Cultura celular

• Conjunto de técnicas que permitem cultivar ou manter células isoladas fora do organismo original,
mantendo suas características.

• A cultura celular pode-se ser realizada a partir de tecidos humanos, animais ou vegetais. Isolamento e
identificação de vírus

• Para demostrar que uma dada infecção tem etiologia viral, é de fundamental importância comprovar-
se laboratorialmente a presença dos vírus no paciente infectado.

• As culturas de células amplificam a quantidade de vírus, facilitando sua detecção e identificação.

• O isolamento viral apresenta vantagens e desvantagens comparando a outros métodos de diagnóstico.

Vantagens da cultura celular Estratégia essencial no tratamento de algumas patologias, como as que
usam:

• Células tronco;

• Terapia gênica;

• Reposição tecidual;

• Produção de vacinas anti-virais;

• Ensaios de fármacos e cosméticos in vitro;

• Compreensaão de fenômenos de neoplasias. Desvantagens da cultura celular

• O sistema usado para o isolamento de certos vírus não está disponível ou é muito complicado para
rotina laboratorial;

• O tempo necessário para isolar certos vírus pode ser demorado, o que não satisfaz a necessidade
clínica. Uma vez inoculados no sistema hospideiro susceptível, os vírus provocam nesse sistema
modificações fisiológicas que são observadas como efeitos consequentes da biossíntese viral. O
fenômeno de alteração morfológica celular, denominado efeito citopático (CPE – cytopathogenic effect).
Métodos de propagação de vírus
• A propagação de vírus em um laboratório pode feita em sistemas hospedeiros obrigatoriamente vivos,
que podem ser representados por animais de laboratório, ovos embrionados e/ou cultura de células.
Atenção: o isolamento de um vírus em determinado hospedeiro não representa a confirmação de que
aquele vírus é o agente etiológico da doença actual.

Propagação em animais de laboratório

• Não tem sido sido utilizada com frequência, devido ao advento das culturas celulares, que fornecem
uma opção mais simples e prática.

• O uso de camudongos, em geral esta limitado ao isolamento de arbovírus, vírus da raiva e alguns
coxsackievírus do grupo A. Inoculação de amostra em animal de laboratório

• Animais de grande porte não são utilizados rotineiramente para o isolamento de vírus humanos.
• Primatas não humanos, especialmente chimpazés, são utilizados em alguns laboratórios de pesquisa
para o isolamento de vírus humano não-cultiváveis em outros sistemas de hospdeiros.

• Algumas espécies de macacos também são utilizadas em testes de neurovirulência de algumas vacinas,
como a Sabin contra a poliomielite.

Propagação em ovos embrionados

• Até a década 1950, os ovos embrionados constituíam o sistema hospedeiro de escolha para a
propagação de muitos vírus.

• Desde década 1950, a cultura célular foi utilizada amplamente.

• Entretanto, ovos embrionados continuam a ser usados, para o isolamento de vírus aviários, da
influenza, e produção de alguns tipos de vacinas.

Propagação de vírus em cultura de células

O uso do cultivo celular para isolamento viral teve ínicio após quatro importantes factos:

• 1. O emprego das técnicas assépticas cirúrgicas;

• 2. A descoberta dos antibióticos;

• 3. O desenvolvimento de um meio de cultura para manutenção de células in vitro;

• 4. Técnicas de cultura celular em monocamadas, por Gey, em 1930; e a demonstração do cultivo de

poliovírus e vacínia em cultura celular por Enders e Weller.

Tipos de culturas celulares As culturas de células rotineiramente utilizadas também podem ser
classificadas de acordo com o tipo de cultivo:

• Culturas de células primárias,

• Culturas celulares finitas (ou diplóides)

• Linhagens celulares contínuas,

• Culturas clonadas,

• Cepas celulares (oriunda de muitas espécies de animais).

Culturas de células primárias

• Também chamadas de culturas finitas, originam-se de células recém desagregadas de determinado

tecido de um organismo (cinco a vinte ciclos de divisão celular, após este período entram em
senescência).

• Quando um cultivo primário é subcultivado (passagem), as células recebem o nome de cultivo

secundário.
Culturas celulares finitas (ou diplóides)

• São estabelecidas a partir do subcultivo de célulares primárias, geralmente derivadas de tecidos

animais, e consistem em uma população homogênea de um único tipo de célula (pode se dividir até 100
vezes).

• Vantagens: as culturas bem caracterizadas e padronizadas, a produção pode ser baseada num sistema
de banco de células.

Linhagens celulares contínuas Permanentes ou imortais consistem em um único tipo celular e têm a
capacidade ilimitada de crescimento em cultura.

Estas linhagens são derivadas dos seguintes métodos:

a) Cultivo primário de células de tumor humano ou animal;

b) Transformação de uma célula normal apresentando um tempo de vida finito, com um oncogene viral;
c) Transformação de uma célula normal através de um agente químico.

Culturas clonadas

• Têm origem na selecção clonal, que é o abastecimento de uma população de células derivadas de
uma única célula. • Os clones podem ser derivados de uma linhagem de células contínuas ou primárias.
Cepas celulares • O termo cepas celulares é usado para descrever a população de células subcultivadas
selecionadas com base na expressão de propriedades específicas, características funcionais ou
marcadores. Os factores fundamentais para a escolha da linhagem celular para o isolamento viral são:
Permissividade celular Velocidade de replicação. Evidência de propagação viral • Observação do
efeito citopático (CPE) O efeito citopático, se refere a alterações na morfologia em células individuais ou
grupos de células induzidas pela infecção viral, as quais são observadas ao microscópio. • Nas últimas
décadas, foram desenvolvidos vários sistemas para acelerar a evidenciação do isolamento viral em
cultura de celular, como é o caso do: • sistema de shell vial • linhagens celulares geneticamente
modificadas • culturas de células mistas Sistema de shell vial • Gleaves e colaboradores em 1984. • O
método utiliza centrifugação em baixa velocidade para favorecer a infecção das culturas de células MRC-
5, seguido por incubação para amplificação de proteínas específicas do vírus. • A detecção dessas
proteínas é realizada por ensaio de Imunoflorescência (IF). Linhagens celulares geneticamente
modificadas • Stabell & Olivo (1992). • Esta linhagem celular está disponível comercialmente como
parte de um kit para diagnóstico denominado ELVIS (enzyme-linked virus-induced system). • O resultado
está disponível em 24hr após a inoculação da amostra por centrifugação em baixa velocidade. Culturas
de células mistas • Sistema desenvolvido para acelerar a propagação viral. • Neste sistema, a
monocamada celular é preparada a partir de uma mistura de células, que é usada em combinação com a
inoculação da amostra por centrifugação em baixa velocidade, o que favorece a infecção. • A replicação
do vírus na cultura amplifica o sinal, e a IF facilita a detecção rápida da progação. Purificação e
concentração de vírus • A purificação é obtida através de cromatografia ou centrifugação através de
gradientes de densidade. • Vírus envelopados podem ser purificados através da velocidade de
sedimentação em gradientes de sacarose. Os vírus não envelopados, podem ser purificados pela
centrifugação em gradientes de cloreto de césio. • Após a adaptação e propagação inicial, os vírus
podem ser separados dos debris celulares e purificados. • O passo inicial desse processo é uma
centrifugação diferencial (baixa velocidade) (~ 2000 x g) que é utilizada para remoção dos debris
celulares. • A centrifugação a alta velocidade (40 000 a 80 000 x g) tem por objectivo reduzir o volume
da amostra, em alguns casos em que deseja reduzir o volume ainda mais pode ser feita uma
concentração por diálise e precipitação com metanol ou polietilenoglicol realizada a baixa temperatura
(-70°C). Criopreservação • Nitrogenio líquido; • Niveis de energia cinetica baixos a • -196°C que não
permitem os movimentos moleculares. • Alta viabilidade >=90%; • De preferencia em fase exponencial;
• Agentes crioprotetores: Soro; DMSO; Glicerol. Contagem de células • Geralmente, antes da utilização
das células para a montagem de um exprimento, é realizada a contagem destas células. • A câmera de
Neubauer é o método mais utilizado; além de ser simples, barato e antigo. • A contagem directa e
indirecta. Contagem directa e indirecta de partículas víricas Contagem directa de vírus • A contagem do
número de partículas víricas possui importância na pesquisa e produção de vacinas. • A microscopia
eletrônica é usada para contagem de partículas víricas em soluções livres de vírus. Um determinado
volume de amostra é examinado e os vírus são contados. • Esse número é então empregado para se
fazer uma estimação do número total de partículas na amostra. Uma limitação desse método é que
capsídeos vazios, partículas não infecciosas, são contadas. Contagem indirecta de vírus Os métodos de
contagem indirectos utilizam factores associados com a infectividade (actividade biológica). Os três
principais métodos utilizados para a determinação da concentração viral são: provas de hemaglutinação,
prova de formação de placas e o método da diluição limitante. Hemaglutinação A prova de
hemaglutinação é baseada na propriedade que muitos vírus envelopados têm de aglutinar eritrócitos. A
hemaglutinação é o resultado da ligação de várias partículas víricas à superfície do eritrócito. Unidade
formadora de placas Esta prova baseia-se na inoculação de células susceptíveis com uma amostra do
vírus e através da sua actividade biológica pode-se estimar a quantidade de partículas. Nesse
procedimento, diluições seriadas na base dez do vírus a ser testado são inoculadas em camadas
celulares. Após o período de incubação que permite o vírus adsorver nas células, e os vírus citopáticos,
as células infectadas serão destruídas formando um área clara indicando a morte celular após a um
período de incubação que pode variar entre 24 - 72 horas. O cálculo do número de placas baseia-se na
contagem do número de placas observadas, no fator de diluição e no volume de amostra usada para,
resultando em Unidade Formadora de Placas por mililitro de amostra. Visualização de vírus • A
visualização de partículas víricas somente pode ser feita com o uso de microscópio eletrônico.
Propagação viral • Para o isolamento, caracterização, identificação e produção de vacinas uma
considerável quantidade de partículas víricas é geralmente necessária. Isso pode ser obtido pela através
de técnicas de propagação. • Cultura de células e tecidos • A cultura de tecidos refere-se ao crescimento
e manutenção de tecidos vivos in vitro. Existem dois tipos básicos: cultivo de explante e cultivo celular.
 Cultivo de explantes são pequenos fragmentos de tecidos oriundos do hospedeiro e mantidos em
cultivo. Cultivo celular é resultado da dissociação do tecido em células individuais seguido de sua
manutenção em cultivo. Cultivos de explante • Cultivos de explante são úteis para isolamento viral e são
necessários para o isolamento de alguns coronavírus. Cultivo celular primário • Cultivo de células
primárias são originados de tecidos frescos que foram submetidos ao tratamento com enzimas (tripsina
ou outras proteases) para a individualização das células. Como resultado, esse tipo de cultivo muitas
vezes é composto de vários tipos celulares. • Nas condições in vitro, os cultivos primários raramente se
dividem ou então o fazem a uma freqüência muito baixa, isso é denominado como limite de Hayflick
Cultivos primários raramente sobrevivem a 20 passagens in vitro. Infectividade e armazenamento •
Infectividade Habilidade que o vírus tem de infectar uma célula hospedeira. • A temperatura exterior à
célula hospedeira afecta directamente a capacidade do vírus manter a sua infectividade,
particularmente nos casos do vírus envelopados. • Os vírus não possuem actividade metabólica própria,
a infectividade é a maneira de avaliar a integridade da partícula após a exposição a determinadas
temperaturas. Alguns parâmetros são considerados críticos: • à 60°C, a infectividade irá diminuir
rapidamente em segundos. • à 37°C, a infectividade irá diminuir em minutos. • à 20°C, infectividade irá
diminuir em horas. • a infectividade, à temperaturas acima citadas, irá influenciar a transmissão pelo
contacto directo (à 37°C) e pelos fomites (à 20°C). • à 4°C, a infectividade nos tecidos é mantida por dias.
• Temperaturas abaixo da temperatura de congelamento são usadas para armazenamento de vírus
durante prolongados períodos. Nesse caso é importante manter a formação de cristais de gelo à níveis
mínimos. • Deve ser considerado que a resistência e labilidade varia muito entre os vírus. Alguns são
capazes de resistir por horas, dias, ou até meses em condições ambientais, enquanto outros são
inactivados em minutos sob condições semelhantes. Três métodos principais de conservação dos vírus
são: • Congelamento à -70°C com ou sem criopreservantes. • Congelamento à -196°C nitrogênio líquido,
para armazenamento por um longo período de tempo. • Liofilização ou congelamento a seco, podendo
ser armazenadas a temperatura ambiente ou congeladores convencionais. Diferentes métodos usados
para caracterização • Sensibilidade a solventes lipídicos • Identificação do ácido nucléico • Análise por
enzimas de restrição • Hemadsorção • Métodos imunológicos Obrigado pela atenção!