Imunoensaios

Rubens de Oliveira Santos Fev/2012

Definio
Imunoensaio:
prova que usa complexos Ag-Ac (imunocomplexos) para gerar um resultado perceptvel desta interao
Imuno relacionado a resposta imunolgica Ensaio referente a prova ou teste

Difere dos ensaios colorimtricos:

Colorimetria:
reagente + amostra = cor
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Anticorpo, antgeno e analito

Anticorpo (Ac)
Produzido pelo sistema imune (SI) frente a um antgeno

Antgeno (Ag)
Substncia que interage com o Ac, de natureza qumica diversa

Analito
aquilo que se quer medir, dosar, determinar Em imunoesaio:
Antgeno Anticorpo

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Anticorpo, antgeno e analito

O analito pode ser:
Substncia naturalmente presente no organismo
Ex: hormnios, anticorpos, etc.

Substncias que o corpo produz mas no esto presente em condies normais:

Ex. protenas de clulas tumorais

Substncias que no esto presentes naturalmente no organismo

Ex.: drogas de abuso, microrganismos patognicos, etc.
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TCNICAS DE IMUNOENSAIO

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Tcnicas de imunoensaio
A utilidade dos imunoensaios atribuda aos Ac empregados:
Especificidade pelo Ag Afinidade pelo Ag

Pela forma de deteco do complexo Ag-Ac, derivam diversas tcnicas

A escolha de uma tcnica mais adequada dependente dos objetivos clnicos e laboratoriais
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Tcnicas de imunoensaio
Referente a produo e performance do anticorpo empregado como reagente em imunoensaios, distinguem duas categorias:
Ac policlonais

Ac monoclonais

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Estrutura dos anticorpos

Regio Fab
Ponto de unio com o Ag e varivel conforme entre os Ac

Regio Fc
Regio de estrutura constante dentro de uma classe de Ac

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Propriedades dos anticorpos

Reversibilidade das interaes Ag-Ac
Regida pela lei de ao das massas

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Propriedades dos anticorpos

Especificidade
Capacidade de distinguir uma estrutura no meio de outras

Afinidade
Fora da ligao dos Acs com um Ag monovalente

Avidez
Fora da ligao dos Acs com um Ag polivalente

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Propriedades dos anticorpos

Reao cruzada:
Dois Ag diferentes apresentam um eptopo idntico
Ac especficos para um eptopo se ligam a um eptopo no relacionado, mas com propriedades qumicas similares

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Propriedades dos anticorpos

IgG
Corresponde a aproximadamente 85% das imunoglobulinas presente nos adultos
Peso molecular de 154kD com duas cadeias leves de 22.000D e duas pesadas de 55.000D cada Imunoglobulina que dura mais tempo em circulao, em mdia 23 dias

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Propriedades dos anticorpos

IgM
Corresponde a 5% das imunoglobulinas presentes no indivduo adulto
Vida mdia de 5 dias

Imunoglobulina mais eficiente na fixao do complemento

Pentamrica

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Propriedades dos anticorpos

IgA
Corresponde a 5% das imunoglobulinas presentes em um adulto
Vida mdia de 6 dias

Encontrada na forma monomrica, dimrica, trimrica ou multimrica

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Propriedades dos anticorpos

IgD
Encontrada ligada a membrana de linfcitos B maduros, peso molecular aproximado de 185kD

IgE
Encontrada sob a forma monomrica na circulao, seu peso molecular de aproximadamente 200kD
Est implicada nas reaes alrgicas, principalmente quando ligada a membrana de mastcitos e basfilos.

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Anticorpos policlonais
So produzidos por animais (coelho, ovelha ou cabras) O Ag (imungeno) escolhido injetado nos animais e estes reagem com a produo de Ac pelo seu SI Aps mltiplas injees, colhe o sangue e separa o soro rico am Ac especficos ao Ag, o anti-soro
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Anticorpos policlonais
Os Ac assim produzidos constituem uma mistura de Ac que interagem com diferentes eptopos do Ag Ag com vrios stios de ligao com Acs so denominados Ag polivalentes Os Acs assim produzidos, reagentes com eptopos diversos de um mesmo Ag, so denominados anticorpos polivalentes
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Anticorpos policlonais
Vantagens
Maior avidez que os Ac monoclonais
Reconhecem vrios eptopos de um Ag

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Anticorpos policlonais

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Anticorpos monoclonais
So anticorpos especficos para um eptopo de um Ag polivalente So produzidos por uma linhagem celular nica (hibridomas) produtor de Ac
O antgeno de interesse injetado no animal (geralmente o rato)

Isolam os LyB do bao do animal

Funde os LyB com clulas tumorais de rato Separam as colnias de interesse Como cada colnia prevem de uma nica clula hdrida, esta produz Ac que reagem apenas com um eptopo do Ag polivalente.
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Anticorpos monoclonais

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Anticorpos monoclonais

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Anticorpos monoclonais

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Anticorpos monoclonais
So anticorpos especficos para um eptopo de um Ag polivalente So produzidos por uma linhagem celular nica (hibridomas) produtor de Ac
O antgeno de interesse injetado no animal (geralmente o rato)

Isolam os LyB do bao do animal

Funde os LyB com clulas tumorais de rato Separam as colnias de interesse Como cada colnia prevem de uma nica clula hdrida, esta produz Ac que reagem apenas com um eptopo do Ag polivalente.
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CLASSES DE IMUNOENSAIOS

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Imunoensaios no marcados e imunoensaios marcados

No marcados
Imunoensaios de precipitao
Imunoensaios de aglutinao

Marcados
Redioimunoensaios
Imunoensaios enzimticos Imunoensaios fluorescentes Imunoensaios quimioluminescentes
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Imunoensaios no marcados

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Imunoensaios de precipitao
Imunoprecipitao Reao de Ag solves com Ac solvel com formao de grandes complexos Ag-Ac insolveis A interao Ag-Ac revelada diretamente pela visualizao de turvao do meio reacional Especificidade Simplicidade Sensibilidade entre 0,1 a 0,5 mg/dL (baixa)
Suficiente para determinao de protenas sricas
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Imunoensaios de precipitao
Imunoprecipitao

Fatores interferentes:
pH Temperatura Fora inica Proporo entre [Ag] e [Ac] ponto de equivalncia e prozona

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Imunoensaios de precipitao
Imunoprecipitao

Mtodos qualitativos:
Imunodifuso simples Imunodifuso dupla Imunodifuso dupla em duas dimenses Imunoeletrofores

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Imunoensaios de precipitao
Imunoprecipitao

Mtodos:
Imunodifuso simples Imunodifuso dupla Imunodifuso dupla em duas dimenses Imunoeletrofores

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Imunoensaios de precipitao
Turbidimetria/nefelometria

Envolve a quantificao de luz dispersa ao por complexos Ag-Ac formados em meio lquido
Sensibilidade de 0,5 g/mL ou 0,5 mg/dL Tcnica quantitativa Pode ser empregadas partculas como suporte

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Imunoensaios de aglutinao
A interao Ag-Ac revelada diretamente pela visualizao de aglutinao de partculas presentes no meio reacional Pode ser classificada em:
Aglutinao passiva:
Pesquisa Ac solvelis numa amostra e os Ag esto presentes natural ou artificialmente na superfcie da partcula usada

Aglutinao reversa:
Pesquisa Ag solveis numa amostra e o Ac especfico e adsorvido artificialmente superfcie usada atravs da regio Fc do Ac
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Imunoensaios de aglutinao
Aglutinao direta:
O Ag faz parte da constituio natural da partcula usada

Aglutinao indireta:
Ag ou Ac no faz parte da constituio natural da partcula usada na reao, sendo adsorvida artificialmente sua superfcie

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Imunoensaios de aglutinao
Aglutinao direta:
O Ag faz parte da constituio natural da partcula usada

Aglutinao indireta:
Ag ou Ac no faz parte parte da constituio natural da partcula usada na reao, sendo adsorvida artificialmente sua superfcie

Sensibilidade moderada, semelhante a precipitao

Alta especificidade Praticidade

Tcnica semiquantitativa
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Imunoensaios de aglutinao
Partculas mais empregadas:
Hemcias:
Hemaglutinao direta: ex. tipagem ABO/Rh Hemaglutinao indireta (HAI): ex. HAI para sfilis, para Chagas, para HIV, para HVB, para HCV, etc

Partculas de ltex:
Aglutinao indireta: pesquisa de protena C reativa (PCR), fator reumatide (FR), pesquisa de rotavrus, HCG, etc. Nos trs exemplos pesquisa-se Ag
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Imunoensaios de aglutinao
Partculas mais empregadas:
Partculas de gelatina:
Empregada como substituta dos testes de HAI

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Fenmeno pr-zona
Partculas mais empregadas:
Partculas de gelatina:
Empregada como substituta dos testes de HAI

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Fenmeno pr-zona

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Imunoensaios marcados

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Imunoensaios marcados
Empregam um reagente marcado para medir a concentrao do analito As substncia marcadoras podem ser:
Composto radioativo, Enzima que catalise uma reao colorimtrica Substncia que produza luz Composto fluorescente

A substancia marcadora pode ser incorporada ao Ag ou ao Ac, conforme o analito Complexo formado denomina-se conjugado
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Imunoensaios marcados

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Classificao
Imunoensaios competitivos Imunoensaios no competitivos Imunoensaios homognios Imunoensaios heterognios

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Imunoensaios competitivos
O analito da amostra (no marcado) compete com o analito marcado presente como reagente no imunoensaio O analito no marcado impede o marcado de reagir com o ligante Quanto mais analito no marcado presente na amostra, menos sinal ser quantificado no final da reao Alta sensibilidade

Podem ser de uma etapa ou de duas etapas

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Imunoensaios competitivos

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Imunoensaios competitivos
Imunoensaio competitivo de uma etapa

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Imunoensaios competitivos
Imunoensaio competitivo de duas etapas

Apresenta maior sensibilidade que o de uma etapa

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Imunoensaios no competitivos
Maior sensibilidade e especificidade

Usado para analitos em concentraes muito baixas

Conhecido como sanduche:
analito ligado entre anticorpos reagentes altamente especficos

A concentrao do analito diretamente proporcional ao sinal

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Imunoensaios no competitivos

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Imunoensaios no competitivos

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