Imunologia

Clínico-
Laboratorial I
Prática
2ºano
2ºsemestre

Andreia Horta; Nádia Condesso

2021-2022
 Aula prática 1

Neste caso, como estamos a fazer diluições de 1 para 2, é necessário no primeiro tubo
termos o dobro da quantidade.
Fator de diluição: 2 600 μl − 30 μl = 570 μl
1 μl ----------- 20 μl 570 μl de eluente e 30 μl de amostra no 1º tubo
30 μl ---------- x x = 600 μl
ou
Diluição de 1/20 sendo que o 1 passa a ser 30
1 + 19 = 20
30 + 570 = 600
A partir do 2º tubo são colocados 300 μl de tampão.

Diluições seriadas
No fim de diluições seriadas todos os tubos ficam com a mesma quantidade de amostra
e a única coisa que muda de tubo para tubo é a diluição.
Para que todos os tubos fiquem com a mesma quantidade, o primeiro tubo tem de ter
sempre quantidade a mais.

Fator de diluição: 2 300 μl de eluente e 20 μl de amostra no 1º tubo

1 μl ---------- 16 μl
20 μl -------- x x = 320 μl
320μl: 2 = 160μl
ou
1 + 15 = 16
20 + 300 = 320
A partir do 2º tubo são colocados 160 μl de tampão.

Fator de diluição: 3
A diluição final não é real. 150 μl de eluente e 10 μl de amostra no 1º tubo
1 μl ---------- 16 μl
10 μl -------- x x = 160 μl
ou
1 + 15 = 16
10 + 150 = 160
A partir do 2º tubo são colocados 100 μl de tampão (2/3 pois vamos passando 1/3).
Neste caso vamos desprezar os 10 μl de amostra e pegar nos 150 μl e dividir pelo fator
de diluição. Isto irá dar 50 μl, valor que vamos transferir de tubo em tubo.
*sempre que na bula disserem que isto pode ser feito é para desprezarmos o valor da amostra*
Há uma quantidade enorme de diluições diferentes que nós deixamos cair ao dizer que,
por exemplo, um resultado é positivo em 144 e negativo em 432. Deste modo só conseguimos
ter uma ideia da positividade do doente face a x doença. As diluições que são feitas têm a ver
com a parte clínica que está por detrás de cada doença, ou seja, os saltos que vemos nas
diluições provavelmente nas patologias que estão a ser estudadas não são importantes.
Deste modo, sempre que aparecem técnicas em que temos diluições, ou seja, “1 para…”
significa que há uma quantidade de concentrações que nós não conseguimos detetar e,
portanto, diz-se que estamos a semiquantificar.
No último tubo positivo vamos dizer “o doente tem um título 44 (diluição 1 para 44)”.
Se no último tubo desta diluição o teste continuasse a dar positivo, nunca podemos dizer
que deu 432, só podemos dizer que o título é superior ou igual a 432, porque não sabemos se
vai ainda dar positivo se continuarmos a diluição.
Diluições seriadas são usadas, por exemplo, no diagnóstico da sífilis.

Aula prática 2
 Nesta aula fomos em busca se a pessoa tem ou não anticorpos para a brucella, através
de uma reação de aglutinação direta. É uma reação de aglutinação direta, porque vamos colocar
os anticorpos do doente em contacto com a bactéria (inativada).
Existem 2 técnicas, o rosa de bengala e a aglutinação de Wright.
Rosa de bengala: É um teste de cartão para a deteção de anticorpos aglutinantes usando células
de Brucella inativadas, coradas com Rosa Bengala e suspensas em tampão ácido. O pH ácido da
suspensão evita a aglutinação não específica das bactérias, aumentando a especificidade do
teste. Os anticorpos aglutinantes IgM, IgG e IgA contribuem para as reações. Como neste teste
não conseguimos fazer diluições, não é com base nele que conseguimos perceber se a pessoa
tem ou não evolução da doença. É uma técnica qualitativa.
Técnica de Wright: Através duma reação de aglutinação direta, os anticorpos específicos contra
a Brucella abortus, (que eventualmente se encontrem na amostra), reagem com os antigénios
presentes na solução corada, o que permite a deteção e semi-quantificação dos anticorpos. Esta
técnica chama-se de Wright quando é realizada em tubo, mas quando é feita em placa chama-
se de Hudlesson. É mais correto fazer em tubo.
Nas técnicas de aglutinação não sabemos qual é a imunoglobulina responsável pela
reação, mas temos maneiras de dar a volta a questão, porque existem reagentes que têm 2-
mercaptoetanol, que vai destruir as ligações das imunoglobulinas pentâmeras (ou seja, ligações
das IgM). Posto isto, se fizermos a técnica de Wright com 2-mercaptoetanol, vamos destruir as
IgMs e vemos o que acontece ao título. Se o título baixar significa que parte das ligações eram
de IgMs; se se mantiver sabemos que o resultado foi obtido à conta das IgGs. Deste modo, o 2-
mercaptoetanol serve então para datar as infeções (quando falamos de aglutinações).

Prática:
Preparar os tubos de acordo com os valores das bulas* e incubá-los.
Depois colocámos 40 μl de amostra e uma gota de reagente no círculo da placa de
aglutinação. Posteriormente pusemos a agitar 4 minutos e analisamos o resultado da
aglutinação.
A reação de aglutinação direta é positiva, pois
conseguimos observar grânulos de areia, que significam
que este paciente já esteve em contacto com a brucella,
uma vez que tem anticorpos contra a mesma.
Quanto maior for a quantidade de grânulos
maior é a quantidade de anticorpos, mas temos de fazer
uma titulação para confirmar isto.

*Link das bulas:

• https://moodle2.ipl.pt/estesl2020/pluginfile.php/9059/mod_resource/content/0/Bruc
elose_Rosa%20de%20Bengala_Vircell.pdf
• https://moodle2.ipl.pt/estesl2020/pluginfile.php/53410/mod_resource/content/0/Bru
cella%20Wright.pdf

Aula prática 3
 Nesta aula o objetivo era a determinação semiquantitativa de anticorpos anti estrepto
desoribunuclease b (DNAse b). Vamos procurar aqueles que já tiveram contacto com
estreptococos do grupo A.

Introdução e objetivos do teste (está na bula)

Durante uma infeção secundária causada por um estreptococo do grupo A (reumatismo
articular agudo (R.A.A), glomerulonefrite aguda …), a pesquisa do agente infecioso permanece
muitas vezes negativa e só um diagnóstico serológico é suscetível de dar uma resposta.
O exame baseia-se na deteção de um aumento da taxa sérica em anticorpos dirigidos
contra diversos antigénios extra ou intracelulares (enzimas em particular). Para um dado
anticorpo, o aumento do título só é observado em cerca de 80% das infeções estreptocócicas.
Para dissimular este inconveniente, é fortemente aconselhada a titulação de, pelo menos, dois
anticorpos diferentes. A pesquisa associada com anti-estreptolisina O e anti-estreptodornase B
aumenta a fiabilidade do diagnóstico.
Após um reumatismo articular agudo, os aumentos da anti-estreptolisina O e da anti-
estreptodornase B estão desfasadas no tempo, com uma persistência da anti-estreptodornase
B.
O doseamento da anti-estreptodornase B é preponderante em certas infeções
estreptocócicas cutâneas nas quais a taxa de anti-estreptolisina O não aumenta ou aumenta
pouco.
A anti-estreptodornase B é produzida para ser uma resposta à secreção de
estreptodornase B pelo agente infecioso. Este antigénio proteico é sintetizado pelas
estirpes/cepas de estreptococos do grupo A e algumas estirpes/cepas dos grupos C e G.
O ASD-Kit permite a determinação semi-quantitativa dos anticorpos anti-
estreptodornase B no soro humano.

Princípio (está na bula)

O princípio do doseamento das anti-estreptodornases B pelo ASD-Kit baseia-se numa
inibição pelos anticorpos do soro a testar da atividade despolimerizante da estreptodornase B
em relação a um substrato ADN (Ácido Desoxirribonucleico).
A despolimerização do substrato é detetada por um indicador corado que vira de azul a
rosa.
O teste ASD-Kit utiliza uma estreptodornase B desidratada no fundo dos poços de uma
barrete. A estreptodornase B é pré-distribuída em quantidades crescentes, o que permite
efetuar um doseamento semi-quantitativo ao efetuar uma diluição única da amostra do soro.
É importante ter em conta os reagentes e as nossas amostras. Os soros devem ser
conservados no frigorifico e podem ou não ser inativados. O complemento são proteínas que
ajudam nas nossas reações Ag/Ac in vitro, mas está presente in vivo nas nossas amostras e
nalgumas técnicas nós somos obrigados a inativar o complemento, porque ele continua a atuar
mesmo in vitro. O soro é inativado a 56 graus durante 30 minutos em banho-maria.
Devem-se evitar congelações e descongelações sucessivas dos soros, porque isto pode
levar à desnaturação dos nossos anticorpos nas nossas amostras.
Não se deve ter soros hemolisados, que contenham lípidos nem soros com cor
amarelada.
 Vão ser utilizadas barretes, que no seu interior contêm estrepto DNAse b no fundo. Não
é necessário realizar diluições seriadas uma vez que nos barretes existem quantidades
crescentes de DNAse (Ag) e vamos simplesmente colocar quantidades iguais de Ac.
Utiliza-se ainda substrato de DNA, um controlo positivo e um tampão.
Na prática, temos então, na base de cada barrete, a DNAse b em quantidades crescentes
nos pocetos e vamos juntar a nossa amostra, que pode ou não ter Ac contra esta mesma DNAse.
Incuba-se e depois coloca-se o substrato de DNA. Incuba-se de novo e dá-se a reação.
Se houver Ac, estes iram neutralizar a DNAse e a cor e a condição do nosso DNA serão
iguais (uma vez que a reação foi neutralizada). Caso a amostra não tenha Ac contra a DNAse,
vão surgir alterações e aquilo que era azul vai passar a cor-de-rosa (a partir do momento em que
o DNA se liga à DNAse b). Desta forma, os negativos são cor-de-rosa e os positivos permanecem
azul.

Leitura:
• Reação positiva: presença de anticorpos anti-estreptodornase B no soro a testar.
Coloração azul devido à neutralização da estreptodornase B.
• Reação negativa: ausência de anticorpos anti-estreptodornase B no soro a testar.
Coloração rosa que testemunha a ação da estreptodornase B.
• Título do soro: anotar a última cúpula que apresenta uma coloração azul ou azul-violeta
e verificar o título na tabela fornecida na bula.

Exemplo:

Nº da cúpula a partir
1 2 3 4 5 6 7 8
da marca ASD
Título em U/ml 100 200 300 400 600 800 1200 ≥ 1600

Condições de aramzenamento (está na bula)

• Conservar os reagentes a 2- 8℃.
• Não congelar os reagentes, com exceção do R2 após reconstituição.
• Se os reagentes forem congelados acidentalmente, não devem ser utilizados.
• Todos os componentes permanecem estáveis até à data de validade indicada na
etiqueta da embalagem, se forem conservados nas condições exigidas.
Consultar o quadro de composição da embalagem para os métodos de conservação
particulares.

Amostras (está na bula)

Natureza e estabilidade das amostras

• Soros recentes ou conservados a -25± 6℃, inativados ou não.

• Evitar as congelações e descongelações sucessivas.
• Rejeitar qualquer soro hemolisado, lipémico ou contaminado.

Procedimento
 1. Esperar que os reagentes e os soros a testar atinjam a temperatura ambiente (18-25℃).
2. Diluir os soros a testar e o controlo positivos R3 a 1/200 no tampão R4: 10 μl de soro +
1990 μl de R4.
3. Colher/coletar uma barrete por amostra a testar. Colocar as barretes no suporte.
4. Distribuir 75 μl da diluição de soro em cada poço da barrete.
Agitar o suporte com pequenos toques manuais laterais durante 1 min de forma
a colocar de novo em solução a estreptodornase B.
5. Incubar 15 min a 37 ℃.
6. Distribuir 75 μl de R2 totalmente dissolvido em cada poço das barretes. Agitar
suavemente para homogeneizar.
7. Incubar ao abrigo da desidratação:
 Ou seja 5 h a 37 ℃,
 Ou seja 3 h a 37 ℃ e uma noite à temperatura ambiente (18-25℃)
Nota: É possível incubar 2 horas a 37 ℃. Neste caso, efetuar do seguinte modo:

• Proceder como acima indicado (de 1 a 6, inclusive)

• Após adição do R2, incubar precisamente 30 min a 37 ℃
• A cada poço adicionar 30 μl de água oxigenada a 0,050% (água oxigenada a 30% diluída
600 vezes em água destilada). Agitar suavemente para homogeneizar.
• Incubar 120 min a 37 ℃, ao abrigo de desidratação. Ler imediatamente.

8. Tirar a barrete do suporte. Efetuar a leitura observando a barrete lateralmente.

9. Eliminar a barrete num recipiente adequado.
Precisámos de 600 μl de solução (8x75).
Na diluição da amostra usamos 10 μl de amostra e 1990 μl de tampão (1/200). Isto dá-
nos mais solução do que a que necessitamos de modo a podermos ter mais margem de
manobra.
Caso usássemos 5 μl de amostra, iriamos usar 995 μl de tampão; se usássemos 3 μl de
amostra, iriamos usar 597 μl de tampão e se usássemos 1 μl de amostra, iriamos usar 19 μl de
tampão.
O controlo só vai dar positivo até ao quarto poço, se der negativo antes deste ou
continuar a dar positivo depois deste, algo correu mal.
(ver o PDF que está nas aulas práticas – “técnica de neutralização – DNAse”)

Aula prática 4
Quando encontramos imunoglobulinas em excesso nas zonas das gamas significa que
existe um clone a produzir uma quantidade especifica de anticorpos que vai migrar e ser visível
na zona das imunoglobulinas. Este pico, no entanto, não fica obrigatoriamente na zona da gama
imunoglobulinas, podendo também aparecer na zona das beta.

Sempre que haja um pico com um aspeto monoclonal na zona das beta ou das gama
devemos suspeitar que haja algum tipo de patologia.

O fibrinogénio migra na zona das beta. O soro não contém fibrinogénio enquanto o
plasma tem. Por este motivo, para realizar imunofixação devemos usar o soro, de modo a não
obtermos picos pelo fibrinogénio.
Gamapatia monoclonal IgG λ

Gamapatia monoclonal IgG K

Erros

Na 3ª imagem apresentada acima o erro foi o gel ter sido colocado ao contrário.

Saudáveis

Gamapatia monoclonal IgM K com cadeias leves λ

Neste caso, para confirmar se as cadeias leves λ eram
livres teríamos que fazer uma segunda imunofixação onde
pesquisamos as IgD e as IgE. Se não houver correspondência de
padrão então são livres, se houver já será uma gamapatia
diclonal.
Gamapatia monoclonal IgA K

Nota: Na eletroforese coloca-se no gel um fixador, no sítio das IgGs coloca-se uma anti-IgG, nas
IgA uma anti-IgA … e incuba-se. Durante a incubação, no sítio onde houver IgGs, a anti-IgG vai
se ligar a elas e assim sucessivamente. As linhas de precipitação ficam desta forma formadas.
 Eletroforese urinária

Na primeira lâmina temos um anticorpo policlonal. Nas

seguintes, a cadeia k, L, cadeias k livres e cadeias L livres. Este doente
tem as cadeias K presentes e não sabemos a que imunoglobolina
corresponde, portanto, vamos dizer que tem uma gamapatia
monoclonal que pode ser IgG, IgA ou IgM K e que está associada a
Bence Jones, correspondentes aos K livres que se observam.

Aula prática 5
A técnica de Waaler Rose é uma técnica de aglutinação onde o teste tem como objetivo
a pesquisa de FR (fator reumatoide).
Neste teste temos uma partícula, o GV (GV têm de ser de carneiro), que são revestidos,
estabilizados e sensibilizados por anticorpos de coelho, anticorpos contra as hemácias de
carneiro.
Os GV de carneiro sensibilizados e estabilizados com Ac de carneiro são um todo, e vão
reagir na presença de FR.
O fator reumatoide é um autoanticorpo dirigido contra o fragmento Fc das
imunoglobulinas, ou seja, as pessoas que têm anticorpos contra as suas próprias
imunoglobulinas, dizemos que têm a presença de FR.
Nos hospitais doseia-se o FR e depois deste dar positivo é que se faz o teste que
realizámos, que é mais específico (e menos sensível), para ter a certeza que aquele FR que deu
positivo é devido à artrite reumatoide e não a outra qualquer doença. É como se este teste fosse
um teste confirmatório.

Procedimento
Vamos diluir o nosso soro 1/10.
Colocou-se 50 μl de tampão em todos os poços.
Colocou-se 50 μl de soro no 1º tubo e descartam-se 50 μl da mistura do 1º poço para o
lixo. No segundo poço colocou-se mais 50 μl de soro e a partir daí começaram as diluições
seriadas, onde se foram passando 50 μl de poço a poço, até descartarmos 50 μl para o lixo.
Posto isto, só necessitávamos de 100 μl de amostra diluída (50 μl no 1º tubo mais 50 μl
no 2º).
 Depois da diluição começou-se a colocar os reagentes. No poço 1 colocou-se 25 μl de R2
(hemácias testemunho ou hemácias não sensibilizadas) * e no resto dos tubos colocou-se 25 μl
R1 (hemácias sensibilizadas).
*estas hemácias são não sensibilizadas, ou seja, não vão reagir com os GV de carneiro. Isto serve
para confirmarmos se a pessoa não tem anticorpos contra GV de carneiro – esta tem de ser
negativa.
Se tivermos positividade neste poceto, onde só colocámos R2, partimos do princípio de
que o individuo tem Ac contra a partícula usada.
 Aula prática 6
Técnicas de fluorescência indireta
1. Pesquisa de Ac contra o treponema através da técnica da absorção da fluorescência dos
Ac de treponemas. O soro nesta técnica vai ter de ser aquecido, para inativar o
complemento. Vão ter de ser realizadas diluições de 1:5. Os controlos também têm de
ser diluídos.

*No primeiro tubo estão 100 μl, sendo que 20 μl são de amostra e 80 μl são de tampão (1/5).
Como substrato nesta técnica usa-se treponemas e, na nossa amostra vão existir Ac que
se vão ligar ao treponema. De seguida, coloca-se o conjugado, uma vez que as ligações sem este
não se iriam visualizar. O conjugado são anti-imunoglobulinas humanas, proveniente de cabras,
contra os nossos Ac, marcada com fluoresceína.
O aspeto de positividade verifica-se na presença das bactérias.
 2. Pesquisa de Ac contra o HHV8 através da fluorescência indireta. O soro nesta técnica
não precisa de ser inativado. Vão ter de ser realizadas diluições de 1:64. O controlo nesta
técnica está pronto a usar, ou seja, não precisa de diluições.
(passar caderno)

*Podíamos tirar qualquer valor que quiséssemos, mas o tampão teria era de ser igual a esse
valor, para conseguirmos manter a relação ½.
Técnica de imunofluorescência indireta para pesquisar anticorpos anti-HHV8 e como
substrato temos células cultivadas (tem o vírus) contendo antigénios virais inativados. Estas
células estão então disponíveis para que quando nós colocarmos os Ac, eles se ligarem aos vírus.
Isto não se visualiza e, portanto, depois vamos colocar o conjugado, que neste caso é uma Anti-
IgG humana marcado com fluoresceína.
O aspeto de positividade verifica-se na presença do vírus.
Notas:
✓ A diferença nas diluições das duas técnicas diz-nos que se na 1ª técnica usarmos
diluições de 1:64 vamos perder positivos (uma vez que a diluição é demasiada para o
tipo de Ac que estamos a estudar). Caso usássemos uma diluição de 1:5 na 2ª técnica,
esta era considerada muito baixa, para podermos ir em busca de Ac contra vírus na sua
amostra.
✓ Na 2ª técnica, os títulos abaixo de 64 vão ter reações inespecíficas, que podem dar
positivo mesmo não tendo a doença. O fator de diluição depende sempre daquilo que
queremos estudar.
✓ As lavagens são importantes para retirar o conjugado, pois caso contrário ele fica ligado,
dando um falso positivo, uma vez que continua a emitir fluorescência na mesma. As
lavagens servem para que só fique ligado ao conjugado aquilo que é suposto.
✓ Nestas técnicas temos de conservar bem os reagentes, uma vez que estes são frágeis,
ou seja, são reagentes que rapidamente podem ser contaminados.

Aula prática 7
O conjugado consiste num Anti-Ac marcado com fluoresceína, caso a ELISA seja indireta,
ou seja, pesquise anticorpos. Podem ter várias classes: Anti-IgG, Anti-IgA…
Podemos ter:
IgG + + - -
IgM + - + -

Fase Aguda
1ª pessoa – IgG + e IgM +

Fase aguda, estamos no início da infeção, no entanto, já temos IgGs positivas e as IgMs
(que são as primeiras), ainda estão positivas também. Numa infeção aguda, podemos ter ambas
positivas, mas é importante estudar a avidez, de modo a conseguirmos datar a infeção. Se não
podermos estudar a avidez, estudamos 2 amostras (com cerca de 10 dias de diferença) em
paralelo, para ter a noção se os Ac sobem ou descem. Se os valores aumentarem significa que
estamos numa fase aguda; se os valores forem semelhantes significa que a infeção é mais antiga,
que aquelas IgMs já são mais antigas.
2ª pessoa – IgG + e IgM -
Estes resultados indicam-nos que a pessoa já esteve contacto com a doença, mas que
neste momento já não tem. Pode ter sido o contacto com a vacina (se esta existir) ou com o
microrganismo envolvido.
3ª pessoa – IgG - e IgM +
As IgMs são as primeiras a aparecer. É provável que estejamos no início da infeção, onde
ainda nem começaram a ser produzidas as IgGs. Podemos ainda estar numa fase em que nem
existem sintomas.
Quando obtemos este resultado, no laboratório o primeiro pensamento não é que
estamos numa fase aguda, mas sim que, provavelmente, existem IgGs e que nós é que não as
conseguimos obter por qualquer problema. Posto isto, ou se pede uma nova amostra ou vamos
aos outros laboratórios pedir informações clínicas, de modo a fazer uma melhor análise do nosso
resultado e a não lançar nenhum resultado sem certezas.
4ª pessoa – IgG - e IgM -
Nunca teve contacto com o microrganismo, nunca criou anticorpos contra o mesmo.
Notas:
✓ O espaço de tempo entre o aparecimento das IgMs e das IgGs depende do
microrganismo.
✓ As IgMs podem ainda dar valores positivos numa altura em que a infeção já não está
ativa.
✓ As IgAs desaparecem muito rapidamente e, portanto, raramente são estudadas.
✓ As IgEs só são avaliadas quando estudamos as alergias.

Aula prática 8
ELISA para deteção de hepatite B
Qual é o calibrador que vamos usar para um resultado qualitativo? O C3.
A. C3
B. Positivo
C. Negativo
D. A1
E. A2
F. A3
G. A4
H. A5
Nos poços, fase sólida, temos Ag. O nosso conjugado é uma anti-imunoglobulina
humana marcada com enzima, que se vai ligar aos nossos Ac, caso estes estejam presentes na
amostra. Coloca-se, no fim, o substrato.
A técnica vai ter 2 leituras, com 2 comprimentos de onda diferentes.
É uma técnica diretamente proporcional, ou seja, quantos mais se ligarem mais cor
vemos.
O resultado obtido é semi-quantitativo, pois para ser quantitativo necessitávamos de
uma curva de calibração.
O índice do doente é calculado através da densidade da amostra a dividir pela densidade
ótica do cut off.
No caso das técnicas competitivas
Adicionar um Ac marcado com enzima contra o Ag que pesquisamos e a amostra que,
eventualmente, também apresenta Ac. Tem de estar garantido que o Ac do doente se liga mais
facilmente ao Ag. Isto pode ficar garantido se o Ac do doente for mais específico, isto é,
apresentar maior afinidade para o Ag. Caso não se possa garantir isto, em primeiro lugar
incubamos com o Ac do doente e depois da lavagem é que adicionamos o Ac marcado com a
enzima. Esta técnica já é inversamente proporcional, uma fez que o facto de não ter cor significa
que o doente tinha Ac e, por isso, nenhum Ac marcado com a enzima se conseguiu ligar.
Notas:
✓ A técnica competitiva em 2 passos em alguns casos é mais sensível e a técnica
competitiva de 1 passo é mais rápida.
✓ Os poços não podem secar, porque as enzimas, Ac e etc… vão desidratando e acabam
por ficar não operacionais.
 Aula prática 9
1.

2.

3.
4.

Notas:

✓ Quando é uma ELISA inversamente proporcional, o nosso conjugado liga-se àquilo onde
não ficou o Ac do doente. Se o Ac do doente não fica marcado, iremos obter menos cor,
isto é, um controlo positivo com baixa absorvância. Nestes casos temos um controlo
negativo com a absorvância maior.
✓ Nas avaliações semi-quantitativas existe a multiplicação por um fator. A vantagem da
multiplicação por esse fator é que lançamos os resultados como índice e não como
absorvância e conseguimos, desta forma, comparar resultados de avaliações de dias
diferentes.
 ✓ A 1ª coisa que se faz sempre é olhar para os controlos. Se o CP tiver uma absorvância
maior que o CN é diretamente proporcional, pois houve mais ligações do conjugado aos
Ac do doente. Se for inversamente proporcional, o nosso conjugado não teve onde se
ligar, pois os Ac do doente foram-se ligar a todos os focos, o que significa que não temos
conjugado com enzima suficiente para ter valores altos de absorvância.
✓ Em relação à zona cinzenta, há várias formas de a fazer. Se for 10% basta multiplicar por
0,9 e ficamos com a zona inferior e por 1,1 e ficamos com a zona superior. Temos de ter
em atenção ao que diz na bula. Sempre que um resultado nos dá na zona cinzenta temos
de fazer nova colheita ou repetir a amostra noutra técnica, ou seja, não se lança o
resultado.

Aula prática 10
RPR

O RPR trata-se de um teste não

treponémico, onde se pesquisam reaginas.
Pelo que é que é constituído o
reagente de RPR? Cardiolipina, lecitina e
colesterol → existem no coração e pessoas
com sífilis reagem a estes compostos.

Poço com 20 l de reagente

e 50 l de amostra
 Como nas técnicas de aglutinação, na sífilis pode haver fenómeno de zona, faz-se o
primeiro poço só com reagente e amostra. Se der positivo avança-se para as diluições, se der
negativo, o caso está arrumado.

TPPA

O teste TPPA trata-se de um teste

treponémico que pesquisa de Ac específicos
contra o treponema. Temos Treponema
pallidum a revestir as nossas partículas e
vamos colocar as amostras em contacto. É
uma técnica de aglutinação indireta, e,
portanto, temos de ter cuidado com as
ligações cruzadas, uma vez que as pessoas
podem ter Ac contra as partículas usadas. Para
garantir que as partículas não fazem alergia à
pessoa, utilizam-se também partículas não
sensibilizadas.

A amostra não sensibilizada está menos diluída que a sensibilizada.

Suspeita de sífilis
Forma clássica
• Teste não treponémico (RPR ou VDRL)
  Positivo → faz-se um teste confirmatório, uma vez que a positividade se pode
dever a outro fator que não o treponema → teste treponémico (TPPA ou TPHA).
Também se pode fazer IF.
 Negativo
Nota: A diferença entre o TPPA e o TPHA é que o primeiro usa partículas revestidas pelo
treponema e o segundo utiliza hemácias. As partículas duram mais tempo que as hemácias, e
isso é uma vantagem.
Se tivermos muita quantidade de amostra, podemos optar pelo diagnóstico invertido.
• Começa-se por uma ELISA (que vai detetar quer IgMs quer IgGs de sífilis)
 Positivo → realiza-se um NT (RPR ou VDRL)
 Negativo
 Duvidoso → faz-se um treponémico para confirmar

Aula prática 11
• Toxoplasmose
• Outros
• Rubéola Podem afetar os fetos
• Citomegalovirus
• Herpes
Quando estudamos estas doenças, as imunoglobulinas que estudamos são as IgGs e as
IgMs. As IgMs são as que aparecem precocemente.
A rubéola é a única que tem um plano nacional de vacinação.

Cinética dos Anticorpos

Casos Toxoplasmose
Caso 1
• Mulher, grávida de 9 semanas
• IgM –
• IgG +
Teve contacto com o parasita, mas não tem infeção ativa. Só há preocupação se for
imunodeprimida.

Caso 2
• Mulher, grávida de 4 meses
• IgM + → avidez baixa
• IgG +
Testar a avidez para datar a infeção (saber se a infeção foi antes ou durante a gravidez):
- Avidez elevada indica infeção antiga
- Avidez baixa indica infeção recente (menos de 3/4 meses)
Nota: Se a avidez fosse elevada, significava que a infeção tinha surgido antes da gravidez e havia
baixo risco para o bebé.

Caso 3
• Mulher grávida
• IgG –
• IgM +
Repetir a análise dentro de 10 dias para ver se os IgG positivam.
Se IgG continuar negativa → IgM é falsamente positiva e considera-se IgG e IgM
negativa. Houve reações cruzadas.
A mulher deve evitar gatos, alimentos crus e carne malpassada e deve lavar muito bem
os alimentos e não comer nada com casca.
Notas:
✓ A toxoplasmose é a única doença deste grupo onde podemos dar medicação à mãe, que
não afete o bebé. Esta medicação serve para baixar a parasitemia.
✓ Na toxoplasmose, a probabilidade de o bebé ficar infetado no início da gravidez é menor
que no fim. Quanto às lesões, a gravidade destas é muito menor quando o bebé é
infetado mais para o fim da gravidez.

Casos Citomegalovírus (CMV)

Caso 1
• Grávida
• IgG +
• IgM –
Teve contacto com o agente, mas não há infeção ativa. Não tem imunidade, portanto,
há possibilidade de reinfeção.

Caso 2
• Grávida
• IgG + → avidez baixa
• IgM +
Testar a avidez, sendo que, caso esta seja baixa, indica infeção recente, havendo risco
para o bebé.
Eventualmente pode realizar-se uma punção para analisar o LCR e averiguar se o bebé
está ou não infetado.
Se a avidez fosse alta significava que a infeção foi antes da gravidez e que, portanto, não
há uma grande preocupação.
Nota: Fazer uma amniocentese é perigoso, pois aumenta-se o risco de o bebé ficar infetado.

Caso 3
• Miúdo de 10 anos
• IgG +
 • IgM +
Analisar o soro de novo dentro de 15 dias e analisar paralelamente
• IgG –
• IgM –
O 1º resultado era um falso positivo.

Caso 4
Mãe Filho (já na cresce)
IgG - IgG +
IgM - IgM +

A mãe pode positivar. A mãe é seronegativa, ou seja, nunca teve contacto com o vírus,
com uma criança positiva, pelo que tem de ter alguns cuidados pois pode vir a positivar, devido
às mudas de fraldas e afins…

Casos rubéola
Caso 1
• Grávida
• IgG –
• IgM –
Não foi vacinada, não teve contacto com a rubéola, pode ter sido vacinada, mas já não
tem anticorpos (perdeu a imunidade).

Caso 2
• Mulher, pré-gravidez
• IgG +
• IgM +
Pedir nova amostra dentro de 15 dias ou testar a avidez.

Na nova amostra ambas as Ig permanecem

positivas, sendo que tal significa que a mulher ou foi
vacinada ou está com uma infeção primária.

Caso 3
• Mulher, 2 meses de gravidez
• IgG +
• IgM duvidoso
Pedir nova amostra (2-3 semanas) e testar a avidez das IgGs para tentar datar a infeção.
Se a avidez for baixa, o valor duvidoso das IgM faz sentido e “mais dia menos dia” elas
vão ficar positivas.
Nota: O herpes normalmente não é diagnosticado, uma vez que não temos nada para oferecer.
Normalmente, só se pesquisa com mais frequência a toxoplasmose e a rubéola, porque para a
toxoplasmose temos medicação para dar e quanto à rubéola temos uma vacina para oferecer.
Não existe nenhum medicamento para o CMV.

Aula prática 12

Notas:
✓ Nos testes de aglutinação não conseguimos saber qual é a classe das imunoglobulinas
que estão a reagir, enquanto que nas ELISAS conseguimos.
✓ Como é que se arranja um conjugado que detete tudo, ou seja, todos os tipos de Ig’s?
Coloca-se um conjugado anti-cadeias leves e ele liga-se a tudo.
✓ Para sabermos se a terapêutica está a resultar, faz-se a monitorização através dos títulos
dos testes NT.
✓ É nos testes NT que necessitamos de ver título.
✓ A imunofluorescência é mais ligada para as IgMs do que para as IgGs, principalmente
para os bebés.

Diagnóstico da sífilis

Diagnóstico reverso baseia-se em começar com

ELISAS, que nos podem dar valores positivos, mas não
sabemos em que altura da doença a pessoa se encontra.
Depois faz-se então um teste não treponémico para
saber o estadio da doença.

O médico pode ainda adotar outra abordagem, pedir 1º um teste NT. Se

este der negativo, provavelmente não tem a doença, se der positivo, vamos ter
de confirmar com testes treponémico.
Nota: Pode haver casos em que se faz ELISA e o resultado é duvidoso. Para nos
ajudar a sair da zona cinzenta recorre-se a TPPA ou a TPHA, só para saber se, de
facto, a positividade da ELISA pode estar relacionada com a aglutinação.

Caso 1

• Mulher, 37 anos
• Apresenta uma úlcera oral, pouco exsudativa e não dolorosa
• VDRL – título: 32 dils
 • TPPA: título 640 → O TPPA é reativo. → O título não interessa uma vez que não há
relação entre a evolução da doença e o título deste teste.
VDRL é também reativo, logo a senhora tem sífilis (primária).

Caso 2
• Recém-nascido
• Mãe com diagnóstico de sífilis pré-parto
Dados da mãe:

• VDRL: título 8 dils

• TPHA: reativo
• IgM: +
Dados do RN:
• VDRL: título 4 dils
• TPHA: reativo
• IgM: +
A mãe tem sífilis. Como o TPHA (IgG’s e IgM’s) é reativo, suspeitamos que o RN também
terá um TPHA reativo. De facto, o RN também é positivo, mas esta positividade pode dever-se
apenas às IgG’s da mãe (que atravessam a placenta). Faz-se a deteção das IgMs através de IF e
como as IgM’s são positivas, o RN também está infetado → sífilis congénita. Se as IgM’s dessem
negativas tínhamos de repetir o teste mais tarde.

Caso 3
• Homem, 48 anos
• Contacto sexual desprotegido
• VDRL: título 1 dils
• TPHA: reativo
Convém repetir os 2 testes. Se o senhor estiver infetado, haverá aumento do VDRL. Caso
não haja, trata-se de um caso antigo de sífilis.

Caso 4
• Mulher, 21 anos
• IgG totais por quimioluminescência (ELISA): positivo
• Fazer um RPR (não treponémico): negativo
• Fazer outro Treponémico (TPHA): negativo → O resultado das IgG’s é um falso positivo.

Caso 5
• Homem, 52 anos
• Úlcera na glande
• VDRL: título 2 dils
• TPHA: não reativo
• Passadas 2/3 semanas os resultados mantiveram-se. → Após os resultados dos 2
primeiros testes, dada a sintomatologia sugestiva de sífilis, convinha repetir os testes
mais tarde. Como os resultados se mantiveram iguais conclui-se que não há sífilis.

Caso 6
 • Mulher, 55 anos
• Úlcera na região vaginal
• IgG total: +
• VDRL: título 2 dils → Uma vez que as IgG’s são positivas e há sintomatologia é necessário
repetir o VDRL ou fazer as IgM’s, foram realizados ambos e os resultados foram os
seguintes:
 IgM: +
 VDRL: título 32 dils → Assim conclui-se que a paciente tem sífilis, pois as IgM’s
estão presentes e o título do VDRL aumentou.

Caso 7
• Mulher, 58 anos
• Parceiro afetado
• RPR: 16 dils
• TPPA: reativo
1 mês depois:
• VDRL: 16 → 2 → NR → 8
• TPPA: reativo → reativo → reativo → reativo → Infeção e reinfeção

Caso 8
• Grávida Pós-parto
• RPR: 2 → 4 → 4 → 4 → NR
• TPPA: NR → NR → NR → NR → NR Pós-parto
A reatividade do RPR na grávida é um falso positivo devido à gravidez, não há infeção.

Caso 9
• Análise de rotina
fevereiro março maio fevereiro abril

RPR 64 8 2 Negativo Negativo

TPPA 2560 640 640 640 320

• A terapêutica está a ser eficaz

Caso 10
• Homem, 23 anos
RPR 8 2 2 NR NR
TPHA 1280 1280 640 640 640

• A terapêutica está a ser eficaz

Casos Brucelose
Caso 1
• Mulher, 37 anos, trabalha numa fábrica de queijos
 • Sintomas: febre, sudorese noturna, fraqueza
• Rosa de Bengala: +
• Wright: título 320
• 2 ME (destrói IgM’s): título 40
Trata-se de uma infeção recente, pois a diferença de títulos entre o Wright e o 2 ME é
significativa. O Wright apresenta um título mais elevado devido à presença de muitas IgM’s, que
sugerem então uma infeção recente. O título baixou à conta da destruição das ligações das
IgM’s.

Caso 2
• Rapaz de 12 anos
• Rosa de bengala: +
• Wright: 160
• 2 ME: 320
Não é possível que o 2ME seja superior ao Wright, pois o Wright deteta IgA’s, IgG’s e
IgM’s, enquanto o 2ME não deteta IgM’s. Podemos afirmar que é positivo, que estamos numa
fase de infeção, mas não conseguimos saber se estamos numa fase aguda ou numa fase mais
adiantada.

Caso 3
02/03:
• Rosa Bengala: +
• Wright: < 10
• 2 ME: < 10
• Coombs: -
25/03:

• Rosa Bengala: +
• Wright: < 10
• 2 ME: < 10
• Coombs: -
O teste foi repetido no dia 25, porque no dia 2 podia estar-se perante o período janela
e, nesse caso, a infeção ainda não seria diagnosticada laboratorialmente. A pessoa não está
infetada, pois os resultados de dia 25 permaneceram iguais. A positividade no Rosa de Bengala
ocorre devido a reações cruzadas.

Caso 4
• Mulher, 52 anos
• Rosa de bengala: -
• Wright: título 10
• 2ME: título < 10
• Coombs: negativo
Os primeiros 3 testes sugeriam ausência de Brucelose. Foi realizado o teste de Coombs
para despistar brucelose crónica. Como este último deu negativo conclui-se pela ausência de
infeção.

Caso 5
 • Homem, 58 anos, suinicultor
• Sintomas: indicativos de infeção por Brucella (terminou terapêutica há 4 meses)
• Rosa de bengala: -
• Wright: título 10
• 2 ME: < 10
• Coombs: negativo
Tendo em conta os resultados do Wright e do 2 ME foi necessário realizar o teste de
Coombs, dada a sintomatologia, para despistar brucelose crónica. A terapêutica está a ser eficaz.

Caso 6
• Rosa de bengala: -
• Wright: título 10
• 2 ME: título < 10
• Coombs: 1º 20; 2º 160 → Suspeita de reinfeção

Caso 7
• Homem
• 52 anos
• Veterinário
02/02/2016

• Rosa Bengala: +
• Wright: título 20
• 2ME: título < 10
09/02/2016
• Rosa Bengala: +
• Wright: título 160
• 2ME: título 10
No dia 2 havia uma diferença nos títulos dos testes de Wright e 2ME, no entanto, não
era significativa. No dia 9 o teste foi repetido e verificou-se um aumento do título do Wright,
havendo uma diferença significativa entre este e o 2ME. Isto significa que as imunoglobulinas
que estão a ser detetadas são as IgM, ou seja, o senhor está infetado (infeção aguda/recente).
Notas:
✓ Na maioria do laboratório faz se o RPR em vez do VDRL, porque através do RPR
facilmente se vê a olho nu a aglutinação. Já no VDRL, implica a observação ao
microscópio, o que significa que temos de proceder à inativação do soro…
✓ A avidez, nas doenças TORCH só se estuda na rubéola, no citomegalovírus e na
toxoplasmose.