Virologia

Aula 5 – Vírus, Transformação Celular e Oncogénese

O que é o cancro?
Crescimento celular anormal seguido de
invasão dos tecidos próximos. As células
escapam dos mecanismos que regulam a
proliferação celular e promovem a morte
celular.

Oncogénese
Processo através do qual células saudáveis se transformam em células cancerígenas:
• Também conhecido como carcinogénese;
• Doença genéEca marcada por mutações em genes reguladores – oncogenes;
• Alterações na proliferação celular, sobrevivência, desEno celular e integridade do genoma;
• Mutações genéEcas podem ser herdadas ou induzidas por carcinógenos ambientais ou por
patógenos como vírus.

Cancro, uma doença gené4ca

Mutações se acumulam ao longo do tempo.

Oncogenes:
• Genes altamente regulados que medeiam a
comunicação celular, crescimento e divisão;
• Os retrovírus podem expressar homólogos de oncogenes
do hospedeiro;
• Vírus de DNA que transformam células expressam
oncogenes únicos.

Transformação celular
• É uma alteração nos parâmetros morfológicos, bioquímicos ou de crescimento de uma célula;
• Resulta em proliferação celular descontrolada, aumentando a desorganização do tecido;
• As células podem se tornar imortalizadas e progredir para o cancro.

Células transformadas NÃO resultam automaEcamente no desenvolvimento de “cancro”.

CaracterísEcas das células transformadas:

• Perda de dependência de ancoragem;
• Perda de inibição de contato;
• Diminuição da necessidade de fatores de crescimento e nutrientes.

Transformação celular induzida por vírus

Vírus sozinhos não causam cancro.
Vírus podem reprogramar células induzindo sua transformação, mas alterações genéEcas adicionais
são necessárias para que ocorra a carcinogénese
Outros fatores que aumentam o risco de oncogénese após infeção viral:

Lucie Bosquet | UA
• Imunodeficiência;
• Fatores Ambientais;
• Fatores genéEcos do hospedeiro.

A transformação e a oncogénese não são necessárias para a replicação de qualquer vírus:

• O genoma viral pode ser integrado na cromaEna celular transformada;
• Raramente ocorre infeção produEva;
• Pode ocorrer expressão limitada de proteínas virais;
• O genoma viral integrado é frequentemente incompleto e pode conter deleções substanciais.

Estudos de transformação viral contribuíram para o nosso conhecimento atual sobre o cancro.

Duas estratégias gerais principais:

• AEvação permanente das cascatas de transdução de sinal celular;
• Interrupção da regulação do ciclo celular.

Os oncogenes celulares são muitas vezes referidos como c-ONC, por ex. c-Myc. Quando incorporado
por um vírus, o homólogo do oncogene é referido como oncogene viral ou v-ONC, por ex. v-Myc.

Vírus de RNA oncogénicos

Fator contribuinte em 20% dos cancros humanos.

Retrovírus
Transdução de retrovírus oncogénicos:
• Formação rápida de tumores;
• Tem um oncogene dominante aEvado no genoma (por exemplo, v-SRC);
• Proteína produzida imediatamente quando o vírus se replica.

Retrovírus oncogénico não transdutor:

• CinéEca intermediária da formação do tumor;
• Não carregam gene v-ONC dominante;
• Cis-aEvação: o provírus aEva a expressão do oncogene endógeno.

Lucie Bosquet | UA
Retrovírus de longa latência:
• CinéEca lenta da formação do tumor;
• Não carrega gene v-ONC dominante;
• Não causa aEvação cis de oncogenes locais;
• Proteína reguladora viral aEva oncogenes por transaEvação.

Nem todos os retrovírus são capazes de induzir a transformação celular (por exemplo, HIV). A
transformação celular por retrovírus é um erro ou um subproduto de seu ciclo de vida.

Mecanismo de recombinação de oncogenes:

• Integração de genomas retrovirais muta o genoma celular;
• Os promotores pró-virais podem aEvar a transcrição de genes próximos aEvando o oncogene
(por exemplo, c-myc);
• A transformação também pode ocorrer se a inserção interromper os genes supressores de tumor.

Lucie Bosquet | UA
Genomas de retrovírus transdutores:

Retrovírus da leucose aviária (ALV):

• Retrovírus;
• Infeta galinhas;
• Causa viremia transitória, mas galinhas ganham imunidade;
• 3% das galinhas infetadas quando envelhecem desenvolvem outros tumores como sarcomas;
• A maioria dos vírus isolados dos sarcomas são defeituosos;
• Diferentes oncogenes podem ser encontrados.

Vírus do sarcoma de Rous (RSV):

• Retrovírus;
• Vírus ALV recombinante;
• Um pedaço do genoma ALV é subsEtuído por um oncogene celular.

Vírus de DNA oncogénicos

Papilomavírus:
• Primeiros vírus de DNA a serem encontrados;
• Encontrado em coelhos;
• Causa verrugas (papilomas);
• Os tumores são um evento raro.

Poliomavírus:
• Vírus de DNA;
• Apenas induz a formação de tumor no hospedeiro errado;
• Os tumores ocorrem em diferentes tecidos (polioma);
• Os tumores são um evento raro;
• Por exemplo, vírus símio 40 (SV40):
o O hospedeiro natural são os macacos (sem tumores);
o Induz tumores em hamsters (hospedeiro errado).

Adenovírus:
• Vírus de DNA;
• Infetam humanos, mas não causam tumores;
• Pode causar tumores em hamster;
• Os tumores são um evento raro.

Anigenos virais T:
• T = tumor;

Lucie Bosquet | UA
• Essas proteínas são sempre encontradas nos tumores;
• Eles são todos diferentes entre os vírus.

Ciclo celular
Descoberto pelo estudo de vírus transformadores.

Checkpoints do ciclo celular

Reguladores essenciais do ciclo celular:
• p53;
• pRB;
• E2f.

Fatores que regulam a progressão do ciclo celular:

• Disponibilidade de nutrientes;
• Produção de fatores de crescimento.

Lucie Bosquet | UA
Os vírus de DNA requerem que as células estejam no fago S
para replicar seu genoma. Os anigenos T são responsáveis
por induzir células quiescentes no fago S.

Adenovirus: E1
HPV: E7
SV-40: LT

Cancro induzido por vírus de DNA

É um evento raro que requer a combinação de vários fatores.

Os genes letais virais não podem ser expressos – os eventos líEcos são bloqueados.
O DNA viral deve ser integrado.
Os anigenos T precisam inaEvar tanto pRB quanto p53.

Transformação celular

Mas não são células cancerígenas, outras mutações são

necessárias para que essas células se tornem
cancerígenas.

Vírus tumorais de RNA – integração no DNA do

hospedeiro

Vírus tumorais de DNA – aEvam o ciclo celular

Aula 6

Vacinas
Memória imunológica:
• Em um primeiro encontro o sistema
imunológico “memoriza” um patógeno;
• Em um segundo encontro responde ao
desafio de forma mais potente e eficiente.

Varíola, a única doença infeciosa a ser erradicada

1 em cada 20 humanos foi morto, aleijado ou desfigurado pelo vírus da varíola.

Lucie Bosquet | UA
Em 1967 havia mais de 15 milhões de casos em todo o mundo com 2 milhões de mortes (taxa de
mortalidade de 13%).

No século XI:
• Indivíduos saudáveis foram injetados com pus de lesões de varíola;
• Pó feito de crostas de varíola secas nas narinas de indivíduos saudáveis, na esperança de induzir
uma doença leve que forneceria proteção ao longo da vida

1721 Lady Montague – inoculação com pus de víEmas de varíola em recuperação

Variolação – a taxa de letalidade foi 10 vezes menor do que em pessoas infetadas diretamente, mas
ainda causou infeção.

Edward Jenner (1798):

1. Injetou um menino saudável com fluido de lesão de varíola bovina;
2. O menino desenvolve febre e uma lesão no local da infeção;
3. Deliberadamente infetou o menino com varíola;
4. O menino sobreviveu.

Em 1800, a vacina contra a varíola (feita a parEr do vírus da varíola bovina) foi disseminada e em
1979 foi considerada erradicada pela OMS.

Vacinação
Louis Pasteur (1885):
• Desenvolveu uma vacina contra a raiva a parEr da medula espinhal desidratada de um coelho
infetado;
• Introduziu o termo vacinação, em homenagem a Jenner (vacc – vacca laEn, vaca).

Devido à dificuldade de idenEficar e estudar os vírus, as seguintes vacinas só apareceriam mais tarde,
em 1930 (contra febre amarela e gripe).

A vacinação:
• Aproveita o sistema de memória da resposta imune adaptaEva;
• Mobiliza o sistema imunológico do hospedeiro para prevenir a doença induzida por infeções
virais;
• Quebra a cadeia de transmissão.

Vacinas mimeEzam a infeção viral para estabelecer memória imunológica sem causar patogénese,
ipico do primeiro encontro com o vírus virulento. Não só os humanos, mas também os animais
domesEcados e selvagens são vacinados. As vacinas são uma parte importante das medidas de saúde
pública do Primeiro Mundo.

Vacinação – imunidade de rebanho

• Para que as vacinas sejam eficazes em manter uma população livre de doenças, é essencial cobrir
um número elevado de indivíduos;
• A alta cobertura permite proteger um pequeno número de indivíduos que não podem ser
vacinados (não têm acesso, têm contraindicações, etc.) ou que perdem ou não desenvolvem
imunidade.

Imunidade de rebanho = cobertura vacinal na comunidade

A propagação do vírus é interrompida quando a probabilidade de infeção cai abaixo de um limite

críEco (dependendo do vírus e da população).

Lucie Bosquet | UA
Grandes campanhas de vacinação
Os programas de vacinação dependem da aceitação pública do seu valor.

Programa Nacional de Vacinação em Portugal:

Vacinas
Requisitos de uma vacina eficaz:
• Segurança – não deve causar doenças, efeitos colaterais mínimos;
• Deve induzir imunidade protetora na população:
o Nem todo indivíduo precisa ser imunizado para impedir a propagação viral;
o 80-95% de imunização geralmente interrompe a propagação viral.
• A proteção deve ser duradoura;
• Outras considerações – baixo custo, estabilidade genéEca, armazenamento, método de entrega.

Vacinas aEvas:
• Preparações de vírus atenuados ou mortos ou proteínas virais purificadas;
• Induz resistência imunológica a infeções ou doenças;
• Geralmente úEl para proteção de longo prazo.

Lucie Bosquet | UA
Vacinas passivas:
• Introduz componentes da resposta imune (por exemplo, anEcorpos ou esEmula células imunes);
• ÚEl apenas para proteção de curto prazo.

Estratégias para o desenvolvimento de vacinas

Vacinas a4vas
Vírus de Epo selvagem “vivos”:
• Vacinas geralmente mais eficazes;
• Um vírus que infecta uma espécie animal às vezes pode ser usado para infetar outras espécies;
• Os vírus podem infetar outras espécies, mas se replicarão mal e terão efeitos patogênicos
limitados ou inexistentes;
• Esses vírus relacionados a espécies podem comparElhar determinantes imunogénicos com o
vírus alvo, resultando em uma resposta imune eficaz;
• Exemplo – varíola bovina foi usada como vacina contra varíola.

Na época, as pessoas temiam que a vacinação com um vírus que infetava vacas causasse
caracterísEcas de vaca e levasse a medos irracionais.

Vírus atenuados “vivos”:

• Passagem seriada de vírus em animais, ovos ou células culEvadas in vitro;
• O vírus mantém a capacidade de replicação, mas apresenta patogenicidade reduzida;
• As vacinas mais bem-sucedidas usadas atualmente.

Lucie Bosquet | UA
 Processo de produção de um vírus
humano atenuado por transferências
repeEdas em células culEvadas (figura
acima).

Vacina poliovírus – em 1961, uma

vacina viva atenuada com três cepas do
poliovírus Sabian foi desenvolvida
(vacina administrada por via oral –
OPV).

Vírus inaEvados:
• Vírus patogénicos são culEvados em ovos ou células
culEvadas e purificados;
• Os vírus purificados são inaEvados usando diferentes
tratamentos químicos (por exemplo, formalina, β-
propriolactona, detergentes não iônicos);
• Os vírus retêm a anEgenicidade, mas perdem sua capacidade de replicação, induzindo uma
resposta imune sem causar doença.

Vacinas vivas atenuadas vs. Vacinas ina4vadas

Vacina poliovírus – em 1952, foi demonstrado que a vacina inaEvada reduzia a virulência devido a
várias passagens em cultura celular:
• Vacina administrada por injeção – IPV;
• Poliovírus são tratados com formalina.

Em 1955, grandes estoques da vacina foram produzidos e liberados, e devido a uma inaEvação
incompleta do vírus das vacinas produzidas por um laboratório, houve 260 casos de poliomielite
associada à vacina.

A vacina viva atenuada (OPV) levou a vírus derivados da vacina que recuperaram a neurovirulência,
com efeitos semelhantes ao vírus do Epo selvagem. Os países que alcançaram e mantêm altas taxas
de cobertura vacinal usam a vacina IPV, enquanto nos países pobres a vacina OPV ainda é usada.

Vacinas a4vas
Vacinas de subunidade:
• Quebrar os vírus em componentes para purificar proteínas virais, que podem induzir resposta
imunogénica;
• Ou expressar genes virais em diferentes sistemas de expressão para purificar proteínas virais (por
exemplo, proteínas do capsídeo viral);
• Não contém outros componentes virais, em parEcular ácidos nucleicos;
• Não tem risco de infeção acidental por vírus vivo;

Ex.: vírus da hepaEte B (HBV), proteína HBsAg:

• Produzido em fermento;
• Monta-se em pariculas vazias.

Vacinas baseadas em vírus “vivos” ou “vivos atenuados”

Vantagens:
• Imitar a infeção natural;
• Potente, induzindo uma imunidade ao longo da vida.

Desvantagens:
• Caro;

Lucie Bosquet | UA
• Instável - requer armazenamento específico;
• Pode causar doenças graves.

Vacinas baseadas em proteínas ina4vadas ou de subunidades

Vantagens:
• Pode gerar imunidade contra uma ampla variedade de anigenos;
• Menos sensível ao armazenamento;
• Mais seguro – sem vírus infecioso;
• A produção pode ser mais rápida.

Desvantagens:
• Caro;
• Menos bem-sucedido - gera baixa anEgenicidade;
• Várias doses podem ser necessárias;
• Pode exigir adjuvantes, para mimeEzar os efeitos inflamatórios da infeção.

Vacinas a4vas “mais recentes”

Vacinas quiméricas:
• Usam organismos não patogênicos manipulados para expressar uma ou mais proteínas virais,
entregando anigenos vacinais a locais específicos (por exemplo, mucosa intesEnal, células
dendríEcas).

Vacinas de pariculas semelhantes a vírus (VLP):

• Pariculas semelhantes a vírus que podem imitar vírus envelopados e não envelopados e
possuem estrutura semelhante ao capsídeo;
• Pode ser gerado em vários sistemas de expressão.

Vacinas pepidicas mulEvalentes:

• Entregam de centenas a milhares de epítopos pepidicos para atender às limitações da vacinação
contra vírus de RNA altamente mutáveis, como HIV ou HCV.

Vacinas de ácido nucleico (DNA ou mRNA):

• Entregam uma sequência de nucleoideos que codifica uma ou mais proteínas virais a serem
expressas nas células hospedeiras;
• Uma vez expressas, essas proteínas virais podem atuar como anigenos nas células hospedeiras
e serem reconhecidas com mais eficiência pelo sistema imunológico;
• A expressão das proteínas virais pode imitar a infeção viral sem causar patogénese.

Vacinas passivas
Transmissão de imunidade verEcal – os anEcorpos
gerados no final da gravidez servem de proteção
aos lactentes desde o nascimento até os 6/9 meses
de idade.

Zmapp/ZMAb/MB-003:
• Baseado em anEcorpos monoclonais contra o
vírus Ebola;
• Criado em camundongos imunizados com pariculas
semelhantes a vírus;
• Ainda em desenvolvimento e testes.

Vacinas SARS-CoV-2
SARS-CoV-2:

Lucie Bosquet | UA
Vacina Pfizer e BioNTech – COMINARTY:
• Nanoparicula lipossolúvel que contém mRNA que codifica o trímero da proteína S;
• Imunização de 2 doses com intervalo de 3 semanas;
• 95% eficaz.

Vacina moderna – mRNA1273:

• Nanoparicula lipídica que contém mRNA que codifica a proteína S completa;
• Imunização de 2 doses com intervalo de 4 semanas;
• 94,5% eficaz.

Vacina Janssen – Ad26:

• Vacina de vetor de adenovírus que contém DNA que codifica variantes da proteína S;
• Imunização em dose única;
• 66% eficaz.

Vacina Oxford e Astrazeneca – AZD1222:

• Vacina recombinante de adenovírus de chimpanzé vacina de vetor de adenovírus que contém
variantes da proteína S;
• Imunização de 2 doses com intervalo de 4 semanas;
• 62% eficaz.

FBRI, vacina da Rússia – EpiVacCorona:

• Pepideo sinteEzado quimicamente da
proteína SARS-CoV-2 como um anEgénio
conjugado a uma proteína transportadora;

Lucie Bosquet | UA
• 2 doses com intervalo de 21 dias.

Novavax:
• Vacina de proteína S trimérica
recombinante de
comprimento total expressa e
purificada em células de
insetos revesEdas por uma
nanoparicula;
• Imunização de dose única;
• 89,3% eficaz.

Sinovac – CoronaVac:
• Virião inaEvado;
• Vacina mulEvalente que visa cepas
de SARS-CoV-2 circulando em várias
regiões;
• CulEvadas em células de macaco e
inaEvadas com β-propil lactona.

As vacinas “vivas” e “vivas atenuadas” são capazes de se replicar no organismo e, portanto, de induzir
imunidade celular e humoral.

Vírus inaEvos ou proteínas de subunidades não podem se replicar e são menos eficientes na indução
de respostas imunes.

Para superar isso, as vacinas são misturadas com adjuvantes – ajuda a induzir uma resposta imune
adaptaEva mais robusta com menos anEgénio.

Adjuvantes
Visam esEmular sinais de defesa intrínsecos e inatos precoces, parEcularmente elementos da
resposta inflamatória, que potencializam as respostas adaptaEvas.

Atuam de três formas disEntas:

• Apresentando anigenos como pariculas;
• Sequestrando o anigeno no local da inoculação;
• EsEmulando diretamente as respostas imunes intrínsecas e inatas (mimeEzam ou induzem dano
celular ou alteram a homeostase, ou envolvendo recetores de defesa celular intrínsecos).

Ex.: sais de alumínio (vacina HBV)

As doenças virais podem ser erradicadas?

Varíola:
• ConEnua a ser a única doença infeciosa a ser declarada como erradicada;
• Várias formulações da vacina foram desenvolvidas, pois a vacina original apresentava efeitos
colaterais raros, mas graves.

Restam dois estoques de varíola: EUA e Rússia!!!!

Para a erradicação da doença, duas condições são essenciais:

• O ciclo infecioso deve ocorrer em um único hospedeiro;
• A infeção ou vacinação deve induzir imunidade vitalícia.

Variáveis que podem afetar a erradicação da doença:

Lucie Bosquet | UA
• Variáveis humanas (pobreza, falta de confiança nos governos/médicos; desafios econômicos);
• Propriedades do vírus – infeções altamente contagiosas, longo período de incubação, diferentes
soroEpos;
• Sistema imunológico – requisito para reforço da vacina.

Desde que a sequência de nucleoideos do vírus seja conhecida, qualquer vírus pode ser recuperado,
mesmo que o erradiquemos da Terra!!!!

As vacinas quase não têm efeito terapêuEco se um indivíduo já esEver infetado.

Segundo braço da defesa anEviral – MEDICAMENTOS ANTIVIRAIS (pode interromper a infeção uma
vez iniciada).

Medicamentos an4virais
Em 50 anos de pesquisa, apenas 100 medicamentos anEvirais
estão disponíveis e visam principalmente infeções
persistentes.

Porquê?
• Alvejam o crescimento do vírus pode afetar
negaEvamente a célula hospedeira;
• Vírus com relevância médica podem ser di€ceis de
estudar devido à falta de modelos animais e problemas
de propagação;
• Alguns medicamentos anEvirais alcançam apenas
inibição parcial, o que pode levar a mutantes resistentes.

Mecanismos de ação:

Não basta encontrar um composto potencial, vários ensaios clínicos diferentes devem ser realizados
antes de ser aprovado para uso geral.

Medicamentos an4virais - design

GenéEca e descoberta de medicamentos:
• Manipular genomas virais para idenEficar um determinado produto gênico viral (inaEvação ou
deleção de genes virais);
• IdenEficação de produtos de genes hospedeiros que são essenciais para o ciclo de vida do vírus
para tentar seu direcionamento

Telas baseadas em mecanismo:

Lucie Bosquet | UA
• IdenEficar compostos que afetam a função de um alvo viral conhecido;
• Pode ser realizado com proteína purificada;
• Os compostos que inibem as proteases virais podem ser rastreados usando ensaios que medem
a aEvidade da protease através da medição de fluorescência.

Resistência viral
• A resistência a medicamentos anEvirais deve ser antecipada antes da aprovação do composto;
• Mutantes virais resistentes a todas as drogas anEvirais desenvolvidas foram detetados.

Vírus de RNA
• RNA polimerases propensas a mutação – sem mecanismos de correção;
• Em um genoma viral de 10kb, 1-10 cópias replicadas podem ter uma mutação.

Vírus de DNA
• A maioria das DNA polimerases pode exErpar e subsEtuir nucleoideos mal incorporados;
• Os vírus de DNA evoluem mais lentamente que os vírus de RNA porque têm menos diversidade.

Medicamentos an4virais do vírus da gripe

Inibidores da neuraminidase:
• Oseltamivir (Tamiflu) ou Zanamivir (Relenza);
• Imitam o ligante NA natural – ácido siálico, inibindo a liberação viral e impedindo que o vírus já
replicado deixe a célula hospedeira.

Bloqueadores de canais iónicos M2:

• Adamantano (Gocovri e outros)
• Tem como alvo o desencapsulamento viral, prejudicando a liberação de ácido nucleico;
• Alta resistência viral (não recomendado pelo CDC).

Baloxavir:
• Novo anEviral contra influenza aprovado pela
FDA em outubro de 2018;
• Deve ser administrado a pacientes
sintomáEcos até 48h após o início dos
sintomas;
• Inibe a endonuclease ácida da polimerase,
impedindo a replicação viral.

Aula 7 – Agentes infeciosos incomuns

Virófagos, os “comedores de vírus”

Vírus pequenos que “infetam” vírus gigantes e se replicam em suas células hospedeiras, reduzindo
bastante o nível de formação de pariculas.

Sputnik – replica apenas em ameba infetada com Mimivírus:

• Contém um genoma circular de DNA de fita dupla de 18
Kbp que codifica 21 proteínas, encapsulado em um
capsídeo icosaédrico;
• Codifica sua própria DNA polimerase;
• Provavelmente depende da maquinaria de transcrição
do vírus auxiliar.

Lucie Bosquet | UA
Mavirus – replica apenas no flagelado fagotrópico marinho
Cafeteria roenbergensis infectado com o vírus gigante Cafeteria
roenbergensis virus (CroV).

Qual é o tamanho mínimo do genoma para sustentar um agente

infecioso? Um agente infecioso poderia exisEr sem nenhum ácido
nucleico?
Viróides, satélites e priões fornecem as respostas – não se
enquadram nos esquemas de taxonomia padrão para vírus
(geralmente chamados de agentes “subvirais”).

Viróides (“os menores patógenos conhecidos”)

Principais patógenos de plantas – pequeno ssRNA
circular infecioso não encapsulado, código para
nenhuma proteína:
• Replicam-se autonomamente quando
introduzidos mecanicamente nas plantas
hospedeiras;
• Os vírus são parasitas da maquinaria de tradução
do hospedeiro, enquanto os viróides são
parasitas da maquinaria de transcrição do
hospedeiro;
• Originado por transferência casual de plantas
silvestres usadas na criação de culturas
modernas;
• Transmissão mecânica por máquinas agrícolas contaminadas;
• Pequenos RNAs de 21-24nt derivados do RNA viróide em plantas podem guiar o silenciamento
do RNA dos genes do hospedeiro e induzir doenças.

Satélites
Dependem da presença de um vírus auxiliar para replicar e
propagar – pequenas moléculas de RNA ou DNA de fita
simples (faltam os genes necessários para a replicação).

Vírus satélites – codificam uma proteína estrutural que

encapsida o genoma.
RNAs satélites – não codificam proteínas do capsídeo; são
empacotados por uma proteína codificada no genoma do
vírus auxiliar.

Infetam plantas, animais ou bactérias e na maioria das

vezes piora os sintomas do vírus auxiliar.

Vírus satélite da hepaEte delta associado ao vírus da hepaEte B (imagem abaixo).

Priões
Agentes infeciosos sem genomas, apenas proteínas, associado a um grupo de
doenças neurodegeneraEvas fatais que afetam humanos e outros animais,
denominadas encefalopaEas espongiformes transmissíveis (EET): BSE, doença de
Creutzfeld-Jacob, tremor epizoóEco, etc.

Isoforma conformacional de uma proteína hospedeira PrPc. Quando introduzido no

organismo causa a conversão da PrPc normal na conformação patogênica PrPsc.

Lucie Bosquet | UA
Cérebro infetado: espongiforme. PrPsc se acumula em placas caracterísEcas e fibrilas amiloides.

Vírus como ferramenta

Terapia de genes:

Terapia de fago – bacteriófagos são subsEtutos para anEbióEcos?

Pontos posiEvos:
• Mais específico;
• Menos prejudicial para o hospedeiro e outras bactérias;
• Pequena dose necessária.

Pontos negaEvos:
• MúlEplas infeções – misturas são necessárias;
• Treino especial;
• Ambiente refrigerado.

Aula 8 – Técnicas mais comumente usadas

Sistemas hospedeiros animais

Usados para idenEficar, estudar e propagar vírus patogénicos (por exemplo, animais transgénicos,
ovos embrionados).

Usos em virologia:
• Produzir vírus que não podem ser efeEvamente estudados in vitro;
• Estudar a patogénese das infeções virais;
• Para testar a segurança da vacina (por exemplo, vacina oral contra o poliovírus).

Dificuldades em estudar vírus:

• A criação e manutenção de animais infetados com vírus patogênicos é cara;
• Os animais são sistemas complexos nos quais às vezes é di€cil isolar os efeitos das infeções virais;
• Os resultados obEdos nem sempre são reproduiveis devido à variação do hospedeiro;
• O uso desnecessário ou perdulário de animais experimentais é moralmente inaceitável.

Os vírus também podem se mul4plicar em células cul4vadas

John Enders, Thomas Weller e Frederick Robbins – Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina (1954)

Culturas de células primárias:

• Células de um animal experimental ou reEradas de um paciente humano que podem ser
manEdas por um curto período em cultura.

Lucie Bosquet | UA
Linhagens celulares imortalizadas:
• Podem crescer em cultura indefinidamente;
• Os genes virais também facilitaram o processo de imortalização, pois a transfeção de proteínas
do anigeno T induz a imortalização das células.

Técnicas usadas em virologia

Métodos biológicos:
• Ensaio de placa, métodos de Etulação de ponto final, etc.;
• Analisar as propriedades infeciosas das pariculas virais recém-formadas.

Métodos €sicos:
• Microscopia eletrônica, métodos imunológicos, etc.;
• Detetar componentes específicos da infeção viral e pariculas virais recém-formadas.

Métodos infeciosos vs. não infeciosos:

• Enquanto a determinação de pariculas infeciosas é essencial em virologia, a determinação de
pariculas não infeciosas também é necessária para avaliar a qualidade de uma preparação de
vírus.

Ensaio de placa
• Mede a quanEdade de viriões viáveis presentes
em uma preparação de vírus;
• Usa diluições seriadas do vírus para infetar
células susceiveis culEvadas em monocamada;
• Após a fixação do vírus, as células são revesEdas
com meio semi-sólido para restringir a difusão de
pariculas virais;
• A disseminação restrita do vírus célula a célula
resulta na destruição localizada da monocamada
celular observada como placas (“centros
infeciosos”);
• Cada placa resulta da infeção por uma única
unidade formadora de placa (p.f.u.) permiEndo
que o número original de pariculas virais seja
esEmado.

!ú#$%& #é)*& )$ +,-.-/ × 1-2&% )$ )*,3*çã&

PFU/ml = 6&,3#$ )$ *!1$çã&

Ensaio de foco fluorescente

• Modificação do ensaio de placa;
• Mais rápido e permite determinar os itulos de vírus que não
formam placas;
• Semelhante ao ensaio de placa, mas após adsorção e expressão
gênica, as células são permeabilizadas;
• AnEcorpos criados contra uma proteína viral são usados para rotular
o vírus;
• As células são então examinadas ao microscópio em um
comprimento de onda apropriado;
• O itulo do estoque de vírus é expresso em unidades formadoras de foco fluorescente por
mililitro;
• Também pode ser feito com vírus que expressam uma proteína fluorescente fundida com uma
de suas proteínas.

Lucie Bosquet | UA
Ensaio de centros infeciosos
• Modificação do ensaio de placa;
• Determina a fração de células em uma cultura que estão infetadas com um vírus;
• Monocamadas de células infetadas são suspensas antes que os vírus descendentes sejam
produzidos;
• Diluições de um número conhecido de células infetadas são então semeadas em monocamadas
de células susceiveis, que são cobertas com uma camada de ágar;
• O número de placas que se formam nas células indicadoras é uma medida do número de células
infetadas na população original;
• Normalmente usado para medir a proporção de células infetadas em culturas persistentemente
infetadas.

Ensaio de diluição de ponto final

• Usado para medir o itulo do vírus antes do desenvolvimento do ensaio de placa;
• É usado para vírus que não formam placas;
• Em altas diluições, nenhuma das culturas de células é infetada porque nenhuma paricula
infeciosa é liberada para as células, enquanto em baixas diluições, todas as culturas são infetadas;
• O ponto final é a diluição do vírus que afeta 50% das unidades de teste e pode ser calculado a
parEr dos dados e expresso como 50% de dose infeciosa (ID 50) por mililitro.

Neste caso, o ponto final de 50% cai entre a 5ª e 6ª diluições = 10–5 A amostra de vírus contém,
portanto, 105 LD50s.

Microscópio eletrónico
• Pode ser usado para determinar a
quanEdade de viriões;
• A preparação do vírus é misturada com
uma concentração conhecida de esferas de
látex;
• O número de pariculas virais e grânulos é
então contado, permiEndo que a
concentração das pariculas virais na
amostra seja determinada por comparação.

Imagens de células vivas de viriões fluorescentes únicos

• Usa proteínas fluorescentes para visualizar pariculas
virais únicas em células vivas;
• A sequência de codificação para a proteína
fluorescente é inserida no genoma viral, muitas vezes
fundida à região de codificação de uma proteína de
virião;
• A proteína de fusão é incorporada à paricula viral,
que é visível nas células por microscopia de
fluorescência.

Lucie Bosquet | UA
Hemaglu4nação
• Membros da família Adenoviridae, Orthomyxoviridae e Paramyxoviridae, entre outros, contêm
proteínas que podem se ligar aos eritrócitos (glóbulos vermelhos);
• Alguns vírus podem ligar várias células,
resultando na formação de uma rede –
hemagluEnação;
• Este ensaio é rápido (30 min), por isso é
frequentemente usado como um
indicador rápido das quanEdades relaEvas
de pariculas virais.;
• Mas não é suficientemente sensível para
detetar pequenos números virais.

Ex.: vírus influenza

• Contêm uma glicoproteína de envelope chamada hemagluEnina, que se liga a glicoproteínas
contendo ácido N-aceElneuramínico nos eritrócitos;
• Na práEca, são preparadas diluições
seriadas duplas do estoque de vírus,
misturadas com uma quanEdade
conhecida de glóbulos vermelhos;
• Os glóbulos vermelhos não adsorvidos
caem no fundo do poço e formam um
ponto ponEagudo ou botão;
• Glóbulos vermelhos agluEnados formam
uma rede difusa que reveste o poço.

Métodos sorológicos
São baseados na especificidade da reação anEcorpo-anigeno:
• Neutralização de vírus;
• Inibição da hemagluEnação;
• Ensaio de fixação de complemento;
• Imunofluorescência;
• ELISA;
• Western Blot.

Imunofluorescência
• UEliza anEcorpos modificados ligados a uma molécula fluorescente que emite luz colorida;
• Para que a luz seja produzida, a molécula fluorescente deve ser iluminada por luz de
comprimento de onda diferente;
• Imunofluorescência direta – o anEcorpo anEviral específico para o anigeno viral é conjugado ao
marcador fluorescente;
• Imunofluorescência indireta – um segundo anEcorpo reaEvo ao anEcorpo anEviral carrega o
marcador fluorescente.

Lucie Bosquet | UA
Esta técnica permite:
• A idenEficação de células infetadas por vírus em populações de células ou em seções de tecido;
• Determinar a localização subcelular de proteínas virais específicas (por exemplo, no núcleo ou
no citoplasma).

ELISA (ensaios imunossorventes ligados a enzimas)

• Permite a idenEficação ou quanEficação de pequenas quanEdades
de anigenos virais ou anEcorpos anEvirais;
• Como na imunofluorescência, os ensaios ELISA podem depender da
detecção direta ou indireta do anigeno de teste;
• A formação de um complexo anEcorpo-anigeno induz um substrato
incolor para que a enzima seja converEda em um produto colorido;
• A intensidade do produto colorido pode ser medida em um
espectrofotômetro especializado.

Western Blot
• Usado para analisar uma proteína viral específica de uma mistura complexa de anigenos;
• Anigenos específicos são detetados permiEndo que a membrana reaja com anEcorpos
direcionados contra o anigeno de interesse;
• QuanEdades relaEvas de anigeno nas amostras de teste podem ser determinadas medindo o
sinal emiEdo pela molécula fluorescente ou conversão de substrato.

Deteção de Ácidos Nucleicos Virais

• Usado para idenEficar vírus que não podem ser propagados em cultura de células;
• Deteta apenas ácidos nucleicos e não discrimina entre vírus infeciosos ou não infeciosos

Exemplos:
• Reação em Cadeia da Polimerase;
• Sequenciamento de alto rendimento;
• Microarranjos de DNA.

Reação em cadeia da polimerase

• Amplifica sequências de DNA viral de células infetadas ou espécimes clínicos;
• A amplificação é feita em ciclos, usando uma DNA polimerase termoestável;

Lucie Bosquet | UA
• Usado para detetar evidências de infeção por um único Epo de vírus (singleplex PCR) ou mais
(mulEplex PCR);
• PCR convencional – ao final da reação o DNA é corado e depois separado para observação (semi-
quanEtaEvo);
• PCR em tempo real – o DNA
amplificado é detetado à medida que
a reação avança, usando (por
exemplo) corantes fluorescentes que
se intercalam inespecificamente no
DNA, permiEndo sua quanEficação.

Reação em cadeia da polimerase com

transcriptase reversa
• Usa mRNA em vez de DNA como modelo inicial;
• Requer uma enzima transcriptase reversa;
• A parEr do modelo de mRNA, uma fita complementar de DNA
de fita simples chamada cDNA é produzida em um processo
conhecido como transcrição reversa;
• As moléculas de DNA podem ser usadas como moldes para
uma reação de PCR.

Cul4vo de vírus
• Ovo de galinha embrionado pode ser inoculado por diferentes
vias, dependendo dos vírus;
• 5 a 14 dias após a ferElização, é feito um furo na casca e o vírus
é injetado no local apropriado para sua replicação;
• Tem um rendimento robusto, por isso tem sido usado para produção de vacinas, por exemplo:
vacinas contra influenza.

Aula 9 –

Lucie Bosquet | UA