Pseudomonas aeruginosa:

Mecanismos de resistência e
provas fenotípicas
Prof. Afonso Luís Barth
LABRESIS
Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Faculdade de Farmácia
Univ. Federal do Rio Grande do Sul
 Pseudomonas aeruginosa
Uma bactéria “com mais de 130
anos... “
 Pseudomonas aeruginosa
• Bastonete Gram negativo não-fermentador aeróbio estrito.

• Nutricionalmente versátil – ubiqüitário.

• Reservatórios: soluções e equipamentos hospitalares - infecções hospitalares

(corrente sanguínea, urinária, pulmonar e relacionadas a cateter).
Pacientes imunocomprometidos e em UTIs.

• Patógeno das vias respiratórias mais comum em pacientes com Fibrose

Cística.

• Resistência a múltiplos antibióticos (MDR).

Barth and Pitt – BJID 1998; Potron et al – IJAA 2015

 Pseudomonas aeruginosa
• Bastonete Gram negativo não-fermentador aeróbio estrito.

• Nutricionalmente versátil – ubiqüitário.

• Reservatórios: soluções e equipamentos hospitalares - infecções hospitalares

(corrente sanguínea, urinária, pulmonar e relacionadas a cateter).
Pacientes imunocomprometidos e em UTIs.

• Patógeno das vias respiratórias mais comum em pacientes com Fibrose

Cística.

• Resistência a múltiplos antibióticos (MDR).

Barth and Pitt – BJID 1998; Potron et al – IJAA 2015

Pseudomonas aeruginosa - morfologia
colonial

P.aeruginosa mucóide
(Fibrose Cística)
 Mecanismos de R em P. aeruginosa
• Bombas de efluxo

• Diminuição de permeabilidade

• Alteração proteína-alvo

• Produção de enzimas que degradam antibióticos

Aminoglicosidases
β-lactamases (Carbapenemases)

MDR ocorre por combinação de

mecanismos ou um mecanismo
único muito potente
Bombas de efluxo em P. aeruginosa
 Bombas de efluxo
(sistema de 3 componentes)
Portal de saída Membrana
(OprM, OprJ, OprN) externa

Lipoproteina ligante Espaço

(MexA, MexC, MexE) periplasmático

Membrana
Bomba de efluxo
citoplasmática
(MexB, MexD, MexF)

Livermore – CID - 2001

 Bombas de efluxo em P. aeruginosa

§ Expressão constitutiva – MDR

§§ Expressão por indução substrato-relacionada Zavascki et al – ERAIT - 2010
Inibidores de Bombas de efluxo

L-Phenyl-L-Arginine β-Naphthylamide
(PaβN)

Diminuição da CIM do antibiótico

(carbapenêmico) em presença de PaβN
indica presença de bomba de efluxo tipo
“Mex”

Mesaros et al – JAC 2007

Inibidores de Bombas de efluxo

L-Phenyl-L-Arginine β-Naphthylamide
(PaβN)
Método pouco “específico”
-Concentração do PaβN
-Antibiótico “marcador”
Diminuição da CIM do antibiótico -Variações sutis da CIM
(carbapenêmico) em presença de PaβN -Outros mecanismos de R
indica presença de bomba de efluxo tipo
“Mex”

Mesaros et al – JAC 2007

 Inibidores de Bombas de efluxo

Pereira et al – to be submitted
 Diminuição de permeabilidade em
P. aeruginosa
• Diminuição de permeabilidade da membrana
externa à compostos hidrofílicos é o principal
fator relacionada a alta resistência intrínseca de
P.aeruginosa (β-lactâmicos)

• “Primeiro” mecanismo de resistência ao

imipenem (perda da OprD) - tratamento com
imipenem seleciona mutantes OprD-

• Maioria dos canais de porina são inespecíficos

(afetam outros antibióticos hidrofílicos =
tetraciclinas, aminoglicosídeos e cloranfenicol)
Diminuição de permeabilidade em
P. aeruginosa
IMI

Zavascki et al – ERAIT - 2010

Perda (alteração) de Porina

Richardot et al – IJAA 2015

 Alteração de proteína-alvo em P.
aeruginosa
• Alteração de PBPs (P.aeruginosa 1a, 1b, 2, 3, 4, 6 e 7)
Resistência a β-lactâmicos – controverso
PBP2 – ligação de carbapenêmicos
PBP3 – cefalosporinas anti-Pseudomonas

• gyrA e parC
Resistência a fluoroquinolonas (mutações nas QRDRs)

• Metilação do rRNA 16S

Resistência aos aminoglicosídeos
Produção de enzimas que degradam
antibióticos
• Produção de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos
(AMEs): AAC(6´)-II – R gentamicina, tobramicina e netilmicina;
ANT(2´´)-I – R a gentamicina, tobramicina

• β-lactamases
AmpC β-lactamase: induzível; R a β-lactâmicos
Outras β-lactamses: “ESBL” - PSE, PER, GES e OXA-ESBL
Carbapenemases = VIM,IMP, SPM (NDM)
β-lactamases em P. aeruginosa

Zavascki et al – ERAIT - 2010

AmpC em P. aeruginosa
AmpC* em P.aeruginosa:
Indução in vitro por
imipenem

*PDC: Pseudomonas-
Derived Cefalosporinase

AmpC* em P.aeruginosa:
Indução in vitro por
clavulanato

Cefoxitina e Imipenem = fortes indutores

Hiperprodução de AmpC pode causar diminuição de sensibilidade

ao imipenem
 β-lactamases em P. aeruginosa
(não-carbapenemases)
• Classes 2b e 2c (Ambler classe A):
espectro reduzido – R a peniclinas e cefalosporinas de 1ªs gerações (TEM, PSE, CARB)

• Classe 2be (Ambler classe A):

espectro ampliado “ESBLs” – R tb a cefalosporinas de 3ª e 4ª gerações
(PER, VEB, GES*, TEM, SHV, CTX-M, BEL, LBT802, PME)
*Enzimas tipo GES podem apresentar atividade carbapenemase (GES-2 e GES-5) devido a
mutações pontuais

• Classe 2d (Ambler classe D):

espectro reduzido – R a penicilinas e cefalosporinas de 1ªs gerações; grupo com inúmeras
variantes que podem apresentar aumento de espectro (oximinocefalosporinas e
carbapenêmicos)
OXA-ESBL (comuns em P.aeruginosa) Zavascki et al – ERAIT 2010
OXA-carbapenemases (incomuns em P.aeruginosa) Potron et al – IJAA 2015
Livermore – JAC 2001
 Carbapenemases em P. aeruginosa
...although still rare, MBL of the IMP and VIM families are
increasing sources of resistance to carbapenems in P.
aeruginosa.

Livermore – JAC 2001

…IMP, VIM and SPM metallo-carbapenemases (class B) are increasingly

scattered in P. aeruginosa and are slowly but steadily increasing in
prevalence!

Livermore and Woodford – Trends Microbiol 2006

…metallo-b-lactamases (MBLs), particularly VIM and IMP types,

are the most widespread and have been reported globally!

Wright et al – JAC 2015

Cornaglia et al – Lancet 2011
Wright et al – JAC 2015
 FIM (Italy)
TMB (Libya) Cornaglia et al – Lancet 2011
Wright et al – JAC 2015
 Carbapenemases em P. aeruginosa
• GES-carbapenemsases: GES-2, GES-5, GES-18

• OXA-carbapenemases:
Constitutivas – OXA-50
Adquiridas – OXA-24/40 (“CHDLs”)

• Carbapenemases classe 2f: serina-carbapenemases

(KPC – casos esporádicos)

• Carbapenemases classe 3: metalo-carbapenemases

VIM Distribuição mundial
IMP Distribuição mundial
SPM Brasil
GIM Alemanha
AIM Australia
FIM Itália
NDM – casos esporádicos (distribuição mundial)
 Carbapenemases em P. aeruginosa
• GES-carbapenemsases: GES-2, GES-5, GES-18

• OXA-carbapenemases:
Constitutivas – OXA-50
Adquiridas – OXA-24/40 (“CHDLs”)

• Carbapenemases classe 2f: serina-carbapenemases

(KPC – casos esporádicos)

• Carbapenemases classe 3: metalo-carbapenemases

VIM Distribuição mundial
IMP Distribuição mundial
SPM Brasil
GIM Alemanha
AIM Australia
FIM Itália
NDM – casos esporádicos (distribuição mundial)
Detecção fenotípica dos mecanismos de
resistência

1)Leitura interpretativa do antibiograma

2)Testes com inibidores

O que precisa ser pesquisado?

- Importância clínica

- Importância Epidemiológica
P.aeruginosa sensível apenas ao
aztreonam
P.aeruginosa sensível apenas ao
aztreonam - Indicativo de MBL
P.aeruginosa resistente apenas ao
imipenem

Z
C A

IM
P

Imipenem
 P.aeruginosa resistente apenas ao
imipenem - Indicativo de perda de OprD

Z
C A

IM
P

Imipenem
Leitura interpretativa do antibiograma não é confiável para identificação de
mecanismos individuais pois é influenciada pela combinação de mecanismos de
resistência... (o que é comum em P.aeruginosa)
Como pesquisar metallo
carbapenemases em P.
aeruginosa??
…concerns remain about whether metallo
carbapenemasas could be used to treat infections
caused by metallo-β-lactamase producers with MICs
within the susceptible range.
Cornaglia et al – Lancet 2011
Utilização de quelantes
(EDTA e MPA)

Arakawa et al JCM 1999

MBL negativo MBL
positivo

Thiol 3µl thiol

“Nossa” experiência

MPA
CAZ
 Uso de quelantes

1) Qual o melhor quelante?

EDTA
MPA

2) Qual o melhor substrato?

CAZ
IMI

3) Qual a melhos técnica?

Aproximação de disco (sinergismo)
Adição em disco
 Uso de quelantes
CAZ com MPA por aproximação de disco = melhor teste (aumenta a
sensibilidade) para P.aeruginosa (100% E e S)
Picão et al – JCM 2008

CAZ com EDTA por aproximação de disco (1 cm); IMP com EDTA por
adição = testes com melhor acurácia
Perez et al – BJM 2014

…all phenotypic detection tests for MBLs in P. aeruginosa either lacked

sensitivity (meropenem/DPA combinations) or specificity
meropenem/EDTA and imipenem/EDTA combinations) when tested on
meropenem nonsusceptible isolates in our epidemiological setting.
1) Combination of tests (phenotypic and genotypic)
2) Carba-NP
Peter et al – EJCMID 2014
 Carba-NP para P.aeruginosa

Especificidade
e Sensibilidade 100%

P.aeruginosa IMP, VIM,

SPM, NDM, GIM e AIM
 Sob o ponto de vista clínico e epidemiológico,
MDR P.aeruginosa resistente aos
carbapenêmicos representam um dos principais
problema de saúde pública!

Resistência aos carbapenêmicos por produção de

carbapenemases – ainda mais preocupantes!!
 Obrigado!!

Afonso Luís Barth - albarth@hcpa.edu.br

Pseudomonas aeruginosa:
Mecanismos de resistência e
provas fenotípicas
Prof. Afonso Luís Barth
LABRESIS
Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Faculdade de Farmácia
Univ. Federal do Rio Grande do Sul