Diagnóstico Sorológico

Müller Ribeiro Andrade

Adrianne Alcântra

Recife, Dezembro de 2015

Por que utilizar anticorpos (Ac)?
Por que utilizar anticorpos (Ac)?
 Características básicas dos Ac

 Especificidade;
 Diversidade;
 Memória;
 Autolimitação;
 Não reativo ao próprio*.
Características básicas dos Ac
Título de Ac

Dias após a imunização

 Características básicas dos Ac
Avidez

IgG

Tempo
 Capacidade do anticorpo IgG de ligar ao antígeno, sendo
que sua força de ligação dependerá do tempo de exposição
ao antígeno;
 Fatores a serem analisados na
escolha do método
Custo;
Disponibilidade de material;
Segurança;
Aplicabilidade à amostra disponível;
Tempo de realização do método;
Sensibilidade;
Especificidade;
Teste diagnóstico IDEAL

Sádios
Doentes

Cut-off ou
Ponto-de-corte
Teste SENSÍVEL

Sádios
Doentes

Falso - Falso +

Cut-off ou
Ponto-de-corte
Teste ESPECÍFICO

Sádios
Doentes

Falso - Falso +

Cut-off ou
Ponto-de-corte
Características dos Ensaios que utilizam Ac
 Especificidade

 Capacidade de identificar os não doentes dentre os

sadios;
 Indica que o teste em questão identificará somente o
antígeno ou o anticorpo desejado.

 Sensibilidade

 Capacidade de identificar os positivos dentre os

doentes;
 Estreitamente relacionada com a quantidade mínima
de antígeno ou anticorpo que poderá ser detectada;
Imunofluorescência
 Imunofluorescência

 Detecção de Ag utilizando Ac específicos, marcados

com fluoróforos (ou fluorocrómos), de modo que a
marcação se torna visível ao microscópio de
fluorescência;

 Ac se ligarem covalentemente a fluorocrómos sem

perder sua reatividade específica com o antígeno.

 Teste qualitativo/semi-quantitativo.

 Titulação
 Imunofluorescência

 Padronização e execução relativamente simples;

 Subjetividade de leitura → pessoal treinado;
 Necessita de conjugados fluorescentes e microscópio.

Detecção de Ag Detecção de Ag Detecção de Ac

DIRETA INDIRETA
 Imunofluorescência – Bases físicas
 Fluorocromos ou Fluoróforo são substâncias que
absorvem luz de um determinado comprimento de onda e
quando excitadas emitem luz de comprimento de onda
diferente → fluorescência.
 Isotionato de fluoresceína e compostos da rodamina
- mais usados
 Imunofluorescência – Bases físicas
 Microscópio de Epifluorescência;

 A reação imunofluorescente - emissão

de cor quando o fóton é excitado por luz de
curto comprimento de onda (UV).

 Filtros - deixar passar somente a

emissão secundária desejada;
 Imunofluorescência – Bases físicas
 Microscópio de Epifluorescência;
 Imunofluorescência direta (IFD)
Y Y
TEM O MICRORGANISMO/ANTÍGENO?
Y Y
Y

Y
Anticorpo Conjugado
Microorganismo
Célula do tecido
Imunofluorescência direta (IFD)
RAIVA

Resultado qualitativo
Imunofluorescência direta (IFD)
RAIVA
Imunofluorescência indireta (IFI ou RIFI)
PESQUISA DE ANTICORPOS Y Y Y
Y
Y Y
Y Y Y Y Y
Y YY Y YY Y YY
Y Y
Y Y Y Y Y Y
 Produção de Antígeno
Cultivo

Concentração de
RIFI 1200 taquizoítos/μl
Imunofluorescência Indireta de PBS
 Imunofluorescência indireta
Técnica

 Antígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro.

O soro do animal é diluído (Ac primário) Anticorpo
 Sempre utilizar controles + e – secundário
FITC
 PONTO DE CORTE
 Influencia na sensibilidade e especificidade do teste
FITC
 Anticorpo conjugado com molécula fluorescente (Ac secundário)

Anticorpo
primário

Antígeno
Imunofluorescência indireta

Resultado qualitativo
 Imunofluorescência indireta
 RESULTADO POSITIVO – TITULAÇÃO DA AMOSTRA
 Imunofluorescência indireta
 Vantagens
 Simples padronização;
 Resultado curto espaço de tempo;
 Fácil execução;
 Boa especificidade e sensibilidade;

 Desvantagens
 Alto custo do microscópio de fluorescência;
 Necessidade de um conjugado/espécie animal;
 Subjetividade da leitura;
 Não-automação.
 Imunofluorescência indireta
 Aplicações
 Imunofluorescência - Cuidados
 Amostras - evitar amostras deterioradas ou congeladas
inadequadamente;

 Fixação do antígeno na placa;

 Lâminas - influência de resíduos químicos nela presentes;

 Glicerina tamponada - melhor luminosidade FITC;

 Conjugação - remoção de fluorocromo não ligado,

excessiva marcação, titulação (maior diluição capaz de
evidenciar um sinal adequado)
 Vamos a prática!!!
Protocolo:
•Retirar os soros dos animais e os controles + e -.

•Diluir os soros em PBS obedecendo o ponto de corte

• 1:200 (bovinos – N. caninum);

• 1:64 (ovino, caprino e bovino – T. gondii).

• 1:16 (rato, humano, gato, galinha e outros – T. gondii)

•Distribuir 10 μL das amostras diluídas nas lâminas;

•Incubar as lâminas em câmara úmida a 37oC por 30 minutos.

•Lavar as lâminas 2X em PBS por 5 minutos. Secar a temperatura ambiente, ou

colocar na estufa por 5 minutos.

•Diluir o conjugado (anti-IgG marcado com fluoresceína)

 Vamos a prática!!!
Exemplo para preparo do conjugado:
- número de lâminas x 12 (n° de poços de cada lâmina) x 10 μL
= 4x 12 x 10 → 480 μL
Deste total deve ser adicionado uma sobra → 480 μL + sobra = 600 μL
- Conjugado bovino 1:600
1 ----- 600
x ----- 600
x = 1 μL do conjugado
- 0,5% de Azul de Evans
0,5% de 600 μL = 3 μL de Azul de Evans
- PBS = 600 - 3 – 1
PBS = 596 μL
 Vamos a prática!!!

• Distribuir 10 μL do conjugado diluído em cada poço e incubação em câmara

úmida e escura a 37oC por 30 minutos.

• Lavar as lâminas 2X em PBS por 5 minutos (escuro). Secar a temperatura

ambiente, ou colocar por 5 minutos na estufa. Montar as lâminas com glicerina
tamponada (90% de glicerol e 10% PBS) e lamínula.

• Observação em microscópio de fluorescência em aumento de 400X,

considerando positivas as reações que ocorram fluorescência periférica total em
mais de 50% dos taquizoítos.
 Vamos a prática!!!

Ratos
Bovinos
+ +
- - Amostras
+ testes
-
Ovinos
+ 1:16
-
+
- 1:32
1:64

1:128
 OBRIGADO!!!
mullerrib@gmail.com