Curso: Farmácia

Disciplina: Imunologia Clínica

Anderson Wilbur Lopes Andrade

Anticorpos Monoclonais
Citometria de Fluxo
TERESINA
2013
ANTICORPOS MONOCLONAIS
INTRODUÇÃO
• Os bioquímicos, em busca de uma preparação
homogênea de anticorpos (Ac), voltaram-se
inicialmente a estudar as proteínas produzidas por
pacientes com mielomas múltiplo (tumor comum de
células plasmáticas) afim de analisar a estrutura
química dos Ac.

• Já se sabia que os Ac eram normalmente produzidos

por células plasmáticas e, como o miolema múltiplo
está associada à presença de grandes quantidades de
ANTICORPOS MONOCLONAIS
INTRODUÇÃO
• Esses estudos demonstraram que os Ac monoclonais
poderiam ser obtidos de células plasmáticas, entretanto, a
especificidade antigênica da maioria das proteínas do
mieloma era desconhecida, o que limitava sua utilidade.
• Este problema foi resolvido
por Georges Kohler e Cesar
Milstein, que desenvolveram
uma técnica para produzir
uma população homogênea
de Ac com especificidade
antigênica conhecida. Georges Kohler Cesar Milstein
ANTICORPOS MONOCLONAIS
PRODUÇÃO

Isso foi possível com a fusão

de células esplênicas de um
camundongo imunizado com
células de um mieloma,
resultando em células
híbridas, que tanto
proliferam como secretam
Ac específicos contra
antígenos.
ANTICORPOS MONOCLONAIS
PRODUÇÃO
• Após a fusão, as células híbridas são selecionadas com
fármacos que matam a célula de mieloma, ao passo que as
células esplências parenterais têm um tempo de vida
limitado e logo morrem.
• Como consequência, apenas as linhagens de células híbridas
de mieloma sobrevivem - HIBRIDOMA
ANTICORPOS MONOCLONAIS
PRODUÇÃO
• Hibridomas que produzem os Ac com
especificidade desejada são identificados e
clonados por novas culturas a partir de
células isoladas.

• Todas as moléculas de Ac produzidas são

idênticas em estrutura inclusive seus sítios de
ligação de antígeno (Ag) e isotipos.

Esses Ac são chamados de

ANTICORPOS MONOCLONAIS.
ANTICORPOS MONOCLONAIS
PRODUÇÃO

• Essa tecnologia revolucionou o uso de Ac ao permitir

uma produção limitada de Ac com uma especificidade
única e bem conhecida.

• Entretanto, até hoje, apenas os Ac monoclonais de

camundongos têm sido rotineiramente produzidos.

• Tentativas para produzir Ac monoclonais humanos não

tiveram muito sucesso até o momento.
ANTICORPOS MONOCLONAIS
UTILIZAÇÕES:
• COMPROENDEM:

Imunoensaios;

Diagnóstico de Neoplasias;

Tipagem Tissular;
ANTICORPOS MONOCLONAIS
VANTAGENS COMO REAGENTE:

• Padronização única para todos os laboratórios no

mundo;

• Anti-soro utilizado em diferentes animais;

• Superioridade sobre às estratégias convencionais na

produção de Ac específicos para componentes
individuais.
CITOMETRIA DE
FLUXO
CITOMETRIA DE FLUXO
INTRODUÇÃO
• Os Ag da superfície celular podem ser detectados e
localizados pela utilização de Ac marcados.

• Como os Ac não conseguem penetrar prontamente nas

células vivas, exceto por endocitose, o tratamento das
células com Ac marcados a frio (minimiza a endocitose)
leva à coloração apenas dos Ag de superfície.
CITOMETRIA DE FLUXO
DEFINIÇÃO

• É uma técnica que permite

medidas rápidas em partículas
ou células enquanto elas passam
uma a uma através de um
sensor, sendo as medidas
realizadas em uma partícula de
cada vez e não como valores
médios da população total.
CITOMETRIA DE FLUXO
CITOFLUORIMETRIA DE FLUXO
• É possível corar células isoladas com vários
fluorocromos diferentes e analisar as células em
gotículas individuais, à medida que elas fluem através
da seção de monitorização de um CITÔMERO DE
FLUXO.
CITOMETRIA DE FLUXO
CITÔMERO DE FLUXO
• Este equipamento é essencialmente, um FACS sem a capacidade de
selecionar células.

• Registra dados quantitativos relativos ao conteúdo do Ag de

superfície e à natureza física de cada célula individual, com
múltiplos parâmetros sendo avaliado por células para fornecer uma
análise fenotípica em uma única célula em lugar de uma medida da
população.

• Não é um aparelho simples, sendo necessário uma conhecimento

básico dos princípios de operação afim de se obter resultados
precisos.
CITOMETRIA DE FLUXO
CITÔMERO DE FLUXO
• Analisa eletronicamente os sinais gerados pelas
células em suspensão, quando elas são interceptadas
por uma feixe de luz que pode ser um laser ou uma
lâmpada de arco voltaico, que forneça comprimento
de onda específicos.
CITOMETRIA DE FLUXO
CITÔMERO DE FLUXO

• Conforme as células passam através do feixe de luz,

promovem o espalhamento da luz em todas as direções,
em um padrão que depende do seu tamanho, forma e
estrutura.

• As moléculas marcadas com fluorocromo são excitadas e

fluorescem.
CITOMETRIA DE FLUXO
CITÔMERO DE FLUXO
• Permite medir vários parâmetros celulares
simultaneamente e separar sub populações de células,
por exemplo:

Podem-se empregar dois parâmetros de

espalhamento de luz e três de imunofluorescência
em cada célula, tornando possível avaliar
determinadas populações celulares em misturas
complexa.
CITOMETRIA DE FLUXO
APLICAÇÃO E UTILIZAÇÃO

• Têm sido cada vez mais numerosa.

• A conjugação de fluorocromos a ligantes e a Ac

monoclonaise policlonais tem permitido o estudo da
distribuição de determinantes antigênicos e
receptores de células;

• Permite também a identificação e separação de

subpopulações celulares.
CITOMETRIA DE FLUXO
FONTE DE LUZ
• Os lasers utilizados na citometria de fluxo podem ser:
 Atômicos (hélio-neônio);

 Iônicos (Íon argônio ou criptônio);

 Moleculares (hélio-cádmio);

 Líquidos ou Sólidos;

 Lâmpada de Mercúrio (menos utilizado).

CITOMETRIA DE FLUXO
MARCADORES – MOLÉCULAS
FLUORESCENTES
• Há um grande número de moléculas fluorescentes que podem ser
empregadas para marcar as proteínas (Ac, Lectina, Avidina).

• O fluoróforo mais comumente utilizado é o Isotiocianato de

Fluoresceína

VANTAGENS:
• Alto coeficiente de absorção e emissão;
Isotiocianato • Encontra-se disponível conjugado a uma série de Ac;
de Fluoresceína • Pico máximo de absorção próximo às linhas de
emissão do laser.
CITOMETRIA DE FLUXO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
• Com Ac monoclonais e fluorocromos à mão, atualmente são
possíveis análises extremamente detalhadas, com uma notável
contribuição diagnóstica.

• A penetração do Ac fluorescente no interior da célula permite

a visualização das citocinas e de outras proteínas
intracelulares.

• Permite também, uma analise do ciclo celular pode com

fixadores de DNA, como o Iodeto de Propídio – determina o
conteúdo de DNA.
REFERÊNCIAS

• MURPHEY, K. et al. Imunobiologia 7º ed. Editora

Artmed, Porto Alegre, 2010.

• ROITT, I. M.; DELVES, P.J. Fundamentos de

Imunologia 10º ed. Editora Guanabara Koogan, Rio
de Janeiro, 2004.

• FERREIRA, A.W.; ÁVILA, S. L. M. Diagnóstico

Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e
Auto-Imune 2ºed. Editora Guanabara Koogan, Rio
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