Departamento de Engenharia de Materiais e de Bioprocessos

EQ 883

Cultivo Celular:
TÉCNICAS DE QUANTIFICAÇÃO DE CÉLULAS EM CULTURA

2023
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 Quem cultiva quer quantificar !!!

MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

Quantificar para estabelecimento de estudo cinético

Diretos Determinação do número de

células ou massa celular
Métodos de
Quantificação
Indiretos Quantificação de substâncias
indiretamente ligadas ao
crescimento celular
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

Métodos Diretos:

Determinação da população total e/ou

do número de células viáveis

•Método do hemocitômetro;
•Método de plaqueamento;
•Medida da massa seca;
•Medida da turbidez.
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR
MÉTODOS DIRETOS

1. Método do Hemocitômetro
A suspensão celular, colocada em uma câmara de volume conhecido, é
observada no microscópio óptico.

profundidade: 0,1 mm

1 mm X 1 mm X 0,1 mm = 0,1 mL

- aplicável a meios de cultura sem outras partículas suspensas;

- pode-se usar corantes para se distinguir células vivas de mortas
(células vivas podem não ser viáveis ou capazes de se reproduzir);
- adequado para células não agregadas.
Pode ser adaptado para realização de forma automatizada!
(Exemplo: https://youtu.be/sDHOL7UEL1M)
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

Exemplo da Análise da Viabilidade Celular com o Auxílio de Corantes:

Avaliação de Mudanças Morfológicas Associadas à Morte Celular
Empregando Laranja de Acridina (LA) e Brometo de Etídio (BE)

Fundamento:

LA: capaz de penetrar no interior da célula,

independentemente da integridade da
membrana, intercalando-se nas fitas duplas
de DNA e emitindo fluorescência verde.

BE: não é capaz de permear através da

membrana íntegra, penetrando somente em
células não viáveis. É capaz de se intercalar
com as bases das fitas duplas de DNA,
resultando em fluorescência laranja. Em verde: células viáveis
Em laranja: células apoptóticas
Fonte: www.cmj.org/paper_journal/04/07/04/7c2.jpg
 MÉTODOS DIRETOS ACOPLADOS A ABORDAGENS INDIRETAS

2. Contagem automatizada

• Determinação baseada em análise de imagem, citometria de fluxo (avalia

tamanho, formato e propriedades! Pode ser associada a diferentes
indicadores), ou impedância elétrica (contadores Coulter).
• Por exemplo, na análise de imagem, a amostra é colocada em uma lâmina
ou cartucho descartável, garantindo que o mesmo volume seja analisado
todas as vezes.
• Resultados mais confiáveis que os da contagem manual, em menor tempo;
• Redução significativa da variação de contagem dependente do usuário e da
concentração celular.

Vídeos ilustrativos disponíveis em:

https://www.bio-rad.com/pt-br/applications-technologies/types-automated-cell-counters
?ID=LUSOMAOZR#Flow_Cytometers
https://www.technologynetworks.com/cell-science/videos/how-does-flow-cytometry-wor
k-317076
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DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR
3. Método do Plaqueamento

Placas de Petri com meio de cultura gelificado são usadas para a contagem de
células viáveis (capazes de se reproduzir).

a) As amostras diluídas são espalhadas no

meio contendo ágar
incubação

b) Determina-se o número de unidades

formadoras de colônias

~ 25 gerações  colônia visível a olho nu

- Células metabolicamente ativas podem não formar colônias se o meio e as

condições de cultura não forem adequados
- Método adequado para bactérias e leveduras
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

4. Medida da Massa Seca

Aplicável a meios de cultura sem outras partículas suspensas.

determinação rápida:
volume empacotado

ugação
rif
cent

filtr secagem
açã
o massa seca celular
80°C, 24 h
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

5. Medida da Turbidez

Determina-se a intensidade da luz transmitida por uma amostra de células

suspensas, pelo uso de um espectrofotômetro.

Comprimento de onda usual : 500 - 700 nm

Variáveis que afetam a intensidade da

luz transmitida:

Absorbância
· densidade celular;
· espessura da cubeta de medida;
· luz espalhada;
· luz absorvida;
· presença de outras partículas suspensas;
· absorção de luz por compostos do
meio de cultura: necessidade de avaliação
de amostras em branco Massa seca
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

Métodos Indiretos:

Baseados na medida de consumo de

substrato e/ou na formação de produtos

•Monitoramento de componentes intracelulares;

•Quantificação de substratos;
•Quantificação de produtos;
•Análise de atividade metabólica;
•Monitoramento da viscosidade, etc.
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DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

MÉTODOS INDIRETOS

1. Monitoramento de componentes intracelulares

Componentes intracelulares usualmente medidos:

· DNA
· Proteína
· RNA
· ATP (para bactérias:  1 mg ATP/g massa seca celular)
· NADH (relacionado à atividade respiratória)

Medida de RNA: não é aconselhável (sua variação de concentração depende

da necessidade de síntese de proteínas, que pode diferir em diferentes estágios
do crescimento celular)

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DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

2. Quantificação de substratos

Substratos normalmente medidos:

· Oxigênio processos aeróbicos

· Fontes de carbono exemplo: glicose
· Fontes de nitrogênio exemplo: nitrato

3. Quantificação de produtos

Produtos comumente monitorados:

· Etanol e ácido lático processos anaeróbicos

· CO2 processos aeróbicos
· H+ queda no pH, resultante da utilização
de amônio
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DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

4. Monitoramento da viscosidade durante a fermentação

· Aumento da viscosidade

 Crescimento de micélios
 Formação de polissacarídeo extracelular

· Redução da viscosidade

 Substrato: polímero biodegradável (exemplos: amido e celulose)

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EXAME VISUAL DE CÉLULAS ANIMAIS CULTIVADAS IN VITRO

“Observe the morphology and viability of cultures regularly and carefully. Examine the
medium in the vessel for macroscopic evidence of microbial contamination. This includes
unusual pH shifts (yellow or purple color from the phenol red), turbidity, or particles.
Also, look for small fungal colonies that float at the medium-air interface. Specifically
check around the edges of the vessel as these may not be readily visible through the
microscope.

With an inverted microscope at low power (40×), check the medium for evidence of
microbial contamination and the morphology of the cells. Bacterial contamination will
appear as small, shimmering black dots within the spaces between the cells. Yeast
contamination will appear as rounded or budding particles, while fungi will have thin
filamentous mycelia.

For nonadherent cells grown in flasks, such as hybridomas, this is a simple matter of
viewing the flask directly on the microscope.

For cells grown in spinner flasks or bioreactors, a sample of the cell suspension will need
to be withdrawn and loaded into a microscope slide or hemocytometer for observation. 14
EXAME VISUAL DE CÉLULAS ANIMAIS CULTIVADAS IN VITRO

Most adherent cells should be attached firmly to the surface. In some cases, healthy
cells will round up and detach somewhat during mitosis and appear very refractile.
Following mitosis, they will reattach. Some of these will float free if the culture vessel is
physically disturbed. In contrast, dead cells often round up and detach from the
monolayer and appear smaller and darker (not refractile) than healthy cells.

Cells in suspension culture grow either as single cells or as clusters of cells. Viable cells
appear round and refractile whereas dead cells appear smaller and darker. Occasionally,
a portion of the cells will attach and grow on the side of the culture vessel and appear
round or flattened.

The percentage of attached cells varies with the culture conditions and the cell density.
Cellular debris may also be observed in healthy cell populations. Some cell lines grow as
mixed adherent and suspension cultures.”

Fonte: Manual da ATCC para o Cultivo de Células Animais

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EXAME VISUAL DE CÉLULAS ANIMAIS CULTIVADAS IN VITRO

ATCCR CCL-61™ em alta densidade ATCCR CCL-61™ em baixa densidade

Análise de contaminação por micoplasmas com o fluoróforo de Hoechst

(liga-se ao DNA dos micoplasmas)
Cultura não contaminada Cultura contaminada

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 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE VÍRUS

Abordagens para a detecção de vírus:

• cultura celular (isolamento do vírus)
• microscopia eletrônica
• teste com anticorpo fluorescente
• imuno-histoquímica
• ELISA
(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
Isolado viral deSARS-CoV-2 infectando
célula em cultura
• análise da sequência de ácidos nucleicos DOI:
https://doi.org/10.1016/S0140-6736(
20)31188-0
• contagem de placas.

Fonte:
https://vetfolio-vetstreet.s3.amazonaws.com/mmah/cd/9c700857714ef8b7f5917db5377891/filePV_26_09_730.pdf
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DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE VÍRUS
Contagem de placas:
1) Infecção de uma série de culturas
celulares com alíquotas de
diluições sucessivas da suspensão
viral e recobrimento com um gel.
2) Após incubação para replicação
viral, faz-se a fixação das células
aderidas à placa com formaldeído e
cora-se com cristal violeta.
3) Observa-se zonas com células
viáveis aderidas e coradas e
regiões das quais as células
infectadas foram arrastadas.

Os resultados são expressos em termos

de pfu (plaque forming units) por volume
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Fonte: DOI - 10.3791/52065
 VÍDEOS DIDÁTICOS
• Making a Streak Plate
http://www.youtube.com/watch?v=0heifCiMbfY
• Serial Dilution and Plate Counts
http://www.youtube.com/watch?v=pmRUBYlPMBM
• Slide Culture Technique for Fungi
http://www.youtube.com/watch?v=FcW5tHrbAos
• Hemocytometer - Counting of cells -
http://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90

• Vídeo não tão didático... Identifique os erros!!!

http://www.youtube.com/watch?v=gd19kbrf6oM

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 Bibliografia recomendada
SHULER, M. L. E KARGI, F. - Bioprocess Engineering Basic Concepts,
Editora Prentice- Hall International Inc., Englewood Cliffs, 1992. 2a.
Edição  cap. 2 (2.1)

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