no caso de reacção positiva, provoca a digestão enzimática do

substrato com a mudança de cor (verde no caso de ABTS e castanho no caso de PAHBA).
Os resultados podem ser determinados visualmente, de forma qualitativa, interpretando-
se como positivo (cor mais intensa) ou negativo.
Outra forma de leitura mais precisa, é a que é feita no espectofotómetro e com base nas
densidades ópticas faz-se a interpretação dos resultados.

Outros tipos de ELISA:

Competitivo e sandwich.
IMUNOFLUORESCÊNCIA

Este teste usa reagentes marcados com substâncias fluorescentes como o isotiocianato de
fluoresceína, lissamina rodamina B, isotiocianato tetrametil rodamina. As substâncias
fluorescentes permitem a visualização do local da reacção antigénio-anticorpo. A
substância fluorescente quando recebe a luz de determinado comprimento de onda
(absorção de luz ultra-violeta 290-495 nm), emite uma radiação de maior comprimento
de onda (525 nm). A fluorescência é detectada no microscópio de fluorescência com luz
ultravioleta.

O teste pode ser usado para detectar antigénios e anticorpos.

Método directo para detecção de antigénios

(ex: raiva)

1. Fazer esfregaços a partir do material infectado;

2. Secar à temperatura ambiente e fixar em acetona 20 a 30 minutos;

3. Retirar a acetona e secar;

4. Cobrir a preparação com o conjugado (anticorpo marcado com substância fluorescente)

e incubar 30 minutos em atmosfera húmida a 37ºC;

5. Lavar com PBS durante 10 minutos;

6. Cobrir com uma lamela e observar.

Método directo
Outros métodos:
Método indirecto; sandwich.

Método indirecto