PROTOCOLO DE OPERAÇÃO PADRÃO - POP
Fase 1: Processamento das amostras, inoculação, isolamento e identificação
Etapa 1: Processamento das amostras e inoculação
As amostras serão processadas de acordo com o protocolo de diluição seriada padrão (1:9).
Materiais
Água destilada
Fitas de pH
Meio de Cultura Brain Heart Infusion (BHI)*
Meio de Cultura Plate Count Agar (PCA)
NaCl
PROCEDIMENTO
1. Inicialmente, o meio de cultura PCA será
enriquecido com 5% de BHI (para cada 23,5 g
de PCA, será adicionado 1,175 g de BHI) para
que o crescimento de cepas mais fastidiosas
seja estimulado. Os cálculos para a quantidade
de meio e água serão realizados de acordo com
a quantidade de amostras a serem processadas,
levando em consideração que uma placa de
petri leva cerca de 17 a 20 ml de meio pronto.
*Em casos onde não se busca encontrar
bactérias mais exigentes, o uso de BHI não se
faz necessário.
2. O meio será preparado de acordo com as
especificações do fabricante. Após as
quantidades de meio e água forem definidas,
homogeneizar em Erlenmeyer, medir o pH (de
7,2 a 7,8) e autoclavar.
3. A salina será preparada na concentração de
0,85% p.v, e os tubos serão preenchidos com 9
mL da solução e esterilizados em autoclave.
4. Decorrido o tempo de esterilização, reservar a
salina estéril. O meio PCA + BHI (ou apenas
PCA) estéril, após arrefecimento, será vertido
em placas de Petri, solidificados e reservados.
Equipamentos
Bico de Bunsen Balança analítica
Erlenmeyers Micropipetas e Pipeta
Placas de Petri Autoclave
Béqueres Estufas
Ponteiras Alça de Drigalski ou em L
Tubos de ensaio Vórtex
5. As amostras serão mantidas sob refrigeração
(±18 °C) até o momento do processamento, se
necessário. No momento do processamento, as
amostras serão homogeneizadas com auxílio de
um vórtex por 30 segundos, se possível.
6. Os tubos contendo salina serão identificados
com a fase de diluição, de 10-1 até 10-10. Será
pipetado 1mL da amostras e colocado no tubo
com a identificação 10-1, homogeneizadas,
pipetado 1mL, passar para o próximo tubo, até
o tubo 10-10, e todo esse processo será feito atrás
da chama (bico de Bunsen).
7. As placas contendo o meio serão identificadas
de acordo com a diluição, amostra e
temperatura em que será incubada. Serão
inoculados 100 uL da diluição 10-5 a 10-10, em
duplicata, e será espalhado pela superfície do
meio pela técnica de spread plate. Para cada
diluição, duas placas serão incubadas em estufa
bacteriológica a 30 °C ± 2 °C, e após 24hrs, será
observado o crescimento e realizada a
Contagem Padrão de Placa (CPP).
 PROTOCOLO DE OPERAÇÃO PADRÃO - POP
Fase 1: Processamento das amostras, inoculação, isolamento e identificação
Etapa 2: Isolamento (CPP, Caracterização e Repicagem)
Materiais Equipamentos
Água destilada Bico de Bunsen Balança analítica
Fitas de pH Erlenmeyers Pipeta
Meio de Cultura Tryptone Soy Agar (TSA) Tubos de ensaio Autoclave
Placas de Petri com Cultura Alça de platina Estufas

PROCEDIMENTO
1. Decorridas 24hrs após incubação das placas, será realizada a CPP. A CPP serve para definir a
quantidade de UFC/mL (UFC = Unidades Formadoras de Colônias). O cálculo de UFC é obtido de
acordo com a fórmula:
𝐹𝑎𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜
UFC = Número de colônias na placa ∗
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑑𝑒 𝑖𝑛ó𝑐𝑢𝑙𝑜
2. Após a CPP, será realizada a caracterização das colônias a serem isoladas, levando em consideração a
morfologia de cada uma, escolhendo colônias mais distintas.

Exemplos:

a) Forma: puntiforme; circular; irregular; filamentosa

b) Elevação: espraiada; elevada; convexa; bosselada; papilada

c) Bordas: ondulado; fimbriado; inteiro; denticulado

INTEIRA ONDULADA

FIMBRIADA LOBADA
d) Transparência: transparente; opaca; translúcida

e) Brilho: fosco; brilhante

BRILHANTE FOSCA

f) Pigmentação: ausente; presente

g) Superfície: rugosa; lisa

LISA RUGOSA

h) Consistência: cremosa; mucoide; quebradiça

3. Após a caracterização das colônias de interesse, as mesmas serão repicadas para tubos de ensaio
contendo meio de cultura TSA com pH aferido entre 7,2 a 7,8, previamente preparado e esterilizado.
4. A repicagem deverá ser feita atrás de chama, utilizando uma alça bacteriológica, agulha bacteriológica
ou palitos de madeira previamente esterilizados. A repicagem consiste na técnica de estriamento em
tubo. Após identificar adequadamente os tubos contendo as cepas isoladas, incubar em estufa
bacteriológica por 24 hrs, a 37 °C.
 PROTOCOLO DE OPERAÇÃO PADRÃO - POP
Fase 1: Processamento das amostras, inoculação, isolamento e identificação
Etapa 3: Identificação (Morfológica e Bioquímica)
Materiais Equipamentos
Salina estéril Bico de Bunsen Balança analítica
Kit de coloração de Gram Lâminas de microscopia Pipeta
Kit de coloração de Ziehl Neelsen Microscópio Autoclave
Tubos de TSA com Cultura Alça de platina Estufas
Meios de cultura para testes bioquímicos

PROCEDIMENTO
1. Após 24hrs, será possível observar o crescimento bacteriano nos tubos. A partir disso, serão
realizados esfregaços bacterianos. Uma gota de salina estéril será pingada numa lâmina
identificada. A alça tem que ser flambada, o tubo aberto atrás da chama, flambado na boca, com a
alça, a bactéria será pescada, a boca do tubo flambada novamente e o mesmo fechado. A massa
bacteriana na alça será homogeneizada na salina e o esfregaço será fixado pelo calor.

2. Após os esfregaços prontos, será realizada a coloração de Gram de acordo com a imagem:

1 minuto

1 minuto

Lavar até tirar o

excesso de violeta

30 segundos
3. Após a coloração, aguardar a secagem e observar na objetiva de 100x. Anotar a morfologia e
coloração das cepas. A coloração se divide entre Gram Positivas (roxo azulado) e Gram
Negativas (rosa púrpura).

4. A partir dessa caracterização, serão realizados testes bioquímicos utilizando chaves de

identificação bioquímica de Bergey. Inicialmente, as bactérias serão divididas em cocos e bacilos,
gram positivos e gram negativos. Para identificar algumas cepas, será realizada a coloração de
Ziehl Neelsen, de acordo com a imagem:

2
minutos

Aquecer por 5 min, até

desprender vapores por 3x

2
minutos
5. As bactérias do gênero Mycobacterium spp. Coram-se de vermelho, e as demais células coram-se
de azul.