Instituto de Cincias e Tecnologia de Alimentos

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO

Patrcia da Silva Malheiros

Analise microbiolgica de alimentos:

Investigar presena / ausncia de micro-organismos

Quantificar os micro-organismos de interesse

Identificar diferentes espcies microbianas presentes

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO

QUANTIFICAO DIRETA: Contagem em placas Filtrao Mtodo do nmero mais provvel Contagem direta ao microscpio

QUANTIFICAO INDIRETA: Turbidimetria Atividade metablica Peso seco

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO

QUANTIFICAO DIRETA
CONTAGEM EM PLACAS

- tcnica mais utilizada na determinao do tamanho da populao bacteriana;

VANTAGEM: qualificao de clulas viveis DESVANTAGEM: tempo

Diluio seriada

Inculo original

9 mL de diluente em cada tubo

Diluies

Diluentes: soluo peptona 0,1% soluo salina 0,85% tampo fosfato pH 7,2

Semeadura
0,1 mL

meio de cultura (45 50oC)

Fonte: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. Microbiologia de Brock. 10 Ed. Editora Person, 624p., 2008.

Aps a incubao, a contagem das colnias efetuada

Inculo original

9 mL de diluente em cada tubo

Diluies

Plaqueamento

Contagem das colnias e clculo dos resultados

Selecionar as placas com 25 a 250 colnias para contagem. O nmero de Unidades Formadores de Colnias (UFC) por grama ou mililitro da amostra ser o nmero de colnias contadas multiplicado pelo inverso da diluio inoculada

O inverso da diluio 10-1 101, o inverso da 10-2 102 e assim por diante... Duas placas por diluio (duplicata) mdia aritmtica da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata.

Resultado final Usar notao exponencial. Usar uma casa decimal depois da vrgula.

Contagem das colnias e clculo dos resultados

Ex: Plaqueamento em profundidade (1 mL)
http://www.youtube.com/watch?v=bCI-O9vCmHM

Diluio 10-3 85 colnias 65 colnias (duplicata)

Fonte: http://skylinecollege.net/case/biol240/pourplate.html

Resultado: 85 x 103 + 65 x 103 2

75 x 103

7,5 x 104 UFC/g

Contagem das colnias e clculo dos resultados

Ex: Plaqueamento em superfcie (0,1 mL)

Diluio 10-3 85 colnias 65 colnias (duplicata)

Fonte: http://skylinecollege.net/case/biol240/pourplate.html

Resultado:

10 x

85 x 103 + 65 x 103 2

75 x 103

7,5 x 105 UFC/g

AUTOMAO LABORATORIAL
Utilizado nas etapas da analise:

a . Pesagem- Por ex, atravs de um aparelho chamado DILUTER ajustado que ao colocar a amostra, pesa a alquota desejada, e j dilui acrescentando o diluente necessria para a diluio!

AUTOMAO LABORATORIAL
b . Homogeneizao- Uso do stomacher homogeneizador de pisto no mais os liquidificadores que cortam as clulas microbianas injuriando-as na anlise!!!

AUTOMAO LABORATORIAL
c. Semeadura Utilizao de um aparelho chamado spiral plater amostra semeada na placa, atravs de uma cnula, que verte o inculo, e a placa fica numa superfcie que gira.
http://www.youtube.com/watch?v=pRChN3QHuqo&hd=1

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO

QUANTIFICAO DIRETA
FILTRAO

Fonte: Tortora GJ, Funke BR, Case CL. Microbiology: An Introduction. 960 p. 9th ed. Benjamin Cummings: California. 2006.

Membrana filtrante colocada sobre o meio de cultura e placa incubada. Clulas bacterianas na superfcie da membrana (poros)

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO

QUANTIFICAO DIRETA

MTODO DO NMERO MAIS PROVVEL (NMP)

- utilizado para microorganismos que no crescem bem em meio slido.

Diluio

10 mL de inculo

5 tubos positivos
Diluio

1 mL de inculo

3 tubos positivos

Diluio

0,1 mL de inculo

1 tubos positivos

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO

QUANTIFICAO DIRETA
CONTAGEM DIRETA AO MICROSCPIO - um volume conhecido de suspenso bacteriana colocado em uma rea definida da lmina de microscpio. - a amostra pode ser corada ou analisada a fresco.

DESVANTAGENS: - no separa clulas mortas e vivas - pode haver erros de contagem - difcil contagem para bactrias mveis

Fonte: Pelczar JR, Chan ECS, Krieg NR. N.R. Microbiologia. 1 Ed. Editora Makron Books, 556p. 2004.

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO

QUANTIFICAO DIRETA

Sistemas prontos para uso: Placas de Petrifilm-3M, Placas de Simplate e diversos gares adicionados de substratos cromognicos ou fluorognicos.

Petrifilme
1 2

Anlise de Escherichia coli

3

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO

QUANTIFICAO INDIRETA
ATIVIDADE METABLICA

- quantidade de um certo produto (como cido ou CO2) diretamente proporcional ao nmero de clulas bacterianas.
PESO SECO

- principalmente para fungos filamentosos

MTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO MICROBIANO

QUANTIFICAO INDIRETA
TURBIDIMETRIA

- monitoramento do crescimento bacteriano atravs da turbidez; - espectrofotmetro (660 nm).

Origem de luz

Espectrofotmetro

Percentagem de luz transtmitida

Branco

Detector de luz

Percentagem de luz transtmitida

Suspenso bacteriana
Fonte: Tortora GJ, Funke BR, Case CL. Microbiology: An Introduction. 960 p. 9th ed. Benjamin Cummings: California. 2006.

- A quantidade de luz que atravessa o detector inversamente proporcional ao n. de bactrias.

TCNICA ASSPTICA

- Cuidado com contaminaes!

TCNICA DE ESGOTAMENTO

- Obteno de colnias puras.