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PROCEDIMENTO
1. Inicialmente, o meio de cultura PCA será 5. As amostras serão mantidas sob refrigeração
enriquecido com 5% de BHI (para cada 23,5 g (±18 °C) até o momento do processamento, se
de PCA, será adicionado 1,175 g de BHI) para necessário. No momento do processamento, as
que o crescimento de cepas mais fastidiosas amostras serão homogeneizadas com auxílio
seja estimulado. Os cálculos para a quantidade de um vórtex por 30 segundos, se possível.
de meio e água serão realizados de acordo com 6. Os tubos contendo salina serão identificados
a quantidade de amostras a serem processadas, com a fase de diluição, de 10-1 até 10-10. Será
levando em consideração que uma placa de pipetado 1mL da amostras e colocado no tubo
petri leva cerca de 17 a 20 ml de meio pronto. com a identificação 10-1, homogeneizadas,
*Em casos onde não se busca encontrar pipetado 1mL, passar para o próximo tubo, até
bactérias mais exigentes, o uso de BHI não se o tubo 10-10, e todo esse processo será feito
faz necessário. atrás da chama (bico de Bunsen).
2. O meio será preparado de acordo com as 7. As placas contendo o meio serão identificadas
especificações do fabricante. Após as de acordo com a diluição, amostra e
quantidades de meio e água forem definidas, temperatura em que será incubada. Serão
homogeneizar em Erlenmeyer, medir o pH (de inoculados 100 uL da diluição 10-5 a 10-10, em
7,2 a 7,8) e autoclavar. duplicata, e será espalhado pela superfície do
3. A salina será preparada na concentração de meio pela técnica de spread plate. Para cada
0,85% p.v, e os tubos serão preenchidos com 9 diluição, duas placas serão incubadas em
mL da solução e esterilizados em autoclave. estufa bacteriológica a 30 °C ± 2 °C, e após
4. Decorrido o tempo de esterilização, reservar a 24hrs, será observado o crescimento e
salina estéril. O meio PCA + BHI (ou apenas realizada a Contagem Padrão de Placa (CPP).
PCA) estéril, após arrefecimento, será vertido
em placas de Petri, solidificados e reservados.
PROTOCOLO DE OPERAÇÃO PADRÃO - POP
Fase 1: Processamento das amostras, inoculação, isolamento e identificação
Etapa 2: Isolamento (CPP, Caracterização e Repicagem)
Materiais Equipamentos
Água destilada Bico de Bunsen Balança analítica
Fitas de pH Erlenmeyers Pipeta
Meio de Cultura Tryptone Soy Agar (TSA) Tubos de ensaio Autoclave
Placas de Petri com Cultura Alça de platina Estufas
PROCEDIMENTO
1. Decorridas 24hrs após incubação das placas, será realizada a CPP. A CPP serve para definir a
quantidade de UFC/mL (UFC = Unidades Formadoras de Colônias). O cálculo de UFC é obtido de
acordo com a fórmula:
placa∗Fator de diluição
UFC=Número de colônias na
Volume de inóculo
2. Após a CPP, será realizada a caracterização das colônias a serem isoladas, levando em consideração
a morfologia de cada uma, escolhendo colônias mais distintas.
Exemplos:
INTEIRA ONDULADA
FIMBRIADA LOBADA
d) Transparência: transparente; opaca; translúcida
BRILHANTE FOSCA
f) Pigmentação: ausente; presente
g) Superfície: rugosa; lisa
LISA RUGOSA
h) Consistência: cremosa; mucoide; quebradiça
3. Após a caracterização das colônias de interesse, as mesmas serão repicadas para tubos de ensaio
contendo meio de cultura TSA com pH aferido entre 7,2 a 7,8, previamente preparado e esterilizado.
4. A repicagem deverá ser feita atrás de chama, utilizando uma alça bacteriológica, agulha
bacteriológica ou palitos de madeira previamente esterilizados. A repicagem consiste na técnica de
estriamento em tubo. Após identificar adequadamente os tubos contendo as cepas isoladas, incubar
em estufa bacteriológica por 24 hrs, a 37 °C.
PROTOCOLO DE OPERAÇÃO PADRÃO - POP
Fase 1: Processamento das amostras, inoculação, isolamento e identificação
Etapa 3: Identificação (Morfológica e Bioquímica)
Materiais Equipamentos
Salina estéril Bico de Bunsen Balança analítica
Kit de coloração de Gram Lâminas de microscopia Pipeta
Kit de coloração de Ziehl Neelsen Microscópio Autoclave
Tubos de TSA com Cultura Alça de platina Estufas
Meios de cultura para testes bioquímicos
PROCEDIMENTO
1. Após 24hrs, será possível observar o crescimento bacteriano nos tubos. A partir disso, serão
realizados esfregaços bacterianos. Uma gota de salina estéril será pingada numa lâmina
identificada. A alça tem que ser flambada, o tubo aberto atrás da chama, flambado na boca, com a
alça, a bactéria será pescada, a boca do tubo flambada novamente e o mesmo fechado. A massa
bacteriana na alça será homogeneizada na salina e o esfregaço será fixado pelo calor.
2. Após os esfregaços prontos, será realizada a coloração de Gram de acordo com a imagem:
1 minuto
1 minuto
30
segundos
3. Após a coloração, aguardar a secagem e observar na objetiva de 100x. Anotar a morfologia e
coloração das cepas. A coloração se divide entre Gram Positivas (roxo azulado) e Gram
Negativas (rosa púrpura).
2
minutos
2
minutos