MARIA VITORIA MENDES – DOENCAS VIROTICAS – 2022 – UFU

ESTÁ FALTANDO A PRIMEIRA AULA (DANI ANOTOU, LEMBRAR DE PEGAR COM ELA)

MORFOLOGIA DOS VIRUS

GENOMA E TAXA DE MUTACAO

 Existem dois tipos de molécula de material genético viral (RNA ou DNA). Tem a característica de ser envelopados ou
não envelopados.
 Os vírus envelopados são mais sensíveis no ambiente.
 Com RNA existe também aplicação pratica. Com relação aos vírus RNA a taxa de mutação deles é muito maior quando
comparada com os vírus DNA.
 Em segundo lugar o que mais sofre mutação é o vírus DNA e em terceiro lugar vem as bactérias.
 Quando um vírus ganha mutação ele pode se tornar mais patogênico, pode infectar mais, pode passar a infectar outras
espécies, pode passar a fugir de medicamentos que funcionam contra esses vírus, escape vacinal.
 Vírus se replicam por agrupamentos de componentes virais pré-formados em muitas partículas.
 Não aumentam de número por fissão binaria ou bipartição.
 Com relação ao vírus temos a situação do gráfico, uma vez que um vírus consegue infectar uma célula, temos o período
de eclipse, nao veremos na circulação durante um período de tempo particular virais. Porque toda a célula esta sendo
escravizada pelo vírus, para replica-lo e tem o momento pós eclipse e várias partículas virais são produzidas e liberadas.
 Genoma viral: replicação (polimerase e prot. Acessórias) do genoma, regulação e timing para a replicação, subversão e
modulação das funções celulares, empacotamento do genoma (proteínas capsídeo e envelope).
 Proteínas codificadas pelo genoma viral
 Proteínas estruturais: fazem parte da arquitetura da partícula viral  capsídeo e envelope.
 Não estruturais: proteínas com atividade enzimática/regulatória  DNA polimerase, RNA polimerase, enzimas do
metabolismo dos nucleotídeos, fatores de transcrição e regulação da regulação da expressão genica.
 Os vírus só se multiplicam utilizando o maquinário celular.
 Taxonomia dos vírus: ordem – virales, viridae – família, subfamília – viriniae, gênero – vírus, espécie – nome em inglês.
 Familia: características estruturais, morfológicas, genéticas e biológicas em comum. Por exemplo os “herpes” são todos
virions grandes, envelopados, varias glicoproteínas, capsídeo icosaedrico, dsDNA, latência.
 Subfamilia: amploespectro hospedeiro, ciclo rápido e lítico (na hora de librar as partículas virais introduzidas dentro da
célula, a célula é rompida).
 No mundo existem mais de 2,600 especies virais e mais de 35,000 cepas virais. Isso é uma contagem que ja esta
desatualizada.

CONCEITOS IMPORTANTES
 Conceitos importantes: a nomenclatura diferente das bactérias (que vem do latim), a dos vírus deriva todo do inglês.
 Não falar que o animal estava com uma patologia. Patologia é o estudo da doença, não a manifestação dela.
 Titulo incorreto da matéria: caso de covid-19 em animais em BH. Está incorreto! Porque covid-19 é a doença, os
animais não tinham manifestado a doença, eles estavam apenas portando o vírus.
 Doenca X infecção: para doenças virais, o evento doença é uma exceção a regra.
(inserir imagem da pirâmide que mostrei)
 Isso não necessariamente é uma regra, como o vírus da raiva que é muito patogênico e foge a essa regra.
 A maioria das infecções virais são detectáveis somente com apoio diagnostico, isso é importante na disseminação da
doença.
 O mais complicado é o animal com uma infecção subclínica. Porque ele não tem sintomas, mas esta infectado e
transmitindo.
 Doença ou infecção assintomática, qual o fator determinante? Sempre temos 3 pilares em toda doença infecciosa, o
patógeno (muito ou pouco patogênico), hospedeiro (ele é saudável? Foi imunizado? É o hospedeiro susceptível?),
 ambiente (mesmo um individuo saudável, mas com alimentação ruim, aglomerado, estressado, mal higienizado,
ambiente ruim pode causar combo de patógenos e o sistema imune não aguenta responder adequadamente),
 Na doença viral: maioria dos sinais clínicos é consequencia da resposta do hospedeiro a lesão celular e tecidual  como
resultado direto da replicação ou como resultado da resposta imune do hospedeiro (resultado indireto).

DIAGNOSTICO
 O que levar em consideração para a escolha do teste? Qual amostra coletar? Raciocinar no momento pré-analítico, ver
a sintomatologia e pensar em suspeitas e ver qual amostra seria melhor coletar nesses casos e preservar da forma
correta ate a testagem.
 A detecção anticorpo ou antígeno é melhor para detecção da doença suspeita? Depende, podemos ter anticorpo de
doenças que recebemos vacinação.
 Por exemplo com herpes, podemos estar com o vírus ativo e ate sem a ferida. Mas um teste de anticorpo nesse caso
definiria, pois estaríamos combatendo a infecção.
 Com intervalo de 15 a 21 dias a titulação de anticorpos precisa ser de 4x maior do que a titulação inicial para afirmar
que ha infecção.
 Método direto: quando detecta o agente em si ou proteínas desse agente.
 Método indireto: quando se detecta a resposta imunológica do hospedeiro frente a esse agente.
 Perguntar se o teste que vai ser feito, responde a pergunta? Por exemplo com o vírus da cinomose, se faz teste em
filhote em época de vacinação, mesmo tendo o resultado positivo é importante associar a clínica e exames
laboratoriais... porque o exame pode dar positivo devido a vacinação.
 Sensibilidade e especificidade analítica: é a capacidade de um teste em detectar pequenas quantidades, quantidades do
agente e seus produtos.
 Especificidade analítica: capacidade de um teste em detectar um determinado vírus (ou seus produtos) e distingui-los
de outros, mesmo que muito semelhantes.
 Nenhum teste é 100% sensível e 100% especifico. Todo teste diagnostico é passível de erro. Seja erro humano, de
armazenamento, do farmacêutico. Um conjunto de fatores que pode interferir na sensibilidade e especificidade dele.
 Metodos diretos: isolamento viral, detecção de genoma, detecção de antígeno.
 Metodos indiretos: sorologia de anticorpos IgM e IgG. (IgM a primeira classe produzida). Os anticorpos começam a ser
produzidos num período mais tardio que a infecção em si, mas primeiramente ocorre a produção de IgM e depois a de
IgG.

METODOS DIRETOS

MICROSCOPIA ELETRÔNICA

 vizualizacao das partículas virais coradas com metais pesados em um microscópio ultrapotente.
 Propriedades: rápida (sai em poucas horas), detecta vírus viáveis e inviáveis, útil para vírus que não replicam em cultivo,
pode permitir a identificação do agente (descobre a família, mas não descobre a espécie – por exemplo é possível
visualizar que é um coronavírus – mas não da pra saber se é o humano, felino, etc.).
 Restricoes da microscopia: equipamento muito caro, pessoa precisa ter o olho muito bem treinado e é uma técnica de
baixa sensibilidade e tem aplicação restrita a alguns vírus.
 Vírus que da pra pedir microscopia: infecções entéricas (rota, corona, astro) e para infecções cutâneas (pox e herpes).

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

 Principio: observação do efeito citopático e/ou detecção de produtos virais apos sua multiplicação em células de
cultivo.
 Coloca células pelas quais o vírus que se suspeita tem tropismo, coloca os vírus e olha no microscópio se esta tendo
citotoxidade e alterações na célula.
 Propriedades: é um teste sensível pois pode haver replicação. Por exemplo uma amostra de urina com apenas uma
partícula de vírus da cinomose vai se replicar nas células e sera deteccado.
 Essa técnica tem implementação e execução relativamente simples, mas tem suas limitações.
 Por exemplo: existem vírus que não tem efeito citopático, e então esse teste não ira dar resultado. Ai tem que pegar as
células da garrafa, fazer PCR ou imunofluorescência.
 Restricoes: é uma técnica demorada, não aplicável a alguns vírus, só detecta vírus viáveis, contaminação bacteriana e
fúngica (podem destruir as células também, é uma situação recorrente pois esta relacionada com o manuseio das
pessoas – umas vez que temos fungos e bactérias em nossas mãos.).
 Aplicacoes: todos os vírus que replicam em cultivo celular, qualquer material pode ser submetido a esse teste (fezes ja
não é muito indicado pois pode ter outras substancias citotóxicas).

HEMAGLUTINACAO

 Principio: observação da capacidade do vírus de se ligar as moléculas da membrana plasmáticas dos eritrócitos 
hemaglutinacao.
 Quando o resultado for positivo ira se formar um veu rosado, difuso. Não fica a imagem do botão vermelho igual
quando temos so hemácias.
 Propriedades: técnica rápida, boa sensibilidade e especificidade, fácil execução.
 Restricoes: aplicável apenas a um grupo restrivo de vírus, hemaglutinacao inespecífica  ha vírus hemaglutinante na
amostra.
 Necessidade de espécies doeadoras de hemácias: galinhas cobaias, coelhos, roedores.
 Aplicacoes: aplicável aos vírus hemaglutinantes de aves e mamíferos. Fluidos corporais e suspensões de tecidos.
 Fluidos corpoarais e suspensões de tecidos: lista no slide.

IMUNOFLUORESCENCIA E IMUNOPEROXIDASE

 Principio: proteínas virais são detectadas por Ac específicos conjugados com um marcador fluorescente (IFA) ou com
enzina (IPX).
 Propriedades: rápida (minutos a poucas horas), simples, baixo custo, boa sensibilidade e especificidade, detecta vírus
inviável, etc (não consegui anotar tudo).
 Imunofluorescencia: tem se um agente que quando ligado ao anticorpo ligado ao vírus faz fluorescência.Pode se ligar
também diretamente a proteína viral.
 Imunoperoxidase: tem se um agente que quando ligado ao anticorpo ligado ao vírus promove a colocaracao castanha.
 Esse é um teste mais sensível pois vai se ligar a uma proteína especifica do vírus, então tem que ter uma suspeita
especifica e a imunofluorescência vai detecta-lo ou não.
 Restricoes: equipamento caro (IFA), pode ter reações inespecíficas  algumas células emitem fluorescência natural.
 Reagentes para alguns vírus podem não estar disponíveis, então não tem o kit para fazer, não tem como aplicar
imunofluorescência para eles.
 Aplicacoes: aplicável para qualquer vírus que se tenha Ac específicos.
 Materiais necessários: tecidos (frescos, congelados, fixados), esfregacos (sanguíneos, de secreção), células de cultivo.

TESTES IMUNOENZIMATICOS/CROMATROGRAFICOS

 Principio: a presença do Ag que reage com o Ac especifico imobilizado ou apos a migração, é revelada pela mudança de
cor.
 Propriedades: simples e pratico, disponível em kits, rápido, boa sensibilidade e especificidade. Teste de gravidez é um
exemplo.
 Restricoes: não é automatizavel (um teste por animal e é descartável), especificidade e sensibilidade podem deixar a
desejar, custo alto para amostra. Não é legal para usar num plantel por exemplo pois o valor seria muito alto.

IMUNOCROMATROGRAFICOS

(pegar essa parte com alguem)

PCR

 Principio: Ac. Nucleidos (DNA) do vírus são detectados por sondas marcadas (hibridização) ou apos amplificação por
reações enzimáticas (PCR).
 Propriedades: especifica, sensível, necessita de quantidades mínimas de amostra (muito pouco ja reage),
potencialmente aplicável a todos os vírus, rápida e automatizavel (PCR), pode ser quantitativo (qPCR)
 Hibridizacao: feita em laminas de histologia  uma sonda com sequencia de nucleotideso complementar ao material
genético do patógeno que se suspeita e ela é marcada com um agente fluorofolo na ponta e ai ela vai fluorescer onde
tiver o DNA do patógeno presente.
  A PCR (reação de cadeia pela polimerase) (questão de prova) é uma técnica onde se tem uma amostra que se submete
a extração do material genético, então da amostra inicial como uma de sangue que tem hemácias células brancas e
anticorpos  vamos dar uma limpada nessa amostra  extração  ao final dela terá uma suspenção de material
genético de ácido nucleico (DNA ou RNA) extraído  se for uma amostra de DNA, não so DNA do patógeno, terá DNA
dos glóbulos brancos também  tudo que tiver de material genético ali ira ficar  pode separar apenas em RNA e DNA
 coloca então DNTP, primer (sequência de nucleotídeos que tem identidade com o fragmento do genoma do
patógeno) e polimerase  tudo isso vai num termociclador (faz 3 ciclos diferentes 1- desnaturação (95 graus), quando
o dna é fita dupla e aquece a essa temperatura e a fita se abre, precisa abrir pra ela se ligar a fita do teste  2-
termociclador diminui para 56 graus para fazer o primer o procurar onde ta complementariedade dele no fragmento de
DNA  a 55-65 o primer anelou  3- etapa de extensão em torno de 72 graus  a enzima polimerase acha a posição
final da fita faz a extensão da fita e completamente ela com as bases de nucleotídeos que faltaram, formando a fita de
dna dupla  ciclo se repete várias vezes (30 a 50 vezes).

16:35 MEU CELEBRO FRITOU E NÃO CONSEGUI MAIS PRESTAR ATENÇÃO PARA DIGITAR (MEU CELEBRO
APODRECEU), PEGAR ESSE FINAL COM ALGUÉM

09/05/22 – SEGUNDA FEIRA – CONTINUACAO DA AULA DE QUINTA – EXPLICACOES SOBRE PCR

 Do que a PCR precisa para funcionar: material genético (DNA ou RNA), se for RNA é RT-PCR. Alem disso precisa do
primer, DNTP (nucleotídeo com material genético A, T, C, G), enzima taq-polimerase (é uma enzima que vem de uma
bactéria (Thermas aquáticas) – que consegue viver em temperatura alta e tem polimerase. Ai descobriram essa bactéria
e por causa dela chama-se taq-polimerase).
 Se for em tempo real chama-se RT-qPCR (o que é quantitativo eh a PCR e não a transcrição reversa).
 RNA pela acao da transcriptase reversa, ele sintetiza DNA – a cigla no DNA feito a partir da transcriptase reversa do
RNA, eh um DNA complementar  cDNA.
 Na reação de RT também são necessárias as DNTPs
 RNA  coloca RT + nucleotídeos  teremos um DNA complementar  complementar ao RNA que ele usou como fita
molde.
 A PCR ela tem 3 ciclos  desnaturação, anelamento e extensão.
 Na RT-PCR ela eh normalmente feita a 37 graus durante uma hora.
 Quando material genetico é o RNA: Coloca a amostra extraída + RT + DNTPs  deixa encubando a 37 graus por 1 hora
 essa mistura vai pro termociclador para fazer a PCR com a adição de primers e RT e ai tem-se o resultado.
 PCR convencional X qPCR real time. O que precisamos para fazer a leitura do resultado da PCR convencional? Gel de
agarose (reação demorada – cerca de 1h30 até 3h). Na real time precisamos de um marcador fluorescente e leitor de
fluorescência do termociclador. Termociclador passa essa informação para o computador, operador le o gráfico para
saber o resultado. Vantagem do real time: mais rápido, diminui o erro operacional (troca de amosra, contaminar o
laboratório, maior sensibilidade (pode ter uma amostra 100x menor e ainda vai achar o patógeno), aqui so tem um
aumento relevante do custo quando se faz uma quantitativa (precisa de fazer 3-5 controles positivos).

FIQUEI PRESTANDO ATENCAO NA PROF E ESQUECI DE ANOTAR (13:45 – 14:10) – PEGAR DEPOIS COM A DANI

 Humor aquoso como amostra, sangue (cuidado com coagulos, diminuiem muito a sensibilidade da PCR – pode ter
qualquer anti coagulante – exceto heparina), urina, liquor, swabs (secreção nasal, conjuntival, orofaringe), medula,
leite, sêmen, fezes, PAAF (todos os órgãos), pele, pelo, fragmento de biopsia, saliva, carrapatos, liquido sinovial, liquido
peritoneal.
 Caso tenha uma amostra, sem suspeitas e que apenas descobrir o que tem ali, oide colocar isso para fazer yna exame
chamado sequenciamento de nova geração e ele diz todos os materiais genéticos que estão ali dentro. Ele da
fragmentos do SNA do vírus, ai joga no programa e ele encaixa com os que já foram descobertos.
 Por quanto tempo pode-se conservar uma amostra? Lembrando que RNA é mais frágil. Se queremos testar para DNA,
pode ficar 7 dias na geladeira, se for demorar mais do que 7 dias tem que colocar no freezer (-20 ou -80) – quando mais
frio mais tempo a amostra sera conservada. Amostra conservada a -20 da professora já esta guardada a 10 anos.
 Rna é mais frágil, 72h na geladeira e se for necessário mais tempo, tem que congelar no freezer a -20 graus.
 Importante: após congelar a amostra (tanto RNA quanto DNA), não descongelar ela de novo varias vezes. Caso a
amostra for ser utilizada varias vezes – em uma pesquisa por exemplo, convem congelar o material em vários
recipientes e separadamente para poder descongelar apenas uma das amostras.
