ANÁLISES CLÍNICAS III

IBMR – CENTRO UNIVERSITÁRIO

MSc. Rodrigo Carvalho

FIOCRUZ / INI-Evandro Chagas
 IMUNODIAGNÓSTICO
IMUNODIAGNÓSTICO
• Comparação com outros setores
• Vantagens
• Importância:
– Elucidar processos patológicos.
– Diferenciar a fase da doença.
– Diagnosticar doença congênita.
– Selecionar doadores e receptores de órgãos.
 PARÂMETROS SOROLÓGICOS

Exemplo: Novo teste sorológico lançado no mercado

(Rodan®), para detectar HIV I e II.
1. São necessários testes estatísticos?

2. Que parâmetros serão estudados?

- Sensibilidade
- Especificidade
- Eficiência
- Reprodutibilidade
- Prevalência
 PARÂMETROS SOROLÓGICOS

TESTE Doença – Diagnóstico Verdadeiro

Presente Ausente

POSITIVO Positivos verdadeiros Positivos falsos

A B

NEGATIVO Negativos falsos Negativos

C verdadeiros
D
 PARÂMETROS SOROLÓGICOS

Sensibilidade – Refere-se à porcentagem de pacientes

doentes com teste positivo detectados em população
sabidamente infectada.
__A__
A+C
Especificidade – É definida pela porcentagem de
indivíduos “normais” com teste negativo em população
sabidamente não infectada.
_D_
B+D
 PARÂMETROS SOROLÓGICOS

TESTE Doença – Diagnóstico Verdadeiro

Presente Ausente

POSITIVO Positivos verdadeiros Positivos falsos

A B

NEGATIVO Negativos falsos Negativos

C verdadeiros
D
 PARÂMETROS SOROLÓGICOS

Eficiência – Refere-se ao somatório dos verdadeiros

resultados positivos e verdadeiros resultados negativos.
____A – D __
A–B–C+D

Reprodutibilidade – Refere-se à obtenção de resultados

iguais em testes realizados com a mesma amostra, sob a
mesma técnica, porém em laboratórios diferentes.
 PARÂMETROS SOROLÓGICOS

Teste estatístico do reagente Rodan®

TESTE Doença – Diagnóstico verdadeiro TOTAL
Presente Ausente

Positivo 18 30 48

Negativo 2 1.950 1.952

TOTAL 20 1.980 2.000

 PARÂMETROS SOROLÓGICOS

Limiar de Reatividade (Cut off)

 IMUNODIAGNÓSTICO
INTRODUÇÃO
REAÇÕES SOROLÓGICAS
2 GRANDES GRUPOS:

1. Reações Sorológicas de ligação secundária

Testes com reagente não marcado

2. Reações Sorológicas de ligação primária

Testes com reagente marcado
 IMUNODIAGNÓSTICO
REAÇÕES SOROLÓGICAS
TESTES DE LIGAÇÃO
SECUNDÁRIA

• HEMAGLUT. PASSIVA 0,01 mg /ml

• RFC 0,05 mg/ml TESTES DE LIGAÇÃO
• AGLUT. BACTÉRIAS 10,05 mg /ml PRIMÁRIA
• PRECIPITAÇÃO GEL 30,00 mg/ml
• RIE 0,00005 mg/ml
• ELISA 0,0005 mg/ml
 IMUNODIAGNÓSTICO
PRECIPITAÇÃO
• Descoberta em Viena (1887, por Rudolf Kraus)
• Heidelberger e Kendall (1935) / Curva Parabólica
• Efeito PROZONA
• Bechold (1905) – estudo sobre precipitados em gel
 IMUNODIAGNÓSTICO
IMUNODIFUSÃO
CONCEITO
Imuno (Imunologia) + Difusão??
DIFUSÃO -“É o processo de transporte de um substância
solúvel, em um meio fluido de uma parte para a outra da
célula como resultado do movimento molecular ao acaso”

CARACTERÍSTICAS
• Representam técnicas de Precipitação + gel.
• A Imunodifusão pode ser:
Simples - Ou Ag ou Ac estão fixados à placa, e o
outro difunde.
Dupla – Tanto o Ag como o Ac estão na placa.
Linear (Unidimensional)
Radial (Bidimensional)
 IMUNODIAGNÓSTICO
IMUNODIFUSÃO
IMUNODIFUSÃO SIMPLES UNIDIMENSIONAL
• Técnica de Jacques OUDIN (França, 1946)
IMUNODIFUSÃO DUPLA UNIDIMENSIONAL
• Técnica de Oakley e Fulthorpe
IMUNODIAGNÓSTICO
IMUNODIFUSÃO

A – SIMPLES
OUDIN

B – DUPLA
OAKLEY E FULTHORPE
 IMUNODIAGNÓSTICO
IMUNODIFUSÃO
IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES
• Técnica descrita por MANCINI (1965), baseia-se
na quantificação de antígenos.
• Incubação em câmara úmida por 48 a 72 horas.
• Sensibilidade: 1 a 3 mg/ml.
• Aplicação: quantificação de imunoglobulinas.
 IMUNODIAGNÓSTICO
IMUNODIFUSÃO
IMUNODIFUSÃO DUPLA RADIAL
• Técnica criada por OUCHTERLONY (Suécia, 1947).
• O complexo antígeno-anticorpo se apresenta
como linha ou arco de precipitação.
• Tem como princípio a pesquisa de afinidade entre
antígenos
• Incubação: 18 a 24 horas em câmara úmida.
IMUNODIAGNÓSTICO
IMUNODIFUSÃO
 IMUNODIAGNÓSTICO
IMUNOELETROFORESE
Eletroforese – É a migração de partículas carregadas em
um solvente condutor sob a influência de um campo elétrico.
(Tiselius
1937).
• Técnica descrita por Grabar e Willians (1953).
• Realiza-se em duas etapas:
1. Eletroforese em gel;
2. Imunodifusão e precipitação das proteínas.
• A caracterização das substâncias é obtida segundo 3 parâmetros:
1. Características eletroforéticas
2. Difusibilidade
3. Especificidade (propriedades imunológicas)
IMUNODIAGNÓSTICO
IMUNOELETROFORESE
 IMUNODIAGNÓSTICO
ELETROIMUNODIFUSÃO
• Também chamada de Imunoeletrodifusão
e Eletroimunoprecipitação.
• Modificação da Imunodifusão, acrescentando campo
elétrico. (10 vezes mais sensível)
• Possui 2 variações:
1. Eletroimunodifusão Simples Unidimensional
2. Eletroimunodifusão Dupla Unidimensional
 IMUNODIAGNÓSTICO
ELETROIMUNODIFUSÃO
ELETROIMUNODIFUSÃO SIMPLES UNIDIMENSIONAL
• Conhecida como “Técnica do Foguete” ou de Laurell
 IMUNODIAGNÓSTICO
ELETROIMUNODIFUSÃO
ELETROIMUNODIFUSÃO DUPLA UNIDIMENSIONAL
• Técnica chamada de Imunoeletroforese de
Contra-corrente
• O método aproveita duas forças químicas:
1. A eletroendosmose (do catodo + para o anodo -)
2. Corrente eletroforética (do anodo – para o catodo +)
 AGLUTINAÇÃO

“A reação de Aglutinação caracteriza-se pela formação de agregados

visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e
partículas insolúveis (ligação chave-fechadura) que contém
determinantes antigênicos em sua superfície”.
Ocorre em 2 estágios:
- 1º Estágio
- 2º Estágio
Quanto ao tipo de antígeno:
- Aglutinação direta
- Aglutinação indireta ou passiva
AGLUTINAÇÃO
INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO DIRETA

Teste realizado para detecção de vírus

 TESTE DE HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA
Características:
- Descoberta por Boyden (1951)
- São utilizadas hemácias de carneiro ou humanas
do grupo O
- Ac IgM são 750 vezes mais eficientes que IgG.
- Utilizados para Treponema pallidum, Toxoplasma
gondii, Trypanosoma cruzi
 TESTE DE AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX
- Singer e Plotz (1956)
- Princípio:
 TESTE DE AGLUTINAÇÃO DE CRISTAIS
DE COLESTEROL
- Reflete o princípio do VDRL (Venereal Disease Research
Laboratory)
- Sensibilização com Cardiolipina (0,03%), Colesterol
(0,9%) Lecitina (0,01%)
 TESTE DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
Ensaio lítico / Hemólise
- Teste criado por Jules Bordet (1901)
Características do teste:
1. Ac pertence à classe IgM ou IgG
2. Utiliza-se como sistema indicador hemolisina e
hemácias de carneiro
 INIBIÇÃO DA HEMÓLISE
1º Etapa / Positivo
Soro
Paciente Hemolisina Neutralização Sistema Indicador

+
 INIBIÇÃO DA HEMÓLISE

1º Etapa / Negativo
Soro
Paciente Hemolisina Neutralização Sistema Indicador

+
 TESTES COM REAGENTE MARCADO
PRIMEIRO ESTÁGIO
IMUNOFLUORESCÊNCIA
- Desenvolvido pela primeira vez por Coons (1941)
- Baseia-se na capacidade do Ac de se ligarcovalentemente
a Fluorocromos sem perder sua reatividade
FLUOROCROMOS – Substâncias que absorvem a luz em um
comprimento de onda menor e quando excitados pela luz ultravioleta,
emitem luz de comprimento de onda maior, fenômeno chamado
FLUORESCÊNCIA.

Principais Fluorocromos – Isotiocianato de

Fluoresceína e rodamina B
TESTES COM REAGENTE MARCADO
PRIMEIRO ESTÁGIO
 TESTES COM REAGENTE MARCADO
PRIMEIRO ESTÁGIO
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Imunofluorescência Direta
- Utilizado para a detecção de antígenos em células ou
tecidos, através de um anticorpo específico marcado com
fluorocromo (conjugado)
Utilização
Pesquisa de C3 / Chlamydia trachomatis / Citomegalovírus
Imunofluorescência Indireta
- Utilizado para a detecção de anticorpos em lâmina
Utilização
FTA-ABS / FAN (Hep-2) / Toxoplasma gondii
 TESTES COM REAGENTE MARCADO
PRIMEIRO ESTÁGIO
Testes com RADIOISÓTOPO
Princípio – Reagentes marcados (Ac ou Ag)
Quantificam o Ac ou Ag não marcado da amostra.
Dois Tipos:
1. Radioimunoensaio (Ag marcado)
2. Imunorradiométrico (Ac marcado)
Vantagens – Medidas rápidas, sensíveis e específicas.
Desvantagens – Alto custo do teste, a vida média
Dos reagentes e o risco operacional.
Radioisótopos utilizados – I 125 / I 131.
 TESTES COM REAGENTE MARCADO
PRIMEIRO ESTÁGIO
Tipos de Radioimunoensaio:
1. Ensaio direto;
2. Ensaio de competição (Ac ou Ag marcado);
3. Ensaio de captura (Ag);
4. Para a detecção de IgE.
- PRIST (Paper Radioimmunosorbent Test)
- RAST (Radioallergosorbent Test)
 TESTES COM REAGENTE MARCADO
PRIMEIRO ESTÁGIO
RADIOIMUNOENSAIO DIRETO
1º Etapa
2º Etapa
3º Etapa
 TESTES COM REAGENTE MARCADO
PRIMEIRO ESTÁGIO
RADIOIMUNOENSAIO DE COMPETIÇÃO
1º Etapa
2º Etapa
3º Etapa
 TESTES COM REAGENTE MARCADO
PRIMEIRO ESTÁGIO
RADIOIMUNOENSAIO DE CAPTURA
1ºEtapa
2ºEtapa
3ºEtapa
4ºEtapa
 TESTES COM REAGENTE MARCADO
PRIMEIRO ESTÁGIO

Ensaio Imunocromatográfico

https://www.youtube.com/watch?v=QCmEV68ubIQ
 TESTES COM REAGENTE MARCADO
PRIMEIRO ESTÁGIO

Ensaio Imunológico Quimioluminescente (CLIA)

I. Os antígenos recombinantes do HIV-1, incluindo o grupo O e HIV-2, estão
fixados na fase sólida – poço de reação. Os anticorpos presentes na amostra
ligam-se aos antígenos fixados na fase sólida, formando um complexo
antígeno-anticorpo.

II. Em uma segunda etapa, é adicionado um conjugado composto de

antígenos recombinantes de HIV marcados com uma enzima (peroxidase). O
conjugado liga-se especificamente aos anticorpos do complexo antígeno-
anticorpo, formado durante a primeira etapa.

III. Na terceira etapa, é adicionado o substrato (um derivado do luminol e

um sal perácido) e um agente de transferência de elétrons.

IV. A reação entre o conjugado e o substrato origina um produto luminoso,

captado e medido pelo equipamento.

V. A presença ou ausência de anticorpos anti-HIV-1 e (ou) HIV-2 na amostra

é Determinada pela intensidade de luz obtida numa amostra, comparada
com o ponto de corte (cutoff), a partir do qual as reações são interpretadas
como reagentes, não reagentes ou indeterminadas.
TESTES COM REAGENTE MARCADO
PRIMEIRO ESTÁGIO
 TESTES COM REAGENTE MARCADO
PRIMEIRO ESTÁGIO

ENZIMAIMUNOENSAIO
- Surgiram em 1985 os primeiros ensaios.
- Dividem-se em:
a. Ensaios homogêneos e heterogêneos;
- Os ensaios mais utilizados no diagnóstico laboratorial são os
heterogêneos.
- São chamados de ELISA (1985). LISE VIRAL
1. ELISA – 1º Geração – método indireto.
2. ELISA – 2º Geração (1987) – método indireto.
Peptídeos sintéticos e Ag recombinantes
3. ELISA – 3º Geração (1990 – O,M,N / 1994 – Sanduíche)
Reduzem o período de JANELA IMUNOLÓGICA
4. ELISA – 4º Geração (2000) – Antígeno P24.
 TESTE MOLECULARES

IMUNOBLOT
- Western Blot – Proteínas;
- Southern Blot – DNA;
- Northern Blot – RNA.

FASES:
1º Extração;
2º Eletroforese
3º Transferência
4º Bloqueio
5º Detecção
6º Revelação
TESTE MOLECULARES
 SOROLOGIA - HEPATITES VIRAIS
HEPATITES VIRAIS
- Tipos:
- Epidemiologia:
-Importância Clínica: (Critérios laboratoriais e
epidemiológicos)
SOROLOGIA - HEPATITES VIRAIS
SOROLOGIA - HEPATITES VIRAIS
SOROLOGIA - HEPATITES VIRAIS
SOROLOGIA - HEPATITES VIRAIS
SOROLOGIA - HEPATITES VIRAIS
SOROLOGIA - HEPATITES VIRAIS
SOROLOGIA - HEPATITES VIRAIS
QUESTÕES
SOROLOGIA - HEPATITES VIRAIS
QUESTÕES
 SOROLOGIA - HEPATITES VIRAIS
QUESTÕES

3. (ENADE 2007) Os marcadores imunológicos da infecção pelo vírus da

hepatite B (HBV) mais utilizados são: antígeno de superfície (AgHBs),
anticorpos anti-Ag de superfície (anti-HBs), anticorpos específicos anti-
Ag do core (anti-HBc), antígenos “e” (AgHBe) e anticorpos específicos
anti-Ag "e" (anti-HBe). O exame laboratorial de um indivíduo mostrou o
seguinte perfil sorológico: AgHBs (+); AgHBe (−); anti-HBc IgM (−); anti-
HBc IgG (+); anti-HBs IgG (+).
O perfil encontrado é característico de um indivíduo que:
(A) foi vacinado contra o HBV.
(B) está em fase de recuperação.
(C) está na fase prodrômica.
(D) está na fase aguda de uma infecção pelo HBV.
(E) está com alta taxa de replicação viral.
SOROLOGIA - HEPATITES VIRAIS
QUESTÕES
 SOROLOGIA - HIV
Características:
Família: Retroviridae (Presença de TR);
 
Gênero: Lentivírus;
Genoma: RNA (2 filamentos de fita simples);
Envelopado:
Infectividade:
Tipos:
HIV – Tipo I (três tipos):
Grupo M – 9 subtipos (6 subsubtipos);
66 formas recombinantes.
Grupo O:
- Guiné Equatorial, Camarões e Gabão.
Grupo N:
- Camarões.
SOROLOGIA
 SOROLOGIA - HIV

 
 SOROLOGIA - HIV

 
 SOROLOGIA - HIV