MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DOS VÍRUS

Os testes usados para o diagnóstico de vírus podem ser agrupados do seguinte modo:
I. Testes que demonstram a presença do vírus ou antigénios virais
II. Testes que demonstram a presença de anticorpos específicos

O sucesso do diagnóstico dependerá de vários factores, como por exemplo, a colheita de

amostras adequadas (sangue, fezes, raspagens cutâneas ou de mucosas, aspirados, urina,
leite, biópsias, secreções, tecidos, etc.), o período em que é feita a colheita, o transporte e
o processamento das mesmas.

I. Testes que demonstram a presença do vírus ou antigénios virais

Testes laboratoriais nesta categoria incluem:

A) Isolamento e identificação dos vírus
B) Demonstração do vírus, antigénios virais ou ácidos nucléicos virais

A) Isolamento e identificação dos vírus

O isolamento dos vírus constitui o critério definitivo para a avaliação de outros métodos
de diagnóstico (é considerado “gold standard”). O mesmo pode ser efectuado em animais
de laboratório, cultura de células e ovos embrionados. A eleição do método dependerá
fundamentalmente do vírus suspeito.

Se as condições óptimas de isolamento do vírus forem criadas, o isolamento é um método

bastante sensível e permite estudos posteriores do vírus em questão. Contudo, o
isolamento de vírus é trabalhoso, oneroso e moroso. O seu uso é recomendado para vírus
específicos e não como método de diagnóstico de rotina.

B) Demonstração directa do vírus, antigénios virais ou ácidos nucléicos virais

a) Demonstração directa do vírus: microscopia electrónica

A microscopia electrónica é usada para a demonstração directa do vírus. É um método

rápido mas pouco sensível. A concentração vírica necessária para que os vírus sejam
visualizados é de cerca de 106 a 107 por mililitro. Resultados negativos não indicam
necessariamente a ausência dos vírus.

Em alguns casos clínicos como infecções entéricas ou da pele, o número de vírus

geralmente é superior a 106. Contudo, vezes há em que é necessário isolar o vírus em
numerosas passagens de forma a serem obtidas tais concentrações.

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No geral, a morfologia dos vírus é suficientemente característica para a sua correcta
classificação a nível de família, visto que membros da mesma família possuem mesma
morfologia. Em algumas famílias como a Poxviridae, Papovaviridae e Reoviridae em
que existem diferenças ultraestruturais significativas entre géneros da mesma família,
pode-se identificar até o nível de género.

A desvantagem do método está associada ao custo do microscópio electrónico e as

despesas para a sua manuntenção.

b) Para a demonstração de antigénios virais podem ser usados os seguintes

testes:
 Imunofluorescência (FA)

 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

 Radioimmunoassay (RIA)

 Fixação do complemento (CFT)

 Imunodifusão

 Hemaglutinação

c) A demonstração de ácidos nucléicos virais pode ser feita através de várias

técnicas, por exemplo:
 Polymerase chain reaction (PCR)

 Hibridização “in situ”

II. Testes que demonstram a presença de anticorpos específicos

A seroconversão para um determinado vírus pode ser demonstrada usando diferentes

testes, como por exemplo ELISA, CFT, vírus neutralização (VN), inibição da
hemaglutinação (HAI), imunofluorescência indirecta e RIA.

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ISOLAMENTO DE VÍRUS EM CULTURA DE CÉLULAS

A cultura de células envolve o crescimento das células in vitro como camadas únicas –
monolayers - aderidas a superfície (de plástico ou de vidro) ou como uma suspensão.
Exemplos de tecidos usados são: rins, pulmões, testículos, etc. Os tecidos ou células
podem provir de órgãos de animais ou do homem, de órgãos embrionários ou adultos,
tecidos normais ou tumorais.

De preferência são usados órgãos ou tecidos de fetos, embriões ou animais jovens

porque:
- os tecidos estão em fase activa de crescimento
- as células têm uma alta capacidade de adaptação e proliferação
- possibilidade de não estarem infectadas

Existem diferentes categorias de culturas celulares:

 Primária - derivada de material colhido directamente dos tecidos animais. Tecidos

fetais são geralmente usados para este fim. As culturas primárias são as mais
sensíveis para o isolamento de vírus mas requerem a sua constante preparação a
partir de material fresco.

 Secundária – subcultura da cultura primária. Têm um período de vida limitado.

 Contínua – com capacidade para uma propagação infinita in vitro. Existem várias
linhas contínuas que são usadas como por exemplo, Vero cells (de macacos),
BHK-21 (baby hamster kidney cells).

Inoculação e manutenção de culturas celulares

As culturas celulares são geralmente mantidas em meios de crescimento apropriados, que

garantam condições de assépcia, condições químicas e nutricionais semelhantes as do
meio das células in vivo. Alguns componentes básicos dos meios de cultura são:

- soluções salinas
- carbohidratos
- aminoácidos
- vitaminas
- aditivos biológicos

As culturas celulares são conservadas em frascos ou em placas. As placas são

particularmente úteis para testes de neutralização. As condições ambientais devem ser
adequadas à manutenção das células sendo a incubação feita a 37oC em aerobiose e as
culturas observadas diariamente para a presença do efeito citopático ou outras evidências
do crescimento do vírus.

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Evidências da multiplicação vírica

a) Alteração morfológica e degenerescência celular observada microscopicamente –

efeito citopático – que envolve: arredondamento da célula que se torna mais
refractária e com destruição total da forma; destruição parcial da forma celular
com presença de células necróticas, com picnose nuclear e coloração alterada;
agrupamento das células necrosadas.

b) Formação de células gigantes. Exemplo: vírus da parainfluenza.

c) Aparecimento de células com corpos de inclusão nuclear que podem corar-se com
corantes policrómicos. Exemplo: vírus do grupo herpes e parvovÍrus.

d) Formação de placas. Exemplo: vírus da doença do Vale do Rift.

e) Infecção da cultura de células indicada por inibição metabólica, por exemplo por
mudança da cor do meio por acúmulo de ácido revelada pelo indicador de pH.

f) Detecção por métodos indirectos – na ausência de alterações visíveis e do efeito

citopático, podem ser usados outros métodos como hemaglutinação e
hemadsorção. Exemplo: vírus da parainfluenza e paramyxovirus.

Após o isolamento, testes adicionais são geralmente necessários para a identificação dos
vírus. Exemplos de testes usados para a identificação, são: VN, ELISA, FA e IHA.

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ISOLAMENTO DE VÍRUS EM ANIMAIS DE LABORATÓRIO

Vias de inoculação:

• intravenosa • intracardíaca
• intraperitoneal • intranasal
• intramuscular • intracutânea
• intratesticular • oral
• subcutânea • intracerebral

Animais mais usados:

Murganhos, cobaias, “hamsters”, coelhos, galinhas e pintos são os animais geralmente

empregues para o isolamento dos vírus. Contudo, animais de laboratório são muito pouco
usados actualmente no diagnóstico virulógico. Culturas celulares são mais utilizadas na
maior parte dos laboratórios, por serem mais versáteis e muito mais fáceis de manejar.

Exemplos: em virologia tumoral empregam-se amplamente “hamsters” e outros roedores

por serem muito susceptíveis a produção de tumores por diversos vírus oncogénicos. A
identificação laboratorial do vírus da raiva em animais de laboratório é baseada na
pesquisa de corpúsculos de Negri nas células nervosas, 7-11 dias após a inoculação
intracerebral em animais susceptíveis. Em casos positivos, os animais apresentam
sintomas, morrem e os esfregaços de cérebro revelam corpúsculos de Negri.

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ISOLAMENTO DE VÍRUS EM OVOS EMBRIONADOS

Ovos embrionados são ovos férteis, submetidos a inoculação a temperatura de 37-39˚C,

humidade relativa entre 50-70%.

Vias de inoculação

1. Inoculação via saco alantoideu

Método apropriado para a propagação de vírus de doenças como por exemplo: doença de
Newcastle, bronquite infecciosa, encefalomielite equina.

2. Inoculação via membrana corioalantoidea (MCA)

Método apropriado para vírus que produzem lesões focais ou do tipo bexigas. Exemplo:
vírus da varíola, vírus herpes simples.

3. Inoculação na cavidade amniótica

Via usada para vírus da influenza.

4. Inoculação via gema ou saco vitelino

Via usada para Rabdovírus, Togavírus, Rickettsias, Mycoplasmas e Chlamydias.

Sinais da replicação viral:

 Hemorragias dos folículos das penas (Paramyxovírus)

 Congestão da epiderme (Togavírus)
 Atraso no crescimento embrionário (Coronavírus)
 Aumento ou diminuição do líquido amniótico, engrossamento e edema da MCA
(Herpesvírus)
 Pústulas na MCA e corpos de inclusão (Poxvírus)
 Morte do embrião