Antifungigrama: testes de

susceptibilidade a antifúngicos
em laboratórios clínicos
Daniel Archimedes da Matta
LEMI-DIPA – UNIFESP
darchimedes@ig.com.br

Maio 2009
“Retirantes” de Candido Portinari
 Introdução

Incidência das doenças fúngicas:

↑ ↑ ↑ forma explosiva => últimas décadas

advento de QT tumores

disponibilidade de novos ATM

transplante de órgãos

novos recursos diagnósticos e terapêuticos

Avanços = alteraram história natural doenças

infecciosas

Danos sistema de reconhecimento e defesa:

vítima microbiota colonizante

microorganismos cuja patogenicidade baixa ou desconhecida
Beck-Sagué, Jarvis, JID 167:1247 1993
Beck-
Colombo, Guimarães,
Guimarães, Rev. S.B.M.Trop. 36:599
36:599--607 2003
 Sepse em Hospitais dos E.U.A

Bactérias Gram-negativas
225.000 Bactérias Gram-positivas
Fungos

150.000
No de casos de Sepse

75.000

25.000

15.000

10.000

5.000
0
1979 1981 1983 1985 1987 1989 1991 1993 1995 1997 1999 2001

Martin et al, NEJM 348:1546-54, 2003

 Antifúngicos Sistêmicos

Classes/Antifúngicos Mecanismo de ação/alvo

Poliênicos Fungicida/ergosterol
•Anfotericina B Destrói o ergosterol da membrana formando poros

Azólicos Fungistático/14 - DM (enzima essencial para formação do

ergosterol)
•Cetoconazol/Miconazol
Inibição da síntese de ergosterol
•Fluconazol / Itraconazol
• Voriconazol / Posaconazol
Inibidores de ácidos nucléicos Fungicida - DNA e RNA
•5-Fluorocitosina
Equinocandinas Fungicida/Fungistatica - enzima β - 1,3 glucana
•Caspofungin / Micafungin / sintetase
Anidulafungina

Groll, Kolve, Eur J Clin Microb Inf Dis. 23:256-

23:256-70. 2004
Espinel--Ingroff Rev Iberoam Micol 25: 101-
Espinel 101-106 2008
Mecanismo de Ação

núcleo
Ergosterol
Poliênicos
Azólicos
Análogos
Nucleosídeos (5FC)
 Posaconazol

Candinas
Antifúngicos Sistêmicos Voriconazol
Caspofungina

AmBisome
Amphocil

Abelcet
Itraconazol

Fluconazol

Cetoconazol

5-fluorocitosina
Anfotericina B

1950 1960 1970 1980 1990 2000 2009

Sheehan et al. CMR 12:40-
12:40-79. 1999
Espinel--Ingroff Rev Iberoam Micol 25:101-
Espinel 25:101-106 2008
Desenvolvimento de testes de susceptibilidade
a antifúngicos nos anos 80 e 90.

Aumento da necessidade de testes de susceptibilidade:

– inúmeros relatos de resistência a antifúngicos
– novas drogas disponíveis

CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute

(antigo NCCLS): estudos multicêntricos para padronizar testes
de susceptibilidade a antifúngicos com leveduras e fungos
filamentosos (“guidelines” para diluição em caldo)

Colombo et al, JAC 36:93-100, 1995

Rex et al, CMR 14:643-58, 2001
 Definição de Resistência # falha terapêutica

Resistência: não-sensibilidade do microrganismo in vitro

frente a antimicrobianos.
- Resistência primária: sem exposição prévia.
- Resistência secundária: com exposição prévia.
- Resistência intrínseca: espécie naturalmente R

Causas ligadas a falha terapêutica:

- sistema imune do paciente
- reduzida biodisponibilidade da droga
- acelerado metabolismo/interação da droga.
- abscessos, próteses, cateteres

Loeffler, Stevens, CID 36(Suppl 1):S31-

1):S31-41 2003
Fungos classificados por sua morfologia

Leveduriformes (Ovais):

Filamentosos (Hifas):

Candida spp.

Cryptococcus spp.

Rhodotorula spp.

Trichosporon spp.

Malassezia spp.

Saccharomyces spp.
 dimórficos:
Fungos dimórficos:
 Histoplasma spp.

Cenocítica (septadas) ou não-
cenotíca (não septadas)

Claros ou escuros

Aspergillus spp.

Fusarium spp.

Scedosporium spp.

Trichoderma spp.

Scopularia

Paecelomyces spp.

Demaceos (Alternaria spp.,
Curvularia spp.)

Zygomicetos

 Paracoccidioides spp.
Leveduras (unidades formadoras Fungos filamentosos
de colônias) UFC bem definidas (Hifas??? Conídios???)

CLSI – M38-A2 (2008)

CLSI - M27-A3 (2008)
Aspergillus spp.
Candida spp. e
Fusarium spp.
Cryptococcus neoformans
Rhizopus arrhizus,
Pseudallescheria boydii
Sporothrix schenckii
e fungos dermatófitos
 CLSI – Diluição em Caldo
Espécies Documentos

M27-P – 1992
Candida spp. e
M27-T – 1995
M27-A – 1997
Cryptococcus neoformans


M27-A2 – 2002

M27-A3 – 2008

M38-P – 1998
Aspergillus spp., Fusarium spp.,
M38-A – 2002
Rhizopus spp., Pseudollescheria boydii,
M38-A2 – 2008
Sporothrix schenckii e dermatófitos

CLSI – Disco Difusão

Espécies Documentos
Candida spp. (Fluconazol e Voriconazol)
M44-P – 2003

M44-A – 2004
 Documentos CLSI em português

Sociedade Brasileira de Análises Clínicas

M27A2 (2002) leveduras

http://www.sbac.org.br/pt/pdfs/biblioteca/clsi_OPAS1M27-A2.pdf

M38A (2002) fungos filamentosos

http://www.sbac.org.br/pt/pdfs/biblioteca/clsi_OPAS1M38-A.pdf
 Variáveis relevantes na padronização dos
ensaios de susceptibilidade a
antimicrobianos

Solubilização de drogas

Tamanho do inóculo

Meio de composição definida e tampão

Temperatura do ensaio

Tempo e critérios de leitura

Avaliação da correlação clínica

Estabelecimento de “breakpoints ou pontos de corte”

Sheehan et al, ClD 17 (suppl 2):S494-500, 1993

Bartizal,, Odds, AAC 47:2100-
Bartizal 47:2100-7 2003
 Correlação in vitro versus in vivo

CIM não pode ser física ou quimicamente medido

Fatores relacionados ao hospedeiro são geralmente mais

importantes que testes de susceptibilidade para definir resposta
terapêutica

Susceptibilidade in vitro pode não implicar em sucesso

terapêutico

Resistência in vitro geralmente associa-se a falha terapêutica

Rex , Pfaller, CID 35:982-9 2002

 A regra do “90-60”

Infecções por microrganismos susceptíveis

repondem à terapêutica apropriada 90% das
vezes

Infecções por microrganismos resistentes

respondem à terapêutica 60% das vezes

Rex , Pfaller, CID 35:982-9 2002

 Correlação in vitro versus in vivo
candidíase orofaríngea tratada com Fluconazol

Autor No isolados No pacientes Correlação

Dupont et al., 1992 45 45 Boa

Rodriguez-Thudela et al., 1992 29 26 Boa
Cameron et al., 1993 98 87 Boa
Troilet et al., 1993 65 25 Boa
Heinic et al., 1993 2 2 Boa
Boken et al., 1993 4 4 Boa
He et al., 1994 212 46 Boa
Pfaller et al., 1994 131 29 Boa
Barchiesi et al., 1995 62 28 Boa
Revankar et al., 1998 155 64 Boa
 Pontos de corte para teste de susceptiblidade para
espécies de Candida
Microdiluição em caldo

Documento CLSI M27-S3 (2008)

Disco Difusão

Documento CLSI M44-S2 (2008)

 Limites de CIMs de 3 antifúngicos
relativos a 2 organismos-controle

Intervalo de CIM %CIMs neste

Organismo Droga (mg/mL) intervalo*
C. parapsilosis Anfotericina B 0,25 - 1,00 99,1
ATCC 22019 Fluconazol 2,00 - 8,00 99,1
5-FC 0,125 - 0,50 98,6

C. krusei Anfotericina B 0,50 - 2,00 99,5

ATCC 6258 Fluconazol 16 - 64 99,1
5-FC 4,0 - 16 96,8

*Seis laboratórios testaram cada isolado 20 vezes utilizando Macrodiluição-NCCLS

Pfaller et al. JCM 33:1104-7 1995

 Metodologia do CLSI para leveduras:
microdiluição em caldo

Meio:
RPMI-1640 tamponado c/MOPS

Inóculo:
0,5 a 2,5 x 103 UFC/Ml

Temperatura:
35ºC

Tempo de leitura:
24 a 48 horas (Candida spp.) e 72h

(Cryptococcus neoformans)

Critério de leitura:
Anfo: inibição total

Azólicos: inibição significativa (trailing)

5FC e Equinocandina: inibição
significativa
CLSI, Documento M27A3, 2008
 Metodologia do CLSI para FUNGOS
FILAMENTOSOS E DERMATÓFITOS:
microdiluição em caldo

Meio:
RPMI-1640 tamponado c/MOPS

Inóculo:
104 UFC/mL non-dermatófitos (ex:
Aspergillus spp.) / 103 UFC/mL

dermatófitos

Temperatura:
35ºC

Tempo de leitura:
48-72 horas (non-dermatófitos) e 4-7 dias
(dermatófitos)

Critério de leitura:
Diversificado dependendo do gênero e

antifúngico (recorrer ao documento)

CLSI, Documento M27A3, 2008

 Métodos

Diluição em caldo:
Macrodiluição (CLSI)
Microdiluição
Clássica (CLSI)
Kits com reduzidas concentrações (comerciais)
Colorimétricos (comerciais)
EUCAST

Difusão em meios sólidos:

Etest (comerciais)
Difusão em Disco (comerciais)
 Macrodiluição: Método-
Método-Referência
(CLSI)

Solução original de inóculo

Diluição 1:100 em água
Diluição 1:20 em RPMI (0,5 - 2,5 x 103 UFC/mL)
0,9 ml solução balanceada inóculo-
inóculo-meio

Tubos contendo 10x 320 160 80 5 0

concentração final da
droga (mg/mL)
32 16 8 0,5 Ctrl Ctrl
POS NEG

Incubação à 35oC por 48-

48-hs/ para Candida spp
 Efeito do “Trailing” na Leitura da CIM

Diluição em
caldo

32 16 8 2 1 0,5 0,25 Tubo

Diferentes controle
concentrações
TRAILING
(mg/ml)

Difusão
Disco
................
em ágar
ÁGAR
 Fenômeno “trailing”

Fenômeno “in vitro”

“Crescimento residual” em TS azólicos (fungistáticos)

Espécie dependente:

C. albicans

C. tropicalis

24h Sensibilidade – 48h Resistência = fenótipo low-high (5%)

< 8µg/ml – > 64µg/ml = LH
Revankar et al. JCM 36:153-6 1998
Arthington-Skaggs et al. AAC 44:2081-5 2000
Coenye et al. CMI 14:495-
14:495-7 2008
 Microdiluição: Parâmetros do CLSI

INÓCULO INICIAL
Diluição 1 : 50 em H2O
Diluição 1: 20 em RPMI (1 - 5 x 103 UFC/mL)
100 ml solução balanceada inóculo-
inóculo-meio

Inóculo final = 0,5-

0,5-2,5 x 103
1 2 3 10 11 12
Concentrações: 0,03-
0,03-32
A – – – – – – – – – – – – – – – –
mg/ml
B – – – – – – – – – – – – – – – –
Incubação à 35oC C – – – – – – – – – – – – – – – –
por 48h/ Candida D – – – – – – – – – – – – – – – – Controle
E – – – – – – – – – – – – – – – – NEG
F – – – – – – – – – – – – – – – –
G – – – – – – – – – – – – – – – – 100 ml de
H – – – – – – – – – – – – – – – – 2x concentração
final da droga
 Fungos filamentosos
Para fungos frente às equinocandinas é utilizado a concentração efetiva mínima
(minimum effective concentration MEC), lido como a menor concentração da
droga capaz de causar a inibição do crescimento e alterar a morfologia das
hifas que aparecem mais compactadas e ovais em relação ao crescimento do
controle positivo.

O fenômeno do trailing não é visto para fungos filamentosos bem como não se
deve levar em consideração a inibição significativa do crescimento do fungo
para antifúngicos azólicos. (MIC = 100% de inibição)
µg/mL
µg/ml 64
64 32
32 16 88 44 2 11 0.5 0.25 0.125
0.5 0.13 0.06
0.06 0.03

Caspofungina

Kanafani, Perfect, CID 46:120-8 2008

 Teste de susceptibilidade a antifúngicos

Procura de métodos de sensibilidade:

reprodutíveis e confiáveis

com baixo custo

fácil execução em laboratórios clínicos

e com excelente correlação com a clínica

Morace et al JCM 40:2953-8 2002

Barry et al AAC 46(6):1781-4 2002
Métodos alternativos para
microdiluição clássica
 Kits comerciais com reduzidas
concentrações baseados em microdiluição
em caldo

Interessante do ponto de vista

econômico $

Pouco eficiente na rotina clínica

Mais preciso para identificação
do que para teste de
susceptibilidade a antifúngico

Baixa correlação com CLSI

Morace et al JCM 40:2953-8 2002

 Colorimétricos
(Comerciais
Comerciais))

Microdiluição em caldo

As CIMs são medidas usando

o indicador colorimétrico de
crescimento azul de alamar
alamar..

Boa correlação com os

métodos do CLSI
CLSI..

$$$$$

Eraso et al. Rev Iberoam Micol. 25:3-

25:3-6. 2008
Pfaller et al. JCM 46(7):2155-
46(7):2155-9 2008
 CLSI X EUCAST

CLSI EUCAST
Temperatura 35ºC 35ºC
Tempo incubação 48h 24h
Inóculo 0,5-2,5 X 103 UFC/ml 0,5-2,5 X 105 UFC/ml
Meio RPMI 1640 RPMI 1640 (2% glicose)
Leitura Visual Espectrofotométrica
Critério Leitura Ausência de crescimento (anfo B) Redução de 90% de crescimento (anfo
(Anfo-B) Redução de 50% crescimento (azóis) B)
Redução de 50% de crescimento (azóis)
Candida spp, C. neoformans e Apenas leveduras fermentadoras
Microrganismos 6 gêneros de fungos filamentosos mais
dermatófitos
OBS: Faltam estudos clínicos de correlação in vitro X in vivo

Chryssanthou, Cuenca-Estrella JCM 40:3841, 2002

Concordância entre CLSI e EUCAST
Microdiluição em caldo

Cuenca-Estrella et al, AAC 46:3644 2002

Princípio de Difusão em Disco:
Etest e Disco Difusão
ETEST
 ETEST

– Facilidade operacional
– Possibilidade de testar poucos isolados
– Correlação entre 60-90% c/ resultados do CLSI
– Leitura difícil c/ azólicos
– Resultados de resistência devem ser confirmados por
método referência
– Parece ser uma boa opção para discriminacão de
cepas menos sensíveis a Anfotericina B

Colombo et al, JCM 33(3):535-40, 1995

Pfaller et al, DMID 32:223-7, 1998
Diekema et al. JCM 45:1974-7 2007
 Descrição da Metodologia

- Placa de petri 90mm para testar um único antifúngico

- Placa 120mm para até 3 antifúngicos
- Fita plástica contendo os antifúngicos
- RPMI 1640 + 1.5% de ágar suplementado com 2% de glicose
- Microrganismo puro com subcultivo recente (18-24h)
- 0.5 de McFarland (espectrofotômetro)
- Swab
- Temperatura de incubação: 35°C
- Tempo de incubação: 24h (azólicos e 5FC) e 48h (anfotericina B)
- Critério de leitura: inibição parcial (azólicos e 5FC) e total
(anfotericina B)

Colombo et al, JCM 33:535-40, 1995

Sensibilidade

Colombo et al, JCM 33(3):535-40, 1995

A B E

C D

Colombo et al, JCM 33:535-40, 1995

Peyron et al, JCM 39:339-42, 2001
 Disco difusão

Documento M44-A (aprovado) – CLSI 2004

 Disco Difusão

Disco-difusão em ágar:
– Facilidade operacional
– Possibilidade de testar poucos ou muitos
isolados
– EXCETO PARA FLUCONAZOL E
VORICONAZOL: Falta de padronização nos
ensaios e produção dos discos c/ drogas

Meis et al. DMID 36:215-23, 2000

Hoffman, Pfaller, Pharmac 21: 111s-123s, 2001
Pfaller et al. JCM 45:1735-45 2007
 Disco Difusão

Disco-difusão em ágar:
– Ótimos resultados com discos de fluconazol 25 µg
em Mueller-Hinton ágar e 2% glicose + azul de
metileno
– Alta reprodutibilidade
– Boa correlação com o CLSI
– Ótima performance no reconhecimento de isolados
sensíveis
Meis et al. DMID 36:215-23, 2000
Hoffman, Pfaller, Pharmac 21: 111s-123s, 2001
Pfaller et al. JCM 45:1735-45 2007
 Leituras de Ensaio de Disco-
Disco-Difusão
com fluconazol

Isolado Resistente, sem halo Isolado Sensível , com halo de

de inibição definido inibição bem definido
 Muticêntrico – comparativo entre 6 métodos
comerciais e microdiluição NCCLS frente a
fluconazol

Laboratórios clínicos preferem produtos comerciais pela facilidade na
execução e rapidez nos resultados.

Estudo italiano (10 centros) que avalia métodos comerciais alternativos ao
NCCLS

800 isolados (50% C. albicans)

ID: Vitek, API 20C AUX ou ATB 32C
- Microdiluição (NCCLS)
- Etest
- Disco difusão
- Candifast
- Integral System Yeasts
- Fungitest
- Sensititre YeastOne

Morace et al JCM 40:2953-8 2002

Morace et al JCM 40:2953-8 2002
 Concordância Disco Difusão DD e Etest X Microdiluição MD
Avaliação da DD (96%) e Etest (98%) comparando com MD: Posaconazol e Fungos
filamentosos (146 isolados).
Messer et al. JCM 45:1322-4 2007

Concordância na avaliação de Etest e DD (93-98%) comparando cm CLSI:

Posaconazol e isolados de Candida spp. (2.200 isolados)
Diekema et al. JCM 45:1974-7 2007

Concordância: TSA de 541 isolados de espécies de Candida por DD X MD. Fluconazol

(95%) e Voriconazol (97%)
Noake et al. JChemother. 19:283-7 2007

Cenário de Perfil de susceptibilidade a antifúngicos para

leveduras
Resultado de TSA por DD de Fluco e Vorico de 200.000 leveduras coletadas durante 8
anos. Fluco: 75% de S sendo a resistência ligada a C. glabrata e C. krusei. Vorico:
95% de S.
Pfaller et al. JCM 45:1735-45 2007
 Estudos brasileiros relacionados à
candidemia publicados nos últimos 10 anos
Autores Ano Pacientes % C. albicans %R % Mortalidade
Colombo et al. 1999 145 37 NI 50%
Costa et al. 2000 86 50 NI 41%
Antunes et al. 2004 120 48 2 NI
Aquino et al. 2005 137 45 4 52
Colombo et al. 2006 712 40 1 54
Barberino et al. 2006 69 >50 NI alta
Medrano et al. 2006 40 40 NI >50
Da Matta et al. 2007 1000 40 2 NI
Colombo et al. 2007 282 38 2 61
França et al. 2008 100 59 1% 56
Chang et al. 2008 96 45 NI 74
Hinrichsen et al. 2008 18 29% NI 61
Girão et al. 2008 108 1ª. rank NI 76
NI = Não Informado
 Selecionando drogas antifúngicas na
presença de identificação de espécie

C. glabrata e C. krusei:

evitar fluconazol

C. lusitaniae:

evitar anfotericina B

Equinocandinas:

nenhum problema neste momento

controvérsias sobre MICs de C. parapsilosis (??)

Voriconazol:

melhor que fluco para C. glabrata e C.krusei

resistência cruzada com fluco Pappas et al CID 38:161-89, 2004
Denning D Lancet 362:1142-51, 2003
Kanafani, Perfect, CID 46:120-8 2008
 Indicações para a realização do TS

Paciente ambulatorial

AIDS em estágio avançado com mucosite refratária

Avaliação de sensibilidade a novos azólicos em episódio de mucosite
por Fluco-R

ATENÇÃO: CVV geralmente é por C. albicans FLUCO-S

Pacientes hospitalizados

Conheça sua epidemiologia!!!!!

Infecção por Candida spp. em paciente com exposição prévia a
fluconazol

Infecção invasiva com má resposta aos antifúngicos

Infecção por patógeno emergente (Ex: Trichosporon spp)
 OBRIGADO

Anjo segurando cálice de Antônio Francisco Lisboa (Aleijadinho)