CITOMETRIA DE FLUXO

por lvaro Luiz Bertho

HISTRIA DA CITOMETRIA DE FLUXO

O primeiro contador celular automtico foi desenvolvido por Moldavan (1934) e consistia num tubo capilar por onde se faziam passar clulas coradas. O capilar era montado sob um microscpio tico com uma objetiva sobre a qual havia um detector fotoeltrico que registrava a passagem das clulas de acordo com a mudana da luz que recebia. Uns anos mais tarde, Kielland (1941) patenteava um modelo semelhante ao de Moldavan. Um importante avano para o desenvolvimento da citometria de fluxo se conseguiu em 1953 ao inventar, Crosland e Taylor, uma cmara de fluxo baseada na injeo das amostras no centro de um fluxo de revestimento (sheath fluid) atravs de um capilar que passava pelo centro da mesma.Com este sistema se evitavam dois grandes problemas: o O capilar tinha um dimetro maior, evitando entupimentos o Permitia um maior foco das amostras com a fonte de luz. a base das cmaras que se usam na atualidade. Wallace Coulter havia descrito um pouco antes (1949) o princpio que leva seu nome (Coulter counter). Desenvolveu um contador celular baseado na mudana que produz uma partcula ao passar por uma agulha em que exista uma diferena de potencial conhecida. Em 1966 tambm usou ondas de rdio freqncia. Em 1953 Parker e Horst descrevem o primeiro contador diferencial hematolgico usando clulas coradas em vermelho (hemcias) e azul (leuccitos), luz visvel e detectores para luz azul e vermelha. Katmentsky (1965) introduziu dois avanos capitais na citometria: o O uso da espectrofotometria (luz absorvida) para quantificar DNA o A medida multiparamtrica de luz dispersada Foi o primeiro a empregar histogramas biparamtricos. Algum tempo mais tarde, desenvolveu um sorter pneumtico. Com o tempo foi-se introduzindo o emprego de substncias fluorescentes que permitiam um menor sinal/rudo do que os corantes e absoro. Em 1967-69 Van Dilla descreve o primeiro citmetro de fluxo com configurao ortogonal usando a cmara descrita por Crosland-Taylor. Demonstraram a relao existente entre ploidia e intensidade de fluorescncia na quantificao de DNA e produziram histogramas aonde se podia visualizar as fases do ciclo celular (G0/G1; fase S; G2M). No final dos anos 60, o Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) foi inventado por Bonner, Sweet, Hullet, Herzenberg e outros. A Becton and Dickinson introduziu equipamentos

comercial no incio dos anos 70 utilizando a patente da Universidade de Stanford e o conhecimento do Laboratrio do Dr. Herzenberg. Fulwyler descreve o processo de sorting eletrosttico em 1965, baseando-se na tecnologia das impressoras jato de tinta. o sistema mais empregado na atualidade. Durante as dcadas de 60 e 70 se produziram avanos na tecnologia e sua aplicao na citometria de fluxo, porm no final dos anos 70 e princpio dos 80 existiam poucas aplicaes da citometria com interesse biolgico. Os esforos se concentravam principalmente em melhorar os equipamentos que estavam sendo desenvolvidos. A partir da, se tem conseguido avanos nas aplicaes da citometria de fluxo na investigao biomdica. Os mais importantes so: o Reinherz (1975) emprega a tecnologia dos anticorpos monoclonais de Kholer e Milstein para identificar subpopulaes celulares em funo dos antgenos de superfcie. o Loken (1977) mede simultaneamente dois antgenos celulares com um laser s, emprega a compensao eletrnica de sinal entre o isotiocianato de fluorescena (FITC) e a tetrametilrodamina (RD). o Oi (1982) introduz as ficobiliprotenas como fluorocromos (ficoeritrina). o Darzynkiewicz e Traganos (1976-79) estidam com laranja de acridina o DNA e RNA. o Andreff inicia a classificao das leucemias. o Grynkiewicz (1985) introduz o Indo-1 para medir a concentrao intracelular de clcio. o Entre 1979-80 vrios autores descrevem tcnicas citofluorimtricas para medir condies fisiolgicas: Visser (pH intracelular), Valet (carga de superfcie) e Thorell (estado redox). o Hedley (1983) pe a ponto uma tcnica para o estudo por citometria de fluxo do DNA de ncleos de amostras parafinadas. o Gratzner (1975) descreve a tcnica da bromodeoxiuridina (BrdU) e anticorpos contra ela, que permite ampliar o estudo das fases do ciclo celular. o Gray (1975) realiza o caritipo por citometria de fluxo. Este procedimento foi posteriormente melhorado por Carrano. Muitos outros autores tm contribudo com seus experimentos para desenvolver tcnicas aplicveis na citometria de fluxo que agora esto dando seus frutos e se empregam tanto em laboratrio de rotina, como na investigao bsica e/ou clnica.

CONCEITOS BSICOS.
Para compreendermos a real importncia da citometria de fluxo, talvez devssemos responder a algumas questes bsicas, como: o que citometria de fluxo; seus princpios; e suas aplicaes, tanto no campo da pesquisa como na clnica.

A citometria de fluxo uma tecnologia, baseada no emprego de radiao laser, fluxo hidrodinmico, tica, substncias fluorescentes (fluorocromos), recursos de informtica, utilizada para determinar algumas caractersticas estruturais e funcionais de partculas biolgicas. Essas partculas biolgicas entendem-se como vrios tipos de clulas, protozorios, bactrias etc. Esta tecnologia usada para determinar componentes e propriedades de clulas e organelas celulares que fluem em uma suspenso celular. Os citmetros de fluxo, como so chamados os equipamentos utilizados para esse fim, tm como princpio bsico aspirar clulas ou partculas de uma suspenso previamente preparada e for-las a passar por uma cmara especial (flow cell) que faz com que as clulas fiquem envolvidas e centralizadas num fluxo contnuo de lquido (sheath fluid) e saiam desta cmara uma atrs da outra de modo que uma nica clula seja interceptada pelo laser. Uma vez interceptada pelo laser, dois tipos de fenmenos fsicos ocorrem e fornecem informaes acerca da clula. Primeiro, uma parte da luz espalhada (scatter) de acordo com as caractersticas morfolgicas e estruturais da clula. O Forward Scatter (FS) se relaciona com o tamanho e o Side Scatter (SS) com a granularidade da clula ou partcula. Segundo, as clulas previamente coradas com fluorocromos, uma vez excitadas pelo laser, emitem luz de acordo com suas caractersticas fluorescentes e so utilizadas para se examinar aspectos bioqumicos, biofsicos e moleculares das clulas. Uma srie de lentes colocadas prximas desta zona de interceptao (clula-laser) coletam a luz dispersa e enviam-na para tubos fotomultiplicadores (PMTs) que convertem o sinal luminosos em pulsos eltricos, os quais so proporcionais quantidade de luz dispersa ou fluorescente captada pelos PMTs. Para a seleo e captao destes sinais luminosos, filtros ticos so usados para bloquear determinados comprimentos de onda da luz incidente e deixar passar somente a luz de comprimento de onda desejado. Os sinais eltricos gerados pelos PMTs so amplificados, convertidos para a forma digital e enviados para um computador. A amostragem dos dados, as anlises e a interpretao podem, ento, ser realizadas atravs de softwares especficos. Seis parmetros so considerados bsicos e podem ser medidos simultaneamente, so eles: tamanho celular (FS); granularidade interna das clulas (SS); fluorescncia verde (FL1); fluorescncia amarela (FL2); fluorescncia laranja (FL3); Fluorescncia vermelha (FL4); Fluorescncia roxa (FL5).

Figura 1 - Configurao tica de duas cores em um citmetro de fluxo baseado num sistema de iluminao com um laser
Amostra Sheath Fluid Flow Cell PMTs

Forward Scatter Side Scatter

Sorting

Laser argnio

Alguns parmetros determinados pela Citometria de Fluxo Estruturais Morfologia da clula Protenas fluorescentes Funcionais Estado RedOx Proliferao celular Ativao celular Apoptose Estudos da membrana celular Atividade enzimtica Endocitose Sntese de DNA Receptores Potencial de membrana Ph, clcio, carga de superfcie

Intrnsecos

Extrnsecos

Contedo de DNA e RNA Taxa de DNA Estrutura cromatnica Protenas totais ou bsicas Grupos qumicos Antgenos Acares de superfcie Estrutura citoesqueleto

CARACTERSTICAS GERAIS DOS CITMETROS DE FLUXO

Atualmente, existem trs fabricantes de citmetros de fluxo com representantes no Brasil. A Beckman-Coulter, que comercializa os EPICS XL, EPICS ALTRA e FC500; a BD Biosciences, com os FACSCalibur, FACSVantage, FACSCanto e o FACSAria; e a Cytomation com o MoFlow. Existem basicamente dois tipos de citmetros de fluxo disponveis comercialmente. Um tipo, chamado de citmetro de bancada (banch-top flow cytometers), empregados principalmente em laboratrios clnicos, realizam somente as anlises multiparamtricas das clulas. Freqentemente, vm equipados com um laser argnio de baixa potncia refrigerado a ar, podendo vir em alguns casos equipados tambm com laser He-Ne. Geralmente analisam at quatro cores. Como exemplos temos o FACSCalibur, FACSCanto, EPICS XL, FC500. J o outro tipo, chamado de cell sorters (separadores de clulas), apresentam mais recursos que os anteriores (at 11 cores), possuem lasers mais potentes refrigerados gua e possuem ainda a capacidade de separar fisicamente as clulas seletivamente de uma suspenso heterognea (sorting). Temos o EPICS ALTRA, o FACSVantage, o FACSAria e o MoFlow. Seu uso mais direcionado para instituies de pesquisa, pois possibilitam uma infinidade de aplicaes. Ambos funcionam de maneira similar durante a aquisio dos dados, entretanto os sorters so mais complexos e possuem mais componentes eletrnicos, o que os tornam mais caros e difceis de operar. Assim, os citmetros no sorters, so os equipamentos mais freqentemente encontrados. A maioria dos citmetros de fluxo utiliza lasers como luz estvel, monocromtica e de alta potncia. Existem lasers sintonizveis ou de emisso fixa, podendo ser refrigerados a gua ou a ar (menor potncia). O laser de on argnio (argon ion laser) o mais empregado, por ter uma emisso a 488 nm, comprimento de onda muito utilizado para a excitao de vrios fluorocromos tais como o FITC, PE, ECD, PerCP, PI, 7-AAD, anexina V, brometo de etdeo, laranja de acridina, pironina Y ,fluo-3, muitas rodaminas. Outros fluorocromos, como o Hoescht, a mitramicina, APC, so excitados por lasers com outros comprimentos de onda, como os de UV ou de Hlio-Nenio (He-Ne). Torna-se assim imprescindvel, o conhecimento do comprimento de onda de excitao do fluorocromo a ser utilizado para se certificar que tal equipamento seja capaz de l-lo. Os citmetros atuais podem ser equipados com dois ou mais lasers aumentando assim sua capacidade de anlise multiparamtrica. Atualmente, cada vez mais se utilizam os lasers de Argnio de baixa intensidade (10-15 mW) refrigerados a ar e que podem ser usados na maioria das aplicaes citomtricas. No caso dos sorters, mais indicado o uso de lasers refrigerados a gua (mais potentes). Em adio aos lasers, componentes eletrnicos, computadores e filtros ticos tm um papel essencial no rendimento dos citmetros de fluxo. A funo de alguns filtros absorver alguns comprimentos de onda e deixar passar a luz com o comprimento de onda que interessa. A qualidade de tais filtros da maior importncia na citometria de fluxo. Deve-se sempre mant-los em timo estado. Outro componente importante nos citmetros a cmara de fluxo (flow cell). Existem alguns tipos de cmaras de fluxo, cada qual com sua finalidade. Os principais so:

o Sense-in-Quartz so cmaras de fluxo que apresentam uma ponteira de quartz no interior da qual ocorre a intercesso laser-clula. Podem apresentar trs tipos: Sort sense - a maioria dos citmetros equipados com lasers refrigerados a ar vem com esse tipo de flow cell. So cmaras que conseguem fluxos hidrodinmicos com velocidades inferiores e produzem menos rudo luminoso. So designadas tambm para sorting usando esse tipo de laser. Possuem modelos com orifcios de 76 ou 100 m de dimetro.

Figura 2 Sort sense flow cell

Fast Quartz Essa flow cell incorpora a carcterstica de baixo rudo luminoso da Sort sense com a vantagem de uma maior velocidade de passagem. Indicada para sorting de alta velocidade e citmetros com laser refrigerados a ar ou a gua.

Figura 3 Fast Quartz Flow Cell HyPerSort Sense Quartz semelhante Fast quartz, porm inclue uma lente para aumentar a sensibilidade sob altas presses de fluxo.

Figura 4 - HyPerSort Sense Quartz Flow Cell

Exemplos de citmetros encontrados atualmente no mercado

EPICS ALTRA Beckman Coulter

FACSCalibur - BD

CYAN Dako Cytomation

MoFlow Dako Cytomation

FC-500 Beckman Coulter

FACSAria - BD

EPICS XL Beckman Coulter

Citometria de fluxo

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FLUOROCROMOS PARA CITOMETRIA DE FLUXO

Os fluorocromos oferecem um mtodo sensvel para obter informao acerca da estrutura, funo e vitalidade das clulas. Existam dois modos de uso: (1) ligao covalente do fluorocromo molculas que se unem especificamente a componentes celulares, e (2) fluorocromos que variam suas caractersticas em funo do microambiente que os cerca. Substncia FITC XTRITC TR R-PE APC Hoestch 33342 DAPI Brometo de etdeo Iodeto de propdeo (PI) DNA RNA Excitao (nm) 490 580 596 480-565 650 340 350 510 536 480 440-470 Emisso (nm) 520 604 620 578 660 450 470 595 623 520 650 Substncia DiBA-Isop RN-heptano RN-acetona Indo 1 PE-Cy5 PE-TR PE-Cy7 Pironina Y DNA Pironina Y RNA N Tiazol Excitao 493 485 530 350 480-565 480-565 480-565 560 497 453 Emisso 517 525 605 505-510 670 613 695 570 563 480

o Tcnicas imunofluorescentes - marcadores fluorescentes de ligao covalente: so fluorocromos que reagem e se usam para marcar protenas, lipdeos ou outras molculas biolgicas. Devem ser suficientes seletivos e reativos. Se empregam cromforos como grupos isotiocianato, clorotrirzinil, e steres de succinimida, por sua capacidade de unio. O fluorocromo mais empregado a FLUORESCENA. Outros que se tem descrito so: rodamina, Texas red, cianinas etc, porm o mais conhecido a FICOERITRINA por sua grande excitao, rendimento e fotoestabilidade; alm disso pode ser excitado a 488 nm porm emite mais a frente do espectro da fluorescena permitindo uma anlise dupla com um s laser. Avanos recentes so o uso de sondas de DNA unidas a fluorescena e os anticorpos anti-bromodeoxiuridina para o estudo do ciclo celular. Atualmente se tem generalizado o estudo multiparamtrico de antgenos celulares aom o emprego simultneo de 4 e 5 anticorpos conjugados cada um com diferentes fluorocromos com diferentes emisses de luz (FITC, PE, ECD ou PerCP, PE-Cy5, PE-Cy7). o Fluorocromos que se ligam no covalentemente estruturas celulares: so fluorocromos que devido a sua composio molecular especial se unem a determinados componentes celulares. Marcadores do contedo de DNA e RNA: dependendo do tipo so mais ou menos especficos para DNA, RNA ou determinadas bases. Se empregam o Hoescht 33342 Liga-se a A-T), DAPI (A-T-), DIPI (A-T), cromomicina A3 (G-C), olivomicina (G-C), mitramicina (G-C).O laranja de acridina se liga ao DNA e RNA porm tem a particularidade de emitir em diferentes comprimentos de onda dependendo do cido nuclico ao qual est ligado. De uso mais comum o Iodeto de propdeo (PI) que se excita com um laser de 488 nm.

Marcadores do potencial de membrana: so as cianinas e a rodamina 123. Tambm marcam mitocndrias devido a alta diferena de potencial entre suas membranas. o Marcadores fluorescentes que so sensveis ao microambiente: certos fluorocromos podem ser empregados para estimar as propriedades do ambiente em que se encontram, posto que variam seu espectro de excitao ou emisso em funo das caractersticas do microambiente que os cerca. So usados para a determinao de diversos estados funcionais celulares: pH (6-carboxi-fluorescena; 2,3-diciano-1,4-dihidroxidenceno; hidroxipireno trisulfato), clcio (quin II, fura 2, indo-1), potencial redox (diclorofluorescena, NADH, NADHP), atividade enzimtica (substratos que por ao da enzima variam sua fluorescncia ou espectro), polaridade (anilino-naftalina-sulfato ou ANS), e viscosidade /fluidez. A disponibilidade de fluorocromos especficos e suas propriedades so essenciais para o desenvolvimento das aplicaes em citometria de fluxo. Usualmente, grandes centros de pesquisa e hospitais possuem citmetros de fluxo e treinam pessoal para oper-los. Embora esses profissionais sejam responsveis em realizar a aquisio de amostras ou estejam disponveis para orientar outros usurios, importante que os pesquisadores e clnicos tenham um conhecimento bsico de, pelo menos, como um citmetro funciona para elaborarem seus experimentos de maneira objetiva, alm de estarem aptos a determinar resultados consistentes e confiveis e interpretar laudos clnicos.

PADRES E CONTROLES

Um padro um material estvel que tem um valor determinado de fluorescncia ou disperso de luz. Utilizam-se para alinhar ou calibrar os citmetros de fluxo. O uso de padres de alinhamento proporciona um bom mtodo para detectar mudanas e problemas na configurao tica e de sinal de um dia para o outro.O citmetro est alinhado quando se consegue uma elevada fluorescncia ou sinal com baixo CV. Os citmetros de fluxo oferecem uma informao relativa, no absoluta. Para quantificar necessrio correlacionar os canais com resultados de amostras conhecidas.O mtodo mais sensvel consiste em ajustar a voltagem do PMT ou ganhos para conseguir um pico de intensidade determinada de um padro estvel. Os fluorocromos tm espectros de emisso que em ocasies se sobrepe e os filtros no so perfeitos, por isso os citmetros possuem um sistema informtico de compensao ou subtrao de sinal. difcil predizer teoricamente o grau de compensao e deve-se ajusta-lo individualmente. Geralmente se deve extrair FL1 de FL2, e tambm FL3 de FL2 e FL1.Alguns citmetros permitem fazer grficos do nmero de clulas processadas, do canal de fluorescncia ao longo do tempo. Podese usar para ver as estabilidades das medies do citmetro com o tempo e detectar a presena de algum problema (Fig. 5).

Figura 5 Interferncia de FL1 em FL2, FL3 e FL4. J os controles so materiais que produzem resultados esperados (conhecidos). So usados para monitorar a reprodutibilidade dos reativos e a qualidade dos mtodos de preparao celular. So importantes nas anlises de DNA e imunofluorescncia. Geralmente, se usam controles de ploidia e controles de imunofluorescncia positivos e negativos. Como controle de ploidia se deve usar um controle interno, processado no mesmo tubo da amostra, para descartar a aneuploidia e calcular o ndice de DNA e outro tubo para calcular as fases do ciclo celular. Para realizar uma boa leitura de DNA se deve ter o citmetro de fluxo em perfeitas condies e ser cuidadoso no processo de preparao da amostra. A anlise e interpretao se fazem mediante um software adequado. O objetivo das anlises de imunofluorescncia se utilizar de reativos especficos para determinar subpopulaes celulares. So necessrios controles negativos para descartar ligaes inespecficas do fluorocromo e selecionar o valor de autofluorescncia. So causas de marcao inespecfica os fragmentos Fc das imunoglobulinas, as clulas mortas, debris etc.

PROCESSAMENTO E ANLISE DE DADOS

Os citmetros de fluxo produzem uma grande quantidade de informaes que pode ser armazenadas em forma de histogramas (histogramas monoparamtricas de 256 ou 1024 canais, histogramas biparamtricos de 64 x 64) ou em List mode, que consiste em guardar toda a informao obtida para cada evento de modo que se pode modificar as regies de anlise e reconstruir os histogramas em funo de novos parmetros de seleo. o Dados univariantes (histogramas monoparamtricos): so representados como um histograma. Um mtodo rpido e sensvel de interpretao, a observao de histograma e a ajuda informtica do citmetro para calcular a porcentagem de eventos

em regies selecionadas. Tem que ser levado em conta a resoluo do histograma para a discriminao do sinal e o CV. Mtodos no paramtricos: se baseiam na observao do histograma e posio dos cursores. Um problema so as amostras com baixa fluorescncia que se diferenciam pouco do negativo. Se empregam mtodos de normalizao e subtrao do sinal com comparaes de curvas (Kolmogorov-Smirnov). Mtodos paramtricos: em alguns casos pela dificuldade de interpretao de dados e a elevada informao que contm, necessario aplicar modelos matemticos.

o Dados bivariantes (histogramas biparamtricos): se apresentam como histogramas biparamtricos com dois eixos e o nmero de eventos se representa como densidade de pontos, cores, ou linhas isomtricas.

APLICAES DA CITOMETRIA DE FLUXO

A citometria de fluxo particularmente importante para investigaes biomdicas j que ela permite avaliaes qualitativa e quantitativa de clulas e de seus constituintes. As aplicaes fundamentais desta tcnica se do em biologia e medicina e so a identificao de antgenos celulares mediante tcnicas de imunofluorescncia e o estudo do contedo de DNA e fases do ciclo celular. A citometria de fluxo tem sido utilizada na biomedicina com diferentes objetivos: Na hematologia contagem celular, formula leucocitria, anlise da medula ssea; na farmacologia estudos de cintica celular, resistncia drogas; na imunologia subpopulaes de clulas T, tipagem tissular, estimulao linfocitria, apoptose; na oncologia diagnstico/prognstico, monitorar tratamento; na microbiologia diagnstico bacteriano e viral, sensibilidade a antibiticos; na gentica caritipo, diagnstico de portador, diagnstico prenatal, tipagem para transplantes. Com a Citometria de Fluxo possvel analisar o contedo de DNA e RNA, definir em que posio do ciclo celular a clula se encontra (Fig. 6), analisar cromossomos (Fig. 7), determinar clulas cancergenas que apresentem alteraes na sua taxa normal de DNA (Fig. 8) e clulas que se encontrem em processo de morte programada (apoptose) ou necrose (Fig. 9).

G0/G1 padro

G2/M

Figura 6 - Histograma de clulas normais coradas com iodeto de propdeo. Aps a diviso, as clulas entram numa fase Gap (G1), seguida por um perodo de sntese de DNA (S) durante o qual todos os cromossomas so replicados. A fase S seguida por uma segunda fase Gap (G2) e, ento, sofre mitose. O pico standard representa o nuleo de eritrcitos de galinha.

Figura 7 - Distribuio da intensidade de fluorescncia do Hoeshst 33258 (eixo do y) vs. Cromomicina A3 (eixo do x), de cromossomos isolados de fibroblastos humanos. Todos os cromossomos esto mostrados no painel (B). O painel (A) mostra uma distribuio somente dos cromossomos 8 at 22 e Y.

Figura 8 - Histogramas padres encontrados em anlise de DNA por citometria de fluxo. Normal = 46 cromossomos; Hipodiploidia < 46 cromossomos; Hiperdiploidia > 46 cromossomos.

Citometria de fluxo

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Figura 9 - Quantificao de linfcitos CD4+ ou CD8+ necrticos, apoptticos ou viveis, utilizando-se uma anlise multiparamtrica. As clulas CD4+ foram marcadas com PE, as CD8+ com FITC) e a incorporao ao DNA foi feita pela a (7 AAD). No que diz respeito ao uso da citometria de fluxo em imunologia, uma variedade grande de estudos podem ser realizados com o intuito de se conhecer melhor o que acontece nas doenas em que h comprometimento do sistema imunolgico, como o caso das doenas auto-imunes e das sindromes de imunodeficincia (AIDS). Mudanas nas taxas de linfcitos T e B, mudanas nas taxas de linfcitos T CD4+ e CD8+ podem ser analisadas facilmente, o que ajuda no diagnstico da doena. O estudo fenotpico destas subpopulaes de clulas, tornou-se importante na clnica, com uma avaliao geral da resposta imune celular, na contribuio da atividade de processos de doenas auto-imunes, na classificao de rgos para que ocorra um transplante com sucesso (Fig. 10), no monitoramento de pacientes que tenham sofrido algum tipo de transplante para a determinao de sinais precoces de rejeio, e ainda, a possvel classificao de determinadas leucemias atravs da deteco de marcadores de superfcie especficos (Tabela 2). A anlise fenotpica est relacionada ainda com outras doenas como a Hemoglobinria Paroxstica Noturna com diminuio ou ausncia de CD55 e CD59; a distino entre leucemia das clulas do manto da leucemia linfoctica crnica atravs da quantificao de CD79; e a espondilite anquilosante com a determinao de HLAB27.. Na oncologia, a mensurao de clulas progenitoras CD34+ por citometria de fluxo se tornou de importante valor para a monitorizao de transplantes dessas clulas. Na imunologia experimental vrios receptores de superfcie das clulas podem ser determinados com o uso de anticorpos monoclonais especficos conjugados a um determinado fluorocromo. Com isso, clulas de vrias origens, como p. ex., timcitos, esplencitos, clulas de gnglios linfticos, clulas intestinais de qualquer modelo experimental podem ter seus receptores de superfcies e/ou molculas intracelulares, como, citocinas e DNA, bem definidos.

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A B C D E F

Figura 10 - Crossmatching para transplantes de rgos. Clulas do doador so incubadas inicialmente com o soro de receptor e posteriormente com um anticorpo anti-imunoglobulina G humana. O experimento feito em duplicata e seu resultado (E, F) comparado com controles negativos (C, D) ou positivos (A, B). A positividade no teste impossibilita a realizao do transplante.

TABELA 1 - Painel resumido de diferentes anticorpos monoclonais usado no diagnstico de vrios tipos de leucemias. HLA-DR CD19 CD5 CD2 CD10 MY7 MY9 LMA 90% 0% 0% <5% 0% 75% 60% LLA-T 25% 0% 75% 90% 10% <5% <5% LLA-No-T CALLA + 90% 95% 0% <5% 100% 0% 0% CALLA 90% 95% 0% <5% 0% <5% <5% LLC-B 90% 0% 100% 90% 0% 0% 0% LLC-T 25% 0% 100% 90% 0% 0% 0% LMC Mielide 90% 0% 0% <5% 0% 75% 90% 90% 90% 0% <5% 80% 0% 0% Linfide
Tipos celulares: LMA - Leucemia Mielide Aguda; LLA-T - Leucemia Linfoblstica Aguda de clulas T; LLA-No-T - Leucemia Linfoblstica Aguda de clulas no-T; CALLA - Leucemia Linfoblstica Aguda Adquirida na Infncia; LCM - Leucemia Mielide Crnica; LLC - Leucemia Linfoblstica Crnica (B ou T).

Para se tentar entender melhor as diferentes patogenias causadas por parasitas, vrios estudos envolvendo a interao parasita-clula hospedeira tm sido desenvolvidos. Alguns autores se utilizam da citometria de fluxo com o intuito de estudar a interao entre protozorios e bactrias com clulas do sistema fagoctico mononuclear. Esse mtodo demonstrou ser bastante eficiente, mostrando inclusive a importncia da Leishmania no processo de fagocitose por macrfagos. Alm disso, estudos da produo de clcio nessas interaes tem sido realizados. A citometria de fluxo pode ser utilizada para determinar a produo de clcio e metablitos do oxignio (burst respiratrio) em clulas infectadas por protozorios do gnero Leishmania e Trypanosoma. Assim como, analisar a presena de cistos de Pneumocystis carinii obtidos de homogeneizados de pulmo, a viabilidade de hemoparasitos intraeritrocticos, identificar espcies de bactrias e determinar a infeco de hemcias por Plasmodium. Pode, ainda, ser utilizada para quantificar o papel funcional de determinada organela (p.ex. mitocndrias) ou a resistncia biolgica de um determinado parasita a drogas. Ainda na parasitologia experimental, a clonagem utilizando a citometria de fluxo tem sido bastante utilizada com o intuito de se conhecer as caractersticas biolgicas e bioqumicas de uma nica espcie de microorganismo. Por fim, a citometria de fluxo abre um leque de opes e perspectivas para o conhecimento. Porm, torna-se indispensvel um grande conhecimento da biologia dos sistemas a serem estudados, assim como, uma familiaridade com reagentes, mtodos de marcao com anticorpos monoclonais fluoresceinados e controles.

SORTING
Alm de analisar clulas, alguns citmetros de fluxo tm a propriedade de separar uma populao celular de acordo com parmetros pr-estabelecidos. A separao de clulas (sorting) pode ser baseado nas propriedades funcionais, bioqumicas ou morfolgicas das clulas. As mesmas no sofrem qualquer dano durante o processo e a populao obtida pode ser posteriormente utilizada em qualquer outro ensaio experimental in vitro ou in vivo, j que todo o processo pode ser feito sob condies estreis. Basicamente o que ocorre no sorting que um sistema especfico aplica vibraes ultrassnicas ao flow cell o qual faz com que no fluxo contnuo de lquido haja a formao de gotas (droplets). As gotas que possurem no seu interior as clulas de interesse passaro p rum colar eltrico onde elas podem permanecer sem carga ou receber uma carga positiva ou negativa de acordo com os critrios pr-estabelecidos no computador. Em seguida, as gotas corregadas passam por entre duas placas eltricas onde, de acordo com a polaridade, as gotas vo ser defletidas para a esquerda ou para a direita caindo em tubos coletores (Fig. 11). As populaes podem ser separadas com uma pureza de at 98% na primeira passagem. Se maiores graus de pureza so desejados a suspenso purificada pode ser submetida ao sorting novamente.

Figura 11 Esquema do sorting

Existem outros mtodos de separao celular conhecidos atualmente, inclusive mais rpidos, porm, o sorting por citometria o nico mtodo pelo qual pode-se separar clulas levando-se em conta apenas suas caractersticas fsicas, como tamanho e granulosidade, sem a utilizao da marcao por anticorpos monoclonais. Utilizando este princpio, que se torna possvel a clonagem de clulas e/ou parasitas. Um acessrio destes equipamentos permite dispensar uma nica partcula (clula ou parasita) em um poo de uma placa de microtitulao (Auto-Clone).

Existem os sorters pneumticos que empregam seringas e energia acstica para desviar o fluxo por alguns milisegundos onde as clulas so coletadas mecanicamente. So processos mais simples e baratos, porm sua especificidade e velocidade so muito baixas. E os sorters de defleo eletrosttica, que so complexos e necessitam de um grande suporte tecnolgico e de informtica. So os mais especficos e os mais utilizados.

Defleo eletrosttica

pneumtico

PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS

Devido s caractersticas especiais dos citmetros de fluxo. A amostra a ser analisada deve se encontrar em forma de suspenso. Existem amostras como o sangue perifrico, medula ssea, ou outros fluidos biolgicos, que precisam de um mnimo de processamento, em contraste os tumores slidos ou as amostras parafinadas necessitam de uma desagregao mais ou menos intensa (mecnica, enzimtica etc). Um fator limitante comum em citometria de fluxo a disponibilidade de uma suspenso celular para estudar suas caractersticas e relacionar ou extrapolar seus resultados com fenmenos in vivo.

REFERNCIAS:
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lvaro Luiz Bertho, PhD Pesquisador Titular, consultor e coordenador do Ncleo de Citometria de Fluxo do Lab. de Imunoparasitologia, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ. Av. Brasil, 4365 - Pavilho Lenidas Deane, Sala 408-A, Manguinhos, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. 21045-900. Coordenador do Programa Integrado em Citometria de Fluxo da FIOCRUZ. Tel: 55 21 3865.8126 bertho@ioc.fiocruz.br http://picf.ioc.fiocruz.br/ncfm.htm http://picf.ioc.fiocruz.br/flowconsult.htm

CITOMETRIA DE FLUXO
por lvaro Luiz Bertho

HISTRIA DA CITOMETRIA DE FLUXO

O primeiro contador celular automtico foi desenvolvido por Moldavan (1934) e consistia num tubo capilar por onde se faziam passar clulas coradas. O capilar era montado sob um microscpio tico com uma objetiva sobre a qual havia um detector fotoeltrico que registrava a passagem das clulas de acordo com a mudana da luz que recebia. Uns anos mais tarde, Kielland (1941) patenteava um modelo semelhante ao de Moldavan. Um importante avano para o desenvolvimento da citometria de fluxo se conseguiu em 1953 ao inventar, Crosland e Taylor, uma cmara de fluxo baseada na injeo das amostras no centro de um fluxo de revestimento (sheath fluid) atravs de um capilar que passava pelo centro da mesma.Com este sistema se evitavam dois grandes problemas: o O capilar tinha um dimetro maior, evitando entupimentos o Permitia um maior foco das amostras com a fonte de luz. a base das cmaras que se usam na atualidade. Wallace Coulter havia descrito um pouco antes (1949) o princpio que leva seu nome (Coulter counter). Desenvolveu um contador celular baseado na mudana que produz uma partcula ao passar por uma agulha em que exista uma diferena de potencial conhecida. Em 1966 tambm usou ondas de rdio freqncia. Em 1953 Parker e Horst descrevem o primeiro contador diferencial hematolgico usando clulas coradas em vermelho (hemcias) e azul (leuccitos), luz visvel e detectores para luz azul e vermelha. Katmentsky (1965) introduziu dois avanos capitais na citometria: o O uso da espectrofotometria (luz absorvida) para quantificar DNA o A medida multiparamtrica de luz dispersada Foi o primeiro a empregar histogramas biparamtricos. Algum tempo mais tarde, desenvolveu um sorter pneumtico.

Com o tempo foi-se introduzindo o emprego de substncias fluorescentes que permitiam um menor sinal/rudo do que os corantes e absoro. Em 1967-69 Van Dilla descreve o primeiro citmetro de fluxo com configurao ortogonal usando a cmara descrita por Crosland-Taylor. Demonstraram a relao existente entre ploidia e intensidade de fluorescncia na quantificao de DNA e produziram histogramas aonde se podia visualizar as fases do ciclo celular (G0/G1; fase S; G2M). No final dos anos 60, o Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) foi inventado por Bonner, Sweet, Hullet, Herzenberg e outros. A Becton and Dickinson introduziu equipamentos comercial no incio dos anos 70 utilizando a patente da Universidade de Stanford e o conhecimento do Laboratrio do Dr. Herzenberg. Fulwyler descreve o processo de sorting eletrosttico em 1965, baseando-se na tecnologia das impressoras jato de tinta. o sistema mais empregado na atualidade. Durante as dcadas de 60 e 70 se produziram avanos na tecnologia e sua aplicao na citometria de fluxo, porm no final dos anos 70 e princpio dos 80 existiam poucas aplicaes da citometria com interesse biolgico. Os esforos se concentravam principalmente em melhorar os equipamentos que estavam sendo desenvolvidos. A partir da, se tem conseguido avanos nas aplicaes da citometria de fluxo na investigao biomdica. Os mais importantes so: o Reinherz (1975) emprega a tecnologia dos anticorpos monoclonais de Kholer e Milstein para identificar subpopulaes celulares em funo dos antgenos de superfcie. o Loken (1977) mede simultaneamente dois antgenos celulares com um laser s, emprega a compensao eletrnica de sinal entre o isotiocianato de fluorescena (FITC) e a tetrametilrodamina (RD). o Oi (1982) introduz as ficobiliprotenas como fluorocromos (ficoeritrina). o Darzynkiewicz e Traganos (1976-79) estidam com laranja de acridina o DNA e RNA. o Andreff inicia a classificao das leucemias. o Grynkiewicz (1985) introduz o Indo-1 para medir a concentrao intracelular de clcio. o Entre 1979-80 vrios autores descrevem tcnicas citofluorimtricas para medir condies fisiolgicas: Visser (pH intracelular), Valet (carga de superfcie) e Thorell (estado redox). o Hedley (1983) pe a ponto uma tcnica para o estudo por citometria de fluxo do DNA de ncleos de amostras parafinadas. o Gratzner (1975) descreve a tcnica da bromodeoxiuridina (BrdU) e anticorpos contra ela, que permite ampliar o estudo das fases do ciclo celular. o Gray (1975) realiza o caritipo por citometria de fluxo. Este procedimento foi posteriormente melhorado por Carrano. Muitos outros autores tm contribudo com seus experimentos para desenvolver tcnicas aplicveis na citometria de fluxo que agora esto dando seus frutos e se empregam tanto em laboratrio de rotina, como na investigao bsica e/ou clnica.

CONCEITOS BSICOS.
Para compreendermos a real importncia da citometria de fluxo, talvez devssemos responder a algumas questes bsicas, como: o que citometria de fluxo; seus princpios; e suas aplicaes, tanto no campo da pesquisa como na clnica. A citometria de fluxo uma tecnologia, baseada no emprego de radiao laser, fluxo hidrodinmico, tica, substncias fluorescentes (fluorocromos), recursos de informtica, utilizada para determinar algumas caractersticas estruturais e funcionais de partculas biolgicas. Essas partculas biolgicas entendem-se como vrios tipos de clulas, protozorios, bactrias etc. Esta tecnologia usada para determinar componentes e propriedades de clulas e organelas celulares que fluem em uma suspenso celular. Os citmetros de fluxo, como so chamados os equipamentos utilizados para esse fim, tm como princpio bsico aspirar clulas ou partculas de uma suspenso previamente preparada e for-las a passar por uma cmara especial (flow cell) que faz com que as clulas fiquem envolvidas e centralizadas num fluxo contnuo de lquido (sheath fluid) e saiam desta cmara uma atrs da outra de modo que uma nica clula seja interceptada pelo laser. Uma vez interceptada pelo laser, dois tipos de fenmenos fsicos ocorrem e fornecem informaes acerca da clula. Primeiro, uma parte da luz espalhada (scatter) de acordo com as caractersticas morfolgicas e estruturais da clula. O Forward Scatter (FS) se relaciona com o tamanho e o Side Scatter (SS) com a granularidade da clula ou partcula. Segundo, as clulas previamente coradas com fluorocromos, uma vez excitadas pelo laser, emitem luz de acordo com suas caractersticas fluorescentes e so utilizadas para se examinar aspectos bioqumicos, biofsicos e moleculares das clulas. Uma srie de lentes colocadas prximas desta zona de interceptao (clula-laser) coletam a luz dispersa e enviam-na para tubos fotomultiplicadores (PMTs) que convertem o sinal luminosos em pulsos eltricos, os quais so proporcionais quantidade de luz dispersa ou fluorescente captada pelos PMTs. Para a seleo e captao destes sinais luminosos, filtros ticos so usados para bloquear determinados comprimentos de onda da luz incidente e deixar passar somente a luz de comprimento de onda desejado. Os sinais eltricos gerados pelos PMTs so amplificados, convertidos para a forma digital e enviados para um computador. A amostragem dos dados, as anlises e a interpretao podem, ento, ser realizadas atravs de softwares especficos. Seis parmetros so considerados bsicos e podem ser medidos simultaneamente, so eles: tamanho celular (FS); granularidade interna

das clulas (SS); fluorescncia verde (FL1); fluorescncia amarela (FL2); fluorescncia laranja (FL3); Fluorescncia vermelha (FL4); Fluorescncia roxa (FL5).

Figura 1 - Configurao tica de duas cores em um citmetro de fluxo baseado num sistema de iluminao com um laser
Amostra Sheath Fluid Flow Cell PMTs

Forward Scatter Side Scatter

Sorting

Laser argnio

Alguns parmetros determinados pela Citometria de Fluxo Estruturais Morfologia da clula Protenas fluorescentes Funcionais Estado RedOx Proliferao celular Ativao celular Apoptose Estudos da membrana celular Atividade enzimtica Endocitose Sntese de DNA Receptores Potencial de membrana Ph, clcio, carga de superfcie

Intrnsecos

Extrnsecos

Contedo de DNA e RNA Taxa de DNA Estrutura cromatnica Protenas totais ou bsicas Grupos qumicos Antgenos Acares de superfcie Estrutura citoesqueleto

CARACTERSTICAS GERAIS DOS CITMETROS DE FLUXO

Atualmente, existem trs fabricantes de citmetros de fluxo com representantes no Brasil. A Beckman-Coulter, que comercializa os EPICS XL, EPICS ALTRA e FC500; a BD Biosciences, com os FACSCalibur, FACSVantage, FACSCanto e o FACSAria; e a Cytomation com o MoFlow. Existem basicamente dois tipos de citmetros de fluxo disponveis comercialmente. Um tipo, chamado de citmetro de bancada (banch-top flow cytometers), empregados principalmente em laboratrios clnicos, realizam somente as anlises multiparamtricas das clulas. Freqentemente, vm equipados com um laser argnio de baixa potncia refrigerado a ar, podendo vir em alguns casos equipados tambm com laser He-Ne. Geralmente analisam at quatro cores. Como exemplos temos o FACSCalibur, FACSCanto, EPICS XL, FC500. J o outro tipo, chamado de cell sorters (separadores de clulas), apresentam mais recursos que os anteriores (at 11 cores), possuem lasers mais potentes refrigerados gua e possuem ainda a capacidade de separar fisicamente as clulas seletivamente de uma suspenso heterognea (sorting). Temos o EPICS ALTRA, o FACSVantage, o FACSAria e o MoFlow. Seu uso mais direcionado para instituies de pesquisa, pois possibilitam uma infinidade de aplicaes. Ambos funcionam de maneira similar durante a aquisio dos dados, entretanto os sorters so mais complexos e possuem mais componentes eletrnicos, o que os tornam mais caros e difceis de operar. Assim, os citmetros no sorters, so os equipamentos mais freqentemente encontrados. A maioria dos citmetros de fluxo utiliza lasers como luz estvel, monocromtica e de alta potncia. Existem lasers sintonizveis ou de emisso fixa, podendo ser refrigerados a gua ou a ar (menor potncia). O laser de on argnio (argon ion laser) o mais empregado, por ter uma emisso

a 488 nm, comprimento de onda muito utilizado para a excitao de vrios fluorocromos tais como o FITC, PE, ECD, PerCP, PI, 7-AAD, anexina V, brometo de etdeo, laranja de acridina, pironina Y ,fluo-3, muitas rodaminas. Outros fluorocromos, como o Hoescht, a mitramicina, APC, so excitados por lasers com outros comprimentos de onda, como os de UV ou de Hlio-Nenio (He-Ne). Torna-se assim imprescindvel, o conhecimento do comprimento de onda de excitao do fluorocromo a ser utilizado para se certificar que tal equipamento seja capaz de l-lo. Os citmetros atuais podem ser equipados com dois ou mais lasers aumentando assim sua capacidade de anlise multiparamtrica. Atualmente, cada vez mais se utilizam os lasers de Argnio de baixa intensidade (10-15 mW) refrigerados a ar e que podem ser usados na maioria das aplicaes citomtricas. No caso dos sorters, mais indicado o uso de lasers refrigerados a gua (mais potentes). Em adio aos lasers, componentes eletrnicos, computadores e filtros ticos tm um papel essencial no rendimento dos citmetros de fluxo. A funo de alguns filtros absorver alguns comprimentos de onda e deixar passar a luz com o comprimento de onda que interessa. A qualidade de tais filtros da maior importncia na citometria de fluxo. Deve-se sempre mant-los em timo estado. Outro componente importante nos citmetros a cmara de fluxo (flow cell). Existem alguns tipos de cmaras de fluxo, cada qual com sua finalidade. Os principais so:

o Sense-in-Quartz so cmaras de fluxo que apresentam uma ponteira de quartz no interior da qual ocorre a intercesso laser-clula. Podem apresentar trs tipos: Sort sense - a maioria dos citmetros equipados com lasers refrigerados a ar vem com esse tipo de flow cell. So cmaras que conseguem fluxos hidrodinmicos com velocidades inferiores e produzem menos rudo luminoso. So designadas tambm para sorting usando esse tipo de laser. Possuem modelos com orifcios de 76 ou 100 m de dimetro.

Figura 2 Sort sense flow cell

Fast Quartz Essa flow cell incorpora a carcterstica de baixo rudo luminoso da Sort sense com a vantagem de uma maior velocidade de passagem. Indicada para sorting de alta velocidade e citmetros com laser refrigerados a ar ou a gua.

Figura 3 Fast Quartz Flow Cell HyPerSort Sense Quartz semelhante Fast quartz, porm inclue uma lente para aumentar a sensibilidade sob altas presses de fluxo.

Figura 4 - HyPerSort Sense Quartz Flow Cell

Exemplos de citmetros encontrados atualmente no mercado

EPICS ALTRA Beckman Coulter

FACSCalibur - BD

CYAN Dako Cytomation

MoFlow Dako Cytomation

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FACSAria - BD

FC-500 Beckman Coulter

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EPICS XL Beckman Coulter

FLUOROCROMOS PARA CITOMETRIA DE FLUXO

Os fluorocromos oferecem um mtodo sensvel para obter informao acerca da estrutura, funo e vitalidade das clulas. Existam dois modos de uso: (1) ligao covalente do fluorocromo molculas que se unem especificamente a componentes celulares, e (2) fluorocromos que variam suas caractersticas em funo do microambiente que os cerca. Substncia FITC XTRITC TR R-PE APC Hoestch 33342 DAPI Brometo de etdeo Iodeto de propdeo (PI) DNA RNA Excitao (nm) 490 580 596 480-565 650 340 350 510 536 480 440-470 Emisso (nm) 520 604 620 578 660 450 470 595 623 520 650 Substncia DiBA-Isop RN-heptano RN-acetona Indo 1 PE-Cy5 PE-TR PE-Cy7 Pironina Y DNA Pironina Y RNA N Tiazol Excitao 493 485 530 350 480-565 480-565 480-565 560 497 453 Emisso 517 525 605 505-510 670 613 695 570 563 480

o Tcnicas imunofluorescentes - marcadores fluorescentes de ligao covalente: so fluorocromos que reagem e se usam para marcar protenas, lipdeos ou outras molculas biolgicas. Devem ser suficientes seletivos e reativos. Se empregam cromforos como grupos isotiocianato, clorotrirzinil, e steres de succinimida, por sua capacidade de unio. O fluorocromo mais empregado a FLUORESCENA. Outros que se tem descrito so: rodamina, Texas red, cianinas etc, porm o

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mais conhecido a FICOERITRINA por sua grande excitao, rendimento e fotoestabilidade; alm disso pode ser excitado a 488 nm porm emite mais a frente do espectro da fluorescena permitindo uma anlise dupla com um s laser. Avanos recentes so o uso de sondas de DNA unidas a fluorescena e os anticorpos anti-bromodeoxiuridina para o estudo do ciclo celular. Atualmente se tem generalizado o estudo multiparamtrico de antgenos celulares aom o emprego simultneo de 4 e 5 anticorpos conjugados cada um com diferentes fluorocromos com diferentes emisses de luz (FITC, PE, ECD ou PerCP, PE-Cy5, PE-Cy7). o Fluorocromos que se ligam no covalentemente estruturas celulares: so fluorocromos que devido a sua composio molecular especial se unem a determinados componentes celulares. Marcadores do contedo de DNA e RNA: dependendo do tipo so mais ou menos especficos para DNA, RNA ou determinadas bases. Se empregam o Hoescht 33342 Liga-se a A-T), DAPI (A-T-), DIPI (A-T), cromomicina A3 (G-C), olivomicina (G-C), mitramicina (G-C).O laranja de acridina se liga ao DNA e RNA porm tem a particularidade de emitir em diferentes comprimentos de onda dependendo do cido nuclico ao qual est ligado. De uso mais comum o Iodeto de propdeo (PI) que se excita com um laser de 488 nm. Marcadores do potencial de membrana: so as cianinas e a rodamina 123. Tambm marcam mitocndrias devido a alta diferena de potencial entre suas membranas. o Marcadores fluorescentes que so sensveis ao microambiente: certos fluorocromos podem ser empregados para estimar as propriedades do ambiente em que se encontram, posto que variam seu espectro de excitao ou emisso em funo das caractersticas do microambiente que os cerca. So usados para a determinao de diversos estados funcionais celulares: pH (6-carboxi-fluorescena; 2,3-diciano-1,4-dihidroxidenceno; hidroxipireno trisulfato), clcio (quin II, fura 2, indo-1), potencial redox (diclorofluorescena, NADH, NADHP), atividade enzimtica (substratos que por ao da enzima variam sua fluorescncia ou espectro), polaridade (anilino-naftalina-sulfato ou ANS), e viscosidade /fluidez. A disponibilidade de fluorocromos especficos e suas propriedades so essenciais para o desenvolvimento das aplicaes em citometria de fluxo. Usualmente, grandes centros de pesquisa e hospitais possuem citmetros de fluxo e treinam pessoal para oper-los. Embora esses profissionais sejam responsveis em realizar a aquisio de amostras ou estejam disponveis para orientar outros usurios, importante que os pesquisadores e clnicos tenham um conhecimento bsico de, pelo menos, como um citmetro funciona para elaborarem seus experimentos de maneira objetiva, alm de estarem aptos a determinar resultados consistentes e confiveis e interpretar laudos clnicos.

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PADRES E CONTROLES

Um padro um material estvel que tem um valor determinado de fluorescncia ou disperso de luz. Utilizam-se para alinhar ou calibrar os citmetros de fluxo. O uso de padres de alinhamento proporciona um bom mtodo para detectar mudanas e problemas na configurao tica e de sinal de um dia para o outro. O citmetro est alinhado quando se consegue uma elevada fluorescncia ou sinal com baixo CV. Os citmetros de fluxo oferecem uma informao relativa, no absoluta. Para quantificar necessrio correlacionar os canais com resultados de amostras conhecidas. O mtodo mais sensvel consiste em ajustar a voltagem do PMT ou ganhos para conseguir um pico de intensidade determinada de um padro estvel. Os fluorocromos tm espectros de emisso que em ocasies se sobrepe e os filtros no so perfeitos, por isso os citmetros possuem um sistema informtico de compensao ou subtrao de sinal. difcil predizer teoricamente o grau de compensao e deve-se ajusta-lo individualmente. Geralmente se deve extrair FL1 de FL2, e tambm FL3 de FL2 e FL1.Alguns citmetros permitem fazer grficos do nmero de clulas processadas, do canal de fluorescncia ao longo do tempo. Podese usar para ver as estabilidades das medies do citmetro com o tempo e detectar a presena de algum problema (Fig. 5).

Figura 5 Interferncia de FL1 em FL2, FL3 e FL4. J os controles so materiais que produzem resultados esperados (conhecidos). So usados para monitorar a reprodutibilidade dos reativos e a qualidade dos mtodos de preparao celular. So

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importantes nas anlises de DNA e imunofluorescncia. Geralmente, se usam controles de ploidia e controles de imunofluorescncia positivos e negativos. Como controle de ploidia se deve usar um controle interno, processado no mesmo tubo da amostra, para descartar a aneuploidia e calcular o ndice de DNA e outro tubo para calcular as fases do ciclo celular. Para realizar uma boa leitura de DNA se deve ter o citmetro de fluxo em perfeitas condies e ser cuidadoso no processo de preparao da amostra. A anlise e interpretao se fazem mediante um software adequado. O objetivo das anlises de imunofluorescncia se utilizar de reativos especficos para determinar subpopulaes celulares. So necessrios controles negativos para descartar ligaes inespecficas do fluorocromo e selecionar o valor de autofluorescncia. So causas de marcao inespecfica os fragmentos Fc das imunoglobulinas, as clulas mortas, debris etc.

PROCESSAMENTO E ANLISE DE DADOS

Os citmetros de fluxo produzem uma grande quantidade de informaes que pode ser armazenadas em forma de histogramas (histogramas monoparamtricas de 256 ou 1024 canais, histogramas biparamtricos de 64 x 64) ou em List mode, que consiste em guardar toda a informao obtida para cada evento de modo que se pode modificar as regies de anlise e reconstruir os histogramas em funo de novos parmetros de seleo. o Dados univariantes (histogramas monoparamtricos): so representados como um histograma. Um mtodo rpido e sensvel de interpretao, a observao de histograma e a ajuda informtica do citmetro para calcular a porcentagem de eventos em regies selecionadas. Tem que ser levado em conta a resoluo do histograma para a discriminao do sinal e o CV. Mtodos no paramtricos: se baseiam na observao do histograma e posio dos cursores. Um problema so as amostras com baixa fluorescncia que se diferenciam pouco do negativo. Empregam-se mtodos de normalizao e subtrao do sinal com comparaes de curvas (Kolmogorov-Smirnov). Mtodos paramtricos: em alguns casos pela dificuldade de interpretao de dados e a elevada informao que contm, necessario aplicar modelos matemticos.

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o Dados bivariantes (histogramas biparamtricos): se apresentam como histogramas biparamtricos com dois eixos e o nmero de eventos se representa como densidade de pontos, cores, ou linhas isomtricas.

APLICAES DA CITOMETRIA DE FLUXO

A citometria de fluxo particularmente importante para investigaes biomdicas j que ela permite avaliaes qualitativa e quantitativa de clulas e de seus constituintes. As aplicaes fundamentais desta tcnica se do em biologia e medicina e so a identificao de antgenos celulares mediante tcnicas de imunofluorescncia e o estudo do contedo de DNA e fases do ciclo celular. A

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citometria de fluxo tem sido utilizada na biomedicina com diferentes objetivos: Na hematologia contagem celular, frmula leucocitria, anlise da medula ssea; na farmacologia estudos de cintica celular, resistncia drogas; na imunologia subpopulaes de clulas T, tipagem tissular, estimulao linfocitria, apoptose; na oncologia diagnstico/prognstico, monitorar tratamento; na microbiologia diagnstico bacteriano e viral, sensibilidade a antibiticos; na gentica caritipo, diagnstico de portador, diagnstico pr-natal, tipagem para transplantes. Com a Citometria de Fluxo possvel analisar o contedo de DNA e RNA, definir em que posio do ciclo celular a clula se encontra (Fig. 6), analisar cromossomos (Fig. 7), determinar clulas cancergenas que apresentem alteraes na sua taxa normal de DNA (Fig. 8) e clulas que se encontrem em processo de morte programada (apoptose) ou necrose (Fig. 9).

G0/G1 padro

G2/M

Figura 6 - Histograma de clulas normais coradas com iodeto de propdeo. Aps a diviso, as clulas entram numa fase Gap (G1), seguida por um perodo de sntese de DNA (S) durante o qual todos os cromossomos so replicados. A fase S seguida por uma segunda fase Gap (G2) e, ento, sofre mitose. O pico padro representa o ncleo de eritrcitos de galinha.

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Figura 7 - Distribuio da intensidade de fluorescncia do Hoeshst 33258 (eixo do y) vs. Cromomicina A3 (eixo do x), de cromossomos isolados de fibroblastos humanos. Todos os cromossomos esto mostrados no painel (B). O painel (A) mostra uma distribuio somente dos cromossomos 8 at 22 e Y.

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Figura 8 - Histogramas padres encontrados em anlise de DNA por citometria de fluxo. Normal = 46 cromossomos; Hipodiploidia < 46 cromossomos; Hiperdiploidia > 46 cromossomos.

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Figura 9 - Quantificao de linfcitos CD4+ ou CD8+ necrticos, apoptticos ou viveis, utilizandose uma anlise multiparamtrica. As clulas CD4+ foram marcadas com PE, as CD8+ com FITC) e a incorporao ao DNA foi feita pela a (7 AAD).

No que diz respeito ao uso da citometria de fluxo em imunologia, uma variedade grande de estudos podem ser realizados com o intuito de se conhecer melhor o que acontece nas doenas em que h comprometimento do sistema imunolgico, como o caso das doenas auto-imunes e das sndromes de imunodeficincia (AIDS). Mudanas nas taxas de linfcitos T e B, mudanas nas taxas de linfcitos T CD4+ e CD8+ podem ser analisadas facilmente, o que ajuda no diagnstico da doena. O estudo fenotpico destas subpopulaes de clulas tornou-se importante na clnica, com uma avaliao geral da resposta imune celular, na contribuio da atividade de processos de doenas auto-imunes, na classificao de rgos para que ocorra um transplante com sucesso (Fig. 10), no monitoramento de pacientes que tenham sofrido algum tipo de transplante para a determinao de sinais precoces de rejeio, e ainda, a possvel classificao de determinadas leucemias atravs da deteco de marcadores de superfcie especficos (Tabela 2). A anlise fenotpica est relacionada ainda com outras doenas como a Hemoglobinria Paroxstica Noturna com diminuio ou ausncia de CD55 e CD59; a distino entre leucemia das clulas do manto da leucemia linfoctica crnica atravs da quantificao de CD79; e a espondilite anquilosante com a determinao de HLAB27..

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Na oncologia, a mensurao de clulas progenitoras CD34+ por citometria de fluxo se tornou de importante valor para a monitorizao de transplantes dessas clulas. Na imunologia experimental vrios receptores de superfcie das clulas podem ser determinados com o uso de anticorpos monoclonais especficos conjugados a um determinado fluorocromo. Com isso, clulas de vrias origens, como p. ex., timcitos, esplencitos, clulas de gnglios linfticos, clulas intestinais de qualquer modelo experimental podem ter seus receptores de superfcies e/ou molculas intracelulares, como, citocinas e DNA, bem definidos.

A B C D E F

Figura 10 - Crossmatching para transplantes de rgos. Clulas do doador so incubadas inicialmente com o soro de receptor e posteriormente com um anticorpo anti-imunoglobulina G humana. O experimento feito em duplicata e seu resultado (E, F) comparado com controles negativos (C, D) ou positivos (A, B). A positividade no teste impossibilita a realizao do transplante.

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TABELA 1 - Painel resumido de diferentes anticorpos monoclonais usado no diagnstico de vrios tipos de leucemias. HLA-DR CD19 CD5 CD2 CD10 MY7 MY9 LMA 90% 0% 0% <5% 0% 75% 60% LLA-T 25% 0% 75% 90% 10% <5% <5% LLA-No-T CALLA + 90% 95% 0% <5% 100% 0% 0% 90% 95% 0% <5% 0% <5% <5% CALLA LLC-B 90% 0% 100% 90% 0% 0% 0% LLC-T 25% 0% 100% 90% 0% 0% 0% LMC Mielide 90% 0% 0% <5% 0% 75% 90% 90% 90% 0% <5% 80% 0% 0% Linfide
Tipos celulares: LMA - Leucemia Mielide Aguda; LLA-T - Leucemia Linfoblstica Aguda de clulas T; LLA-No-T - Leucemia Linfoblstica Aguda de clulas no-T; CALLA - Leucemia Linfoblstica Aguda Adquirida na Infncia; LCM - Leucemia Mielide Crnica; LLC - Leucemia Linfoblstica Crnica (B ou T).

Para se tentar entender melhor as diferentes patogenias causadas por parasitas, vrios estudos envolvendo a interao parasita-clula hospedeira tm sido desenvolvidos. Alguns autores se utilizam da citometria de fluxo com o intuito de estudar a interao entre protozorios e bactrias com clulas do sistema fagoctico mononuclear. Esse mtodo demonstrou ser bastante eficiente, mostrando inclusive a importncia da Leishmania no processo de fagocitose por macrfagos. Alm disso, estudos da produo de clcio nessas interaes tm sido realizados. A citometria de fluxo pode ser utilizada para determinar a produo de clcio e metablitos do oxignio (burst respiratrio) em clulas infectadas por protozorios do gnero Leishmania e Trypanosoma. Assim como, analisar a presena de cistos de Pneumocystis carinii obtidos de homogeneizados de pulmo, a viabilidade de hemoparasitos intraeritrocticos, identificar espcies de bactrias e determinar a infeco de hemcias por Plasmodium. Pode, ainda, ser utilizada para quantificar o papel funcional de determinada organela (p.ex. mitocndrias) ou a resistncia biolgica de um determinado parasita a drogas. Ainda na parasitologia experimental, a clonagem utilizando a citometria de fluxo tem sido bastante utilizada com o intuito de se conhecer as caractersticas biolgicas e bioqumicas de uma nica espcie de microorganismo.

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Por fim, a citometria de fluxo abre um leque de opes e perspectivas para o conhecimento. Porm, torna-se indispensvel um grande conhecimento da biologia dos sistemas a serem estudados, assim como, uma familiaridade com reagentes, mtodos de marcao com anticorpos monoclonais fluoresceinados e controles.

SORTING
Alm de analisar clulas, alguns citmetros de fluxo tm a propriedade de separar uma populao celular de acordo com parmetros pr-estabelecidos. A separao de clulas (sorting) pode ser baseado nas propriedades funcionais, bioqumicas ou morfolgicas das clulas. As mesmas no sofrem qualquer dano durante o processo e a populao obtida pode ser posteriormente utilizada em qualquer outro ensaio experimental in vitro ou in vivo, j que todo o processo pode ser feito sob condies estreis. Basicamente o que ocorre no sorting que um sistema especfico aplica vibraes ultrassnicas ao flow cell o qual faz com que no fluxo contnuo de lquido haja a formao de gotas (droplets). As gotas que possurem no seu interior as clulas de interesse passaro p rum colar eltrico onde elas podem permanecer sem carga ou receber uma carga positiva ou negativa de acordo com os critrios pr-estabelecidos no computador. Em seguida, as gotas carregadas passam por entre duas placas eltricas onde, de acordo com a polaridade, as gotas vo ser defletidas para a esquerda ou para a direita caindo em tubos coletores (Fig. 11). As populaes podem ser separadas com uma pureza de at 98% na primeira passagem. Se maiores graus de pureza so desejados a suspenso purificada pode ser submetida ao sorting novamente.

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Figura 11 Esquema do sorting

Existem outros mtodos de separao celular conhecidos atualmente, inclusive mais rpidos, porm, o sorting por citometria o nico mtodo pelo qual pode-se separar clulas levando-se em conta apenas suas caractersticas fsicas, como tamanho e granulosidade, sem a utilizao da marcao por anticorpos monoclonais. Utilizando este princpio, que se torna possvel a clonagem de clulas e/ou parasitas. Um acessrio destes equipamentos permite dispensar uma nica partcula (clula ou parasita) em um poo de uma placa de microtitulao (Auto-Clone).

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Existem os sorters pneumticos que empregam seringas e energia acstica para desviar o fluxo por alguns milisegundos onde as clulas so coletadas mecanicamente. So processos mais simples e baratos, porm sua especificidade e velocidade so muito baixas. E os sorters de defleo eletrosttica, que so complexos e necessitam de um grande suporte tecnolgico e de informtica. So os mais especficos e os mais utilizados.

Defleo eletrosttica

pneumtico

PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS

Devido s caractersticas especiais dos citmetros de fluxo. A amostra a ser analisada deve se encontrar em forma de suspenso. Existem amostras como o sangue perifrico, medula ssea, ou outros fluidos biolgicos, que precisam de um mnimo de processamento, em contraste os tumores slidos ou as amostras parafinadas necessitam de uma desagregao mais ou menos intensa (mecnica, enzimtica etc). Um fator limitante comum em citometria de fluxo a disponibilidade de uma suspenso celular para estudar suas caractersticas e relacionar ou extrapolar seus resultados com fenmenos in vivo.

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lvaro Luiz Bertho, Biomdico, PhD, Pesquisador Titular, consultor e coordenador do Ncleo de Citometria de Fluxo do Lab. de Imunoparasitologia, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ. Av. Brasil, 4365 - Pavilho Lenidas Deane, Sala 408-A, Manguinhos, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. 21045-900. Coordenador do Programa Integrado em Citometria de Fluxo da FIOCRUZ. Professor Adjunto da Universidade Severino Sombra, Vassouras, RJ. Tel: 55 21 3865.8126 bertho@ioc.fiocruz.br http://picf.ioc.fiocruz.br/ncfm.htm http://picf.ioc.fiocruz.br/flowconsult.htm