V CURSO DE MONITORAMENTO TEÓRICO E

PRÁTICO DA FERMENTAÇÃO ETANÓLICA

Roteiros de Procedimentos Laboratoriais

COORDENADORES:

Profa. Dra. Dejanira de Franceschi de Angelis – UNESP – IB – RC

Prof. Dr. Otávio Antonio Valsechi – UFSCar - Araras

RIO CLARO
2011
V Curso de Monitoramento Teórico e Prático da Fermentação Etanólica

1. OBJETIVO
O controle do crescimento da população microbiana dentro de um complexo
industrial de açúcar e álcool objetiva essencialmente a diminuição das perdas de
matéria-prima e, conseqüentemente, alcançar melhores rendimentos econômicos.

2. PONTOS DE AMOSTRAGEM E ANÁLISES OU TESTES DEPENDENDO DA

INDÚSTRIA
Pontos de amostragem
Água de lavagem da cana
Caldo primário
Caldo misto
Caldo antes da sulfitação ou calagem
Caldo decantado
Mosto e Mel
Xarope, água de diluição, caldo cru
Mosto antes e após os trocadores de
calor
Início de alimentação da dorna
Final da alimentação
Análises que podem ser realizadas
• n° bactérias/mL
• Redução de resazurina
• Plaqueamento (contagem geral)
• nº bactérias/mL
• Plaqueamento para produtores de
goma e ácido
• nº bactérias/mL
• Plaqueamento para produtores de
goma e ácido
• nº bactérias/mL
• Plaqueamento para produtores de
goma e ácido
• nº bactérias/mL
• Plaqueamento para produtores de
goma e ácido
• Redução de resazurina
• nº bactérias/mL
• Redução de resazurina
• Plaqueamento para produtores de
goma e ácido
• Redução de resazurina
• nº bactérias/mL
• nº de células vivas/mL
• % de viabilidade
• % de brotamento
• % de brotos vivos
• Plaqueamento

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• nº bactérias/mL
• % de células vivas
Leite de leveduras ou cubas • % de brotamento
• % de brotos vivos
• Plaqueamento
3. COLETA DE AMOSTRAS
As amostras devem ser coletadas com muito cuidado, sempre da mesma forma,
por pessoas de alta responsabilidade e com treinamento prévio.
Da coleta correta das amostras, acoplado ao bom desenvolvimento laboratorial,
depende o resultado de empresa.
O ideal é que as coletas sejam feitas em frascos inquebráveis, autoclaváveis e
transparentes. Existem frascos especiais de coleta, que podem ser autoclavados.
Quando as análises são para microbiologia, os frascos são de 200; 300 a 500
mL. A amostragem deve ser efetuada na forma mista ou composta.
Uma vez coletadas as amostras, os frascos devem ser fechados e guardados
sob refrigeração de 5 ± 2ºC, pelo menor tempo possível. Dependendo da amostra é
conveniente anotar no momento da coleta a temperatura e o pH (ficar atento quando as
amostras estão em etapa fermentativa, pois podem gerar pressão nos frascos).

4. AVALIAÇÃO DO NÚMERO DE BACTÉRIAS

A avaliação pode ser feita pelos seguintes métodos:

MICROSCOPIA
A análise por contagem microscópica é importante, pois permite relacionar
possíveis aumentos das bactérias no material proveniente das diferentes etapas do
processo.
Para contagem pode-se empregar várias técnicas, entretanto a câmara de
Neubauer é simples e confiável quando bem conduzida.

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˚ PLAQUEAMENTO
O plaqueamento embora não forneça o resultado imediato pode garantir a
viabilidade dos microrganismos presentes, além de permitir quantificar a presença de
microrganismos em volumes maiores.

˚ FISIOLOGIA
O método de resazurina (indicador de oxido - redução) ou corantes diferenciais
(azul de metileno e eritrosina) permitem avaliar de forma relativa à presença de
atividade microbiana em função da mudança de cor no corante.
A produção de ácido pode ser comprovada mediante a medida do pH, ou com
aplicação de corantes como indicadores diferenciais, ou ainda nos meios os quais se
adiciona CaCO3.
Quanto à produção de goma, que é o resultado da polimerização de açúcares
simples glicose ou frutose que formam respectivamente dextrana e levana.

5. MATERIAL E MÉTODOS

5.1. Teste da Resazurina

• Preparar uma solução de NaCl 9 g/L, ajustar o pH a 7,0 com solução de NaOH.
• Solução de resazurina a 10 mg/L de solução de NaCl 9,0%. A solução não deve
ser estocada por muito tempo (10 dias), e deve ser protegida da luz e de altas
temperaturas.
• Preparar tubos com 9 mL de solução de resazurina, tampar com algodão,
autoclavar 10 minutos a 121 ºC.
• Nos tubos com resazurina, adicionar 1 mL da amostra. Incubar em estufa ou
banho-maria a 37 ºC.

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• Anotar as mudanças de cor a cada 30 minutos (violeta-róseo-incolor), estão em

relação direta com a atividade microbiana.

Avaliação Tratamento
Modificação da cor (horas)
da infecção
violeta róseo incolor
- 0,5 3,0 alta imediato
0,5 2,0 4,0 alta imediato
1,0 4,0 6,0 média imediato
3,0 5,0 7,0 fraca normal
3,0 5,0 - desprezível preventivo

5.2. Plaqueamento
Para este teste deve-se dispor dos seguintes materiais:
• Autoclave;
• Estufa de incubação;
• Placas de petri;
• Tubos para diluição;
• Pipetas;
• Bico de bunsen;
• Algodão;
• Reagentes: meios de cultura que podem ser adquiridos prontos ou preparados a
partir de seus componentes. Os meios podem variar de acordo com a
necessidade e o ponto de amostragem.

Preparo do material:
Placas de Petri e pipetas devem ser esterilizadas embrulhadas em papel ou em
recipientes próprios.
A solução salina (NaCl a 0,85%) é colocada no volume de 9 mL em tubos. A
seguir tampa-se com algodão e esteriliza-se em autoclave.

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Os meios de cultura quando preparados devem ser autoclavados para

esterilização durante 15 minutos a 121ºC.
A amostra a ser analisada deve ser representativa do ponto selecionado.
Das amostras são feitas diluições decimais utilizando-se soluções contidas nos
tubos. Deve-se diluir a amostra para se atingir entre 30 e 300 UFC (Unidades
Formadoras de Colônias) por placa.
Feitas as diluições, selecionam-se as que serão processadas. A seguir, retira-se
uma alíquota do tubo da diluição selecionada e transfere-se para a placa que conterá
ou não o meio de cultura, dependendo da técnica a ser aplicada (superfície = 0,1 mL ou
“pour plate” = 1 mL).
Caso a placa não contenha o meio, este deverá ser colocado posteriormente, já
liquefeito e a uma temperatura (± 50ºC), vertendo-o sobre a amostra, colocada no
centro da placa, fazendo-se movimentos suaves em forma de oito para homogeneizá-la
no meio antes da solidificação (técnica “pour plate”).
Caso o meio já tenha sido colocado na placa, este deve estar frio e solidificado
ao se colocar a amostra na superfície. Neste caso a amostra é espalhada com auxílio
de uma espátula de Drigalsky (técnica de superfície).
Marcar na placa o meio, a amostra, a diluição, o volume de amostra e a data do
experimento.
Após estarem solidificadas, as placas então são incubadas a 36 ºC (bactérias) ou
28 ºC (leveduras). Pode-se aplicar também uma temperatura de 30ºC para bactérias e
leveduras, embora esta esteja abaixo do ideal para as bactérias que demorarão mais
para crescer.
A incubação deve ser por 24 a 48 horas e, a seguir, as colônias (Unidades
Formadoras de Colônias – UFC/ mL ) são contadas. O experimento deve sempre ser
feito em placas com duplicatas.

Ex. de contagem na diluição a 10-3, plaqueando-se 0,1 mL

Placa 1: 110 colônias

Placa 2: 130 colônias
Média: 120 colônias
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120 x 103 x 0,1 = 12 x 105 UFC/mL

5.3 Principais problemas microbiológicos envolvendo bactérias em usinas

5.3.1 Produção de ácido

Amostras de caldo são coletadas nos diferentes pontos do processo em frascos,
tubos ou recipientes esterilizados. A seguir são colocadas em uma solução contendo
indicador com pequena faixa de variação (ex. púrpura de bromocresol ou verde de
bromocresol).
Ajustar o pH das amostras a pH 6,8 para púrpura de bromocresol e pH 5,0 para
verde de bromocresol.
Os tubos são incubados a 30ºC e observados de hora em hora. Descartar após
12 ou 24 horas. Quando ocorrer predominância de bactérias ácidas as alterações
poderão ocorrer a partir de 3 horas.

5.3.2 Produção de goma

Amostras devem ser coletadas como no caso anterior e colocadas diretamente
na estufa, caso a presença de goma seja numerosa o meio mostra-se em 12 horas
turvo e viscoso. Para acelerar a reação é conveniente acrescentar para cada 10 mL de
amostra 2 mL de solução esterilizada de extrato de levedura.
O número das bactérias formadoras de goma pode ser determinado pelo meio de
Mayeux & Colmer ou ainda pelo meio Caldo Suplementado com Nutrientes - (CSN). As
UFC aparecem convexas ou espalhadas, podem ser leitosas ou límpidas.

5.4 Principais problemas microbianos envolvendo leveduras na fermentação

etanólica.

• VOLUME DE FERMENTO
• VIABILIDADE CELULAR E BROTAMENTO CELULAR

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• FLOCULAÇÃO
• LEVEDURAS SELVAGENS

Para uma avaliação geral da situação das leveduras a microscopia envolvendo a

contagem auxilia muito.
5.4.1 Técnica de contagem de células ou partículas
Rotineiramente emprega-se em Microbiologia a Câmara de Neubauer,
considerada como precisa e de leitura rápida para quantificar células de leveduras,
esporos, bactérias e outras partículas.
A câmara de Neubauer é conhecida por “lâmina hematimétrica”. Presta-se à
contagem de células ou partículas visíveis ao microscópio óptico.

Retículo simples Retículo duplo

De uma maneira geral a câmara é dividida em 16 ou 25 quadrados.

• Quando estiver dividida em 25, cada quadrado terá 0,2 mm.

• Quando estiver dividida em 16, cada quadrado terá 0,25 mm.

Assim o volume útil de cada quadrado médio é:

0,2 mm x 0,2 mm x 0,1mm = 0,004 mm3

25 quadrados: 25 x 0,004 = 0,1 mm3

0,25 mm x 0,25 mm x 0,1mm = 0,00625 mm3

16 quadrados: 16 x 0,00625 = 0,1 mm3

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Como a profundidade da câmara é de 0,1 mm

(1/10 cm) o seu volume equivale a:

1 mm x 1 mm x 0,1 mm = 1/10 cm x 1/10 cm x

1/100 cm = 1/10000 cm3 = 0,0001 cm3

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Lembrando que:
10 x 0,1 mm3 = 1 mm3
1000 x 0,001 mm3 = 1 mm3
10000 x 0,1000 mm3 = 1 cm3 ou
104 x 0,1 mm3 = 1 cm3

Considerando a profundidade da câmara (1/10 mm) e que as contagens são

anotadas em cm3 (1 cm3 = 1 mL) o volume de um quadrado grande é: 1 mm x 1
mm x 0,1 mm = 1/10 cm x 1/10 cm x 1/100 cm = 1/10.000 cm3 ou 0,0001 cm3.
0,0001 é o fator da lâmina = 1 x 104.

REGRAS DE CONTAGEM

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1) Conte as células usando o quadrado grande do centro.

2) Conte as células dos quadrados médios e as células que estiverem tocando
as linhas superiores e as linhas à direita.
3) Conte cerca de 200 a 250 células antes de determinar o número por cm3.

NOS 25 OU 16 QUADRADOS PODEM SURGIR 4 SITUAÇÕES:

A) Coincidir de haver 200 a 250 células, neste caso conte as mesmas e

multiplique por 104 para obter o número de células por cm3.
Ex: 200 células 2 x 102 x 104 = 2 x 106

B) Pode haver menos de 200 células por quadrado grande, neste caso será
necessário a contagem de células de alguns quadrados grandes laterais para
atingir cerca de 200. Divida o número de células pelo número de quadrados
grandes e multiplique por 104 para achar o número de células por mL ou cm3.

C) Pode haver mais de 200 células por quadrado grande, neste caso conte as
células dos quadrados médios até haver contado cerca de 200. Determine o
número de células de um dos quadrados médios. Multiplique a média por 25
para obter as células por quadrado grande. Este número x 104 fornece o número
de células por cm3.

Ex: 210 células em 3 quadrados médios.

Cada um medindo 0,2 x 0,2 mm. Quantas células há por cm3?

210/3 = 70 células por quadrado médio
70 x 25 = 1750 em 0,1 mm3 (1750 células por quadrado grande)
1750 x 104 = 17.500.000 ou 1,75 x 107 células/cm3

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D) O número de células é muito grande para ser contado.

Neste caso a solução precisa ser diluída.

Uma alíquota de 1mL diluído em 9 mL de água ou solução salina é uma diluição

de 1:10 ou 1/10, neste caso o número de células contadas deve ser multiplicado por 10.

CÁLCULO DA PORCENTAGEM DE CÉLULAS DE LEVEDURAS

• % Viabilidade = _____Vivas____ x 100

Vivas + mortas

• % Brotamento = _____Vivos____ x 100

Vivos + mortos

• % Viabilidade dos brotos = __ Brotos vivos____ x 100

Br. vivos + Br. Mortos

• Flocos por campo (mL) = _____Flocos____ x 100

N° de quadrados

5.5 Soluções utilizadas na contagem de leveduras

Solução A - Solução de sulfato azul de Nilo

20 g de sulfato azul de Nilo em 100 mL de água destilada

Solução B - Solução de azul de metileno

0,2 g de azul de metileno em 100 mL de água destilada

Uso: solução A + solução B em partes iguais

Eritrosina - 1 g de eritrosina em 100 mL de água destilada.

Diluir 1 mL desta solução em 50 mL de solução tampão (partes
iguais de 0,2 M de Na2HPO4 de 0,2 de NH2PO4). Ficando solução
corante de 1:5000. Guardar em refrigerador.
1 mL (suspensão de células) + 1 mL de solução corante.
Examinar em câmara de Neubauer.
Obs.: pode-se ainda utilizar a câmara de Petroff-Hauser.

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5.6 MEIOS DE CULTURA PARA LEVEDURAS

Estes meios permitem o desenvolvimento de técnicas microbianas que
possibilitem a identificação da presença de bactérias contaminantes e leveduras
diferentes daquelas usualmente empregadas (Saccharomyces cerevisiae e S. uvarum)
na fermentação etanólica.

5.6.1 Meio WLN

Este meio permite avaliar o número total de células, as diferenças morfológicas
entre colônias e a produção de ácido. Além disso, há a possibilidade de tornar o meio
parcialmente seletivo pela adição de actidiona.

5.6.1.1 Preparo do meio

Composição do WLN-modificado (quantidade para 100mL):
Glicose................................................................................ 5,0000g
KH2PO4............................................................................... 0,0550g (a)
KCl...................................................................................... 0,0425g (b)
CaCl2.2H2O......................................................................... 0,0125g (c)
MgSO4.7H2O...................................................................... 0,0125g (d)
FeCl3.6H2O......................................................................... 0,2500g (e)
MnSO4.4H2O...................................................................... 0,2500g (f)
Peptona de caseína............................. .............................. 0,5000g
Extrato de levedura............................................................ 0,4000g
Ágar.................................................................................... 2,0000g
Verde de bromocresol........................................................ 0,0022g (g)
Ácido nalidíxico................................................................. 5,0000mg (h)
Ampicilina.......................................................................... 5,0000mg (i)
pH = 5,5 (HCl, 1 N)

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Observação: os ingredientes a, b, c, d, e, f, g, h e i serão adicionados na forma de

solução.

a) Solução de KH2PO4 – 5,5 g/ 100 mL. Usar 1 mL para 100 mL de meio.

b) Solução de KCl – 4,25 g/ 100 mL. Usar 1 mL para 100 mL de meio.
c) Solução de CaCl2.2H2O – 1,25 g/ 100 mL. Usar 1 mL para cada 100 mL de meio.
d) Solução de MgSO4.7H2O – 1,25 g/ 100 mL. Usar 1 mL para cada 100 mL de meio.
e) Solução de FeCl3.6H2O – 0,5 g/ 200 mL. Usar 0,1 mL para cada 100 mL de meio.
f) Solução de MnSO4.4H2O – 0,5 g/ 200 mL. Usar 0,1 mL para cada 100 mL de
meio.
g) Verde de bromocresol – 220mg/ 100 mL. Dissolver em 5 mL de álcool e completar
para 100 mL com água. Usar 1 mL para cada 100 mL de meio.

5.6.1.2 Procedimento

a) Pesar a glicose em um becker. Coletar água em um becker (1/10 do volume total

do meio, isto é, 10 mL) e acrescentar a glicose. Dissolver. Transferir para o tubo.
Etiquetar “glicose 5 g/ 10 mL para 100 mL de WLN”. Esterilizar, após fechar com
tampão e folha de alumínio.
b) Coletar 83 mL de água destilada em um becker, acrescentar a peptona de
caseína, extrato de levedura e as soluções. Dissolver em banho-maria, medir pH e
ajustar com HCl 1N, se necessário. Acrescentar o ágar e voltar ao banho-maria.
Após a dissolução, transferir para Erlenmeyer de 250 mL e etiquetar “WLN sem
glicose”. Fechar com tampão de algodão e folha de alumínio. Esterilizar 10
minutos a 1 atmosfera (121oC).

5.6.1.3 Uso de antibiótico e preparação das soluções

Para minimizar o crescimento bacteriano que prejudicaria os resultados, o meio

WLN sofre a adição de antibióticos. Na rotina dos laboratórios III e IV do

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Departamento de Bioquímica e Microbiologia do Instituto de Biociências da UNESP-

Rio Claro, verificou-se a eficiência da combinação do antibiótico ácido nalidíxico com
ampicilina.

a) Preparo da solução de ácido nalidíxico (Solução h)

Triturar 1 comprimido de 500 mg de ácido nalidíxico farmacêutico em almofariz.
Dissolver a solução de NaOH 0,05N completando o volume para 100 mL. Guardar
em geladeira. Usar 1 mL para cada 100 mL de meio de forma a obter 50 ppm (50
microgramas/ mililitro). A solução de ácido nalidíxico é autoclavável, podendo ser
acrescentado ao meio antes da esterilização.

b) Preparo da solução do antibiótico ampicilina (Solução i):

Triturar 1 comprimido de 500 mg de ampicilina (farmacêutica) num almofariz.
Dissolver em água destilada, completando o volume para 100 mL. Usar 1 mL para
100 mL de meio, de forma a obter a concentração final de 50 ppm (50
microgramas/ mililitro). Pode ser autoclavado.

5.6.2 Meio WLN sem bromocresol

A preparação é idêntica à descrita em 5.6.1.1 e 5.6.1.2, exceto pela ausência
do verde de bromocresol.

5.6.3 Meio WLN com actidiona

O meio WLN pode sofrer a adição de actidiona a um nível suficiente para inibir
o crescimento de leveduras de processo e permitir o desenvolvimento daquelas
espécies presentes que tenham menor sensibilidade ao produto. Vale lembrar que
algumas espécies de leveduras são insensíveis a 1000 ppm. A actidiona inibe
Saccharomyces cerevisiae e S. uvarum nas concentrações de 2,5 e 0,17 ppm. Por
medida de segurança, trabalha-se com 5 ppm de actidiona.

a) Preparação da solução de actidiona

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A actidiona deve ser manipulada com máxima cautela, com o objetivo de evitar
sua ingestão ou contato com a pele.

Solução estoque A:
Pesar 0,2 g e dissolver em 1 mL de acetona. Juntar 9 mL de água e esterilizar
por filtração em membrana “millipore” GSWP-01300, 0,22 micrometros. Essa
solução terá a concentração de 20 mg/mL. Guardar em geladeira.

Solução de trabalho B:
Transferir 5 mL da solução A e adicionar 95 mL de água destilada estéril.
A solução de trabalho terá a concentração de 1mg/mL. Usar 0,5 mL para cada
100 mL de meio já esterilizado e fundido. Guardar em geladeira.

5.6.3.1 Preparação da amostra

Toma-se um volume medido da amostra (por exemplo, 10 mL). Centrifuga-se
com assepsia, ressuspende-se em 9 mL de solução salina estéril. Após nova
centrifugação, o sobrenadante é descartado e a massa celular é ressuspensa em
salina de forma a se reconstituir o volume inicial da amostra.
A suspensão sofrerá diluição em série até 10-7. O plaqueamento em meio WLN
sem actidiona é feito em duplicata, nas diluições 10-5, 10-6 e 10-7. O plaqueamento nos
demais meios é feito nas diluições 10-1, 10-2 e 10-3.
Observação: a prática de cada laboratório indicará as melhores diluições.

5.6.3.2 Plaqueamento
Plaquear em superfície 0,1 mL de suspensão de células por placa, espalhando
com espátula de Drigalsky. Incubar em estufa a 28oC e proceder às leituras de 2 a 5
dias.

5.6.4 Meio de lisina

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5.6.4.1 Preparo do meio

Composição do meio de lisina modificado (para 100 mL de meio)
YCB (Yeast Carbon Base).......................................................1,17 g
Lisina........................................................................................0,10 g
Ágar..........................................................................................2,00 g
Ampicilina.................................................................................5,00 g
Ácido nalidíxico.........................................................................5,00 g

5.6.4.2 Preparo do meio

a) Preparo da solução YCB concentrada 10 vezes.
Tomar 11,7 g de YCB e preparar 100 mL de solução concentrada 10 vezes,
usando água morna. Esterilizar através de membrana “millipore” GSWP-04700
(0,22 micrômetros) e pré-filtro AP15-04700. Esta quantidade é suficiente para
preparar 1000 mL de meio.

b) Preparo do meio sólido.

Dissolver 2,0 g de ágar e 0,1 g (100 mL) de lisina em 88 mL de água destilada
em banho-maria. Adicionar 1 mL de solução de ampicilina e 1 mL de solução
de ácido nalidíxico preparados como nos itens 1.2.3.b. Autoclavar 10 minutos a
1 atmosfera (1210C). Após autoclavagem, adicionar assepticamente 10 mL da
solução de YCB concentrada 10 vezes.

5.6.4.3 Preparo da amostra e plaqueamento

Seguir instruções dos itens 5.6.3.1 e 5.6.3.2.

5.7 Meio de preservação de leveduras

5.7.1 Meio Sólido de Sabouraud 4%

- Peptona ou triptona............................................................................10 g

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- Glicose...............................................................................................40 g
- Ágar ..................................................................................................17 g
- Água destilada............................................................................1000 mL
Misturar os componentes e fundir em banho-maria. A seguir, distribuir
em frascos ou tubos, tampar e esterilizar em autoclave por 10 minutos a 1 atmosfera
(1210C).
Observação: este meio pode ser preparado com 20 g de glicose.

5.7.2 Meio YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose)

Glicose...............................................................................................20 g
Peptona..............................................................................................20 g
Extrato de levedura................10g ou 20 mL de hidrolisado de levedura
Ágar...........................................................................................15 a 17 g
Água destilada............................................................................1000 mL
Misturar os componentes, fundir em banho-maria e a seguir, distribuir
em frascos ou tubos. Esterilizar durante 10 minutos a 1 atm de pressão.

5.7.3 Extrato de malte 2%

Extrato de malte.................................................................................20 g
Ágar............................................................................................15 a 17 g
Água destilada.............................................................................1000 mL
Dissolver em banho-maria o extrato de malte e o ágar. A seguir distribuir
em frascos ou tubos, tamponar e esterilizar durante 15 minutos a 1 atm de pressão
(121o).

Figura 1: Leveduras de dorna cultivada no meio WLN com verde de

bromocresol onde se verifica diferentes biotipos.

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Figura 2: Leveduras selvagens cultivadas em meio WLN com verde

de bromocresol e actidiona, onde se verifica diferentes biotipos.

6 – LITERATURA CONSULTADA

LIMA, A. O.; SOARES, J. B.; GRECO, J. B.; GRAUZZI, J. E.; CANÇADO, J. R.

Métodos laboratoriais aplicados à clínica. 5° ed., p. 403-411.

SHARF J. M. Métodos recomendados para o exame microbiológico de alimentos.

Polígono, p. 239, 1972.

SUSSMAN, A. S. Microrganismos, crescimento, nutrição e interação. Edart, p. 56-

58, 1972.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R; CASE, C. L. Microbiologia. Ed. Artmed. 2000.

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