IMUNOLOGIA ENZIMAIMUNOENSAIO
ELISA
CLÍNICA
TÉCNICAS
Afinidade: força de interação entre um
único sítio de ligação Ag- Ac (em um
único epítopo)
Avidez: força de interação total entre Ac e
Ag. É a soma das afinidades de tds os
epítopos)
Especificidade: habilidade de um sítio de
combinação de anticorpo em particular de
reagir apenas c/ um antígeno. Conceito
chave e fechadura
Reação cruzada: dois ag diferentes
apresentam epítopos estruturalmente
iguais. Ac específicos p um epítopo se
ligam a um epítopo ñ relacionado, mas c/
propriedades químicas similares.
Fatores que afetam a relação Ag- Ac:
 Afinidade: quanto maior a
afinidade do Ac pelo Ag, + estável
será a interação.
 Avidez: reações entre Ag
multivalentes e Ac multivalentes
são + estáveis e assim, + fáceis de
detectar.
 Relação Ag – Ac: influencia a
detecção dos complexos Ag- Ac pq
o tamanho dos complexos está
relacionado c/ a concentração do
Ag e do Ac.
 Forma física do Ag (solúvel ou
particulado):
 Particulado: se observa a  Anticorpos em doenças
aglutinação do Ag pelo Ac
 Solúvel: se pesquisa a precipitação
de um Ag após a prod de grandes
complexos Ag – Ac insolúveis.
 Concentração dos anticorpos
 Ph do meio de reação
 Temp de reação
 Tempo de reação
(EIE) -
Ensaios heterogêneos:
 Requerem imobilização do AG ou
Ac em uma supercilie sólida p/
separar os complexos Ag – Ac.
 Imobilização por adsorção passiva
e ligações covalentes.
Ensaios competitivos:
 AC específicos são detectados pela
habilidade de inibir a ligação de
um Ac de referência marcado.
 A concentração de Ac na amostra é
inversamente proporcional a
magnitude do sinal obtido.
 Não são adequados como teste
confirmatórios, mas pd ser usado
como teste de triagem.
 Variação: usar Ag marcado ao
invés do Ac.
Elisa indireto:
 Testes + rápidos e + utilizados p/
detectar ou titular AC
 AG adsorvido na fase sólida
 Desvantagens: propensos á lig
inespecíficas e reações falso –
positivas.
Ensaios de captura de Ac (IGM):
Aplicações da técnica de Elisa:
 Endocrinologia
 Proteínas séricas
 Proteínas oncofetais
 Antígenos
 Autoanticorpos
Enzimas e substratos:
 Peroxidase: ABTS (verde); OPD
(marrom); TMB (amarelo)
HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA
(HAI)
 Imunoensaio utilizado p/ detectar
AC no soro humano
  Pd ser utilizado p/ pesquisa de entre 2 marcas (2 linhas coloridas
diferentes tipos de AC no topo)
 Utiliza hemácias c/ AG  Pipeta graduada de escoamento
imobilizados na superfície total (sorológica). Graduada até a
extremidade inferior (1 linha
REAÇÃO DE colorida no topo)
IMUNOFLUORESCÊNCIA Cuidados para pipetagem:
 Técnica q emprega compostos  Pipeta limpa e seca?
fluorescentes p/ detecção do  Pipeta quebrada nas extremidades?
complexo Ag – AC  Volume é apropriado?
 Localização e intensidade da  Não pipetar com a boca
fluorescência estão relacionadas a Pipetadores Automáticos:
formação do complexo e é  Permite a transferência de precisão
visualizada em microscópio de de pequenos volumes de líquidos
fluorescência.  0,1 a 1000 μL
 Técnica simples, especifica,  Podem ser:
sensível, versátil e de alto custo.  Monocanal
 Detecta Ac ou Ag solúveis e  Multicanal
insolúveis.  Ambas podem apresentar volumes
fixos ou variáveis
TÉCNICAS DE PIPETAGEM,  Tipos:
DILUIÇÃO E TITULAÇÃO
 Pipetas de deslocamento de ar →
Pipetas
uso geral (nossas)
 Instrumento utilizado p transferir
 Pipetas de deslocamento positivo
volumes pré- estabelecidos de um
→ líquidos densos
recipiente p outro.
Diluição e titulação
 Podem ser:
 Método onde uma quantidade de
 Pipeta Volumétrica ou uma subst é adicionada à outra p
Transferidora reduzir a concentração de uma
 Pipeta Graduada ou Medidora delas.
 Pipeta Automática  Indica a quantidade relativa de
Pipeta Volumétrica: substs em uma solução, ou seja, o
 Usada p medir volume FIXO de no de partes q foram diluídas em
líquido um número total de partes.
 Usadas p amostras ñ viscosas  Diluir é acrescentar um solvente a
 Exatidão e a calibração é uma solução, mantendo-se a
diretamente proporcional à quantidade de soluto inalterada
capacidade. Diluição seriada
Pipeta Graduada ou Medidora:  Série de diluições simples q
 Tubo de vidro graduado amplifica o fator de diluição.
uniformemente  A fonte de amostra de cada diluição
 2 tipos: vem da etapa anterior
 Pipeta graduada de escoamento  Tds as diluições em série têm o
parcial (pipeta Mohr). Calibrada msm fator de diluição
Título
  É a concentração de uma solução
determinada por titulação.
 Menor quantidade ou concentração
da amostra que produza um efeito
particular ou produto
 É a recíproca da diluição
 Se uma reação positiva em 1⁄2 e 1⁄4
e negativa em 1/8 e 1/16 por
exemplo, o título é igual a 4
(diluição 1⁄4)
TOXOPLASMOSE
 Zoonose, transmitida por um
protozoário
 Infecção mt frequente em várias
espécies de animais: Mamíferos e
aves.
 Possui alta prevalência sorológica
→ contato prévio com o parasita,
mas ñ necessariamente a doença
ativa.
 Os hospedeiros definitivos são os
felídeos.
 Hospedeiros intermediários:
homem e outros animais.
Agente etiológico:
 Toxoplasma gondii
 Filo: Apicomplexa
 Protozoário q pd ser encontrado em
vários tecidos e células, além de
líquidos orgânicos.
 Possui ciclo sexuado e assexuado.
 Morfologia múltipla: Dependendo
do hábitat e do estágio evolutivo.
Mecanismo de invasão:
 Adesão da parte anterior do
parasita (Complexo apical) à
membrana celular
 Invaginação da membrana celular
(ocasionada por proteínas das
ruptrias)
 Formação do vacúolo parasitóforo
 Multiplicação do parasita
 Saída do parasita e morte celular
Transmissão:
 Mordedura de animais
 Ingestão de oocistos presentes em
alimentos, ág contaminados,
bradizoítos em carne crua ou mal
passada.
 Transmissão congênita ou
transplacentária (taquizoítos)
Ciclo biológico:
2 fases:
 Fase assexuada: no hospedeiro
intermediário ou no definitivo
• Linfonodos e tecidos
 Fase sexuada ou coccidiana: no
hospedeiro definitivo
• Células do epitélio intestinal dos
felídeos.
Ciclo heteroxênico:
 Hospedeiro definitivo: gatos
 Hospedeiro intermediário: homem
e outros mamíferos.
Manifestações clínicas:
 Assintomática ou pode provocar
quadros graves (miocárdio, fígado,
músculos, encefalite, exantema
máculo-papular.
 Sintomas mais comuns:
 Febre
 Manchas pelo corpo
 Cansaço
 Dores no corpo
 Linfadenopatias
 Lesões na retina → cegueira.
Toxoplasmose congênita:
 A mãe encontra-se na fase aguda da
doença ou ocorreu reagudização
durante o período gestacional.
 As consequências p o feto
dependerá do grau de exposição
aos parasitos, da virulência da cepa,
da capacidade dos anticorpos
maternos protegerem o feto e do
período da gestação.
 As gestantes pd sofrer aborto,
produzir partos precoces, dar à luz
a crianças sadias, q apresentam
anomalias, ou q vão a óbito.
  Primeiro trimestre: aborto
 Segundo trimestre: aborto ou
nascimento prematuro, podendo a
criança apresentar-se normal ou c/
anomalias.
 Terceiro trimestre: A criança pd
nascer normal e apresentar
evidências relacionadas a doença
alguns dias, semanas ou meses após
o parto. Pode ocorrer:
comprometimento ganglionar,
hepatoesplenomegalia, edema,
miocardite, anemia,
trombocitopenia, lesões oculares.
Diagnóstico Laboratorial:
 Pesquisa de Ac contra o parasita:
De acordo c/ as caract
imunoquímicas destes Ac
diferentes marcadores sorológicos
distinguem infecção latente da
infecção recente ou toxoplasmose-
doença.
Imunofluorescência Indireta:
 Permite a identificação de Ac IgG e
IgM e demais imunoglobulinas
 Os soros reagentes são titulados em
diluições e incubados sobre
toxoplasmas fixados em lâmina de
microscopia e em presença de um
conjugado fluorescente.
 Resultados Quantitativos → são
expressos pela maior diluição
reagente ou, no teste IF-IgG, em
Unidades Internacionais (UI/mL) c/
referência ao soro padrão da OMS.
 IgM e IgA → não se dispõe de soro
de referência, os resultados são
dados em títulos.
Elisa:
 Frações antigênicas do toxoplasma
fixadas em cavidades de placas, são
incubadas c/ diluições dos soros a
testar e, em seguida, c/ conjugado
enzimático antiglobulina (G, M, A
ou E) e um substrato.
 A intensidade da cor produzida, é
proporcional à quantidade de Ac
antitoxoplasma no soro.
 ELISA-IgG → resultado em
U.I./mL
 P/ demais imunoglobulinas →
resultado em índices que
correspondem ao quociente entre as
densidades ópticas do soro em
estudo e a de um soro de
reatividade mínima.
Teste de avidez para Ac:
 Avalia a afinidade c q os Ac IgG se
ligam aos seus respectivos Ag,
sendo medida pela maior ou menor
facilidade de quebra dessa ligação.
 Teste ELISA-IgG modificado:
 mede-se a dissociação dos
complexos Ag-Ac formados e
liberação de IgG de baixa avidez,
por meio de uma solução de uréia
6M (ELISA-Uréia)
 Resultados → expressos pela % de
IgG remanescente, calculado em
razão do título de IgG sem o
tratamento com ureia.
Hemaglutinação Indireta:
 São utilizadas hemácias de aves
recobertas com Ag completos do
parasito, aglutináveis com Ac IgG
e Ac IgM.
 Altamente sensível
 Os títulos são expressos pela maior
diluição reagente
 P detectar Ac IgM, adiciona-se ao
soro 2-mercaptoetanol.
 Após remoção dos Ac IgG, a
hemaglutinação mostra maior
sensibilidade para Ac IgM
Anticorpos IgM:
 A pesquisa por técnicas indiretas
(fluorescentes ou enzimáticas)
podem sofrer reações FALSO-
POSITIVAS pela presença de
fatores reumatoides.
IgM contra IgG.
  É necessário remover os anticorpos
IgG do soro, por precipitação com
um soro anti-IgG.
Testes p triagem e seguimento de
gestantes de risco:
P gestantes desprovidas de Ac p
toxoplasma e pelas repetições dos testes a
cada 4 ou 5 semanas das soronegativas:
 Testes sensíveis, de baixo custo e
execução simples, q detectam Ac
IgG e IgM e fornecem resultados
em curto prazo:
 Sistema automatizados: limitados
pelo custo
 Hemaglutinação: prático e Recém-nascido
adequado, detecta até 5 UI/ ml de
Ac IgG e assinalar a presença de
Ac IgM.
 P um perfil de toxoplasmose
recente, a determinação da época
da primoinfecção (gestação atual
ou anterior) é prognóstico para
infecção fetal:
 Pesquisa de Ac IgA e IgE,
presentes no soro por períodos +
curtos
 IgA ➔ 3 a 6 meses, podendo variar
de 1 a 18 meses
 IgE ➔ 4 meses, podendo se
estender por 8 meses
 Para perfil de toxoplasmose latente,
exclui possibilidade de
soroconversão na gestação em
curso:
 Presença de Ac IgM residuais,
detectáveis pelos testes + sensíveis,
pd criar problemas de um falso
diagnóstico de risco
 Ausente: IgA, IgE e IgG de alta
aviadez
Feto
•10a semana ➔ evidenciação do
toxoplasma no Líquido amniótico por PCR
= sensibilidade de até 100%
• Após 20a ou 22a semanas ➔
toxoplasma demonstrado em sangue fetal
por cordocentese, podendo pesquisar Ac p
o parasita:
 Ac IgG → ñ tem valor diagnóstico,
devido a presença dos Ac maternos.
 Ac IgM → reveladores de
infecção,  especificidade e 
sensibilidade.
 Ac IgA → + sensível
• No Sg fetal ➔ indícios de infecção
(eosinofilia, plaquetopenia, níveis  de
IgM total e de enzimas como Gama GT e
LDH)
• Durante 1o mês de vida ➔ parasitemia
detectada na camada leucocitária do
sangue venoso pela PCR = Sensibilidade
de 90%
• Na presença de sinais clínicos ➔ títulos
de IgG no recém-nascido, preditivo
positivo de Toxoplasmose congênita
comprovado pela presença de Ac IgM ou
evidenciação do toxoplasma.
• Comprovação  sensibilidade ➔ perfis
diferentes de Ac IgG maternos e da criança
no teste de Immunoblot com Ag do
toxoplasma.
• Pesquisa de Ac IgM ➔ exceto nos 10
primeiros dias de vida,  sensibilidade na
imunofluorescência. Nos testes de captura
de IgM (ensaios fluorométricos),
sensibilidade atinge 80-90%.
• Pesquisa de Ac IgA ➔ sensibilidade =
Ac IgM
• Teste para IgG antitoxoplasma ➔ são
+ no LCR do recém-nascido, msm
assintomático
• Nos não infectados ➔ os títulos de IgG
caem progressivamente até negativação,
em poucos meses a 1 ano.
• Nos infectados ➔ esses títulos são
permanentes e ascendentes.
• Na imaturidade imunológica da
criança ➔ ñ produz Ac, os títulos caem
até negativação por esgotamento dos Ac de antitoxoplasma, c/ carga de Ac IgG no
transferência passiva, e se elevam à humor aquoso maior que no soro.
medida que desperta a Imunidade • Bons marcadores de toxoplasmose
Humoral. ocular ➔ Baixa avidez dos Ac IgG,
• Após o 3o mês ➔ apresenta alta presença de IgA e IgM no humor aquoso.
sensibilidade • Maior valor diagnóstico ➔ avaliação
• Citometria de fluxo ➔ detecta a comparativa dos perfis de Ac no humor
expressão de receptores indicativos de aquoso ou vítreo e no soro.
ativação, na superfície dos linfócitos, • Diagnóstico etiológico ➔ detecção de
facilita a pesquisa da Imunidade Celular. Toxoplasmas intra-oculares c/
A Toxoplasmose congênita pd passar identificação de DNA parasitário por PCR.
despercebida, mas causa lesões oculares e A Toxoplasmose Ocular ocorre em fase
cerebrais posteriores, levando à cegueira e tardia da infecção, com o paciente
ao retardo mental. Pode ser evitada ou apresentando perfil de fase crônica, porém
minimizada com tratamento iniciado o 1o pode ser encontrada em pacientes com
mês de vida perfil de fase aguda.
Diagnóstico em imunocomprometidos:
• A evidenciação do parasito ➔ máx
importância. Pd ser encontrado por simples
coloração ou imunofluorescência.
• Técnicas + sensíveis ➔ inoculação no
camundongo ou cultivo de células,
pesquisa de Ag parasitários por
imunohistoquímica de biópsias, reações
imunológicas em LCR ou urina e com +
alta sensibilidade, pesquisa de segmentos
de DNA por hibridização e PCR.
• Investigação de Ac antitoxoplasma no
soro ➔ nos imunocomprometidos c/
infecção latente, pesquisa periódica de IgA
e IgE, a cada 2 meses, como marcadores de
risco de reativação.
• Ac IgG ➔ maior carga no LCR que no
soro
• Indicação de reagudização ➔ detecção
do parasito no Sg, por PCR
Nos transplantados (coração, fígado ou
MO) e nos imunocomprometidos,
especialmente na AIDS, a toxoplasmose
apresenta quadros graves, nas
primoinfecções e nas frequentes
reagudizações de infecções latentes.
Diagnóstico da toxoplasmose ocular:
• Lesão ocular por toxoplasma ➔
produção intra-ocular de Ac